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FACULTAD DE MEDICINA
Curso de Introduccin a la Biotecnologa
GRUPO # 1
Integrantes:
- Pinzn, Armando 4-764-88
- Snchez, Ismael
8-858-606
- Zeng, Julio
8-868-704
- Zheng, Antonio
8-866-935
MED-3
6,2
20 de octubre de 2014
INTRODUCCIN
La Terapia Gnica fue desarrollada a partir de la curiosidad del ser humano en la bsqueda
incesante de respuestas a las inquietudes de los fenmenos naturales incomprendidos y
muchas veces desconocidos.
El descubrimiento de la etructura del ADN permiti, de manera exponencial, la produccin de
conocimientos imprecedentes sobre el funcionamiento del cuerpo y mecanismos moleculares
de enfermedades antes inexplicables. Esto ampli las limitaciones en el rea cientfico,
permitiendo desarrollar nuevas tcnicas y procedimientos para el estudio del ADN y de
molculas funcionales en organismos vivos.
El desarrollo de nuevas tcnicas y procedimientos moleculares dio paso a estudios en
microorganismos, tanto patgenos como no patgenos, y resultado de stos estudios se ve
el potencial de utilizarlos para el beneficio de la humanidad. sta es la base de la Terapia
Gnica, donde se utilizan microorganismos no virulentos para transferir genes teraputicos a
clulas que producen protenas con funcin anormal, llevando la teraputica mdica a un
nuevo nivel.
En el siguiente trabajo describiremos detalladamente la Terapia Gnica, sus componentes,
aplicaciones e implicaciones ticas de la misma.
OBJETIVOS GENERALES
OBJETIVOS ESPECFICOS
Describir y explicar los principales vectores, tanto virales y no virales que implica la
Terapia Gnica
Material gentico
Vectores de transferencia
Clulas diana
Mtodo de transferencia
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A. Material gentico
El material gentico que puede emplearse es de muy diversa naturaleza. Los genes
naturales son porciones de ADN que codifican para protenas naturales que tienen un
efecto biolgico conocido, y se utilizan en la terapia gnica de complementacin y de
induccin.
La terapia de complementacin se utiliza en la ausencia de una protena o la elaboracin
de una protena anormal que contribuyen sustancialmente a la fisiopatologa de la
enfermedad, por lo que la transferencia de los genes correspondientes puede restaurar
en la clula la produccin de la protena. Tiene su principal campo de aplicacin en las
enfermedades monognicas y polignicas, como la hemofilia y el cncer respectivamente,
en el que es frecuente hallar protenas alteradas, como la p53.
La terapia de induccin pretende que en la clula se ejerza una funcin biolgica nueva,
como puede ser la produccin de una citocina, la expresin de un antgeno o la activacin
de un profrmaco en una clula tumoral.
Los genes quimricos se disean en el laboratorio y, en general, pretenden interferir en
funciones celulares que participan en la enfermedad. Para lograr esta interferencia se
pueden disear genes que fabriquen diferentes molculas. Los anticuerpos de cadena
simple son capaces de reconocer especficamente un antgeno y unirse a l, pero que
quedan retenidos dentro de la clula y all ejercen una funcin de bloqueo del antgeno
que reconocen. Las protenas dominantes mutadas son molculas similares a protenas
reguladoras, que conservan la capacidad de unin al ADN, por lo que compiten con las
protenas no mutadas, pero carecen del efecto regulador y as interfieren en la funcin de
aquellas.
Otros tipos de material gentico no requieren sntesis proteica para ejercer su accin
teraputica. Entre ellos estn los ribozimas y las molculas antisentido y seuelo que
comparten su capacidad para interferir en la expresin de genes celulares. Los ribozimas
son pequeas molculas de ARN de secuencia complementaria a la de otros ARN diana
a los que se unen especficamente, pero con actividad cataltica que les permite destruir
este ARN al que se unen. Las molculas antisentido son oligonucletidos que, por ser
complementarios, se unen a secuencias especficas de ADN o ARN y bloquean su
expresin. Y las molculas seuelo son molculas de ADN que secuestran, por unin
especfica, las protenas reguladoras e impiden su efecto biolgico.
B. Vectores de Transferencia
Los vectores van a contener los elementos que queramos introducir al paciente, que no van a
ser slo los genes funcionales, sino tambin elementos necesarios para su expresin y
regulacin, como pueden ser promotores, potenciadores o secuencias especficas que
permitan su control bajo ciertas condiciones.
La gran diversidad de situaciones en las que podra aplicarse la terapia gnica hace
imposible la existencia de un solo tipo de vector adecuado. Podemos distinguir dos
categoras principales en vectores usados en terapia gnica: virales y no virales.
1. VECTORES VIRALES
Los vectores virales fueron los primeros en ser utilizados, dada su alta eficacia como
vehculos de cidos nucleicos. Los virus estn compuestos por un ADN un ARN rodeado
de una cpside proteica y, en algunos casos, una envuelta lipoproteica. El ciclo biolgico de
los virus pasa por la introduccin del genoma viral en determinados tipos celulares,
habitualmente por la presencia de receptores en la membrana de las clulas. Para poder
utilizar un virus como vector en terapia gnica, es preciso insertar el cido nucleico
teraputico en el genoma viral, y conseguir al mismo tiempo que el virus no se replique y por
tanto no sea patognico. Por esto, los virus utilizados en terapia gnica se denominan virus
recombinantes y defectivos (carecen de alguna funcin necesaria para su propio ciclo
replicativo).
a) Vectores retrovirales
Los vectores retrovirales utilizados en terapia gnica estn derivados de los oncovirus
murinos del tipo C, especialmente los que son anfitrpicos (que pueden infectar tanto clulas
murinas como humanas).
Caractersticas
Los retrovirus son virus ARN que tienen una envuelta fosfolipdica, con glicoprotenas que
determinan el tropismo del virus al ser reconocidas por receptores celulares especficos.
Dentro de esta envuelta hay una cpside proteica de estructura icosadrica que contiene 2
copias del genoma viral, la transcriptasa inversa (RT), y la integrasa. El genoma de un
retrovirus es una molcula de ARN de polaridad positiva en la que se distinguen 3 tipos de
genes: genes gag (codifican las protenas de la cpside), genes pol (codifican las enzimas
para el ciclo viral, como la proteasa y la integrasa) y genes env (codifican las glicoprotenas
de la envuelta).
Mecanismo
Un sistema retroviral para terapia gentica necesita de dos componentes: el vector de
expresin, el cual lleva el gen teraputico y la clula empaquetadora. El vector retroviral est
desprovisto de genes virales, dejando espacio para llevar el gen teraputico. En el vector se
conservan las secuencias de nucletidos que sirven de seales para empaquetar la partcula
viral y para lograr la insercin dentro del genoma celular. Este material gentico es
introducido dentro de la clula empaquetadora, la cual produce las protenas virales
necesarias para la formacin de una partcula viral. El vector viral es producido y liberado al
sobrenadante del cultivo celular. Este sobrenadante es utilizado para infectar las clulas o el
tejido objetivo. Una vez que la clula objetivo es infectada, el material gentico viral se
integra al genoma celular. La ausencia de genes virales asegura que no haya produccin de
partculas virales. Luego de ser integrado, el gen teraputico se expresa utilizando las
enzimas de la clula hospedera.
Es importante sealar que el nucleoide de un oncovirus es incapaz de atravesar la
membrana nuclear, por lo que es necesario que la clula sufra al menos una mitosis para
que el genoma viral entre en contacto con el genoma de la clula husped.
Ventajas
Son vectores con buena infectividad, un tropismo amplio.
Su capacidad integrativa les permite alcanzar, en teora, una duracin muy larga de la
expresin incluso en clulas que estn dividindose activamente
Desventajas
Por las limitaciones propias del tamao del genoma viral, el ADN teraputico no puede
ser mayor a 7-8 kb
Muy lbiles, lo que dificulta su purificacin
Son inactivados en el torrente sanguneo por el sistema del complemento, por lo que
su principal uso es en terapia gnica ex vivo
Los promotores virales suelen silenciarse por metilacin, por lo que la expresin no es
tan prolongada como cabra esperar
b) Lentivirus
Caractersticas
Los lentivirus son retrovirus no oncognicos que producen trastornos multiorgnicos
caracterizados por largos tiempos de incubacin e infeccin persistente.
Recientemente se
han desarrollado vectores retrovirales basados en lentivirus, aprovechando la circunstancia
de que el HIV-1 es uno de los virus mejor estudiados.
Mecanismo
El genoma de este virus contiene algunos genes (tat y rev, por ejemplo) que no estn
presentes en los oncoretrovirus y que son esenciales para la expresin de los genes virales.
Algunas de las protenas virales tienen seales de localizacin nuclear y facilitan la entrada
del virus por los poros nucleares, de ah la capacidad que tienen estos virus de infectar
clulas que no estn en divisin.
Ventajas
Los lentivirus son capaces de infectar a todo tipo de clulas, tanto quiescentes como
en divisin
No inmunognicos
Desventajas
La mayora de los vectores lentivirales que se emplean hoy da proceden del VIH,
pudiendo producirse infecciones por recombinacin. Adems, su integracin es al azar,
por lo que puede ocasionar mutaciones por recombinacin.
Utilidad
c) Vectores adenovirales
Caractersticas
Los adenovirus son virus de ADN de doble hebra de aproximadamente 35 kb de tamao, que
producen infecciones del tracto respiratorio, y tienen tropismo por los epitelios respiratorio,
gastrointestinal, y de la crnea.
Se conocen gran cantidad de serotipos de adenovirus humanos, pero los ms utilizados en
terapia gnica han sido los serotipos 2 y 5.
La nucleocpside de un adenovirus consta de una cpside icosadrica que est compuesta
por 720 protenas hexona y 60 protenas pentona. De las pentonas parte la protena de la
fibra (una protena trimrica) que termina en una protena botn (knob) mediante la cual el
adenovirus se une a receptores celulares especficos.
Mecanismo
El ciclo replicativo de un adenovirus es ms sencillo que el de los retrovirus. El adenovirus se
une a un receptor de membrana especfico denominado CAR (Coxackie Adenovirus
Receptor) mediante el botn de la fibra, y a continuacin la pentona se une por un motivo
RGD (arginina-glicina-asprtico) a integrinas cercanas para despus ser internalizado por
endocitosis. La propia cpside adenoviral es capaz de desestabilizar el endosoma, que se
rompe y libera las partculas virales al citoplasma. Las nucleocpsides llegan a la membrana
nuclear y son capaces de introducir el genoma viral a travs de los poros nucleares.
Para generar adenovirus recombinantes defectivos (es decir, que lleven el ADN teraputico
pero no puedan replicarse) se sigue una estrategia similar a la que veamos para los
retrovirus: substituir algn gen viral(los genes de las protenas tempranas E1a, E1b, E2 y E3,
esenciales para la replicacin viral) por el gen teraputico. Lo ms habitual es delecionar el
genoma viral en la regin E1, para lo que necesitaremos una clula empaquetadora que
exprese de manera estable los genes contenidos en esa regin. La lnea celular ms
utilizada como clula empaquetadora para construir adenovirus recombinantes se denomina
clula 293. La ltima generacin de vectores adenovirales consiste en los llamados
adenovirus gutless (vacos), en los que todo el genoma viral ha sido delecionado y por tanto
tienen una capacidad terica en torno a las 30 kb de ADN exgeno. Para producirlos hay que
aportar en trans todas las funciones adenovirales necesarias, mediante plsmidos helper
por estrategias que utilizan el sistema Cre/loxP.
Ventajas
Relativamente estables
Son eficaces tanto sobre clulas que no estn en division como sobre clulas en
divisin.
Los niveles in vivo de fabricacin de protena a partir de un gen exgeno son muy
elevados.
Desventajas
Toxicidad que producen a dosis altas, y la fuerte respuesta inmune celular y humoral
que sigue a su administracin, con la consiguiente disminucin de eficacia teraputica.
Alta infectividad
Muy baja toxicidad y ausencia de respuesta inmune celular frente a las protenas
virales.
Desventajas
La especificidad de la integracin en un locus concreto se pierde en los virus
Limitacin del tamao de DNA recombinante que podemos usar, que es muy poco,
dado el tamao del virus
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Utilidad
Su tropismo por clulas epiteliales los hace bastante verstiles. Estn siendo
utilizados para el desarrollo de terapia gentica para las dos enfermedades
pulmonares hereditarias ms frecuentes, la fibrosis qustica y la deficiencia de antitripsina.
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Ventajas
Desventajas
Utilidad
Representan un intento de imitar las funciones de los virus como vehculos de transferencia
gnica mediante sistemas sintticos, de forma que en principio son vectores mucho ms
seguros desde el punto de vista de su peligrosidad biolgica y su patogenicidad.
La principal limitacin de este tipo de vectores es que su eficacia in vivo es mucho menor que
la de los vectores virales. Esto se debe a la inestabilidad propia de sistemas sintticos
complejos y a las diferentes barreras que han de superar.
Los vectores no virales entran en las clulas por endocitosis, de manera que quedan
expuestos al ataque de las enzimas lisosomales. Para evitar esto, se intenta incluir en estos
vectores algn tipo de molcula que altere el pH del endosoma y consiga romperlo antes de
su fusin con los lisosomas y liberar as el complejo intacto al citoplasma. Una vez en el
citoplasma, estos complejos han de ser lo suficientemente estables como para llegar hasta el
ncleo, pues si el cido nucleico se libera muy pronto ser degradado por nucleasas
citoplasmticas. Pero si son demasiado estables, el cido nucleico no conseguir liberarse y
por tanto no podr entrar en el ncleo de la clula.
La inclusin en estos complejos de alguna molcula capaz de dirigirlos al ncleo celular
servira para acelerar su trnsito citoplasmtico. Por tanto, otro componente habitual en los
vectores no virales son las molculas con seales de localizacin nuclear que adems
permitan la entrada del cido nucleico a travs del complejo del poro nuclear, pues de lo
contrario slo sern capaces de ser efectivos en clulas que estn en mitosis.
Actualmente, los vectores no-virales ms utilizados son los siguientes:
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a) Plsmidos
ste es el mtodo ms simple de la transfeccin no viral. Consiste en la aplicacin localizada
de, por ejemplo, un plsmido con ADN desnudo. Varios de estos ensayos dieron resultados
exitosos. Sin embargo, la expresin ha sido muy baja en comparacin con otros mtodos de
transformacin. Adems de los ensayos con plsmidos, se han realizado ensayos con
productos de PCR, y se ha obtenido un xito similar o superior. Este logro, sin embargo, no
supera a otros mtodos, lo que ha llevado a una investigacin con mtodos ms eficientes de
transformacin, tales como la electroporacin, la sonicacin, o el uso de la biobalstica.
b) Oligonucletidos
Tiene como objetivo la inactivacin de los genes implicados en el proceso de la enfermedad.
Los mecanismos de estos vectores son la de oligonucletidos de secuencia antisentido y los
oligonucletidos de seuelo, descritos con anterioridad. Adems, oligonucletidos de ADN
monocatenario han sido utilizados para dirigir el cambio de un nica base dentro de la
secuencia de un gen mutante. Al igual que los mtodos de ADN desnudo, requieren de
tcnicas de transformacin para introducirse en la clula.
c) Cromosomas humanos artificiales
La creacin de Cromosomas Humanos Artificiales (HACs) estables es una de las
posibilidades que se baraja en la actualidad como una de las formas de introducir ADN
permanentemente en clulas somticas para el tratamiento de enfermedades mediante el
uso de la terapia gnica. Presentan una elevada estabilidad, adems de permitir introducir
grandes cantidades de informacin gentica.
d) Mtodos Fisicos
Los mtodos fsicos aumentan la permeabilidad de la membrana celular. Ejemplos de stos
tenemos:
- Biobalstica. Es el mtodo ms utilizado para transformar las clulas vegetales. Consiste en
propulsar los genes de inters dentro de las clulas con la ayuda de un can de ADN, con
lo cual se modifica el ADN de las clulas
Se utilizan microesferas de metal cubiertas de ADN (bolas de oro o tungsteno de un micrn
de dimetro). Se proyectan a enorme velocidad sobre las clulas que deben modificarse
con el fin de cruzar su pared. Estas bolas se retrasarn progresivamente cruzando las
distintas capas celulares. Algunas de las clulas alcanzadas van entonces a integrar
espontneamente los genes que se disparan en su genoma.
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Liposomas Aninicos: No son de mucha utilidad por la carga negativa que presenta
el ADN, esto hace que se repele la unin.
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Linfocitos: son clulas de larga vida media y fcil acceso (sangre perifrica).
Constituyen un blanco para terapias ex vivo de melanomas e inmunodeficiencias.
Hepatocitos: su transformacin en posible tanto ex vivo (es factible cultivar las clulas
y transplantarlas por la circulacin portal) como in vivo (se estn desarrollando
receptores proteicos especficos de hepatocitos).
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D. Mtodos de Transferencia
La transferencia de material gentico a las clulas diana puede hacerse dentro o fuera del
organismo. Segn el modo de hacer llegar el vector a las clulas diana, es ya clsica la
distincin entre terapia gnica ex vivo y terapia gnica in vivo.
En el primer caso, la administracin del vector se realiza fuera del individuo: se obtiene
una biopsia del rgano de inters, se expanden las clulas mediante cultivo celular y se
ponen en contacto con el vector mientras estn siendo cultivadas. Esto hace posible
seleccionar las clulas que hayan sido modificadas genticamente y re- introducirlas en el
paciente.
En la administracin in vivo, el vector teraputico se administra directamente al individuo
enfermo por cualquiera de las vas habituales (intramuscular, oral, intravenosa, intraportal,
subcutnea), escogiendo aquella que nos permita alcanzar la mxima eficacia teraputica.
Tipos de terapia gnica
Existen, en teora, dos tipos de terapia gnica: la Terapia Gnica de Clulas Somticas y la
Terapia Gnica de Clulas Germinales, aunque slo la primera est siendo desarrollada
actualmente.
La Terapia Gnica Somtica busca introducir los genes a las clulas somticas (esto es,
todas las clulas del organismo que no son gametos o sus precursores), y as eliminar las
consecuencias clnicas de una enfermedad gentica heredada o adquirida. Las generaciones
futuras no son afectadas porque el gen insertado no pasa a ellas.
La Terapia Gnica Germinal slo existe como posibilidad, pues no se cuenta con la
tecnologa necesaria para llevarla a cabo. Adems ha sido proscrita por la comunidad
cientfica y por organismos internacionales por sus implicaciones ticas. La terapia gnica
germinal tratara las clulas del embrin temprano, los vulos, los espermatozoides o sus
precursores. Cualquier gen introducido en estas clulas estara presente no slo en el
individuo, sino que sera transmitido a su descendencia.
Aplicacin de la Terapia Gnica en algunas Enfermedades
Actualmente, se ha ampliado el nmero de afecciones a ser tratadas mediante TG.
Entre las aplicaciones clnicas podemos mencionar:
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CONCLUSIN
La terapia gnica est cambiando a la humanidad. Cientificos de todo el mundo investigan
nuevas tcnicas y estrategias para elevar el nivel teraputico de la Terapia Gnica
La Terapia Gnica permite desarrollar protocolos para tratar las enfermedades genticas y
as disminuir la mortalidad que causa
Es costoso y los beneficiaros inmediatos son la industria farmacutica y los enfermos
Actualmente se utilizan como vectores para llevar los genes a las clulas afectadas, a
virus modificados de la familia de los retrovirus (incluye lentivirus) y los adenovirus,
tambin los adenoasociados. Si bien los virus que intervienen en esta terapia, estn
atenuados y no deberan producir ningn tipo de reaccin en el paciente. Los retrovirus
presentan una eficacia alta de trasferencia gnica y tienen la ventaja de que integran el
ADN transferido en los cromosomas de la clula tratada por lo que ofrecen estabilidad a
largo plazo. Sin embargo, presentan algunos inconvenientes de importancia. Los ms
destacados son que la integracin del ADN trasferido en los cromosomas de la clula se
realiza al azar por lo que podra interferir el funcionamiento de un gen sano. Por su parte
los adenovirus, virus que en estado natural provocan resfriados comunes, tienen como
principales ventajas que tambin presentan una eficacia alta de transferencia gnica,
pueden transportar genes grandes, de hasta 35 kb, y pueden infectar clulas que no se
dividan. Adems, son aptos para realizar terapia in vivo, ya que pueden transferirse
directamente a los tejidos del paciente.
Los principales inconvenientes en el uso de vectores virales radican en que no integran el
ADN en los cromosomas por lo que su efecto no es duradero, ya que los genes se pierden
cuando las clulas se dividen. Otro problema es que suelen provocar una importante
respuesta inflamatoria e inmunolgica. Adems, esta respuesta inmunitaria reduce la
eficacia de la terapia, al eliminar una buena parte de los virus que se usan para la
transfeccin.
La terapia genica a traves de vectores no virales es la mas segura y casi sin riesgo alguno
para el paciente, sin embargo, es debil en la penetracion del material genetico a la celula.
Creemos que un futuro esto se podra mejorar y asi llevar esta terapia a ser de mayor uso y
con menores riesgos para las personas.
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BIBLIOGRAFA
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