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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Departamento de Cincia dos Alimentos
Bacharelado em Qumica de Alimentos
Seminrios em Alimentos

Avanos na Cromatografia Lquida

Josiane Kuhn Rutz

Pelotas, 2009

JOSIANE KUHN RUTZ

AVANOS NA CROMATOGRAFIA LQUIDA

Trabalho acadmico apresentado ao Curso de

Bacharelado em Qumica de Alimentos da
Universidade

Federal

de

Pelotas,

como

requisito parcial da disciplina de Seminrios

em Alimentos.

Orientador: Fabrzio Barbosa

Pelotas, 2009

No deixe que a saudade sufoque, que a

rotina acomode, que o medo impea de
tentar, pois o medo nos afasta das
derrotas, mas das vitrias tambm.
(Autor desconhecido)

Resumo
RUTZ, Josiane Kuhn. Avanos na cromatografia lquida. 2009. 41f. Trabalho
acadmico (Seminrio em Alimentos) - Bacharelado em Qumica de Alimentos.
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Podendo ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras tcnicas
instrumentais de anlise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque entre os
mtodos analticos modernos, devido a facilidade em efetuar a separao,
identificao e quantificao de espcies qumicas. Trata-se de um mtodo fsicoqumico e fundamenta-se no deslocamento diferencial dos componentes de uma
mistura, devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis (fase mvel e
estacionria). Sendo um dos mais novos e mais importantes membros das tcnicas
de separao, a cromatografia lquida de alta eficincia utiliza pequenas colunas,
nas quais uma fase mvel lquida que bombeada a alta presso e elui sobre a fase
estacionria que est em seu interior, esta formada de partculas com dimetro de
3 a 10m, assim, os solutos com maior afinidade com a fase mvel sero eludos
primeiro e posteriormente os que tm maior afinidade com a fase estacionria.
Quanto menor o tamanho da partcula, maior ser a eficincia da coluna e maior a
resistncia vazo. As fases estacionrias mais utilizadas so as que contm
partculas de slica microporosa ligada covalentemente com grupos octadecil
(C18H37). O mtodo dispe de diferentes mecanismos de separao podendo ser de:
partio, adsoro, fase ligada, troca inica ou excluso de tamanho. Pode ser
efetuada em fase normal, fase estacionria polar e fase mvel apolar, ou em fase
reversa, fase estacionria apolar e fase mvel polar. O equipamento dotado de um
sistema de abastecimento e programadores da fase mvel, podendo esta ser
isocrtica ou de gradiente, bombas de alta presso, injetor, coluna, e detectores,
sendo o registro dos dados feito por um registrador, integrador ou mesmo um
microcomputador, que tambm utilizado na programao de todas as etapas do
processo.
Palavras-chave: Cromatografia. HPLC. Anlise Quantitativa. Separao

Lista de Figuras
Figura 1 - Tipos de cromatografia.....................................................................
Figura 2 - Etapas da cromatografia lquida clssica.........................................
Figura 3 - Etapas da cromatografia lquida de alta eficincia...........................
Figura 4 - Estrutura esquemtica da slica gel..................................................
Figura 5 - Reao de silanizao de um cloro-silano substitudo com silanol..
Figura 6 - Esquema de troca inica da cromatografia por troca inica............
Figura 7 - Esquema do cromatgrafo lquido....................................................
Figura 8 - Programador de fase mvel a baixa presso...................................
Figura 9 - Programador de fase mvel a alta presso......................................
Figura 10 - Bomba pneumtica.........................................................................
Figura 11 - Bomba recproca............................................................................
Figura 12 - Bomba do tipo seringa....................................................................
Figura 13 - Medidor de presso Bourbon ........................................................
Figura 14 - Medidor de presso do tipo transdutor de presso........................
Figura 15 - Vlvula rotatria de amostragem para HPLC.................................
Figura 16 - Tipos de colunas utilizadas em HPLC............................................
Figura 17 - Cromatograma tpico da separao dos tocoferis em amora-

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preta (Rubus sp) cv. Tupy, por HPLC, com coluna de fase reversa e detector
de fluorescncia a 290nm de excitao e de 330nm de emisso....................

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Lista de Tabelas
Tabela 1 - Principais caractersticas da CG e HPLC........................................
Tabela 2 - Tipos de fases estacionrias para HPLC........................................
Tabela 3 - Fases mveis e estacionrias mais utilizadas na CLL....................
Tabela 4 - Principais radicais R utilizados nas fases estacionrias de

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cromatografia lquida com fase ligada..............................................................

Tabela 5 - Classificao das colunas de separao.........................................
Tabela 6 - Detectores utilizados na HPLC........................................................

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Sumrio
1 Introduo...................................................................................................
2 Cromatografia.............................................................................................
2.1 Conceito e histrico..................................................................................
2.2 Tipos de cromatografia.............................................................................
3 Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)........................................
3.1 Histria e Conceito...................................................................................
3.2 Diferenas entre HPLC e a cromatografia lquida clssica (CLC)...........
3.3 Comparao da HPLC com a cromatografia gasosa (CG).....................
3.4 Fases........................................................................................................
3.4.1 Fase Mvel (FM)...................................................................................
3.4.2 Fase Estacionria (FE)..........................................................................
3.5 Mecanismos da HPLC..............................................................................
3.5.1 Lquido-lquido ou partio ...................................................................
3.5.2 Lquida com fase ligada........................................................................
3.5.3 Lquido-slido ou absoro...................................................................
3.5.4 Cromatografia por troca inica..............................................................
3.5.5 Cromatografia por excluso..................................................................
3.6 Equipamentos..........................................................................................
3.6.1 Sistema de abastecimento da fase mvel ............................................
3.6.2 Programadores de fase mvel..............................................................
3.6.3 Sistema de bombeamento....................................................................
3.6.4 Medidores e controladores de presso.................................................
3.6.5 Sistema de injeo da amostra.............................................................
3.6.6 Coluna...................................................................................................
3.6.7 Detectores.............................................................................................
3.6.8 Registro de dados.................................................................................
3.7 Aplicaes................................................................................................
4 Concluso...................................................................................................
Referncias....................................................................................................

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1 Introduo
Desde o incio do sculo passado a cromatografia vem sendo utilizada como
tcnica analtica, tendo seus mtodos aperfeioados com o passar dos anos.
Inicialmente era usada para separao de substncias coradas, de onde lhe deriva o
nome, mas atualmente a tcnica utilizada para separar uma grande variedade de

compostos, que s ocasionalmente apresentam colorao (LANAS, 1993;

GONALVES, 2001).
Diferentes critrios so utilizados para distinguir os mtodos cromatogrficos,
estes podem ser separados quanto ao mecanismo de separao, tcnica
empregada, tipo de fase utilizada e tipo de superfcie na qual ocorre a separao,
podendo ser cromatografia em coluna, quando ocorre dentro de um tubo, ou
cromatografia planar, quando ocorre em uma superfcie plana (LANAS, 1993).
A

cromatografia

em

coluna

divide-se

em

cromatografia

gasosa,

cromatografia com fludo supercrtico e cromatografia lquida, podendo esta ltima

ser classificada em cromatografia lquida clssica e cromatografia lquida de alta
eficincia, tema que ser abordado no presente trabalho (DEGANI ; CASS; VIEIRA,
1998).
Somente por volta dos anos 60 que a tecnologia permitiu o uso de colunas
empacotadas com partculas de dimetro da ordem de 3 a 10m, sendo fabricados
aparelhos sofisticados que trabalhassem a alta presso, ao contrrio do que
acontecia com as colunas de vidro simples da cromatografia lquida clssica, em que
a eluio da fase lquida era devido somente a ao da gravidade. Desde ento o
nome cromatografia lquida de alta eficincia comeou a ser utilizado para distinguir
esta nova tcnica

dos mtodos bsicos, que ainda so usados em anlise

preparativa (GONALVES, 2001).

Apresentar o histrico, assim como os mecanismos de separao,
equipamentos e aplicaes da cromatografia lquida de alta eficincia so os
principais objetivos deste trabalho.

2 Cromatografia
2.1 Conceito e histrico
Devido a facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao de
espcies qumicas, a cromatografia ocupa um lugar de destaque entre os mtodos
analticos modernos, podendo ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras
tcnicas instrumentais de anlise (COLLINS,1997).
Sendo a cromatografia um mtodo fsico-qumico, ela fundamenta-se na
migrao diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido a
diferentes interaes entre duas fases imiscveis, sendo uma fase fixa que tem uma
grande rea superficial chamada fase estacionria, e a outra um fluido que se move
atravs da fase estacionria sendo chamada de fase mvel (LANAS, 1993;
DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998).
Atribuida ao botnico russo Mikhael Semenovich Tswett, a descoberta da
cromatografia como tcnica analtica ocorreu em 1906, quando este descreveu sua
experincia na separao dos componentes de extrato de folhas. Neste estudo o
botnico conseguiu separar pigmentos de cloroplastos em folhas verdes de plantas,
onde usou uma coluna de vidro recheada com carbonato de clcio como fase
estacionria e ter de petrleo como fase mvel, ocorrendo a separao de
componentes em faixas coloridas, este fato deu origem ao nome de cromatografia
(chrom = cor e grafie = escrita) embora o processo no dependa da cor. Apesar de
estudos semelhantes terem sido desenvolvidos, Tswett foi o primeiro a compreender
e interpretar este processo como aceito atualmente, empregando o termo
cromatografia para descrever as zonas coloridas que se moviam dentro da coluna
(LANAS, 1993; DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998).
A tcnica cromatogrfica foi praticamente ignorada at a dcada de 30
quando foi redescoberta por Kuhn e Lederer que apefeioaram a cromatografia em
coluna, separando e identificando as xantofilas da gema de ovo, utilizando um
experimento semelhante ao de Tswett, com carbonato de clcio como fase
estacionria e ter de petrleo como fase mvel. Apartir da a cromatografia foi

aperfeioada e em conjunto com os avanos tecnolgicos esta foi levada a um alto

grau de sofisticao que resultou no seu grande potencial de aplicao em muitas
reas (LANAS, 1993; COLLINS,1997).
2.2 Tipos de Cromatografia
A classificao dos mtodos cromatogrficos pode ser quanto ao mecanismo
de separao, quanto a tcnica empregada e em relao ao tipo de fase utilizada.
No entanto, a classificao mais popular a que leva em considerao o tipo de
superfcie na qual ocorre a separao (Fig.1), sendo dividida em cromatografia em
coluna e cromatografia planar (LANAS, 1993).

Cromatografia

Planar
Camada
delgada

Coluna

Papel

Lquida

Clssica

Fludo
Supercrtico

Gasosa

HPLC

Figura 1 - Tipos de cromatografia.

Fonte: DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998.

2.2.1 Cromatografia em coluna

A separao ocorre no interior de um tubo de vidro ou metal. De acordo com
o estado fsico da fase mvel distingui-se a cromatografia gasosa, cromatografia
lquida e a cromatografia de fludo supercrtico (LANAS, 1993).

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2.2.1.1 Cromatografia gasosa

Neste mtodo a fase estacionria pode ser slida, com uma grande rea
superficial, ou lquida, onde uma pelcula delgada lquida recobre um slido inerte; e
a fase mvel um gs denominado gs de arraste, sendo este inerte tem a
finalidade de transportar as molculas a serem separadas. Assim, uma corrente de
gs elui continuamente pela coluna e quando a amostra vaporizada ela se introduz
nesta corrente sendo arrastada atravs da coluna (LANAS, 1993; BONATO, 1997).
2.2.1.2 Cromatografia lquida
A fase estacionria utilizada neste mtodo, como na cromatografia gasosa,
pode ser um slido ou um lquido e como fase mvel utiliza-se um lquido no qual o
soluto est dissolvido, assim, enquanto a fase mvel elui sobre a fase estacionria
os solutos so separados de acordo com a interao destes com as fases, sendo
eludo primeiro os que tm maior afinidade com a fase mvel e posteriomente os que
tm maior afinidade com a fase estacionria. A cromatografia lquida pode ser
dividida em:
Cromatografia lquida clssica (CLC): este mtodo utiliza colunas com
dimetros relativamente grandes, empacotadas com fases estacionrias finamente
divididas, pelas quais passam as fases mveis sob ao da gravidade. Separa
misturas bastante complexas, porm demorada e necessita que seja feito exame
qumico ou espectroscpico das fraes coletadas (VOGEL, 2002).
Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC): Utiliza colunas fechadas
que contm partculas muito finas que proporcionam separaes muito eficientes,
so utilizadas altas presses para forar a passagem do solvente e assim diminuir o
tempo da anlise (HARRIS, 2005).
2.2.1.3 Cromatografia com fludo supercrtico (CSC)
Neste mtodo um gs ou um lquido no estado supercrtico utilizado como
fase mvel, possuindo propriedades do solvente que se situam entre as de um
lquido e de um gs. Acima do ponto triplo existe uma presso na qual o lquido e o
vapor esto como fases separadas, acima do ponto crtico, independente da

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presso, existir apenas uma fase que chamada de fludo supercrtico. Quando
comparada com a cromatografia lquida este mtodo proporciona um aumento na
resoluo e na velocidade, pois o coeficiente de difuso do soluto maior em fludos
supercrticos, j em relao cromatografia gasosa este tem menor resoluo e
velocidade, mas capaz de dissolver solutos no-volteis (LANAS, 1993; HARRIS,
2005).
2.2.2 Cromatografia planar
A separao ocorre em uma superfcie plana, geralmente uma placa de vidro
ou metal, impregnado com a fase estacionria ou ento em uma folha de papel
embebida com um solvente apropriado. Este mtodo divide-se em cromatografia em
camada delgada e cromatografia em papel (LANAS, 1993).
2.2.2.1 Cromatografia em camada delgada
A separao consiste no deslocamento diferencial sobre uma camada
delgada de adsorvente retido sobre uma superfcie plana. O processo de separao
fundamenta-se na adsoro, mas quando so utilizadas fases estacionrias tratadas
pode ocorrer partio ou troca inica, podendo ento ser utilizada tanto na
separao de substncias hidrofbicas como hidroflicas (LOPES, 1997).
2.2.2.2 Cromatografia em papel
Classificada como cromatografia de partio, na qual a separao dos
componentes est relacionada com as diferentes solubilidades relativas destes
componentes nas fases mveis e estacionria. Os componentes que tm maior
solubilidade na fase estacionria so seletivamente retidos se movimentando mais
lentamente ao longo do papel, enquanto que os componentes com maior
solubilidade na fase mvel se movem mais rapidamente. Esta utiliza pequena
quantidade de amostra, tem boa capacidade de resoluo e preferencialmente
aplicada na separao e identificao de componentes polares (BRAGA, 1997).

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3 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

3.1 Conceito e histrico
Sendo um dos mais novos e mais importantes membros das tcnicas de
separao, a cromatografia lquida de alta eficincia tem sua aplicao considerada
indispensvel em vrios laboratrios. Ela utiliza equipamentos muito sofisticados que
podem ser totalmente automatizados. Neste mtodo so utilizadas pequenas
colunas, nas quais uma fase mvel lquida elui sobre a fase estacionria que est
em seu interior, sendo esta formada de materiais especialmente preparados;
emprega-se alta presso na separao dos componentes da amostra sendo capaz
de completar a anlise em alguns minutos (COLLINS; GUIMARES, 1997; CECCHI,
2003).
Inicialmente a cromatografia lquida utilizava colunas de vidro com dimetro
de 1 a 5cm e comprimento de 50 a 500cm, sendo o dimetro das partculas das
fases estacionrias slidas geralmente entre 150 a 200m, nessas condies as
vazes eram muito baixas, da ordem de alguns dcimos de milmetros por minuto,
tornando os tempos de separao muito longos. Na tentativa de acelerar o processo
foi utilizado bombeamento e aplicadas bombas de vcuo, o que no foi eficiente,
pois o aumento da vazo fazia com que aumentasse tambm a altura dos pratos
tericos. Alguns cientistas j haviam percebido, no incio do desenvolvimento da
cromatografia, que a diminuio das partculas da fase estacionria poderia
aumentar a eficincia da coluna, mas somente nos anos 60 foi possvel rechear as
colunas com partculas pequenas, necessrias para aumentar a resoluo, e
tambm, adquirir equipamentos que funcionam a alta presso, o que necessrio
para uma boa velocidade de eluio (COLLINS; GUIMARES, 1997; SKOOG;
HOLLER; NIEMAN, 2002).
O avano considervel da cromatografia lquida se deu por volta de meados
dos anos 60, sendo o primeiro cromatgrafo lquido de uso prtico construdo em
1964 por Csaka Horvath na Universidade de Yale. Este operava em presses de at
1000psi (6897kPa ou 6897bar), com fase mvel em gua tamponada passando por
colunas de 1mm de dimetro interno e com detector de espectrmetro de

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ultravioleta. As primeiras misturas separadas continham cidos nuclicos associados

funo da tireide (VOGEL, 2002).
3.2 Diferenas entre a HPLC e a cromatografia lquida clssica (CLC)
A cromatografia lquida clssica utiliza-se de um equipamento barato no qual
o empacotamento da coluna descartado, pois parte da amostra pode se adsorver
de forma irreversvel; a coluna deve ser cheia a cada separao acarretando
desperdcio de material e de mo-de-obra; o analista deve ser experiente; a eluio
feita pela ao da gravidade tornando o processo demorado; a quantificao e
deteco so feitas pela anlise manual das fraes individuais, o que requer muito
tempo devido ao grande nmero de fraes coletadas, tambm pode ser usada
alguma tcnica que auxilie neste processo, como, espectrofotometria, anlise
qumica ou registro gravimtrico e os resultados so registrados em forma de
cromatograma, um grfico da concentrao da amostra versus o nmero da frao.
Essas etapas podem se vistas na Fig. 2 (COLLINS; GUIMARES, 1997; CECCHI,
2003).
Preparao de
coluna

Aplicao de
Amostra

Eluio

Deteco e
Quantificao
Evaporar para
pesagem
Anlise Qumica
Espectrofotomtrica
Etc

Figura 2 - Etapas da cromatografia lquida clssica

Fonte: COLLINS; GUIMARES, 1997.
Na cromatografia lquida de alta eficincia (Fig.3) a coluna fechada,
podendo ser utilizada inmeras vezes; as colunas utilizadas so bastante eficientes,
mas oferecem resistncia vazo da fase mvel necessitando aplicao de
sistemas de bombas de alta presso, isso faz com que a velocidade da eluio
aumente. As anlises so mais precisas, pois a vazo da fase mvel facilmente
controlada. A injeo feita com microsseringas ou atravs de vlvulas de injeo e

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diversos tipos de detectores podem ser utilizados. Este mtodo no necessita tanta
experincia do operador; tem alta resoluo, sensibilidade e reprodutibilidade, mas
dispe de equipamentos caros e de alto custo de manuteno e operao
(COLLINS; GUIMARES, 1997; CECCHI, 2003).

Figura 3 - Etapas da cromatografia lquida de alta eficincia

Fonte: COLLINS; GUIMARES, 1997.
3.3 Comparao da HPLC com a cromatografia gasosa (CG)
Na cromatografia gasosa as amostras devem ser volteis, para que possam
passar pela coluna na forma de vapor, e termicamente estveis, a fim de que no se
decomponham nas condies da separao. Isso faz com que somente gases e
cerca de 20% dos compostos orgnicos possam ser analisados por este mtodo
sem que suas estruturas sejam modificadas para aumentar sua volatilidade. A
amostra no deve interagir com a fase mvel, por este motivo que a fase mvel um
gs inerte tendo como funo somente carregar a amostra volatilizada. Neste
mtodo os equipamentos so mais baratos e o tempo de anlise reduzido
(COLLINS; GUIMARES, 1997; CECCHI, 2003; ARAJO, 2004).
Na HPLC as amostras no precisam ser volteis nem termicamente estveis,
basta que sejam solveis na fase mvel, por isso tem uma maior aplicao. A
amostra interage com as duas fases, o que faz com que tenha maior variedade de
mecanismos de separao, enquanto que na CG a amostra s interage com a fase
estacionria. Este mtodo possui maior versatilidade, pois pode ocorrer a variao
tanto na fase mvel como na fase estacionria, o que ocorre no na CG, pois a fase
mvel sempre um gs inerte. As principais caractersticas de ambos os mtodos
esto descritos na tab.1 ( CECCHI, 2003; ARAJO, 2004).

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Tabela 1 - Principais caractersticas da CG e HPLC

Parmetros
Fase mvel
Fase estacionria
Tamanho da coluna
Fase do composto
- Injetado
- Detectado
Temperatura da coluna
Identificao dos picos
Quantidade mnima
detectvel
Detectores mais usados

CG
Gs inerte
Lquida ou slida
1,0 a 100,0m

HPLC
Lquida
Lquida ou slida
Menor que 30,0cm

Gs ou lquido
Gs
100 a 300C
Tempo de reteno

Lquido
Lquido
Ambiente a 65C
Tempo de reteno

10-12g
Ionizao em chama

10-9g
Absorbncia do UV

ou captura de eltrons
Pratos tericos por coluna
2.000 a 3000.000
Fonte: COLLINS; GUIMARES, 1997; ARAJO, 2004.

500 a 25.000

3.4 Fases
3.4.1 Fases Mveis (FM)
Para que um solvente possa ser utilizado como fase mvel na HPLC este
deve apresentar alto grau de pureza ou ser de fcil purificao; deve dissolver a fase
mvel sem decompor seus componentes, para que estes sejam transportados pela
coluna sem que haja modificao; no deve dissolver a fase estacionria; deve ser
compatvel com o detector; no ser txico e deve ter baixa viscosidade, pois isso ir
interferir diretamente na eficincia da separao, devido ao fato de solventes
viscosos alm de dificultarem a transferncia de massa entre a fase mvel e a fase
estacionria,

tambm

influenciarem

na

intensidade

da

vazo

(COLLINS;

GUIMARES, 1997).
Se durante a separao for empregado um nico solvente de composio
constante a eluio chamada de isocrtica. Mas algumas amostras que so
formadas de componentes que necessitam de uma separao por gradiente, para
que esta seja mais eficiente, requerem mudana na composio da fase mvel
durante a anlise, com a variao da proporo entre os solventes, que geralmente
diferem entre si na polaridade. A separao por gradiente tem as vantagens de
reduzir o tempo de anlise, aumentar a resoluo e reproduzir picos mais finos e
mais simtricos. Mas tambm apresenta as desvantagens de aumentar o custo, j

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que necessita de bomba com misturador; no ser compatvel com todos os

detectores, como por exemplo, com o detector de ndice de refrao; ter menor
estabilidade da linha de base pela variao da fase mvel e tambm pode degenerar
a coluna, sendo necessrio fazer a sua regenerao, pois a mudana na fora da
fase mvel no incio e no final da cromatografia grande (SKOOG; HOLLER;
NIEMAN, 2002; CECCHI, 2003).
Uma fase mvel adequada indispensvel para a HPLC, por isso
necessrio examinar fatores que determinam sua escolha, como a polaridade desta,
que determina seu poder de eluio juntamente com a polaridade da fase
estacionria e com a natureza dos componentes da amostra. Se a separao for
com fase normal, o poder de eluio aumenta com o aumento da polaridade, se a
separao for em fase reversa, o poder de eluio diminui com o aumento da
polaridade. Outros fatores que tambm devem ser considerados so o ponto de
ebulio, a viscosidade, a compatibilidade com o detector e a toxidez (VOGEL,
2002).
3.4.2 Fases Estacionrias (FE)
As fases estacionrias a serem utilizadas na HPLC devem ter alta resoluo
entre os componentes da amostra, devem ser de fcil introduo na coluna, ter
dimetro uniforme, partculas porosas ou peliculares e serem slidos rgidos, semirgidos ou no rgidos (COLLINS; GUIMARES, 1997; CECCHI, 2003).
As partculas da fase estacionrias podem ser classificadas quanto ao seu
tamanho em: macropartculas, quando apresentam dimetro entre 20 e 40m;
intermedirias, quando tem entre 20 e 10m; e micropartculas, de 3 a 10m. Quanto
menor for a partcula, maior ser a eficincia da separao, melhorando assim o
processo de difuso das molculas da amostra dentro e fora das partculas, pois
partculas menores reduzem a distncia de contato do soluto com as fases
estacionria e mvel, facilitando o equilbrio e, consequentemente, melhorando a
eficincia da coluna. Elas podem ser de formato esfrico, tambm chamado de
regular, e de formato irregular, sendo que as regulares so mais eficientes por
oferecerem um enchimento mais uniforme e mais reprodutvel da coluna e por esse
motivo so mais caras (CECCHI, 2003; ARAJO, 2004).

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De acordo com a natureza das fases mvel e estacionria pode-se classificar

o processo como: cromatografia em fase normal e cromatografia em fase reversa.
Cromatografia em fase normal: neste mtodo a fase estacionria utilizada
polar e a fase mvel apolar, em relao eluio, os solutos mais apolares so
eludos primeiramente, enquanto que os polares so retidos pela fase estacionria e
so eludos depois (VOGEL, 2002).
Cromatografia com fase reversa (FR): a fase estacionria apolar e a fase
mvel polar, portanto os compostos polares so eludos primeiro e os mais apolares
eludos posteriormente (VOGEL, 2002).
Sendo o material mais utilizado como empacotamento de colunas a slica,
que consiste principalmente em dixido de silcio (SiO 2) com o tomo de silcio no
centro de um tetraedro, sendo a valncia remanescente na superfcie ocupada por
uma hidroxila (-OH) (Fig. 4). Esta no deve ser utilizada em pH acima de 8,0, pois
isso acarretaria sua dissoluo, ento, para a cromatografia de compostos bsicos
com pH entre 8,0 e 12,0 recomenda-se o uso de compostos polimricos como
poliestireno, ligado covalentemente a fase estacionria (ARAJO, 2004; HARRIS,
2005).

Figura 4 - Estrutura esquemtica da slica gel.

Fonte: HARRIS, 2005.
Uma superfcie de slica tem cerca de 8mol de grupos silanol (Si-OH) por
metro quadrado, em pH entre 2,0 e 3,0 estes se encontram completamente
protonados e em uma ampla faixa de pH acima de 3,0 se dissociam em Si-O -, que se
ficarem expostos podem reter fortemente bases protonadas (como RNH 3+),
provocando a formao de caudas nos picos (HARRIS, 2005).

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A slica sozinha pode ser usada como fase estacionria para a cromatografia
de adsoro, j para sua utilizao na cromatografia de partio esta deve estar
quimicamente ligada, na qual dependendo do radical R esta pode ser utilizada como
fase normal ou fase reversa. A fase estacionria de octadecil (C 18) a mais utilizada
na cromatografia lquida de alta eficincia, sendo representada por ODS
(octadecilsilano) (HARRIS, 2005). Alguns tipos de fases estacionrias para HPLC
esto descritos na tab.2.
Tabela 2 - Tipos de fases estacionrias para HPLC
Descrio
Octadecil (C18)
Octil (C8)
Etil (C2)
Metil (C1)
Fenil (PH)
Cicloexano (CH)
Cianopropil (CN)
Diol ( 2 OH)
Slica (Si)
cido Carboxlico (CBA)
cido Propilsulfnico (PRS)
cido Benzenossulfnico (SCX)
Aminopropil (NH2)
Amina Primria/Secundria (PSA)
Dietilaminopropil (DEA)
Amina Quaternria (SAX)
cido Fenilbornico (PBA)
Fonte: ARAJO, 2004.

Polaridade/ interao
Altamente apolar
Moderadamente apolar
Fracamente apolar
Fracamente apolar
Moderadamente apolar
Moderadamente apolar
Moderadamente apolar/polar
Polar
Polar
Troca catinica fraca
Troca catinica forte
Troca catinica forte
Troca aninica fraca/polar
Troca aninica fraca/polar
Troca aninica fraca/polar
Troca aninica forte
Covalente

Como fase estacionria, alm da slica, podem ser utilizados slidos semirigdos, que geralmente, so constitudas de partculas porosas de poliestireno
entrecruzado com divinilbenzeno. Estes podem ser usados em HPLC por excluso
com fase mvel orgnica e ainda so muito utilizados na cromatografia por troca
inica (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).
Na cromatografia lquido-slido pode ser utilizada a alumina, alm da slica,
podendo esta tambm ser utilizada na cromatografia lquido-lquido, assim como o
vidro de porosidade controlada, carbono grafitizado, titnia, zircnia e slica
recoberta com zircnio (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).

19

3.5 Mecanismos da HPLC

3.5.1 Lquido-lquido ou partio
Com a finalidade de obter a separao de aminocidos, Martin e Synge, em
1941 desenvolveram a cromatografia lquido-lquido (CLL), utilizando como fase
estacionria gua em slica e como fase mvel clorofrmio (COLLINS, 1997). Este
mtodo preferencialmente utilizado na separao de compostos no-inicos,
polares e que apresentem de baixo a moderado peso molecular, sendo este
geralmente inferior a 3000 (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).
O mtodo consiste de uma fase lquida (estacionria) que por adsoro fsica
retida na superfcie da coluna empacotada geralmente com slica e de uma fase
mvel, tambm lquida, que passa sobre esta fase estacionria sendo uma destas
polar e a outra apolar. A separao baseia-se na solubilidade da amostra em relao
ao solvente (fase mvel) e a fase estacionria, sendo assim os componentes da
amostra que so mais solveis na fase mvel so eluidos primeiro enquanto os que
tm maior afinidade com a fase estacionria so seletivamente retidos por ela
(COLLINS; GUIMARES, 1997; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; VOGEL, 2002).
A desvantagem da CLL, que pode acarretar a deteriorao da coluna, a
solubilidade da fase estacionria na fase mvel, ocasionando a no reprodutibilidade
nas separaes repetitivas. A fim de solucionar este problema pode-se saturar a fase
mvel com a fase estacionria atravs de uma pr-coluna que contenha um
percentual elevado da substncia que compe a mesma, disposta antes do injetor;
ou tambm ligar a fase estacionria quimicamente ao material de suporte.
(COLLINS; GUIMARES, 1997).
A CLL pode ser dividida em cromatografia lquido-lquido normal (onde a fase
estacionria polar e a fase normal e apolar) e em cromatografia com fase reversa
(fase estacionria apolar e fase mvel polar). As fases mveis e estacionrias mais
utilizadas nestes mtodos esto descritas na tab. 3 (VOGEL, 2002).
Tabela 3 - Fases mveis e estacionrias mais utilizadas na CLL
Fases estacionrias
,

-oxidipropionitrila

Fases mveis
Normal
Carbowax Hidrocarbonetos saturados: hexano e heptano;

20

(400, 600, 750, etc.

solventes

aromticos:

Glicis (etileno, dietileno)

hidrocarbonetos saturados misturados (at 10%)

Ciano-etil-silicone

com

dioxano,

tolueno
metanol,

xileno;
etanol,

clorofrmio,cloreto de metileno.
Fase reversa
gua e misturas lcool-gua; acetonitrila e

Esqualano
Zipax-HCP

misturas acetonitrila-gua

Ciano-etil-silicone
Fonte: VOGEL, 2002.
3.5.2 Cromatografia Lquida com Fase Ligada
Tendo por objetivo solucionar o problema da perda da fase estacionria da
CLL surgiu cromatografia liquida com fase ligada (CLFL), na qual a fase
estacionria est quimicamente ligada superfcie de um suporte eliminando, assim,
o problema da solubilidade desta na fase mvel (COLLINS; GUIMARES, 1997).
Nesta forma de cromatografia as fases monomricas e polimricas se ligam a
uma vasta gama de materiais de suporte. As fases ligadas so geralmente
preparadas por reaes de silanizao. Na superfcie da slica que foi
completamente hidrolisada, por aquecimento com HCl 0,1M por um dia ou dois,
forma-se grupos silanis, estes grupos, posteriormente, iro reagir com cloro-silanos
substitudos formando as fases estacionrias quimicamente ligadas (sendo clorometil-silano amplamente utilizado), como pode ser visto na Fig. 5 (VOGEL, 2002).
CH3
Si

OH + Cl

Si
CH3

CH3
R

Si

Si

R + HCl

CH3

Figura 5 - Reao de silanizao de um cloro-silano substitudo com silanol.

Fonte: VOGEL, 2002.
De acordo com o grupo funcional que est ligado ao radical R que se
classifica quanto fase normal, quando este de natureza polar, e fase reversa,
quando este de natureza apolar, na tab. 4 esto descritas as principais sustncias

21

utilizadas como radical R tanto em fase normal como em fase reversa (SKOOG;
HOLLER; NIEMAN, 2002).
Tabela 4 - Principais radicais R utilizados nas fases estacionrias de cromatografia
lquida com fase ligada
Fase normal

Fase reversa

- C2H4CN (ciano)

Cadeia C8 (- octil)

-C3H6OCH2CHOHCH2OH (diol)

Cadeia C18 (-octildecil)

-C3H6NH2 (amina)
-C3H6N(CH3)2 (dimetilamina)
Fonte: SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002.
Os grupos silanis que no reagiram podem absorver molculas polares,
levando a mudanas nas propriedades cromatogrficas da fase ligada na
cromatografia com fase reversa, j que esta apresenta a fase estacionria apolar, ou
tambm pode ocorrer a formao de caudas nos picos cromatogrficos,
particularmente com solutos bsicos. Estes efeitos podem ser reduzidos pela
inativao de grupos silanis que so encapados pela reao com trimetilclorosilano, que em funo do seu tamanho menor, tem a capacidade de se ligarem a
muitos grupos silanis (VOGEL, 2002; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).

3.5.3 Lquido-slido ou absoro

Sendo introduzida inicialmente por Stwett no incio do sculo XX, a
cromatografia lquido-slido (CLS) a forma mais clssica da cromatografia lquida e
devido a recentes adaptaes tornou-se o mais importante membro dos mtodos de
HPLC (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).
Este tipo de cromatografia baseia-se na competio entre as molculas do
soluto e do solvente pelos stios ativos do adsorvente, estando relacionada com a
interao entre os grupos funcionais das partculas do suporte da fase estacionria e

22

os grupos polares das molculas do soluto (ARAJO, 2004). Primeiramente uma

molcula da fase mvel passa a ser deslocada da superfcie para que possa ser
adsorvida pela fase estacionria, levando em considerao que esta possui uma
superfcie polar ela ter pouca afinidade com grupos apolares que no sero retidos
por no terem sido deslocados da fase mvel (COLLINS; GUIMARES, 1997).
As fases estacionrias devem permitir a interao diferencial com os
componentes da amostra a serem separadas. As principais interaes responsveis
pela adsoro so as de Van de Waals, eletrosttica, pontes de hidrognio e
interaes hidrofbicas. Os grupos que so capazes de formar pontes de hidrognio
sero fortemente retidos pela superfcie do adsorvente assim como as molculas
polarizveis que iro apresentar a interao dipolo dipolo-induzido, portanto o grau
de reteno depende da polarizao de cada molcula ou grupo funcional, sendo
que compostos que contm grupos funcionais polares sero fortemente retidos pelo
adsorvente polar e, portanto, eludos por ltimo, enquanto que com os solutos
apolares ocorrer o contrrio (COLLINS; GUIMARES, 1997; ARAJO, 2004;
SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).
Geralmente se usa como adsorvente, um slido ativo com grande rea
superficial, os mais comumente usados so a slica e a alumina. Um aspecto que
deve

ser

considerado

que

adsorventes

muito

ativos

podem

adsorver

irreversivelmente o soluto sendo que a slica que ligeiramente cida pode reter
fortemente solutos bsicos e a alumina que bsica no deveria ser usada em
cromatografia de compostos sensveis a bases (VOGEL, 2002).
A escolha do solvente de extrema importncia neste mtodo devido ao fato
deste competir com o soluto pelos stios ativos do adsorvente, pois quanto mais forte
a interao da fase mvel com a estacionria, menor a adsoro do soluto. Os
solventes so classificados de acordo com sua srie eluotrpica, ou seja, sua
capacidade de absoro, que so utilizadas na escolha do melhor solvente a ser
utilizado para uma determinada separao. Este tambm deve ser puro, pois
impurezas podem afetar tanto a eficincia da coluna como a deteco (VOGEL,
2002).
Muito apropriada para compostos apolares que tem pesos moleculares
menores do que 5000, geralmente mais apropriada para amostras que so
solveis em solventes apolares, utilizando fase normal (GONALVEZ, 2001).

23

3.5.4 Cromatografia por troca inica

Para resolver o problema de separao de terras raras e da concentrao de
ons transurnio necessria para o desenvolvimento das primeiras armas nucleares,
no incio dos anos 40, foi desenvolvida a cromatografia de troca inica. Sua
aplicao em HPLC comeou em 1975 com o desenvolvimento de trabalhos de uma
tcnica de suspenso do eluente que tornou possvel a deteco condutomtrica dos
ons eludos na Dow Chemical Company (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).
A Cromatografia por troca inica um mtodo de absoro que baseia-se na
interao eletrosttica entre o soluto e a fase estacionria, buscando o equilbrio de
troca entre ons em soluo e ons de mesmo sinal na superfcie de um slido que
deve ser insolvel e de alto peso molecular. A amostra a ser separada geralmente
uma soluo aquosa contendo ons orgnicos e inorgnicos; na superfcie da fase
estacionria ctions e nions so covalentemente ligados e ons so trocados com a
fase mvel, separando assim os ons que no interagem com a resina daqueles que
se ligam com os grupos carregados (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; ARAJO,
2004).
A fase estacionria utilizada neste mtodo, geralmente, uma resina de
poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno a qual so ligados os grupos inicos.
As trocas podem ser catinicas ou aninicas o que depende da natureza da fase
estacionria. Os stios ativos mais comuns para as resinas trocadoras de ctions so
o grupo cido sulfnico -SO3-H+, um cido forte, e o grupo cido carboxlico -COO -H+,
um cido fraco; e para os trocadores de nions so os que contm grupos amina
tercirias -N(CH3)3+OH-, base forte, e aminas primrias N3+OH-, base fraca. Os
grupos inicos possuem contra-ons que so deslocados por ons de carga similar da
fase mvel. Nas trocas catinicas, as resinas possuem stios ativos negativos e
contra-ons com carga positiva, de forma que os ctions da resina sejam trocados
pelos ctions da amostra; nas trocas aninicas, ocorre o contrrio, os stios ativos da
resina tm carga positiva e o contra-on tem carga negativa permitindo a troca destes
com a fase mvel. O esquema das trocas catinicas e aninicas pode ser
visualizado na Fig.6 (COLLINS; GUIMARES, 1997; SKOOG; HOLLER; NIEMAN,
2002; ARAJO, 2004).
X-

R + Y-

Y-

R+ X- (troca aninica)

24

X+

R-Y+

Y+

R- X+ (troca catinica)

Figura 6 - Esquema de troca inica da Cromatografia por Troca Inica

Fonte: ARAJO, 2004.
Atravs da alterao do pH ou aumento da troca inica, que leva ao
enfraquecimento das interaes eletrostticas, a fase mvel deve ser modificada,
afim de eluir o soluto da resina (ARAJO, 2004).
Geralmente os compostos que so separados por este mtodo so cidos
carboxlicos, bases orgnicas, peptdeos e aminocidos, que podem se ionizar em
solues com pH devidamente tamponado, bem como nions inorgnicos e ctions
metlicos ou complexos (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).
3.5.5 Cromatografia por excluso
Geralmente utilizada na separao de componentes de alto peso molecular,
a cromatografia por excluso (CE) baseia-se na separao de acordo com o
tamanho efetivo das molculas. Este mtodo subdividido em cromatografia por
filtrao em gel (GFC) e cromatografia com permeao em gel (GPC). A GFC
utilizada na separao de espcies solveis gua (polares) sendo a fase
estacionria hidroflica, na GFC os solventes utilizados so orgnicos apolares e
fases estacionrias hidrofbicas, o que torna o mtodo complementar sendo que
podem ser analisadas substncias polares e apolares (SKOOG; HOLLER; NIEMAN,
2002; VOGEL, 2002).
Pelo fato de no haver interaes fsicas ou qumicas entre o soluto e a fase
estacionria, a CE difere dos demais mtodos cromatogrficos. O principal
mecanismo de reteno das molculas do soluto a penetrao diferenciada destas
no interior das partculas do gel. A coluna empacotada com matria inerte com
poros de tamanho controlado, ao entrar em contato com a fase estacionria as
molculas pequenas ficam retidas no interior de seus poros apresentando maior
tempo de reteno sendo eludas mais lentamente pela fase mvel, enquanto que as
molculas maiores, que no conseguiram penetram nos poros, so carregadas pela

25

fase mvel, tendo, portanto, menor tempo de reteno (COLLINS; GUIMARES,

1997; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; VOGEL, 2002).
Utiliza-se este mtodo na separao de materiais orgnicos e inorgnicos,
mas sua maior utilidade no estudo de biomolculas ou de compostos com alto grau
de polimerizao. O material utilizado no empacotamento da coluna deve ser com
estrutura rgida a fim de facilitar o empacotamento, e que sejam capazes de suportar
as presses elevadas da cromatografia lquida de alta eficincia. Geralmente o
empacotamento da coluna para este mtodo e feito por leito de polmeros e
partculas de slica, ambos com dimetro de 5 a 10m (SKOOG; HOLLER; NIEMAN,
2002; VOGEL, 2002).
3.6 Equipamentos
A instrumentao bsica de um cromatgrafo lquido consiste nos seguintes
componentes (Fig.7): Reservatrio do solvente, bomba de alta presso, misturador
de solventes, injetor, microsseringas, loop, coluna, detector, coletor de solvente,
registrador e sistema computadorizado para coleta de dados (ARAJO, 2003).
Coletor de solvente

Reservatrio do
solvente

Coluna
Sistema computadorizado
de coletor de dados

Microsseringa

Cmara de
mistura Injetor
Detector
Registrador
loop
Bomba de alta
presso

Figura 7 - Esquema do cromatgrafo lquido.

Fonte: ARAJO, 2003.
3.6.1 Sistema de abastecimento da fase mvel
O abastecimento da fase mvel equipado com um ou mais reservatrios
que podem ser de vidro, o prprio recipiente do solvente; de plstico, desde que este

26

seja inerte; ou de ao inoxidvel, sendo que este no apropriado para fases

mveis tamponadas em pH baixo, pois poder ocorrer a corroso do recipiente
(CECCHI, 1999; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; SCOTT, 2003).
Fases mveis como a gua e outros solventes polares tm tendncia em
dissolverem gases como oxignio e nitrognio, se estes gases forem libertados
dentro do equipamento podem formar bolhas na coluna e no sistema de deteco
essas bolhas podem causar o espalhamento de banda e interferir na eficincia do
detector, por este motivo os solventes devem ser desgaseificados, o que pode ser
feito atravs de sistemas de bomba de vcuo, de sistemas de destilao, de
dispositivos de aquecimento e agitao do solvente, sob a ao de ultra-som e
tambm atravs do sistema de borbulhamento que geralmente feito com gs hlio,
por ser um gs inerte e de baixa solubilidade (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002;
SCOTT, 2003; POMBEIRO, 2003).
Alguns sistemas contem tambm filtros a fim de impedir que a poeira e
materiais particulados no solvente que causem danos no sistema de bombeamento e
de injeo e entupimento da coluna. No necessariamente os desgaseificadores e
filtros devem fazer parte do equipamento, um mtodo bastante eficiente passar os
solventes em filtros milipore sob vcuo, antes de introduzi-los no recipiente, o que
ocasiona a remoo dos gases e materiais em suspenso (COLLINS; GUIMARES,
1997; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).
3.6.2 Programadores de fase mvel
Quando se utiliza a eluio por gradiente necessria mudana na
composio da fase mvel, que feita por programadores de fase mvel. Os
solventes utilizados apresentam diferentes polaridades variando a porcentagem
destes em mistura binria, ternria ou quaternria, aumentando a fora
cromatogrfica da FM, fazendo assim, com que picos retidos eluam mais
rapidamente. Tambm podem ser utilizados em misturas isocrticas, em que a fase
mvel apesar de ter uma concentrao contnua, formada por mais de um
solvente.

Para

que

programao

seja

automtica

so

empregados

microcomputadores. Existem dois tipos de programadores: a baixa e a alta presso

(JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).

27

Nos programadores de baixa presso (Fig. 8) os reservatrios de solventes

esto dispostos em ordem crescente de polaridade e os solventes so misturados
antes da bomba. Atravs de uma vlvula ligada ao reservatrio do solvente se faz o
gradiente, sendo que esta programada para ficar aberta at que saia o volume
desejado dos solventes, que sero misturados presso atmosfrica em uma
cmara com agitao magntica, posteriormente so enviados a uma bomba de alta
presso, passando pelo injetor, coluna e detector (JARDIM; COLLINS; GUIMARES,
Controlador do
sistema

2006).
C

Cmara de
mistura

Injetor
Vlvulas

Bomba de alta
presso

Reservatrio do
solvente

Figura 8 - Programador de fase mvel a baixa presso

Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.
Nos programadores de alta presso (Fig. 9) diferentes solventes alimentam
diferentes bombas. A vazo de cada bomba modificada para produzir os mais
variados tipos de gradientes. Os solventes so liberados pelas bombas estando
estes a alta presso e vo para uma cmara de pequeno volume onde so
misturados por agitao magntica, sendo encaminhados posteriormente ao injetor,
coluna e detector (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).
Controlador do
sistema

Injetor
Cmara de
mistura
Bomba de alta
presso
Reservatrio do
solvente

Figura 9 - Programador de fase mvel a alta presso

Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.

28

3.6.3 Sistema de bombeamento

Devido ao fato de trabalhar com colunas de partculas muito reduzidas, a
cromatografia lquida de alta eficincia necessita que o fluxo da fase mvel seja
constante e a alta presso o que se consegue atravs de um sistema de
bombeamento eficaz. A utilizao de alta presso necessria, pois partculas
exercem alta resistncia ao fluxo da fase mvel e se no fosse utilizada a anlise
seria muito lenta. O fluxo deve ser constante para garantir a reprodutibilidade,
sensibilidade e resoluo da anlise. Utiliza-se tambm o sistema de bombeamento
para fazer gradiente de eluio quando os compostos apresentam fator de
separao muito prximo (CECCHI, 2003).
Alguns aspectos importantes para o sistema de bombeamento so: presso
mxima de 600bars, vazo contnua, intervalos de vazo de 0,1 a 1mL/min,
reprodutibilidade e constncia da vazo de 1% e inrcia qumica a solventes comuns
(COLLINS; GUIMARES, 1997).
Levando

em

considerao

desempenho

caractersticas

de

funcionamento, existem basicamente dois tipos de bombas, as pneumticas e as

mecnicas (COLLINS; GUIMARES, 1997).
3.6.3.1 Bombas pneumticas
Neste tipo de bombas um gs inerte exerce uma presso deslocando o
lquido de forma contnua, a presso pode ser diretamente sobre o lquido ou sobre
um recipiente onde o mesmo est contido. Essas bombas so baratas e fornecem
um fluxo que no sujeito a pulsaes, sendo que o fluxo total depende do fluxo do
gs e a presso depende do gs usado e do recipiente. Ela pode ser vista na Fig.10
(PIZZOLATO, 2001).

Para a
coluna

29

Reservatrio da
fase mvel

Anel Hermtico

Gs

Figura 10 - Bomba pneumtica.

Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.
3.6.3.2 Bombas mecnicas
As bombas mecnicas podem ser divididas em bombas recprocas e
bombas tipo seringa:
Bombas recprocas: Consiste de uma pequena cmara na qual o solvente
bombeado pelo deslocamento de um pisto controlado por um motor, desloca fluxos
de volume constante, porm de forma descontnua, ou seja, em pulsos. Esse tipo de
bomba pode ser visto na Fig.11 (PIZZOLATO, 2001; SKOOG; HOLLER; NIEMAN,
2002).

Para a
coluna

Anel Hermtico

Vlvulas
unidirecionais

Do reservatrio da
fase mvel

30

Figura 11 - Bomba recproca.

Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.

Bombas do tipo seringa: Tambm chamadas de bombas de deslocamento

contnuo (Fig.12), nessas bombas so formadas por um pisto que se move por
ao de um mecanismo de rosca, sustentado por um motor, o fluxo contnuo e sem
pulsaes, porm tem capacidade total limitada, devendo parar para o enchimento
aps o fornecimento de uma relativamente baixa quantidade de solvente (SKOOG;
HOLLER; NIEMAN, 2002; POMBEIRO, 2003).

31

Para a
coluna

Reservatrio da
fase mvel
Anel Hermtico

Motor

Figura 12 - Bomba do tipo seringa.

Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.
3.6.4 Medidores e controladores de presso
Problemas no equipamento, como entupimentos ou vazamentos, podem ser
diagnosticados pelos monitores de presso, que tambm podem ser utilizados para
aperfeioar a separao. Dois tipos de medidores de presso podem ser utilizados:
Bourbon ou diafragma (Fig.13) e transdutor de presso (Fig.14).
Bourbon ou diafragma: no qual um tubo de ao inoxidvel flexvel
preenchido com um lquido viscoso abaixa presso, se expande com o aumento da
presso da FM que vai da bomba para a coluna, essa expanso desloca o ponteiro
acusando o aumento da presso.

Figura 13 - Medidor de presso Bourbon

Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006

32

Transdutor de presso: Ao ir da bomba para a coluna a fase mvel exerce

uma presso em uma membrana, que sentida no transdutor convertendo a
presso em corrente eltrica, cujo valor medido.

Figura 14 - Medidor de presso do tipo transdutor de presso.

Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.
3.6.5 Sistema de injeo da amostra
Para se obter uma boa eficincia em anlises cromatogrficas, um fator
muito importante a se considerar a maneira como se introduz a amostra na coluna.
A injeo deve ser reprodutvel e ter grandes variedades de volumes, assim como
no deve introduzir bolhas. Esta parte do instrumento necessita de um cuidadoso
desenho, pois devem resistir a altas presses e suas cavidades devem ser
completamente lavadas pela fase mvel. Duas so as formas de injeo da amostra:
com microsseringas e com vlvula rotatria, sendo esta de injeo automtica
(PIZZOLATO, 2001; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).
O injetor do tipo seringa apresenta a vantagem de ser mais barato, porm
de baixa reprodutibilidade e necessita de um septo para evitar o retorno da amostra
e do mbolo para fora do injetor. O sistema de injeo mais utilizado o da vlvula
rotatria, pois alm de ser reprodutvel, elimina o problema de retorno da amostra.
Neste sistema o volume injetado no necessita ser preciso, pois a vlvula rotatria
tem uma ala capilar amostradora (loop) capaz de selecionar volumes de 1 a 100 L
de amostra, sendo o excesso levado para fora do equipamento. Na Fig. 15 pode ser
visualizado o mtodo de injeo da amostra com a vlvula rotatria. Na posio de
carregar (Fig.15 a) um determinado volume de amostra carregado enquanto a fase
mvel vai direto para a coluna, a rotao da posio geralmente feita
manualmente, assim na posio injetar (Fig.15 b), mudam-se as conexes, fazendo
com que a fase mvel passe pela ala de amostragem e arraste a amostra para a
coluna (CECCHI, 2003; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).

33

a: posio para carregar

b: posio para injetar

Figura 15 - Vlvula rotatria de amostragem para HPLC.

Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.

3.6.6 Coluna
Em um cromatgrafo lquido podem ter trs tipos de colunas, a coluna se
saturao, a coluna de guarda e a coluna analtica, como pode ser visto na Fig. 16.

Coluna de
saturao

Coluna de
guarda

Coluna
analtica

Figura 16 - Tipos de colunas utilizadas em HPLC.

Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.
3.6.6.1 Coluna de saturao
Tambm chamada de pr-coluna, colocada entre a bomba e o injetor
sendo usada pra condicionar a fase estacionria. Muito empregada no passado

34

quando se utilizava a cromatografia lquido-lquido com a finalidade de saturar a fase

mvel com o lquido da fase estacionria, no sendo to necessria atualmente
devido ao grande desempenho das fases estacionrias quimicamente ligadas. Mas
ainda pode ser utilizada quando se usam recheios a base de slica e uma fase mvel
que dissolve este material, tendo este efeito aumentado com o aumento da
temperatura, polaridade, fora inica e pH da fase mvel, de modo que a fase mvel
estando saturada com fase estacionria, no ir reagir com a fase estacionria
contida na coluna. Pode ser usada tambm para reter impurezas da fase mvel a fim
de preservar a coluna (CECCHI, 2003; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).
3.6.6.2 Coluna de guarda
Colocada entre o injetor e a coluna analtica, esta possui normalmente de 2 a
5cm e tem o mesmo dimetro interno e fase estacionria da coluna analtica.
utilizada para prevenir que impurezas e compostos fortemente retidos, contaminem a
coluna de separao, aumentando assim seu tempo de uso, portanto a coluna de
guarda deve ser renovada com certa freqncia, pois satura rapidamente. Devido ao
seu pequeno tamanho, em relao ao tamanho da coluna analtica, o custo das
diversas trocas desta ainda muito menor do que uma nova analtica, que
deteriorada rapidamente quando no se usa a coluna de guarda (CECCHI, 2003;
JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).
3.6.6.3 Coluna analtica
Esta deve ser constituda de algum material inerte, de dimetro uniforme,
capaz de resistir s presses que sero usadas. O material mais utilizado o ao
inoxidvel, mas tambm podem ser constitudas de vidro reforado e slica fundida,
sendo esta ltima mais utilizada na confeco de colunas capilares. As mais usadas
apresentam dimetro interno de 4,6mm, comprimento de 250mm e so recheadas
com partculas porosas com dimetro de 5m. A escolha da coluna feita em funo
da sua capacidade, que determinada por suas dimenses, material de
empacotamento, comprimento e dimetro interno. Dependo do dimetro interno as
colunas podem ser classificadas de diferentes formas, como descreve a tab.5
(CECCHI, 2003; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).

35

Tabela 5 - Classificao das colunas de separao

Nome

Comprimento

Dimetro

Vazo

Tamanho de

Colunas

(cm)
3-10

interno (mm)
2-6

(l min-1)
1.000-5.000

partcula (m)
3

Rpidas
Convencional

5-30

2-6

1.000-3.000

3; 5; 10

ou analtica
Small bore ou

10-100

1-2

5-200

1; 3; 5

microbore
Capilar

20-200

0,1-0,5

0,1-20

1; 3

recheada
Capilar

10-10.000

0,02-0,1

0,1-2

1; 3

0,05-2
>1.000

a
>10

semipermevel
Capilar aberto
100-10.000
0,01-0,075
Preparativa
>20
>10
a: Filme lquido ligado nas paredes.
Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.
3.6.7 Detectores

Tendo como funo monitorar o fluxo da fase mvel na sada da coluna, o

detector mede de forma contnua propriedades fsicas ou fsico-qumicas da amostra,
ou da soluo que a contm enviando um sinal para registro que , geralmente,
diretamente proporcional concentrao do componente na amostra. O detector
ideal aquele que apresenta as seguintes caractersticas:

ter alta sensibilidade: detectar pequenas quantidades de

amostra;

ser estvel: insensvel a variaes de temperatura e de

fluxo, no caso de eluies com gradiente;

linearidade: o sinal deve manter uma relao linear com a

concentrao da amostra;

uma leitura contnua;

resposta universal: capaz de trabalhar com todos os tipos

de amostra (PIZZOLATO, 2001; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).

36

Os detectores dividem-se em duas grandes classes: detectores de

propriedades macroscpicas, que so aqueles que medem as alteraes de
propriedades fsicas provocadas pelo soluto na fase mvel; e detectores de
propriedades do soluto, que so aqueles que respondem a uma dada propriedade
qumica ou fsica do soluto e so, idealmente, independentes da fase mvel. Os tipos
de detectores esto descritos na tab.6. Em HPLC os detectores mais empregados
so os de espectrofotomtricos (UV ou fluorescncia), condutomtricos e
refratomtricos (VOGEL, 2002; NETO; NUNES, 2003).
Tabela 6 Detectores utilizados na HPLC
Detector

Limite de

Gradiente

Aplicao

Ultravioleta
ndice de refrao
Espalhamento de luz
Eletroqumico
Fluorescncia
Espectrometria de massas
Infravermelho com

deteco (ng)
0,1-1
100-1000
0,1-1
0,01-1
0,0001-0,01
0,1-1
1000

Sim
No
Sim
No
Sim
Sim
Sim

Seletivo
Universal
Alta massa molar
Seletivo
Seletivo
Universal
Seletivo

transformada de Fourier
Fonte: VOGEL, 2002; HARRIS, 2005.
3.6.8 Registro de dados
Os dados obtidos pelos detectores, podem ser registrados ou manipulados
atravs de um registrador, um integrador ou um microcomputador. O integrador
fornece o tempo de reteno de cada pico, a rea de cada um e a rea total de todos
eles. Para aumentar a versatilidade, exatido e preciso da cromatografia lquida de
alta eficincia utilizam microcomputadores, que alm de processar os dados obtidos
pelo detector, armazenado-os, podem controlar a composio da fase mvel, a
vazo que sai da bomba, a injeo da amostra, a temperatura da coluna, podendo
diagnosticar possveis problemas (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).
3.6.8.1 Identificao e quantificao
A identificao dos componentes de uma amostra feita atravs da
comparao dos cromatogramas obtidos com padres, nestes padres o

37

componente em questo eludo nas mesmas condies da amostra a ser

analisada, tendo a formao de um pico em um determinado tempo chamado de
tempo de reteno, sendo assim os componentes so identificados pelo tempo de
reteno. Os cromatogramas (Fig. 17) so grficos do tempo em minutos pela
resposta do detector.

Figura 17 Cromatograma tpico da separao dos tocoferis em amora-preta

(Rubus sp) cv. Tupy, por HPLC, com coluna de fase reversa e detector de
fluorescncia a 290nm de excitao e de 330nm de emisso.
Fonte: CHIM, 2008.
Os padres so obtidos comercialmente e so analisados em diferentes
concentraes, formando assim uma curva de calibrao, esta trata-se de um grfico
da concentrao do componente pela rea do pico obtido. Atravs desta pode-se
quantificar os componentes da amostra quando se obtm a rea dos picos.

3.7 Aplicaes

38

A cromatografia lquida de alta eficincia tem uma ampla aplicao na

anlise de alimentos na quantificao de compostos. Alguns exemplos mais comuns
so:

Vitaminas hidrossolveis como as do Complexo B como B5, B1, B2, B6

e niacina (MORESCHI; MURADIAN, 2007; PRESOTO; ALMEIDA-MURADIAN,

2008).

Vitaminas lipossolveis, como -tocoferol, precursor da Vitamina E; -

caroteno, precursor da vitamina A e a vitamina K (JAKOB; ELMAFDA, 2000; OTLES;

CAGINDI, 2005; GIMENO et al, 2000)

Antocianinas (LIMA et al., 2006)

Carotenides (DELLA LUCIA, et al., 2008)

Compostos fenlicos (ABE et al., 2007)

Lipdios (VILA NOVA, 2005; BAGGIO; BRAGAGNOLO, 2008)

Acares (DRUZIAN; DOKI; SCAMPARINI, 2005)

Hidrolisados proticos (BIZZOTTO, 2006; BIASUTTI, 2008)

39

4 Concluso
A cromatografia lquida de alta eficincia um dos mais modernos mtodos
cromatogrficos, que se destaca entre os demais devido ao fato de ser capaz de
quantificar uma ampla variedade de compostos que, por exemplo, no poderiam ser
analisados utilizando a cromatografia gasosa, devido ao fato de que estes
necessitam apenas ser solveis na fase mvel, o que o torna de fato extremamente
vantajoso na anlise de alimentos. Ela vem sendo aprimorada com o passar dos
anos a fim de se tornar um mtodo cada vez mais eficaz na separao e
quantificao de compostos. Seus equipamentos so de alto custo, mas se for
levado em considerao quantidade de anlises que se pode efetuar, um
investimento que trs retorno, sendo assim seu emprego em vrios laboratrios vem
se tornando indispensvel.

40

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