SPIS TRESCI Skréty vit Przedmowa XI Od redaktoréw naukowych wydania polskiego XI Sekeja A - Organizacja komérki 1 Al Prokariota 1 ‘A2_ Eukariota 4 A3. Mikroskopia ut Ad Rozdzielanie struktur komérkowych i komérek 7 Sekcja B - Aminokwasy i bialka 23 BI Aminokwasy 23 B2_ Kwasy i zasady 28 B3_ Struktura bialka 33 Bd Mioglobina i hemoglobina 44 BS Kolagen 52 B6 Qczyszczanie bialek 59 B7 Chromatografia bialek 63 BS. Elektroforeza bialek 68 B9_ Sekwenconowanie bialek i synteza peptydéw 74 Sekeja C - Enzymy 81 Cl Wprowadzenie do enzyméw. 81 C2. Termodynamika 90 C3 Kinetyka enzymow 95 C4 Inhibicja enzyméw 101 C5. Regulacja aktywnosci enzymatyczne} 105 Sekeja D - Przeciweiata 113 D1 Ukiad odpornosciowy 113 D2 Struktura przeciweial u7 D3. Przeciwciala poliklonalne i monoklonalne 121 D4 Synteza przeciwcial 123 D5. Przeciwciala jako narzedzia badaweze 128 Sekeja E - Blony 133 E1_Lipidy blonowe 133 E2_ Biatka blonowe i weglowodany 141 E3_ Transport malych czasteczek 149 E4 Transport makroczasteczek 158 ES. Przeksztatcanie sygnalu 160 Sekeja F - Struktura i replikacja DNA 167 Fl Struktura DNA 167 F2_ Chromosomy 172 F3 Replikacja DNA u bakterii 77 F4 Replikacja DNA w komérkach eukariotyeznych 183 Sekcja G ~ Synteza i dojrzewanie RNA 189 G1 Struktura RNA 189 32. Transkrypcja w komérkach prokariotycznych 191 3. Operon laktozowy (lac) 196 G4 Operon tryptofanowy (trp) 201 G5 Transkrypeja u eukariotéw — wiadomosci podstawowe 205vi Spis tres G6 Transkrypcja eukariotyeznych genéw kodujacych biatka G7 Regulacja transkrypeji prowadzonej przez polimeraze RNA Il G8_Dojrzewanie pre-mRNA u eukariotow G9_Rybosomowy RNA G10 Transportujacy RNA Sekcja H — Synteza biatka H1 Kod genetycny H2 Synteza bialka (translacja) u prokariotéw H3_Synteza bialek (translacja) u eukariotow H4 Kierowanie bialek HS Glikozylacja bialek Sekeja I - Rekombinacyjna technologia DNA 11 Enzymy restrykcyjne 12 Hybrydyzacja kwas6w nukleinowych 13 Klonowanie DNA 14 Wirusy 15 Sekwencjonowanie DNA 16 Eaticuchowa reakcja polimerazy Sekeja J - Metabolizm weglowodan6w Ji Monosacharydy i disacharydy J2_ Polisacharydy i oligosacharydy 33. Glikoliza J4 Glukoneogeneza 15. Szlak pentozofosforanowy J6 Metabolizm glikogenu J7_ Kontrola metabolizmu glikogenu Sekcja K - Metabolizm lipid6w K1 Struktura i funkcje kwas6w tuszczowych K2_ Rozpad kwaséw Huszezowych K3_ Synteza kwaséw tlusaczowych K4_ Triacyloglicerole K5_ Cholesterol K6 Lipoproteiny Sekcja L- Oddychanie i energia L1_ Cyki kwasu cytrynowego 12. Transport elektronéw i fosforylacja oksydacyjna L3_ Fotosynteza Sekcja M - Metabolizm azotu M1 Wiazanie i asymilacja azotu M2 Metabolizm aminokwas6w MB Cykl mocznikowy M4 Hemy i chlorofile Sekcja N - Specjalizacja komérek NI Miesnie N2_ Rzeski i wici N3 Nerw Literatura uzupelniajaca Indeks 207 212 221 231 238 243 243 248 258 262 271 277 277 283 287 293 298 301 305 305 312 316 328 337 342 346 353 353 357, 372 377 384 389 389 394 419 419 423 431 437 443 449 452 457 463SKROTY ACAT ACP ADP AIDS Ala ALA AMP ATPaza cAMP CAP cDNA cDP «GMP CMP CNBr CoA CoQ CoQH> eR adenina (ang. adenine) acylotransferaza acylo-CoA : : cholesterol (ang. acyl-CoA cholesterol acyltransferase) bialkowy nosnik grup acylowych (ang. acyl carrier protein) adenozyno-5'-difosforan (5’-difosforan. adenozyny) (ang. adenosine diphosphate) zespél nabytego niedoboru odpornoéci (ang. acquired immune deficiency syndrome) alanina (ang. alanine) kwas aminolewulinowy (ang. aminolaevulinic acid) adenozyno-5’-monofosforan (S’-monofosforan adenozyny) (ang. adenosine monophosphate) arginina (ang. agrinine) asparagina (ang. asparagine) transkarbamoilaza asparaginianowa (ang. aspartate transcarbamoylase) adenozyno-5’-trifosforan (5'-trifosfo- ran adenozyny) (ang. adenosine triphosphate) adenozynotrifosfataza (ang. adenosine triphosphatase) cytozyna (ang. cytosine) 3--5-cykliczny AMP (ang. 3',5’cyclic AMP) bialko aktywujace geny kataboliczne (ang. catabolite activator protein) DNA skopiowany z RNA (ang. complementary DNA) cytydyno-5’-difosforan (5'-difosforan cytydyny) (ang. cytidine diphosphate) 35/-cyklicany GMP (ang. cyclic GMP) karboksymetylo- (ang. carboxymethyl) cytydyno-5’-monofosforan (ang. cytidine monophosphate) bromek cyjanogenu (ang. cyanogen bromide) koenzym A (ang. coenzyme A) cytochrom Q (ubichinon) (ang. cytochrome Q, ubiquinone) ubichinol (ang. ubiquinol) receptor cAMP (ang. cAMP receptor protein) CTL CTP cys AEo’ AG act AG?’ dATP dcTP ddNTP DEAE, GTP DIPF DNA DNaza DNP aTTP E EC EF elF ELISA limfocyt T cytotoksyczny (ang. cytotoxic T lymphocyte) cytydyno-5’-trifosforan (ang. cytidine triphosphate) cysteina (ang. cysteine) zmiana potencjalu oksydoredukcyj- nego w standardowych warunkach (ang. change in redox potential under standard conditions) swobodna energia Gibbsa (ang. Gibbs free energy) energia aktywagji (ang. Gibbs free energy of activation) energia aktywacji w warunkach stan- dardowych (ang. Gibbs free energy of activation under standard conditions) 2’-deoksyrybo- (ang. 2’-deoxyribo-) 1,2-diacyloglicerol (ang. 1,2-diacylglycerol) 5’-trifosforan deoksyadenozyny (ang. deoxyadenosine 5’-triphosphate) 5’-trifosforan cytydyny (ang. cytidine ‘-triphosphate) trifosforan dideoksynukleozydu (ang. dideoxynucleoside triphosphate) dietyloaminoetylo- (ang. diethylaminoethyl) 5'trifosforan deoksyguanozyny (ang. deoxyguanosine 5’-triphosphate) diizopropylofluorofosforan (ang, diisopropylfluorophosphate) kwas deoksyrybonukleinowy (ang. deoxyribonucleic acid) deoksyrybonukleaza (ang. deoxyribonuclease) dinitrofenol lub dinitrofenylo- (ang. dinitrophenol) 5‘-trifosforan deoksytymidyny (ang. deoxythymidine 5’-triphosphate) potencjat oksydoredukcyjny (ang. redox potential) Komisja Enzyméw (ang. Enzyme Commission) ezynnik elongacyjny (ang. elongation factor) eukariotyczny czynnik iniciujacy (ang. eukaryotic initiation factor) test immunoenzymatyczny (ang. enzyme-linked immunosorbent assay)vi ER ETS F-2,6-BP FAB-MS FADHp FBPaza N-fMet FMN FMNHQ, GalNAc cpp GleNAc Gin Glu Gly GMP Hb HbA HbF HbS. retikulum endoplazmatycane (ang. endoplasmic reticulum) zewnetrzna transkrybowana sekwengja przerywniko {ang, external transcribed spacer) fruktozo-2,6-bisfosforan (ang. fructose 2,6-bisphosphate) spektrometria masowa wykorzys- tujaca bombardowanie rozpedzonymi. atomami (ang, fast atom bombardement mass spectrometry) cytometr przeplywowy sortujacy komorki znakowane fluorescencyjnie (ang. fluorescence-activated cell sorter) dinukleotyd flawinoadeninowy ulleniony (flavin adenine dinucleotide (oxidized)) dinukleotyd flawinoadeninowy zredukowany (ang. flavin adenine dinucleotide (reduced)} fruktozobisfosfataza (ang. fructose bisphosphatase) N-formylometionina (ang, N-formylmethionine) mononukleotyd flawinowy utleniony (ang, flavin mononucleotide (oxidized)) mononukleotyd flawinowy zredukowany (ang. flavin mononucleotide (reduced)) N-acetylogalaktozoamina’ (ang. N-acetylgalactosamine) guanozyno-5'-difosforan (5'-difosforan guanozyny) (ang. guanosine diphosphate) N-acetyloglukozoamina (ang. N-acetylglucosamine) glutamina (ang. glutamine) Kwas glutaminowy (ang. glutamic acid) glicyna (ang. glycine) guanozyno-5’-monofosforan (@-monofosforan guanozyny) (ang. guanosine monophosphate) glikozylofosfatydyloinozytol (ang. glycosyl phosphatidylinositol) guanozyno-5’-trifosforan (S'-trifosforan guanozyny) (ang. guanosine 5’-triphosphate) hemoglobina (ang. hemoglobin) hemoglobina dorastych (ang. adult hemoglobina) hemoglobina plodowa (ang. fetal hemoglobin) hemoglobina sierpowata (ang. sickle cell hemoglobin) HDL His HIV HMG HMM, hnRNA hnRNP, HPLC IPs, Km LCAT LDH LDL Leu LMM Skroty lipoproteina o duzej gestosci (ang. high density lipoprotein) histydyna (ang. histidine) ludzki wirus niedoboru odpornosci fang, human immunodeficiency virus) S-hydroksy-3-metyloglutarylo- (ang. 3-hydroxy-3-methylglutaryl) meromiozyna cigzka (ang. heavy meromyosin) heterogenny jadrowy RNA (ang. heterogeneous nuclear RNA) heterogenne jadrowe czastki rybonu- Kleoproteinowe (ang. heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography) bialko szoku cieplnego (ang. heat shock protein) 5-hydroksylizyna (ang. 5-hydroxylysine) A-hydroksyprolina {ang. 4-hydroxyproline) lipoproteina o posredniej gestosci (ang. intermediate density lipoprotein) czynnik inicjujacy (ang. initiation factor) immunoglobulina (ang. immunoglobulin) immunoglobulina G (ang. immunoglobulin G) oleucyna (ang. isoleucine) trisfosforan inozytolu (14,5-trisfosfoinozytol) (ang. inositol 145-trisphosphate) izopropylo-p--tiogalaktopiranozyd (isopropyl- f-D-thiogalactopyranoside) wewnetrzne miejsce wiazania rybosomu (ang. internal ribosome entry sites) transkrybowany rejon migdzygenowy (ang. internal transcribed spacer) stala rownowagi (ang. equilibrium constant) stala Michaelisa (ang. Michealis constant) acylotransferaza lecytyna : cholesterol (ang. lecithin-cholesterol acyltransferase) dehydrogenaza mleczanowa (ang. lactate dehydrogenase) lipoproteina 0 male gestosci (ang. low density lipoprotein) leucyna (ang. leucine) meromiozyna lekka (ang. light meromyosin)ins Lys Met mRNA mV NAD! NADH, NADP* lizyna (ang. lysine) metionina (ang. methionine) spektrometria masowa (ang. mass spectrometry) informacyjny RNA (ang. messenger RNA) miliwolt (ang. millivolt) dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy utleniony (ang. nicotinamide adenine dinticleotide (oxidized)) dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy zredukowany (ang. nicotinamide adenine dinucleotide (reduced)) fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego utleniony (ang, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (oxidized) NADPH fosforan dinukleotydu NAM NHP NMR ORE PAGE rc PCR PEP PKF PP, PQ nikotynoamidoadeninowego zredukowany (ang. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced) was N-acetylomuraminowy (ang. N-acetylmuramic acid) bialko niehistonowe (ang. nonhistone protein) jadrowy rezonans magnetyczny {ang. nuclear magnetic resonance) otwarta ramka odezytu (ang. open reading frame) elektroforeza w Zehu poliakryloamidowym (ang. polyacrylamide gel electrophoresis) plastocyjanina (ang. plastocyanin) Jaticuchowa reakeja polimerazy (ang. polymerase chain reaction) fosfoenoiopirogronian (ang, phosphoenolpyruvate) fenyloalanina (ang. phenylalanine) fostoran nieorganiczny (ang. inorganic phosphate) punkt izoelektrycany (ang. isoelectric point) stata dysocjaqji (ang. dissociation constant) kinaza biatkowa A (ang. protein kinase A) fosfofruktokinaza (ang. phosphofructokinase) nieorganiczny pirofosforan (ang. inorganic pyrophosphate) plastochinon (ang. plastoquinone) prolina (ang. proline) PSI _fotosystem I (ang. photosystem I) PSII fotosystem II (ang. photosystem TI) PTH _ fenylotiohydantoina (ang. phenylthiohydantoin) pz para zasad (ang. base pair) Q ubichinon (koenzym Q) (ang ubiquinone (coenzyme Q)) QH2 —_ubichinol (CoQH)) (ang. ubiquinol (CoQ) RER __ szorstkie retikulum endoplazmatyczne (ang. rough endoplasmic reticulum) RE ezynnik uwalniajacy (ang. release factor) RFLP polimorfizm dlugosci fragmentéw restrykeyjnych (ang, restriction fragment length polymorphism) RNA __ kwas rybonukleinowy (ang. ribonucleic acid) RNaza_rybonukleaza (ang. ribonuclease) rRNA rybosomowy RNA (ang. ribosomal RNA) rubisco_karboksylaza rybulozobisfosforanu (ang. ribulose bisphosphate carboxylase) SDS dodecylosiarezan sodu (ang. sodium dodecyl sulfate) Ser _seryna (ang. serine) SER _ gladkie retikulum endoplazmatyczne (ang. smooth endoplasmic reticulum) snoRNA maly jaderkowy RNA (ang. small nucleolar RNA) snoRNP mala jaderkowa rybonukleoproteina (ang. small nucleolar ribonucleoprotein) snRNA. maly jadrowy RNA (ang. small nuclear RNA) snRNP_ mata jadrowa rybonukleoproteina (ang. small nuclear ribonucleoprotein) SRP czastka rozpoznajaca sygnal (ang. signal recognition particle) SSB __bialko wiaéace jednoniciowy DNA (ang. single-stranded DNA-binding protein) TBP _bialko wigéace kasete TATA (ang. TATA box-binding protein) TRH czynnik transkrypeyjny dla polimerazy RNA II (ang. transcription factor for RNA polymerase Il) TFIIA czynnik transkrypcyjny HLA (ang. transcription factor ILA) Thr _treonina (ang. threonine) Tm temperatura topnienia (ang. melting, point) Tris tris-(hydroksymetylojaminometan (ang. Tris(hydroxymethyl)amino- methane)x tRNA Trp Tyr UDP UMP URE transportujacy RNA (ang. transfer RNA) tryptofan (ang. tryptophan) tyrozyna (ang. tyrosine) urydyno-5’-difosforan (5’-difosforan. urydyny) (ang. uridine 5'-diphosphate) urydyno-5’-monofosforan (5'-mono- fosforan urydyny) (ang. uridine 5’-monophosphate) element regulatorowy polozony powyzej promotora (ang. upstream regulatory element) UTP UV Val Vo VLDL Vimax Skréty urydyno-5’-trifosforan (5’-trifosforan urydyny) (ang. uridine 5’-triphosphate) ultrafiolet (ang. ultraviolet) walina (ang. valine) poczatkowa szybkog¢ reakeji (ang. initial rate of reaction) lipoproteina o bardzo malej gestosci (ang. very low density lipoprotein) szybkosé maksymalna reakcji (ang. maximum rate of reaction)PRZEDMOWA LLAMA TELS SATS STARS Se eS SS Trzy lata temu widok studentéw pierwszego roku przedzierajacych sie przez sterty zapisanych maczkiem licznych podrecznikéw biochemii natchnal nas pomystem stworzenia ksiazki pre- zentujacej podstawowe informacje w bardziej przystepnej formie. Tak narodzila sig ksiazka Instant Notes in Biochemistry. Olbrzymi jej sukces potwierdzil stusznosé naszego podejécia. Jed- nakie, co nie powinno dziwié, nie wszystko sie udalo za pierwszym razem. Studenci i wyktadowcy zwrécili uwage na niewystarczajace oméwienie ekspresji genéw i wielu innych, mniej obszernych, ale istotnych zagadnieri. Wszystkie te wskaz6wki uwzgledniliémy przygo- towujac nowe wydanie. Przede wszystkim rozszerzylismy opis transkrypcji genow i jej regula- gi zaré6wno w komorkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. To samo dotyczy procesu dojrzewania RNA i syntezy bialka (Sekcje G i H). Take pod wplywem uwag czytelnikow wiele innych zagadniet zostalo dodanych lub ponownie opisanych. Naleza do nich kwasy i zasady, pH, jonizacja aminokwaséw, termodynamika, stabilnosé bialek, faldowanie sig bialek, wyznaczanie struktury przestrzennej biatka, cytometria przeplywowa i synteza pepty- d6w. Przygotowujac nowe wydanie sprawdziliémy tez wszystkie rysunki i wprowadziliémy modyfikacje, aby uczyni¢ je jeszcze bardziej czyteinymi dla studentéw. Wprowadzilismy tez wiele nowych rysunk6éw. Naturalna koleja rzeczy, wszystkie te poprawki doprowadzily do znacznego powiekszenia ksiazki. Jednakée za kaédym razem, gdy zastanawialigmy sie nad danym fragmentem tekstu lub rysunkiem, ograniczaligmy sie wylacznie do zamieszczenia informagji, ktére uznaliémy za kluczowe dla dobrego zrozumienia przez studentéw danego zagadnienia. Zatem nadrzedny cel ksiazki w nowym wydaniu nie uleg! zmianie. Jest nim zaprezentowanie podstawowych informadji z dziedziny biochemii w latwo przyswajalnej for- mie, idealnie dostosowanej do modliwosci studentéw i ulatwiajacej powtérzenie wiadomoéci przed strasznymi egzaminami. Wiemy od student6w, Ze pierwsze wydanie realizowalo ten cel Mamy nadzieje, ze okaze sie to rowniez prawda w nowym wydaniu. David Hames Nigel Hooperieee er eres rer er ee eee es coon OP SOLS LET LOLS LSS S Rew Seria Krétkie wyklady, nowosé na polskim rynku wydawniczym, sklada sie z kilku ksiazek z daiedziny biologi i nauk pokrewnych. Pierwszymi z serii sa: Biologia molekularna, Biochemia, Biologia zwierzat, a nastepnymi Mikrobiologia, Genetyka, Ekologia, Immunologia, Chemia organiczna. Maja one nowoczesna forme skondensowanego podrecznika. Zadaniem Biochemii wchodzacej w skiad tej serii jest dostarczenie zwartego przegladu i przy- pomnienie najwazniejszych probleméw i zasad podstawowego kursu biochemii. Nie zastapi ona ani obszerniejszych podrecznik6w, ani wyklad6w, ale bedzie ich podsumowaniem, tak jak sugeruja to autorzy serii angielskie}. Na polskim rynku wydawniczym podrecznikiem obszer- nym inowoczesny™m jest Stryer, Biochemia, PWN 2000 oraz, w mniejszym i bardziej medycznym zakresie, Harper, Biochemia, PZWL 2001. Szeroki zakres wiadomosci biochemicznych jest tez zawarty w ksiazce: Klyszejko, Cyfobiochent PWN 2002. Obecna ksiazka z serii Krotkie wyklady moze stanowie tez rodzaj wademekum dla os6b szukajacych szybkiej, hastowej odpowiedzi, dla ktérych biochemia jest przedmiotem pomocniczym (ubocznym). Redaktorzy naukowi wydania polskiegoSekcja A - Organizacja komérki A‘ PROKARIOTA meas oa oa a a ee Hasta [/) Brokaina |] P#0kariota (bakterie i sinie) sq organizmami najlicaniej wystepujacymi [Bibediterbad | Ketda komoria prokariotyczna jst otoczona biona komérkowa. - bakleryjnych — Tematy pokrewne Eukariota (A2) Chromosomy (F2) na Ziemi. Komérka prokariotyczna nie zawiera jadra otoczonego blona. Bakterie maja ksztalt kulisty, cylindryczny lub Srubowaty i dziela sie na dwie grupy, eubakterie i archebakterie Komérki nie maja organelli, a jedynie blona komérkowa tworzy wpuklenia okreslane jako mezosomy. Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) wystepuje w cytozolu w formie skondensowanego nukleoidu Pewne prokariota maja wici, dlugie struktury wystajace poza komérke. ‘Zbudowana z peptydoglikanu (bialko i oligosacharyd) ciana komérkowa ochrania komorke prokariotyczna przed dzialaniem sit mechanicznych i osmotycznych. Bakterie gramdodatnie maja gruba Sciane komérkowg otaczajgca bione komérkowa, natomiast bakterie gramujemne maja cietisza éciane komérkowa oraz dodatkowo blone Zewnelrzna, miedzy ktOrymi znajduje sig przestrzeh peryplazmatycana. Aminokwasy (B1) Rzeski i wici (N2) Lipidy blonowe (E1) Prokariota Budowa komérki Prokariota sq najliczniej wystepujacymi i najbardziej rozprzestrzenionymi organizmami na Ziemi. Ich nazwa wynika z braku wyragnie oddzielonego blona jadra. Wielkosé prokariota siega od 0,1 do 10 jum, a ich ksztalt obej- muje trzy glowne typy: kulisty — ziarniaki (cocci), cylindrycany — paleczki, laseczki (bacilli) lub skrecony helikalnie — kretki (spirilla). Moéna je podzielié na dwie odrebne grupy: eubakterie i archebakterie. Eubakterie wystepuja powszechnie w glebie i wodzie oraz zyja wewnatrz wigkszych organizméw; obejmuja bakterie gramdodatnie i gramujemne oraz fotosyntetyzujgce sinice. Archebakterie rosnq w srodowiskach niety- powych, takich jak zbiorniki o duzym zasoleniu, gorace Zrédla i glebiny morskie; obejmuja bakterie siarkowe i metanogenne. Komérki prokariotyczne, jak wszystkie komérki, sq otoczone blong komérkowa, ktéra calkowicie oddziela cytozol od otoczenia zewnetrz- nego. Blona komérkowa 0 grubosci okolo 8 nm sklada sig z dwuwarstwy lipidowej i zawartych w niej bialek (patrz temat E1). Aczkolwiek proka-Sciany komérek bakteryinych Sekeja A - Organizacja komérki riota nie maja organelli blonowych typowych dla komérek eukariotycz- nych (patrz, temat A2), ich blona komérkowa moze wpuklaé sie tworzac mezosomy (rys. 1). Mezosomy moga byé miejscem replikacji kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) i innych wyspecjalizowanych reakcji ‘enzymatycznych. W bakteriach fotosyntetyzujacych mezosomy zawieraja bialka i barwniki, kt6re wychwytuja Swiatlo i wytwarzaja adeno- zyno-S’trifosforan (ATP). Stanowigcy faze wodna cytozol zawiera makroczasteczki [enzymy, informacyjny kwas rybonukleinowy (mRNA), transportujacy RNA (tRNA) i rybosomy] oraz zwiazki organiczne i jony niezbedne do metabolizmu komérki. Réwniez w cytoplazmie znajduje sie prokariotyczny ,,chromosom” stanowiacy pojedyncza kolista czasteczke DNA, ktéra w skondensowanej postaci tworzy nukleoid (rys. 1) (patrz temat F2). Wiele komérek bakteryjnych ma na powierzchni jedna lub wie- ce) niciowatych struktur — rzesek, ktére umozliwiaja komérce przemiesz- czanie sig w Srodowisku (patrz temat N2). bblona zewnetrzna przostzoh \ _Z. peryplazmatyczna _- Sciana komorkowa ~ blona komérkowa mezosom oytozol nuklecid = DNA ys. 1. Budowa komérki prokariotyczne} W celu ochrony komérki przed uszkodzeniem mechanicznym i dzia- laniem cignienia osmotycznego wigkszos¢ prokariota jest otoczona sztywna Sciana komérkowa grubosci 3-25 nm (rys. 1). Gana komér- Kowa jest zbudowana z peptydoglikanu, makroczasteczki zlozonej z oli- gosacharydéw i biatek. Skladnikiem oligosacharydowym sq liniowe laficuchy ulozonych naprzemiennie czasteczek N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc) i kwasu. N-acetylomuraminowego (NAM), polaczonych wiazaniami (1-4) (patrz temat J1). Z reszta kwasu mlekowego obecna w NAM jest zwiazany wiazaniem amidowym tetrapeptyd zawierajacy D-aminokwas. Przylegajace do siebie réwnolegle laricuchy peptydoghi- kanu sa — poprzez boczne laticuchy tetrapeptydéw — usieciowane kowa- lencyjnie przez inne krétkie peptydy. Rozlegle usieciowanie peptydogli- kanu nadaje Scianie komrkowej wytrzymatosé mechaniczna i sztywnosé. Obecne w peptydoglikanie D-aminokwasy uodporniaja Sciang komér- kowa na wplyw proteaz, ktore dzialaja na czeSciej wystepujace L-amino- kwasy (patrz temat Bl), ale zarazem stanowia wyjatkowy cel dziatania pewnych antybiotykéw, takich jak penicylina. Dziatanie penicyliny pole- gana hamowaniu enzymu tworzacego kowalencyjne wiqzania poprzecz- ne w peptydoglikanie, przez co éciana komérkowa zostaje oslabiona.Al ~ Prokariota Z kolei wiazanie (1-4) glikozydowe miedzy NAM i GIcNAc jest wraz- liwe na hydrolityczne dziatanie lizozymu — enzymu obecnego w Izach, Sluzie i innych wydzielinach ciala. Bakterie mozna podzielié na gramdodatnie i gramujemne w zaleznosci od tego, jak wybarwiaja sie w barwieniu Grama. Bakterie gramdodatnie (np. Baccillus polymyxa) maja gruba (25 nm) sciane komérkowa otaczajaca ich blone komérkowa, natomiast bakterie gramujemne (np. Escherichia coli) maja Sciane komérkowa cieriszq (3 nm) i otoczona przez blone ze- wnetrzna (rys. 2). W odréznieniu od blony komérkowgj (patrz temat E3) ta blona zewnetrzna jest wysoce przepuszczalna dla wzglednie duzych czasteczek (> 1 kDa), a to dzieki biatkom — porynom, kt6re tworza pory w dwuwarstwie lipidowej. Miedzy blona zewnetrzna a Sciana komér- kowa znajduje sie peryplazma, przestrzefi wypelniona bialkami wydzie- lonymi z komérki. @ ) przestrzen btona ii nn btona S$ciana komdérkowa btona komérkowa, zbudowana z peptydoglikanu komérkowa_ Rys. 2. Budowa Sciany komérkowej bakterii (a) gramdodatnich oraz (b) gramujemnychSekcja A - Organizacja komérki A2 EUKARIOTA aaeewna ee 8 Maw ec asey ies 7 ean | ‘endoplazmatyezne eR (eee _Miochonasia | (~Chioroplasty Komérki eukariotyczne maja otoczone blonami jadro i pewna ilogé innych blonowych organelli wewnatrzkomérkowych, z ktorych kazda pelni specyficzne funkcje. Blona komérkowa otacza komorke, oddzielajac ja od srodowiska zewnetrznego. Blona komérkowa jest bariera selektywnie przepuszczalna dzieki obecnosci specyficznych bialek transportowych. Bierze ona réwnied. udzial w przyjmowaniu informagji, w momencie gay ligandy wiada sie na jej powierzchni z blonowymi receptorami, a takZe w procesach egzocytozy i endocytozy. Jadro przechowuije informacje genetyczna komérki jako DNA w chromosomach. Otoczone jest dwiema blonami, przez kt6re przechodza bardzo zlozone pory, umoéliwiajace czasteczkom Wwehodzenie do jadra i wychodzenie z niego. Jaderko jest w obrebie jadra miejscem syntezy rybosomowego kwasu rybonukleinowego GRNA). Ta sieé potaczonych ze soba pecherzykow i cystern dzieli sig na dwie odrebne czesci. Szorstkie (ang. rough) retikulum endoplazmatyczne (RER), obsadzone rybosomami, jest miejscem biosyntezy biatek blonowych i wydzielniczych oraz miejscem ich potranslacyjnej modyfikagji. Gladkie (ang. smooth) retikulum endoplazmatyczne (GER) bierze udziat w biosyntezie fosfolipidow i detoksykagi zwiazk6w trujacych. Aparat Golgiego bedacy systemem splaszczonych woreczkow blonowych stanowi w komérce centrum sortowania i pakowania. Prayjmuje pecherzyki blonowe z RER, modyfikuje dostarczone w ten spos6b bialka i nastepnie upakowuje je w inne pecherzyki, ktore w koricu ulegaja fuzji z blong komérkowa lub innymi organellami wewnatrzkomérkowymi. Mitochondria maja blone zewnetrzng i wewnetrzna, oddzielone przestrzenia miedzyblonowa. Blona zewngtrzna jest bardziej przepuszczalna niz blona wewnetrzna, dzi¢ki obecnosci bialka — poryny. Blona wewnetrzna pofaldowana w grzebienie jest miejscem. fostorylagii oksydacyjnej, procesu wytwarzajacego ATP. Zamknigta blona wewnetrzng matriks jest miejscem utleniania kwasow thuszczowych i przebiegu cyklu kwasu cytrynowego. Chloroplasty obecne w komérkach roslin sa otoczone podwéjna blona i maja wewnetrzny system blonowy w postaci splaszczonych peche- rzykow tylakoidowych ulozonych w stosy jako grana.Az - Eukariota fiipet Wakuola komérki rodlinne| Tematy pokrewne Pecherzyki tylakoidowe zawieraja chlorofil i sq miejscem fotosyntezy. W stromie, plynnym osrodku otaczajacym pecherzyki tylakoidowe, zachodzi proces wiazania dwutlenku wegla (CO,).. Lizosomy otoczone pojedyncza blona sq organellami komérek awierzecych. Ich wnetrze jest kwasne (pH 4-5) dzieki dzialaniu w blonie pompy bialkowej wprowadzajacej jony H*. Wewnatrz lizosoméw znajduja sig hydrolazy kwaSne — enzymy czynne podczas degradacji makroczasteczek, w tym wchionigtych w drodze endocytozy. Peroksysomy zawieraja enzymy czynne podczas rozkladu aminokwaséw i kwaséw thuszczowych, czego produktem ubocznym jest nadtlenek wodoru. Ten toksyczny zwiazek jest szybko rozkladany przez enzym katalaze, rownied obecna w peroksysomach. Cytozol jest rozpuszczalna czgsciq cytoplazmy, w ktérej zachodzi ogromna ilosé reakcji metabolicznych. W cytozolu znajduje sig cytoszkielet, sieé widkien (mikrotubuli, filamentw posrednich i mikrofilamentéw) podtrzymujaca ksztalt komérki, Kom¢rki eukariotyczne maja jako wewngtrzne rusztowanie cytoszkielet, ktory kontroluje ksztalt i ruchy komérki. Cytoszkielet jest zbudowany z mikrofilamentow aktynowych, filament6w posrednich i mikrotubul. Filamenty mikrotubul sq wydrazonymi, cylindryeznymi strukturami zbudowanymi z bialka tubuliny. Sciana mikrotubuli jest utworzona zhelikalnego ukladu ulogonych naprzemiennie podjednostek o- i B-tubuliny. Wrzeciono mitotyczne, biorace udzial w rozdzielaniu chromosoméw podczas podzialu komérki, jest zbudowane z mikrotubul. Kolchicyna hamuje powstawanie mikrotubul, natomiast czynnik przeciwnowotworowy taksol stabilizuje mikrotubule zaklécajac mitoze. Sciana komérkowa otaczajaca komérke roglinna jest zbudowana z polisacharydu celulozy. W roslinach zdrewnialych dodatkowa wytrzymalos¢ i satywnosé zapewnia polimer fenolowy nazywany lignina, Otoczona blona wakuola shuzy do magazynowania substangi zapasowych i wydalin, ma kwasne pH i— w wyniku wplywania wody —wytwarza w komérce ciSnienie turgorowe, skierowane ku Scianie komérkowe) Mikroskopia (A3) Kierowanie bialek (H4) Transport blonowy Transport elektronow makroczasteczek (E4) i fosforylacja oksydacyjna (L2) Przeksztalcanie sygnaléw (E5) __Fotosynteza (L3) Chromosomy (F2) Rzeski i wici (N2)8 Sekcia A ~ Organizacia komorki Eukariota Komérka eukariotyczna jest otoczona btong komérkowa, ma oslonigte otoczka jadro i zawiera znaczna ilog wyodrebnionych organelli wewnatrzkomérkowych (rys. 1). Organelle te sq strukturami otoczonymi long (edna lub dwiema), a kazda z nich pelni unikatowa funkeje i zawiera specyficany zestaw bialek oraz innych czasteczek. Komérki awierzece i roslinne majq taka sama budowe podstawowa, aczkolwiek niektore organelle wystepuja tylko w komérkach zwierzecych, a inne ww roglinnych (np. chloroplasty, wakuola i Sciana komérkowa — w komor- kach roélin, lizosomy — w komérkach zwierzat). Bona Blona komérkowa otacza komérke oddzielajac ja od otoczenia i umozli- komérkowa wiajac utrzymanie w cytozolu wlasciwego skiadu jonowego i ciénienia osmotycznego. Tak jak wszystkie inne blony, blona komérkowa jest nie~ przepuszczaina dla wiekszosci substangj, ale staje sig selektywnie prze- puszczalna dla niektérych czasteczek, dzi¢ki obecnosci w blonie specyfi- canych bialek transportowych (patrz temat E3). Blona komérkowa pelni @ bblena komérkowa cytozol ——_pecherzyki wydzielnicze jadro — aparat Golaiego jaderko — mitochonatium szorstkie retikulurn endoplazmatyezne lizosomy rzeska gladkie retkulum ——_peroksysom endoplazmatyczne (o) Sciana——wakuola agtadkie reticulum komorkowa \ endoplazmatyczne bona komerkowa - chloroplast laderko mitochondrium iadro ~ cytozol szorstkie retikulum —_aparat Golgiego ‘endoplazmalyezne Rys. 1. Budowa komérki eukariotyezne). (a) Budowa typowe] Komérki zwierzece}, (b) budowa typowe) komérkt rosiinne}A2 ~ Eukariota Jadro Retikulum endo- plazmatyczne Aparat Golgiego Mitochondria réwniez wazna funkcje w porozumiewaniu sig komérek ze soba, w szcze~ gélnosci przez wiazanie na swej powierzchni ligandéw (malych czaste- czek, takich jak hormony, przekagniki nerwowe itd.) z bialkowymi recep- torami (patrz temat E5). Blona komérkowa bierze tez udziat w procesie egzocytozy (wydzielania) i endocytozy (internalizacji, wchlaniania) makroczasteczek (patrz temat E4) Jadro jest otoczone przez. dwie blony, wewnetrzna i zewnetrzna bone jadrowa. Te dwie blony sa ze soba zlaczone w porach jadrowych, poprzez Kt6re moga sie przemieszczaé z jadra do cytozolu nawet duze czasteczki linformacyjny kwas rybonukleinowy (mRNA), bialka i in, a nawet c2astki, jak podjednostki rybosoméw]. Inne bialka, na przykdad te, ktére biora udzial w regulacji ekspresji genéw, moga przechodzi¢ przez pory z cytozolu do jadra. Zewnetrzna blona jadrowa pozostaje czesto w ciaglosci z szorstkim retikulum endoplazmatycznym (RER). W obrebie jadra DNA jest ciasno owinigty helikalnie wokél bialek histonowych i zorganizowany w kompleksy stanowiace chromosomy (patrz temat F2). W mikroskopie éwietInym (patrz temat A3) jest widoczne jaderko, wyod- rebniony obszar jadra, stanowiacy miejsce syntezy rybosomowego kwastt nukleinowego (tRNA). Retikulum endoplazmatyczne (ER) jest siecia polaczonych ze soba peche- rzyk6w blonowych, przewainie splaszczonych w cysterny. Szorstkie retikulum endoplazmatyczne (RER) ma od strony cytozolowej przy- igczone rybosomy, ktére sq miejscem biosyntezy biatek bionowych i wydzielanych (sekrecyjnych) (patrz temat H3). W Swietle RER wyste- puja enzymy przeprowadzajace potranslacyjna modyfikacje (glikozyla- Ge, proteolize i in.) bialek zaréwno blonowych, jak i sekrecyjnych (patrz temat H5). Gtadkie retikulum endoplazmatyczne (SER) pozbawione rybosoméw jest miejscem biosyntezy fosfolipidéw oraz miejscem, w kt6- rym zachodzi wiele reakeji detoksykacyjnych. Aparat Golgiego, stanowiacy system splaszezonych woreczkéw blono- wych, jest w komérce ofrodkiem sortujacym. Pecherzyki btonowe powstajace z RER, zawierajace bialka blonowe i sekrecyjne, ulegaja fuzji z aparatem Golgiego i uwalniaja do niego swa zawartosé. Przechodzac przez aparat Golgiego biatka te ulegaja dalszym modyfikacjom potrans- lacyjnym i sq nastepnie sortowane oraz pakowane w odmienne peche- rzyki (patrz temat H5). Pecherzyki te odpaczkowuja z aparatu Golgiego i sq transportowane w obrebie cytozolu, ulegajac ostatecznie fuzji albo z blona komérkowa, uwalniajac swa zawartosé do przestrzeni migdzyko- mérkowej (w procesie egzocytozy; patrz temat F4), albo z organellami komérki (lizosomami, peroksysomami itd.). Mitochondrium ma bione wewnetrzna i zewnetxzna, pomiedzy ktérymi znajduje sie przestrzen migdzybtonowa (rys. 2a). Zewnetrzna blona zawiera poryne, bialko, ktére umodliwia przechodzenie przez te blone czasteczek mniejszych niz 10 kDa. O wiele mnie} przepuszezalna blona wewnetrzna wytwarza silnie wpuklone faldy, grzebienie, wnikajace do centralnej matziks. Blona wewngtrzna jest miejscem transportu elektro- néw i zwiazanej z nim fosforylacji oksydacyjne| wytwarzajace} ATP (patrzSekcia A ~ Organizacja komoérki (0) bjona przestrzen ®) —_biona bbiona zewneltzna migdzybtonowa plone zowngtrena wewnetrzna, wewnetrza i ~ stroma matriks grzebienie pecherzyk grana tylakoidowy Rys. 2. Budowa (a) mitochondrium oraz (b) chloroplastu Chloroplasty Lizosomy Peroksysomy temat L2). Matriks jest miejscem, w ktérym przebiegaja licane reakcje metaboliczne laczniez cyklem kwasu cytrynowego (patrz temat L1) i szla- kiem rozkladu kwas6w tluszezowych (patrz temat K2). W matriks znaj- duje sig tez mitochondriainy DNA, ktory Koduje niektére bialka mitochondrialne, Chloroplasty maja blone zewnetrzna i wewnetrzna. Poza tym wystepuje w nich wewnetrzny system blonowy utworzony przez pecherzyki tyla- koidowe (polacaone ze soba pecherzyki splaszczone w ksztalcie dysk6w), tore tworza stosy o nazwie grana (rys, 2b). W pecherzykach tylakoido- wych jest zawarty zielony barwnik chlorofil (patrz temat M4) oraz enzymy, co razem wzigte stanowi uklad wychwytujacy energie swieting i zamieniajacy ja w energig chemiczna w formie ATP (patrz temat L3). Przestrzefi otaczajaca pecherzyki tylakoidowe — stroma — jest miejscem wiazania dwutlenku wegla (CO2), czyli wbudowywania CO w zwiazki organiczne. Podobnie jak mitochondria, chloroplasty zawieraja DNA, ktory koduje niekt6re biatka chloroplastowe. Lizosomy wystgpujace tylko w komérkach zwierzecych maja blone poje- dyncza. Wewnatrz tych organelli srodowisko jest lekko kwasne (pH 4-5), co jest wynikiem dzialania integralnego biatka blonowego, ktére pompuje do organelli jony H* (patrz temat E3). Lizosomy zawieraja wiele hydrolaz, Ktorych optymalna aktywnosé przypada na pH kwasne (nazywanych stad hydrolazami kwasnymi), a ktore sq nieaktywne w neutralnym pH cyto- zolu i plynu miedzykomérkowego. Enzymy te przeprowadzaja degrada- Ge wlasnych i obcych organizmowi makroczasteczek do ich monomerycz- nych podjednostek; proteazy degraduja bialka, lipazy degraduja lipidy, fosfatazy usuwaja grupy fosforanowe z nukleotyd6w i fosfolipidow, a nukleazy degraduja DNA i RNA. Funkcja lizosoméw jest glownie degradacja makroczasteczek zewnatrzkomérkowych, kt6re sa wprowa- dzane do komérki w drodze endocytozy (patrz temat E4) Te organelle maja pojedyncza blong i zawieraja enzymy degradujace kwasy thuszczowe oraz aminokwasy. Ubocznym produktem tych reakeji jest nadtlenek wodoru, toksyczny dla komérki. Duza ilos¢ zawartego w peroksysomach enzymu katalazy szybko przeksztalca toksyczny nad- tlenek wodoru w nieszkodliwe produkty HO i Oz: 2H,0, —#H" + 2H,0 + OzAz - Eukariota Cytozol Cytoszkielet Mikrotubule Sciana komérki roslinnej Cytozol stanowi te czeSé cytoplazmy, ktéra nie wchodzi w obreb jakichkol- wiek organelli i stanowi glowne miejsce metabolizmu komérkowego Zawiera znaczna licabe réznych enzyméw i innych bialek. Cytozol nie jest homogennym plynem, ale przebiega przez niego cytoszkielet — sieé wldkienek rozpigta wewnatrz komérki i umodliwiajaca utrzymanie je) ksztaltu. Wiokna cytoszkieletu obejmujq mikrotubule (0 Srednicy 251nm), filamenty posrednie (0 Srednicy 10 nm) i mikrofilamenty (o Srednicy 8 nm) (patrz. temat N2). W cytozolu wielu komérek wystepuja ted tw. ciatka (ang. inclusion bodies) (ziarnistogci materialu nie otoczonego blo- na), takie jak ziarna glikogenu w komérkach watroby i migsni oraz kro- pelki triacyloglicerolu w Komérkach tkanki Huszczowe) W cytozolu komérek eukariotycznych jest obecne wewnetrzne rusztowa- nie — cytoszkielet (patrz temat E2). Cytoszkielet pelni wazng role w utrzymaniu i zmienianiu ksztaltu komérki, w umoéliwianiu przemie- szczania sig komérki z jednego miejsca w inne oraz w transporcie peche- rzykéw wewnatrzkomérkowych. Cytoszkiclet jest zbudowany z trzech typéw filamentéw: mikrofilament6w, filamentéw posrednich i mikrotu- bul. Mikrofilamenty 0 Srednicy okoto 7 nm sq zbudowane z aktyny i pelnia funkejg podpory mechanicznej. Poprzez swoje interakcje z mio- zyna (patrz temat N1) mikrofilamenty tworza kurczliwe uklady, biorace udzial w régnych ruchach wewnatrzkomérkowych, takich jak plyniecie cytoplazmy i tworzenie wpuklei blony (patrz temat E4). Filamenty posrednie (0 Srednicy 7-11 nm) biora prawdopodobnie udzial w przemie- szczaniu ,zatadunkw” w obrebie komorki. Na przyklad, skéra zwierzat wyzszych zawiera rozlegia sieé filamentéw posrednich zbudowana z bialka keratyny, ktére ma strukture dwuniciowej superhelisy skrecone} o-helikalnie. ‘Trzeci typ filamentéw cytoszkieletu stanowia mikrotubule, cylindryczne wydrazone struktury 0 Srednicy zewnetrzne) 30 nm, zbudowane z biatka tubuliny. Sztywna Sciana mikrotubuli jest utworzona przez. helikalny uklad wystepujacych naprzemiennie podjednostek a- i B-tubuliny, po 50 kDa kazda.Na przekroju poprzecznym mikrotubuli widaé, zena kazdy pelen skret filamentu przypada 13 podjednostek tubuliny. W komérce mikrotubule powstaja przez dodawanie czasteczek a- i f-tubuliny do juz istniejacych filamentéw lub do centréw nukleagji. Mikrotubule tworza podpierajace rusztowanie (rame), dzialajace jak prowadnica do prze- mieszczania organelli w obrebie komérki. Na przyklad wrzeciono mitoty- czne, dziatajace podczas mitozy przy rozdzielaniu zreplikowanych chro- mosoméw, jest ukladem mikrotubul. Srodek farmakologicany kolchicyna hamuje polimeryzacje mikrotubul, a przez to hamuje procesy takie jak podziat komérki, uzalegniony od dzialania mikrotubul. Inny zwiazek, taksol, stabilizuje tubuling w mikrotubulach i powoduje polimeryzace; jest on uzywany jako lek przeciwnowotworowy, poniewaz przeszka- dzajac dzialaniu wrzeciona mitotycznego blokuje proliferage szybko dzielacych sig komérek. Blone komérkowa komérek roslinnych otacza éciana komérkowa, ktora nadaje komérce odpornosé i sztywnoéé. Skiada sig ona gléwnie z celu-10 Wakuola komorki roglinnej Sekeja A - Organizacja komorki lozy, wi6knistego polisacharydu zbudowanego z powtarzajacych sie jed- nostek glukozy potaczonych wiazaniami [(1—4) (patrz temat J1). Czaste- czki celulozy polaczone wiazaniami wodorowymi tworza peczki wlékien, kt6re saz kolei usieciowane przez inne polisacharydy. W roglinach zdrew- nialych wytrzymatos¢ i sztywnosé éciany komérkowej jest zwiekszona przez inny zwigzek, lignine, kt6ra jest zlozonym polimerem fenolowym nierozpuszczalnym w wodzie. Kom6rki roglinne zawieraja zazwyczaj jedna lub wigce] otocz onych btona wakuol (wodniczek). Stuza one jako magazyn substancji zapasowych (np. sacharozy), wody i jonéw oraz jako miejsce odkladania zbednych produ- kt6w (zwlaszcza nadmiaru zwiazk6w zawierajacych azot). Podobnie jak lizosomy w komérkach zwierzecych, wakuole maja kwasne pH, utrzymy- wane przez blonowe pompy H* i zawieraja réznorodne enzymy degrada- cyjne. WejScie wody pociaga za soba powiekszanie sig wakuoli, powo- dujac wystapienie w komérce ciénienia hydrostatycznego (turgoru), zrownowazonego mechaniczna odpornoscia Sciany komérkowej.Sekcja A - Organizacja kom6r! AS MIKROSKOPIA A AE RE EA A a a a a W mikroskopie swietinym zogniskowanie wiazki Swiatla przez soczewki ze szkla pozwala na otrzymanie powiekszonego obrazu ogladanego preparatu. Preparat praygotowany do ogladania zostaje najpierw utrwalony np. alkoholem lub formaldehydem, zatopiony w parafinie i pociety na cienkie skrawki. Skrawek przeswiella sig wiazka éwiatla zogniskowanego na preparacie przez soczewki kondensora. Swiatlo przechodzace przez preparat zostaje nastepnie skupione w plaszczyénie ogniskowe} przez soczewki obiektywu, tworzac powigkszony obraz. Wiekszosci organelli w komérce nie mogna latwo wyr6znié w mikroskopie swietinym bez uprzedniego wybarwienia preparatu odpowiednim zwiazkiem chemicznym. Bialka mozna wybarwiaé eozyna lub biekitem metylenowym, a DNA — fuksyna. Umiejscowienie enzyméw w preparacie mozna wykazaé barwieniem cytochemicznym, stosujac substrat, ktory zostaje przez enzym zamieniony w barwny produkt. W mikroskopie z ciemnym polem widzenia Swiatlo jest kierowane na Pfeparat pod takim katem, kiéry powoduje, Ze tylko éwiatlo ugigte lub rozproszone przez preparat przechodzi przez soczewki obiektywu tworzac obraz. W mikroskopii z kontrastem fazowym mikroskop Swietlny jest przystosowany do przesunigcia fazy fali Swiatla; w efekcie powstaje obraz, w ktérym stopier jasnosci poszczegdlnych obszaréw preparatu zalezy od ich wspélezynnika zalamania Swiatla. W mikroskopii immunofluorescencyjnej przeciwciala specyficzne dla danej struktury komérkowej zostajq zlaczone ze zwigzkami fluoryzujacymi (takimi, ktére absorbuja Swiatlo o wzbudzajacej dlugosci fali, a nastepnie wysylaja swiatlo emisyjne o innej dlugosci fali). Przeciwcialo takie podaje sig na preparat i umozliwia jego zwiazanie. Po usunigciu nie zwigzanego nadmiaru przeciwciala preparat zostaje oswietlony promieniami o webudzajacej dlugosc fali, co pozwala zobaczyé miejsca, w ktérych przeciwecialo zostalo zwigzane. Jest to odmiana mikroskopii fluorescencyjnej, w tore) uzywa sie lasera, by zogniskowaé na preparacie Swiatlo o wzbudzajace| dlugosci fali, przez.co jest oSwietlona tylko cienka warstwa (taw. przekr6) optyczny) preparatu. Wiqzke laserowa przesuwa sie (skanuje) po preparacie, wytwarzajac serie obrazéw, ktére sa zbierane i opracowywane przez komputer; prowadzi to do powstania ‘trdjwymiarowego obrazu preparatu.12 Sokeja A ~ Organizacja komorki W mikroskopii elektronowej wiqzka elektronowa zostaje Mikraskopia lektrongwea zogniskowana przez soczewki elektromagnetyczne. Preparat jest mikroskopia elektronowa ( Skaningowa | umieszczony w prézni, dzieki czemu elektrony moga sie poruszaé liniowo. preechodzi przez ultracienki skrawek preparatu skontrastowanego metalami cigzkimi. Metale elektronowo geste rozpraszaja elektrony padajace na preparat i przez to wytwarzaja obraz preparatu, W transmisyjnej mikroskopii elektronowej wiazka elektronéw Transmisyjna I din I W skaningowej mikroskopii elektronowej powierzchnia calego Sijaiagow's | _preparatu zwykle jest pokrywana warstwa metal ciezkiego aie eeheea | iskanowana skupiona wigzka elektronéw. Pobudzone czasteczki ie preparatu wysylaja elektrony wtérne, ktore po zogniskowanitt ‘wytwarzaja trojwymiarowy obraz preparatu. Tematy pokrewne Eukariota (A2) Bialka blonowe Przeciweiala jako narzedzia badaweze (D5) —_i weglowodany (E2) Mikroskopia Po raz pierwszy do obejrzenia i zidentyfikowania poszezegéInych kom6- Swietina rek uéyli prymitywnego mikroskopu Swietlnego Schleiden i Schwann w 1835 roku i na podstawie tych badati zaproponowali swoja teorie komérkowa zaktadajaca, Ze ,majaca jadro komérka jest podstawowa jed- nostka budowy i funkeji roslin oraz zwierzat”: W mikroskopii swietlne} do zogniskowania wiazki Swiatla na badanym preparacie stosuje sig soczew- ki szklane. Nastepnie swiatlo przechodzace przez preparat zostaje 20g- niskowane przez inne soczewki, wytwarzajac powi¢kszony obraz. Po 1835 roku postep techniczny doprowadzil do produkcji mikroskopéw bardziej efektywnych i skomplikowanych, ktore umodliwily przeprowa- dzenie szczegdlowych badan nad budowa i funkcja komérek, Zwykty Zwykla mikroskopia Swietina (w jasnym polu) jest najezesciej stosowana mikroskop dzig technika mikroskopowa i postuguje sie zwyktym (standardowym) Swietiny mikroskopem. Badany preparat zostaje najpierw utrwalony roztworem zawierajacym np. alkohol lub formaldehyd. Zwiazki te denaturuja biatka, przy ezym formaldehyd wytwarza kowalencyjne wiazania poprzecane miedzy resztami aminokwas6w przylegajacych do siebie czasteczek, co stabilizuje oddzialywania biatko-bialko i bialko-kwas nukleinowy. Utrwalony preparat zostaje nastepnie zatopiony w parafinie i pociety na cienkie skrawki (0 grubogci ok. 1 um). Kady skrawek naktada sig na szkietko podstawowe i umieszcza na ruchomym stoliku mikroskopu. Pre- parat zostaje oswietlony od spodu przez lampe umieszczona w podstawie mikroskopu (rys. 1a), przy czym Swiatlo jest zogniskowane w plaszezy2- nie preparatu przez soczewki kondensora. Swiatlo przechodzace przez preparat zbierane przez soczewki obiektywu i skupione w jego plaszczy- nie ogniskowe} tworzy powigkszony obraz. Obraz ten jest dale} powie- kszany przez okular, a calkowite uzyskane powiekszenie jest ilocaynem powigkszett poszczegdlnych soczewek. W celu zwigkszenia rozdzielczo- Sci uzyskiwane| w zwyklym mikroskopie preparat pokrywa sie czgstoAd ~ Mikroskopia 13 @ oR _ plytka fazowa roskop zciemnym polem Mikroskop zkontrastem fazowym plerscieh soczewka Bivth fazowe| ohare Sviatio siete plaszczyena - lub rozproszone Sgriskona (opdirione w fazie) soczevika ~~~ soezewka obientyl obiextynu _- preparat na ~ gato niezakiécone Fachomy stotiku preparet soczowia soczewka = Me _- kondensora kondenso _ przestona, Plerscieriowa 2rédto Swatla __ tr6dlo 2 Swiatla ys. 1. Droga swiatta (a) w zwykiym mikroskopie Swietinym oraz (b) w mikroskopie 2 kontrastem fazowym olejkiem imersyjnym, w ktérym zostaje zanurzona soczewka obiektywu. Granica zdolnosci rozdzielcze| mikroskopu Swietlnego z uzyciem Swiatla widzialnego wynosi okolo 0,2 um Réine struktury komérkowe (np. mitochondria, leukoplasty itd.) absor- buja Swiatlo widzialne w ten sam spos6b, co utrudnia ich rozréénienie w_mikroskopie SwietInym bez uprzedniego wybarwienia preparatu Wiele barwnikéw chemicanych wiaze sie z czasteczkami biologicznymi; na przykiad eozyna i biekit metylenowy wiaza sie z bialkami, a fuksyna wiaze sie z DNA. Innym uzytecznym sposobem uwidaczniania w komér- kach specyficznych struktur jest barwienie cytochemicane, w ktorym reakcja enzymu obecnego w tych strukturach katalizuje przetwarzanie bezbarwnego substratu w barwny produkt, stracajacy sig w miejscu prze- biegu reakcji. Taki widoczny w mikroskopie SwietInym barwny strat wskazujena miejsce obecnosci enzymu. Na przyKlad peroksysomy mozna uwidocznié uzywajac cytochemicznego barwnika dla katalazy (patrz temat A2). W mikroskopie z ciemnym polem widzenia éwiatlo jest skierowane przez soczewki kondensora pod pewnym katem tak, Ze do soczewek obiektywu wchodzi tylko swiatlo ugigte lub rozproszone przez preparat. Rozdziel- zo$é mikroskopu z ciemnym polem jest niezbyt dobra, ale metoda ta umo- Zliwia ujawnienie w postaci jasnych (blyszczacych) czastek tych malych obiekt6w, kt6re uginaja znaczna czeé¢ Swiatla padajacego; dlatego metoda ta jest szeroko stosowana w mikrobiologii do wykrywania bakterii W mikroskopie z kontrastem fazowym szklana plytka fazowa wstawiona migdzy preparat a obserwatora zwieksza réinice w kontrascie. Swiatto padajace przechodzi przez przestone pierécieniowa, kt6ra skupia na pre-4 Sekcia A ~ Organizacja komorki Mikroskopia immuno- fluorescencyjna Konfokaina mikroskopi skaningowa Mikroskopia elektronowa paracie Swiatlo w ksztalcie pierscienia (rys. 1b). Swiatlo, ktore przechodzi przez preparat bez zakiécesi, jest zogniskowane przez soczewki obie- ktywu na szarym pierscieniu plytki fazowej, ktéry absorbuje pewna czesé Swiatla i zmienia (przesuwa) jego faze. Swiatlo ugiete lub rozproszone przez preparat bedzie mialo zmieniona faze i przejdzie przez jasny obszar plytki fazowej. Te ugiete i rozproszone fale Swiatla interferuja z nieugie- tymi (nie opéznionymi) falami swiatla tworzac obraz, w ktorym stopien jasnogci danego regionu probki zalezy od wspétczynnika zatamania $wiatta przez ten region. Mikroskopia z kontrastem fazowym jest uzyte- cana do badania struktury i ruchéw dudych organelli (plastydéw, mito- chondriéw itd.) w Zywych komérkach, ale mozna ja stosowaé tylko do pojedynczych komérek lub cienkiej ich warstwy. W mikroskopii immunofluorescencyjnej mikroskop SwietIny jest przysto- sowany do wykrywania Swiatla emitowanego przez zwiazek fluory- zujacy, to jest zwiazek absorbujacy Swiatlo o okreslone} diugosé fali (wzbudzajaca dlugosé fali Swiatla), ktéry nastepnie emituje swiatlo © dludszej fali (emisyjna dlugosé fali Swiatta). Powszechnie uzywa sig w mikroskopii fluorescencyjne} dwéch zwiqzkw: rodaminy emitujace} Swiatlo czerwone oraz fluoresceiny emitujacej swiatlo zielone. Zwiazek fluoryzuiacy laczy sie najpierw chemicznie z przeciwciatem specyficz- nym dla badanego w komérce bialka lub innej makroczasteczki (patrz temat D5). Nastepnie przeciwcialo oznakowane fluorescencyjnie podaje sie do skrawka tkanki lub do komérki o zwiekszonej (np. przez elektro- poracje) przepuszczalnosci, a preparat oswietla sig Swiatlem 0 wzbu- dzajacej dlugosci fali. W ten spos6b zostana uwidocznione te struktury preparatu, z ktérymi zwiazalo sig przeciwcialo. Mikroskopie fluorescen- cyjna mona zastosowaé réwnied do zywych komérek, co umodliwia przesledzenie np. ruchéw komérki i jej struktur (patrz. temat E2, gdzie podano przyklady) Konfokalna mikroskopia skaningowa jest rozwinigciem zwyklej mikro- skopii immunofluorescencyjnej i tworzy bardzie| wyraéne obrazy calych komirek lub wiekszych obiekt6w. W zwyklej mikroskopii immunofluo- rescencyjnej Swiatlo fluorescencyjne emitowane przez dany zwiqzek pochadzi z czasteczek znajdujacych sig zaréwno pod, jak i nad pta- szczyzna ogniskowa, co zmniejsza ostrosé obrazu i utrudnia okreslenie wiasciwego tréjwymiarowego ulozenia czasteczek. W konfokalnej mikro- skopii skaningowej fluoryzuja tylko te czasteczki, ktére znajduja sie w plaszezyénie ogniskowej, a to dzigki uzyciu zogniskowanej wiazki laserowej 0 wzbudzajacej diugosci fali. Wiazke laserowa przesuwa sig po réénych czeSciach preparatu (przekrojach optycznych), co umodliwia otrzymanie seri obrazéw z réznych giebokosci preparatu. Obrazy sa nastepnie lacznie opracowywane (przetwarzane) przez komputer, tory tworzy kompletny obraz tréjwymiarowy. W odréznieniu od mikroskopii éwietlnej, w ktére} wiazka swiatla jest ogniskowana przez soczewki optyczne, w mikroskopii elektronowej wiazka elektronowa jest ogniskowana przez soczewki elektromagnety- czne. Poniewaé w powietrzu elektrony sq absorbowane i/lub rozpra-A3- Mikroskopia 15 Transmisyjna mikroskopia elektronowa szane, preparat trzeba umiescié w kolumnie préiniowej. Dla materialu Diologicznego rozdzielczosé mikroskopii elektronowej nie moze byé muniejsza niz 0,10 nm. W transmisyjnej mikroskopii elektronowej przez preparat jest kierowana wigzka elektronowa, a soczewki elektromagnetyczne ogniskuja prze- chodzace elektrony tworzac obraz na ekranie lub kliszy fotograficzne| (rys. 2a). W zwyklej mikroskopii swietlnej oglada sig cienkie skrawki mate- rialu biologicznego. Jednakze do transmisyjnej mikroskopii elektronowej skrawki takie musza byé znacznie cietisze (0 grubosci 50-100 nm). Ponie- wai elektrony przechodza przez material biologicany jednakowo, prepa- raty nie wybarwione daja nieczytelne obrazy. Dlatego tez preparat musi byé wybarwiony (skontrastowany), aby uzyskaé rozproszenie niektorych padajacych clektronéw, ktére nie beda jud zogniskowane przez soczewki elektromagnetyczne i przez to nie utworza obrazu. Jako barwnika do materialu biologicznego uzywa sig czesto metali ciezkich, takich jak osm, uran i olow. Czterotlenek osmu preferencyjnie barwi (kontrastuje) pewne struktury komérkowe, zwlaszcza blony, kt6re na kliszy pojawiaja sie jako czarne, a na fotografii jako jasne. Zdolnosé rozdzielcza transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest dostatecznie duza, aby umodliwi¢ uzyska- nie informagji o ksztatcie oczyszczonych bialek, wirus6w i organelli. Podobnie jak w mikroskopii immunofluorescencyjne}_przeciwciala byly taczone ze zwiazkiem fluorescencyjnym, tak w mikroskopii elektro- nowej mogna przeciwciata oznakowaé gestymi elektronowo czastkami zlota, a nastepnie zwiazaé je ze specyficznymi poszukiwanymi bialkami w ultracienkich skrawkach materialu biologicznego. Ogladane w mikro- skopie elektronowym male, czarne ziarenka przedstawiaja obraz czastek zlota i wskazuja miejsca, w ktorych czasteczki przeciwciata zwiazaly sie ze swym antygenem (patrz temat D5), przez co techniki tej mozna uzy¢ do zlokalizowania specyficznych antygenéw. 5 o * rédto elektronow © (deeito slektonovey-—— soozenkakordensuace eee a ae avert Bp erence wine aa RR PEAY corar na montorze soczovka projokora a obraz na ekranio ~ I delektor preparat Rys. 2. Gldwne elementy mikroskopu elektronowego (a) transmisyinego oraz (b) skaningowego16 Sekeja A ~ Organizacja komorki Skaningowa mikroskopia elektronowa W skaningowej mikroskopii elektronowej nie skrojony preparat zwykle zostaje najpierw utrwalony, a potem pokryty cienka warstwa metalu ciez- kiego, takiego jak platyna. Nastepnie skupiona wiazka elektronowa ska- nuje (omiata) powierzchnie preparatu wybijajac z niego elektrony wt6rne. Zostaja one zogniskowane w detektorze scyntylacyjnym, a powstajacy obraz ukazuje sie na lampie kineskopu (lampie katodowe)) (rys. 2b). Ska- ningowa mikroskopia elektronowa tworzy obrazy tréjwymiarowe, poniewaz liczba elektroné6w wtérnych wytworzonych przez jakikolwiek punkt w preparacie zalezy od kata miedzy wiazka elektronowa a powierz- chnia preparatu. Zdolnosé rozdzielcza skaningowej mikroskopii elektro- nowej wynosi z reguly 10 nm, a wiec jest 100 razy mniejsza niz w transmi- syjnej mikroskopii elektronowej.Sekcja A - Organizacja kom6r' A4 ROZDZIELANIE STRUKTUR KOMORKOWYCH I KOMOREK | Wire wegradiencie -rownowagowe _ Tematy pokrewne Eukariota (A2) Oczyszczanie bialek (B6) Rozdzielanie struktur komorkowych polega na otwarciu komérki przez jej rozbicie (np. w drodze homogenizagj) i oddzieleniu od siebie r6énych organelli przez wirowanie. Wirowanie z r6inq predkoscia (wirowanie réznicowe) rozdziela organelle na podstawie ich wielkosci. Sile niezbedna do oddzielenia réznych organelli i osadzenia ich na dnie probowki wiréwkowej wytwarza odpowiednia wiréwka. Przy malych silach osiadaja jadra, mitochondria, chloroplasty i lizosomy, natomiast do zebrania jako osadu retikulum endoplazmatycznego, aparatu Golgiego i blony komérkowej treba uzyé wiekszych sit Procedura ta opiera sig na uzyciu gradientu gestoSci roztworu (np. roztworu sacharozy) do rozdzielenia organelli wedlug ich gestosci. Uaycie ultrawiréwki umoiliwia osiadanie organelli w tym miejscu gradientu, w ktorym gestosé organelli jest réwna gestosci sacharozy. W wirowaniu strefowym prébka homogenatu jest odwirowywana w niezbyt stezonym roztworze sacharozy az do rozdzielenia sie corganelli. Rozazial nastepuje wedlug wielkosci. Po zbyt dlugim wirowaniu wszystkie organelle osiada na dnie probowki wiréwkowe). Dogodnym sposobem oznaczenia stopnia czystosci preparaléw organelli jest pomiar aktywnoéci enzymu markerowego w réznych uzyskanych frakcjach. Enzymem markerowym jest taki enzym, ktory wystepuje tylko w jednym okreslonym przedziale komérki. Pojedyneze komérki mona identyfikowaé z zastosowaniem cytometrii przeplywowe). Przeciwciala, sprzezone ze skladnikami fluorescencyjnymi, wbudowane do czasteczek na powierzchni poszczegélnych typow komérek, moga byé zastosowane do rozdzielania komérek w cytometrze przeplywowym sortujacym komérki znakowane fluorescencyjnie. Mikroskopia (A3) Wprowadzenie do enzyméw (C1) Rozdzielanie struktur W badaniu makroczasteczek i proceséw metabolicznych przebiegajacych w komérkach, bardzo pomoce jest odizolowanie okreslonego typu orga- elli (patrz temat A2) od reszty skladnik6w komérkowych przez frakcjo-18 Wirowanie z r6ing predkosciq @) osad jadra komérkowe (b) pe amin supernatant ieee 8min weowanie | supernatant supernatant osad mitochondria, chioroplasty lizosomy, peroksysomy osad bona komérkowa, Sekeja A - Organizacja komorki nowanie. Trzeba zacza¢ od rozbicia blony komérkowej (i Sciany komérko- wei, jesli jest obecna). W tym celu sporzadza sie suspensie (zawiesing) tkanki lub prébki komérek w izotonicznym roztworze sacharozy (0,25-0,32 M) zbuforowanym przy odpowiednim pH, a nastepnie komér- ki rozbija sie przez homogenizacje w homogenizatorze, lub przez soni- Kacje (dzialanie ultradéwigk6w), badé tez dzialanie wysokich cignieti (prasa Frencha lub ,bomba azotowa”). Zar6wno homogenizacja, jak i nastepne frakcjonowanie prowadzi sig zazwyczaj w 4°C, w celu ograni- czenia do minimum enzymatyczne} degradagi sktadnikow komérko- wych. Czesto przesacza sie probke rozbitych komOrek przez muslin lub gesta gaze w celu usunigcia wiekszych fragment6w materialu przed przystapieniem do dalszej procedury Podezas wirowania z réznq predkoscia poszczegdIne organelle oddzie- laja sig od siebie zaleznie od wielkoéci. Uzywa sig wiréwki do wytwo- rzenia duzych sil, siegajacych 100000g (g=przyspieszenie ziemskie). Zhomogenizowana probke umieszcza sig w odpowiednie| probowce wiréwkowej, kt6ra wklada sie do rotoru wiréwki i poddaje wirowaniu (rys. 1a). Poczatkowo przez krétki okres uzywa sie malych przyspieszer, a nastepnie stosuje sie coraz wieksze sily przez coraz diuzszy czas. Na przyklad wirowanie przy 600 g przez.3 min spowoduje osadzenie najwie- kszych organelli, jader komérkowych (rys. 15). Supernatant powstaly w tym etapie przenosi si¢ do Swieze} prob6wki i poddaje wirowaniu przy 6000 przez 8 min w celu osadzenia mitochondriéw i peroksysoméw oraz lizosoméw i chloroplast6w, jesli sa obecne. Kolejne wirowanie powstalego w tym drugim etapie supematantu przy 40000g przez 30 min doprowadzi do osadzenia blony komérkowej oraz fragment6w reti- kulum endoplazmatycznego i aparatu Golgiego. Ostatnie wirowanie przy 100000g przez 90 min rozdzieli osad rybosoméw od ostatecznego supernatantu, ktory jest pozbawiony juz jakichkolwiek czastek, a ktory homogenat | J 40 000g, 30 min ‘supematant fragmenty aparatu supermatant podjednostki —_cytozol rybosomow Rys. 1. Frakojonowanie homogenatu komérki przez wirowanie z rdzna predkoscig (wirowanie roznicowe). (a) Schemat frakcjonowania probk tkanki, (b) wyglad probki w probowice wirdwkowej przed | po wirowanixAA - Rozdziolanie struktur komérkowych | komérek 19 Wirowanie rownowagowe w gradiencie gestosci strefowe uznaje sie za wlasciwa rozpuszczalng frakcje cytozolowa. Jednakée fra- kcje izolowane metoda wirowania z rézna predkoscia nie sq zazwyczaj wolne od innych organelli i moga wymagaé dalszego oczyszczenia. Do oddzielania z mniejszym przyspieszeniem uzywa sie wiréwki prepara- cyinej, w kt6rej rotor wiruje w powietrzu przy cignieniu atmosferycznym. Do rozdzielania z wiekszym przyspieszeniem trzeba jednak uZyé ultra- wiréwki i wytworzyé w je} komorze wysoka prOénig, zmniejszajaca tarcie i wytwarzanie ciepla, kt6re to zjawiska wystepowalyby podczas wirowa- nia rotoru w powietrzu. Wirowanie rwnowagowe w gradiencie gestosci czesto stosuje sig do dal- szego oczyszczania organelli czeSciowo juz oddzielonych przez wirowa- nie z r6znq predkoscia. W procedurze tej organelle rozdziela si¢ zaleznie od ich gestosci, a nie wielkosci. Surowa (jeszcze nie oczyszczona) frakcja organelli zostaje natogona na wierzch wypelniajacego probowke wiréw- kowa gradientu gestego roztworu (np. roztworu sacharozy; rys. 2). Roz twor sacharozy jest najbardziej stezony (gesty) przy dnie probéwki, a jego stezenie (i gestos¢) zmniejsza sie w kierunku ku gérze probéwki. Podczas wirowania (np. przy 160000g przez 3 h) rézne organelle przemieszczaja sig w dél prob6wki do pozycji rownowagowe), w Ktére| ich gestosé jest réwna gestosci sacharozy z tej warstwy. Sity powodujace sedymentacje maja tendencje do przemieszczania organelli dalej w dé! probéwki, ale organelle wchodzac do obszaru o wiekszej gestosci niz ich wlasna, wyplywaja z powrotem do swej poprzedniej pozycji. Mitochondria, lizo- somy i peroksysomy réznia sig gestosciq i dlatego moga byé efektywnie rozdzielone przez wirowanie w gradiencie gestosci (rys. 2). Podobnie, sto- sujac gradient o mniejszej gestosci mozna rozdzielié blony komérkowe od bion szorstkiego retikulum endoplazmatycznego i aparatu Golgiego. Natomiast do rozdzielenia przez wirowanie réwnowagowe czastek cied- szych, takich jak DNA, RNA i biatka, stosuje sie gradient chlorku cezu 0 duzej gestosci. >> tieoczyszezona 3 frakoja 3g organeli & _-tizosomy 38 wirowanie es eee. mitochondna qs 5 peroksysomy, Rys. 2. Rozdzielanie organelll przez wirowanie réwnowagowe w gradiencio gestosci W wirowaniu strefowym prébke naklada sig na wypelniajacy probowke wiréwkowa roztwér sacharozy o malym stezeniu. W tym przypadku sacharoza nie ma sluzy¢ do rozdzielenia prbek wedlug gestosci, ale ma Po prostu uchroni¢ przed mieszaniem konwekcyjnym ijest poddana wiro-20 Enzymy markerowe Cytom przeptywowa je A - Organizacja komérki waniu. Organelle przemieszczajq si¢ ku dotowi probowki z predkoscia okreslona przez: site odsrodkowa, mase organelli, r6znice miedzy ich gestoscig a gestoscia otaczajacego roztworu oraz przez tarcie miedzy orga- nellami a otaczajacym roztworem. Po zakoriczeniu wirowania organelle rééniace sie wielkoSciq zatrzymuja sie w réznych strefach (warstwach) probéwki wirowkowej. Probke nalezy wirowa¢ tylko tak dtugo, jak jest to potrzebne do oddziclenia adanego typu organelli. Przedluzenie czasu wirowania spowoduje, 2e wszystkie rodzaje organelli przejda do osadu na dnie probowki Po rozdzieleniu homogenatu otrzymanego z komérek trzeba sprawdzié caystosé roznych preparatéw organelli. Jednym ze sposobow jest tu ocena morfologiczna w mikroskopie elektronowym (patrz temat A3). Eatwiejszq alternatywa jest pomiar aktywnosci takiego enzymu, ktory jest charakterystycany dla danej organelli i kt6ry poza nia w komérce nie wystepuje (patrz temat C1). Na prayktad dobrym enzymem markerowym dla peroksysomow jest katalaza, dla mitochondriéw — dehydrogenaza bursztynianowa, dla lizosoméw — katepsyna C lub fosfataza kwaéna, a dla blony komérkowej — fosfataza alkalicana. Dobrej wskaz6wki stopniu ezystosci lub zanieczyszczenia preparatu organelli dostarcza przeprowadzenie pomiaréw aktywnosci takich enzy- méw we wszystkich wyizolowanych frakcjach. Poszczegélne typy komérek moina rozréénié dzieki pomiarom rozpro- szenia éwiatla lub emisji fluorescencji, gdy przechodza one przez promiett lasera w cytometrze przeplywowym. W cytometrze przeplywowym sor- tujacym komdrki znakowane fluorescencyjnie (FACS — ang, fluorescence activated cell sorter), urzadzeniu o budowie podobnej do cytometru praeplywowego, komérki moga by¢identyfikowane i rozdzielane. Intere- sujace nas komorki sa najpierw znakowane przeciwcialami specyficznymi dla charakterystycznych czasteczek na powierzchni tych komérek. Prze~ ciwcialo jest sprzegniete z barwnikiem fluorescencyjnym (patrz temat A3) tak, Ze gdy komérki przechodza przez promien lasera pojedynczo, jedna za druga, waskim strumieniem, fluorescencja kazde} komérki jest zmie- rzona, Wibrujaca koficéwka wytwarza drobne kropelki zawierajace poje- dyncze komérki, ktore wykazuja dodatni lub ujemny ladunek w zalezno- Sci od tego, czy komérka wykazuje fluorescence. Silne pole elektryczne odchyla réznie naladowane krople kierujac je do odrebnych pojemnikow tak, Ze kaady pojemnik ostatecznie zawiera homogeniczna populace komérek pod wzgledem obecnosci czasteczek powierzchniowych wyzna- kowanych fluoryzujacym przeciwciatem. Te homogenne populacje moga byé uzyte do biologicanych analiz lub hodowli komérkowej. Takée za- wartogé DNA i RNA w komérkach moze byé zmierzona cytometria przeplywowa.21 konconka wibratora ultradéwigkowego (tworzy kropelki) zawiesina komorkowa plyn ostaniajacy Move mala grupa kropelek ujemrie natadowanych ze wealecu ta cbeonase pojedynszej fluoryzviace) mala grupa kropeiek Kem dodatnio natadowanych |-—— eveolodune ebeokces jedynczej nie fluoryzujace} comOrki -2000v *] LL +2000 . kolektor komorkowy kolektor komorkowy kolba zbierajaca nie adchylone kropelki Rys. 3. Cytometr przeplywowy sortujacy komérki znakowane fiuorescencyinie. Gdy komérki przemieszczaia sie poprzez promien lasera, sq monitorowane pod wegledem obecnosci fluorescengji. Kropelki zawierajace pojedyncze komérki wykazuja dodatni lub ujemny ladunek, zaleznie od tego, czy komérka posiada woudowane oznakowane fluorescencyjnie przeciwcialo, czy nie, Kropelki Zawierajace pojedyncza komérke sq Kierowane przez pole elektryezne do zbiorozych probéwek odpowiednio do ich tadunkuBi AMINOKWASY LAL CR ER a I AE RE RR Ie Wszystkie bialka sq zbudowane z 20 standardowych aminokwaséw. W typowym aminokwasie centralnie pologony atom wegla a. (C.) jest polaczony z pierwszorzedowa grupa aminowa, grupa karboksylowa, atomem wodoru i laficuchem bocznym (grupa R). Prolina stanowi pod tym wzgledem wyjatek, poniewaz zawiera drugorzedowa grupe aminowa. We wszystkich 20 standardowych aminokwasach, z wyjatkiem Se glicyny, cztery rézne grupy sq ulozone tetraedrycznie wokél atomu C, idlatego aminokwasy te moga wystepowaé w konfiguragji D lub L. Oba enancjomery stanowiq nie nakladajace sie odbicia lustrzane, ktore moéna odréénié tylko na podstawie réznic w skrecalnosci plaszczyzny swiatla spolaryzowanego. W bialkach wystepuje tylko izomer L. 20 standardowych aminokwas6w zawiera r6ane laricuchy bocane (grupy R) i wykazuje rine wlasciwosci fizykochemiczne (polamosé, kwasowosé, zasadowosé, aromatycznosé, objetosé, sztywnosé konformagji, zdolnosé do tworzenia wiqzah wodorowych, zdolnosé do tworzenia wiazah poprzecznych i reaktywnoéé chemiczna) W glicynie (Gly, G) grupa R jest atom wodoru. Alanina (Ala, A), walina (Val, V), leucyna (Leu, L), izoleucyna (le, 1) i metionina (Met, M) zawieraja Jaficuchy boczne o réznej strukturze, kt6re sq hydrofobowe i chemicznie obojetne. Aromatyczne laficuchy boczne fenyloalaniny (Phe, F), tyrozyny (Tyr, T) i tryptofanu (Trp, W) maja takze charakter hydrofobowy. W prolinie (Pro, P) aromatyczny Jaficuch boczny jest zwiazany z grupa aminowa i dlatego ten aminokwas o sztywnej konformagj jest faktycznie iminokwasem. Hydrofobowy, zawierajacy siarke laticuch bocany cysteiny (Cys, C) jest wysoce reaktywny i moze tworzyé wiazanie dwusiarczkowe z inna reszta cysteiny. Aminokwasy zasadowe, arginina (Arg, R) ilizyna (Lys, K) zawieraja laricuch boczny obdarzony tadunkiem dodatnim, natomiast laficuch boczny histydyny (His, H) w pH neutralnym moze byé naladowany dodatnio lub pozbawiony ladunku. Laticuchy bocane aminokwas6w kwasnych, kwasu asparaginowego (Asp, D) i kwasu glutaminowego (Glu, E) sq obdarzone ladunkiem ujemnym w pH neutralnym. Amidowe laticuchy boczne asparaginy (Asn, N) i glutaminy (Gln, Q) oraz hydroksylowe laticuchy boczne seryny (Ser, 5) i treoniny (Thr, T) sa pozbawione ladunku, polarne i tworza wigzania wodorowe. Tematy pokrewne Kwasy i zasady (B2) Struktura bialka (B3)Sokcja B - Aminokwasy i biatke COOH [atom wegla a 24 Aminokwasy @ ‘HNO H i RB Aminokwasy sq jednostkami budowy bialek (patrz temat B2). Bialka wszystkich gatunk6w, od bakterii do czlowieka, sq zbudowane z tych samych dwudziestu standardowych aminokwaséw. Dziewigtnascie z nich to a-aminokwasy z pierwszorzedowa grupa aminowa (-NH*) i grupa kwasu karboksylowego (karboksyl; ~COOH), ktore sa potaczone z centralnym atomem wegla, nazywanym atomem wegla a (C.), ze wagledu na sqsiedztwo z grupa karboksylowa (rys. 1a). Z atomem Ca jest polaczony réwnied atom wodoru i zmienny laftcuch boczny (grupa ,R") Jedynym wyjatkiem od tej powszechnie wystepujace| reguly jest prolina, Ktora zawiera drugorzedowa grupe aminowa i jest w rzeczywistosci o-iminokwasem. Nazwy aminokwas6w przedstawia sie czesto w postaci trojliterowych lub jednoliterowych skrotow. Na przyklad w przypadku proliny sa stosowane skréty Pro lub P (patrz rys. 2). plaszezyzna & coon lustra c0H Nay ® a L-aminokwas peaminokwas ys. 1 (a) Podstawowa struktura aminokwasow, uwzgledniajaca cztery rééne podstawniki wok6t contrainie polozonago atomu wegla a, (b) dwa enancjomery aminokwasu Enancjomery 20 standardowych aminokwas6w Wszystkie aminokwasy, z wyjatkiem glicyny (Gly lub Gj patrz rys. 2), zawieraja cztery rééne grupy ulozone tetraedrycznie wok6l centralnego atomu C, nazywanego w zwiqzku z tym centrum asymetrii lub centrum chiralnosei i decydujacego o powstaniu czasteczki chiralnej (z greckiego _cheir’ - dloti)(rys. 1b). Moze ona wystepowaé w postaci jednego z dw6ch nienaktadajacych sig na siebie lustrzanych odbié nazywanych enancjo- merami. Enancjomery sa fizycznie i chemicznie nierozr6znialne z wyko- rzystaniem wigkszosci technik, ale mozna je odr6énié na podstawie r6éne} skrecalnoéci plaszezyzny swiatla spolaryzowanego. Czasteczki Klasyfi- kuje sig jako prawoskretne (D; z greckiego ,,dextro” — prawy) lub lewo- skretne (L; z greckiego ,,levo” —lewy), w zaleznosci od tego, czy skrecaja one plaszezyzne Swiatla spolaryzowanego w kierunku zgodnym 2 rie chem wskazéwek zegara lub w przeciwnym. W bialkach wystepuja tylko L-aminokwasy. D-Aminokwasy wystepuja rzadko, ale mozna je zna- leé w Scianie komérkowej bakterii (patrz temat Al) i w pewnych antybiotykach. 20 standardowych aminokwas6w rééni sie od siebie jedynie struktura tafeucha bocznego (grupy .R”) (rys. 2 i 3). Biorac pod uwage podobien- stwa we wlasciwosciach laficuchéw bocznych aminokwasy mozna81 - Aminokwasy 25 @ 00) 00 I i WN E—n —o—n HNC H OH, ie? glicyna alanina walina tevoyna Gye) (Ala) Wal,\) (teu) coo" 00" i ‘WN-C—H WN E—H T Ho cH, o I cH, SH i cH izoleucyna metioniva pralina cysteina tio.) (Met. M) (ro, P) G0) o) femyjoalanina tyrozyna, tryptotan (Phe, F) yr.) (Tp, W) fs. 2, Standardowe aminokwasy. (a) Hydrofobowe, alfatyezne grupy R, (b) hydrofabowe, aromatyezne grupy R. Masy czasteczkowe aminokwasow podano w temacie B2, w tabeli 1 podzielié na grupy. Aminokwasy wykazuja rézne wtaéciwosci fizyko- chemiczne, zaleznie od natury laficuchéw bocznych. Niektére z nich sq kwasne, inne zasadowe. Niektére zawieraja male laticuchy boczne, inne — laricuchy 0 duzej masie. Niektére maja aromatyczne laticuchy boczne, inne polame. Niektére zapewniaja sztywnos¢ konformagji, inne uczest- nicza w tworzeniu wiazan wodorowych lub kowalencyjnych. Niektére sq chemicznie reaktywne Hydrofobowe aminokwasy alifatyczne W glicynie (Gly lub G) (rys. 2a), najmniejszym aminokwasie o najpros- tsze} strukturze, pozycje laficucha bocznego zajmuje atom wodoru. W czasteczce glicyny wystepuja wiec dwie identyczne grupy (atomy wodoru) polaczone z atomem C., w zwiazku z tym nie istnieje para enan-26 Sokcja B - Aminokwasy i biatka coo coo coo" 00" coo widen weben wwedan cgan wird oF om oe oe cH Oe or ool C00" CH, CH, CH | pH coo" 1 i wot NH Oh 4 bana na Ny argining lzyra histydyna asparaginian glutaminian (arg, F) (ys. k) Hs.) ‘asp, D) (Gi. E) » coo C00" coo coo" nme wyiago TANG wing cH,0H H—o—oH oh oH fo an’ %o or8) eet) “Rent sano) ‘, : . .Q) ys. 3, Standarcowe aminokwasy. (a) Polame grupy R obdarzone adunkiem, (b) polame grupy R pozbawione ladunku. Masy czasteczkowe aminokwaséw podano w temacie 82, w tabeli 1 cjomeréw. Alifatyczne lafcuchy bocene alaniny (Ala lub A), waliny Wal lub V), leucyny (Leu lub L}, izoleucyny (Ile lub I) i metioniny (Met lub M) (rys. 22) sq chemicznie niereaktywne i hydrofobowe. Prolina (Pro ub P) (rys. 2a) jest takze hydrofobowa, ale jej alifatyczny laticuch boczny jest polaczony z grupa aminowa, co prowadzi do usztywnienia konforma- i. Zawierajacy siarke laticuch bocany eysteiny (Cys lub C) (rys. 2a) jest réwniet hydrofobowy, ale wysoce reaktywny, zdoiny do reagowania z inna czastecaka cysteiny i tworzenia wiqzafi dwusiarczkowych (patra temat B3). Hydrofobowe aminokwasy aromatyczne Fenyloalanina (Phe lub F), tyrozyna (Tyr lub T) i tryptofan (Trp lub W) (rys. 26) sa hydrofobowe dzieki swym aromatycanym pierécieniom. Polarne aminokwasy obdarzone tadunkiem Wszystkie pozostate aminokwasy zawieraja polarne hydrofilowe lafcu- chy boczne, z kt6rych niekt6re sq obdarzone ladunkiem w pH neutral- nym. Grupy aminowe laficuch6w bocznych aminokwas6w zasadowych, argininy (Arg lub R) i lizyny (Lys lub K) (rys. 3a) sq w pH neutralnym tuprotonowane i stad obdarzone ladunkiem dodatnim. Earicuch boczny histydyny (His lub H) (rys. 3a) w pH neutralnym moze byé naladowanyB1 - Aminokwasy 27 dodatnio lub pozbawiony ladunku. Natomiast grupy karboksylowe tari- cuchéw bocznych aminokwas6w kwasnych, kwasu asparaginowego (asparaginian; Asp lub D) i kwasu glutaminowego (glutaminian; Glu lub E) (rys. 3a) w pH neutralnym ulegaja deprotonacji i maja ladunek ujemny. Polarne aminokwasy pozbawione tadunku Lanicuchy boczne asparaginy (Asn lub N) i glutaminy (Gin lub Q) (rys. 3b), amidowych pochodnych Asp i Glu, nie sa obdarzone tadunkiem, ale moga uczestniczy¢ w tworzeniu wiazan wodorowych. Seryna (Ser lub S) i treo- nina (Thr lub T) (rys. 3b) sq aminokwasami polarnymi dzieki zawartej w laricuchu bocznym grupie hydroksylowej i moga takze uczestniczyé w tworzeniu wiazarfi wodorowych (tak jak grupa hydroksylowa amino- kwasu aromatycznego Tyr).Sekcja B - Aminokwasy i biatka B2 Kwasy I ZASADY eae #ESEREELOA ERASE SOBER “Jonizacja | aminokwas6w Kwasy, zasady ipH “Rwasy, zasady i wasy, zasady i pH] + Grupy c-aminowa i a-karboksylowa w aminokwasie dziataja jak Tematy pokrewne —Aminokwasy (B1) pH jest miara steZenia H* w roztworze. Kwas jest donorem protont, F zasada jest akceptorem protonu. W wyniku jonizacii kwasu powstaje sprzezona z tym kwasem zasada, Oba zwigzki tworza spragéona pare kwas_zasada, Taka para jest na przyklad kwas octowy (CH;COOH) joctan (CH;COO). pK kwasu odpowiada takiemu pH, w ktérym polowa tego kwasu jest zdysocjowana. Rownanie Henderson PHasselbacha przedstawia zaleznosé miedzy pH, pK i proporcia kwasu do zasady, a wigc moze byé wykorzystane do obliczenia ich wartosei. Sprzgzona para kwas-zasada bedac odporna na zmiany pH dziala jak pufor. Punkt przegiecia na krzywej miareczkowania kwasu. odpowiada wartosci pK. Pojemnosé buforowa pary kwas-zasada {od thumacza: czyli je) zdolnosé buforowania) jest rowna wartosci pK #1 pH. W plynach fizjologicznych jako bufory dziataja jony fosioranowe i wodoroweglanowe. Aminokwasy, bialka, kwasy nukleinowe i lipidy takze wykazuja pewna zdolnosé buforowania. W laboratorium do utrzymania stalego pH roztworu stosuje sig inne zwiazki, na przyklad TRIS. ugrupowania kwas-zasada, uwalniajac lub przylaczajac protony, salednie od zmian pH. W niskim pH obie grupy sa calkowicie uprotonowane, ale wraz ze wzrostem pH najpierw grupa Karboksylowa, a potem grupa aminowa traca proton. Dla 20 standardowych aminokwas6w wartose pK miesci sie w granicach 18-29 dla grupy a-karboksylowej i 8,8-108 dla grupy a-aminowe). ‘Aminokwasy z laficuchem bocznym podlegajacym jonizacji maja dodatkowa grupe typu kwas-zasada z odrebna wartoscia pK. pH roztworu jest miara stezenia protonéw (H"). pH definiuje sig za pomioca rownania: i . PH = login logit] Ww kt6rym nawias kwadratowy oznacza stezenie molowe. Kwas moze byé definiowany jako donor protonéw, a zasada — jako akceptor protonéw: kwas <—> H* + zasada82 ~ Kwasy i zasady 29 Na przyklad: CH,;COOH «<—+ H'+CH,COO™ kwas octowy octan NH, <—> H'+NH, jon amonowy amoniak W wyniku jonizagji kwasu powstaje sprzezona z tym kwasem zasada. I odwrotnie, protonacja zasady prowadzi do powstania sprzezonego z ta zasada kwasu, Taka sprz¢zona pare kwas-zasada tworza, na przyklad, kwas octowy i octan. R6wnanie jonizacji slabego kwasu ma postaé: HA <> H+A" Stata r6wnowagi (K) tej jonizacji definiuje sie za pomoca rownania: HAT) [Ha] (réwnanie 1) pK kwasu definiuje sig jako: 1 K = -log K = log— PK = -logK = log pK kwasu odpowiada takiemu pH, w obecnosci ktérego polowa tego kwasu ulega dysocjacji, ti. gdy [A-] = [HA]. R6wnanie Hendersona-Hasselbacha przedstawia zaleanosé migdzy pHi proporcja kwasu do zasady, Punktem wyjécia w uzyskaniu tego row~ nania jest przeksztalcenie rownania 1. W wyniku tego przeksztalcenia uzyskuje sig rownanie: 1 i ad ta) K" [Hal Po zlogarytmowaniu obu stron tego réwnania otrzymuje sig: Ad 1 1 los ae 8 * Say fH) Podstawiajac w powyészym réwnaniu pH zamiast log 1/[H’]i pK zamiast log1/K uzyskuje sie rownanie: {Ad =pK pH =pK +053) nazywane réwnaniem Hendersona-Hasselbacha. Rownanie to wskazuje, de wartosé pK kwasu jest rowna pH roztworu, gdy stezenie molowe tego kwasu jest rowne stezeniu sprzezonej z nim zasady. Réwnanie Hender- sona-Hasselbacha pozwala na wyznaczenie pH roztworu, jesli znane sa stedenia molowe A-i HA oraz pk dla HA. Umodliwia ono rownied obli- czenie pK kwasu, jeéli znane sq stezenia molowe A” i HA oraz pH roztworu.Bufory Sekcja B- Aminokwasy i bialke Sprzezona para kwas-zasada, taka jak kwas octowy i octan, jest odporna na zmiany pH roztworu. Oznacza to, iz dziala jak bufor. W wyniku doda- nia jonéw wodorotlenowych (OH?) do roztworu kwasu octowego zacho- dzi reakcja: CH,COOH + OH> <—> CH3COO™ + H20. Krzywa zaleznosci pH tego roztworu od ilosci dodanych jonéw OH” nazywana jest krzywa miareczkowania (rys. 1). Na tej krzywej istnieje punkt przegiecia w pH 4,8, co odpowiada pK kwasu octowego. W poblizu tego pH stosunkowo duda ilosé OH” (lub H*) wywoluje niewielka zmia- ne pH, poniewaz dodawane jony OH" (lub H*) reaguja odpowiednio CH3COOH (lub CHsCOO°). Slabe kwasy najskuteczniej przeciwdzialaja zmianie pH roztworu, jesli réani sig ono nie wigce| niz o jednostke od ich pK (rys. 1). Wlagciwosé ta czesto przedstawiana w postaci wyrazenia pK = 1 nazywana jest pojemnoscia buforowa. Plyny fizjologiczne, w tym cytozol i plyny zewnatrzkomérkowe jak krew, sa buforowane. Na przyklad, pH krwi zdrowych osobnikéw jest precyzyjnie utrzymywane na poziomie 7,4. W wigkszosci plynow fizjo- logicznych gléwnymi zwiqzkami buforujacymi sq jony fosforanowe (ELPO.;, pK 6,82) i jony wodoroweglanowe (HCOs-, pK 6,35), poniewaz wartosci ich pK mieszcza sig w wymaganym zakresie. Jednakze wiele bio- logicenych czasteczek, w tym aminokwasy, bialka, kwasy nukleinowe i lipidy, zawieraja liczne grupy kwasowo-zasadowe, ktore stanowia skute- czne elementy buforujace w fizjologicznym zakresie pH (pH 6-8). W pracy nad enzymami, bialkami i innymi biologicznymi czasteczkami cagsto kluczowe znaczenie ma utrzymanie stalego pH roztworu, co pozwala na uniknigcie denaturacji (utraty aktywnosci) badanych czqste- czek (patrz. temat C3). W tym celu w laboratoriach uzywa sie rézne bufory. Jednym z najczesciej stosowanych jest tris(hydroksymetylo)aminometan lub TRIS, kt6rego pK wynosi 8,08. dodane rOwnowaéniki OH ° ys. 1. Krzywa miareczkowania kwasu octowego2 - Kwasy i zasady Jonizacja aminokwasow 20 standardowych aminokwaséw zawiera dwie grupy typu kwas-zasa- da: grupe a-aminowa i a-karboksylowa, polaczone 2 atomnem C,,. Amino- kwasy z laficuchem bocznym podlegajacym jonizacji (Asp, Glu, Arg, Lys, His, Cys, Tyr) maja dodatkowa grupe typu kwas-zasada. Na rysunkw 2a przedstawiono krzywa miareczkowania Gly. W niskim pH (tj. duzym stezeniu protonéw) zar6wno grupa aminowa, jak i karboksylowa sq calkowicie uprotonowane, wskutek czego aminokwas wystepuje w posta- ci kationu H3N*CH2COOH (rys. 2b). Poniewaz w roztworze aminokwas podlega miareczkowaniu przez wzrastajace ilosci silne} zasady (np. NaOH), traci dwa protony, pierwszy z grupy karboksylowej 0 mniejsze] wartosci pK (pK = 2,3) i nastepnie z grupy aminowej o wiekszej wartosci pK (pK = 9,6). WartoSé pH, w ktérego obecnoéci Gly ma zerowy tadunek wypadkowy, jest nazywana je punktem izoelektrycznym, pI. Wartosci pk grup a-karboksylowych wszystkich 20 standardowych aminokwas6w mieszcza sie w granicach 1,8-2,9, a ich grup a-aminowych w granicach 8,8-10,8 (tabela 1). Dla Jaticuchéw bocznych aminokwaséw kwasnych Asp i Glu wartosé pK wynosi odpowiednio 3,9 i 4,1, natomiast dla aminokwa- sw zasadowych Arg i Lys odpowiednio 12,5 i 108. Jedynie laficuch boczny His, dia ktorego wartosé pK wynosi 6, podlega jonizacji w fizjolo- gicznym zakresie pH (6-8). Nalezy pamietaé 0 tym, Ze kiedy amino- kwasy lacza sig ze soba w bialku, jonizacji moga podlegaé jedynie ich laficuchy boczne oraz koricowa grupa a-aminowa i a-karboksylowa, odane rownowazniki “OH " H OH H H sun bcoon es tab 000 Se nb 000" I I | a @ eo Rys. 2, Jonizacia glicyny. (a) Krzywa miareczkowania glicyny, (b) dysocjacja glicyny. Liczby w nawlasach w ozesci (a) odpowiadaja sirukturom przedstawionym w czesci (b)Sekcja B- Aminokwasy i biatka Tabela 1. Wartosci pK i masy czasteczkowe 20 standardowych aminokwasow Aminokwas Moz. pKa-COOH pK a-NH3* oo Alanina 89,1 2,35 9,87 Arginina 174.2 1,82 8,99 12,48 Asparagina 1321 2,14 8,72 Cysteina 1212 1,92 10,70 837 Fenyloalanina 165,2 2,20 9,31 Glutamina 1462 217 9,13 Glicyna 75,1 2,35 9,78 Histydyna 1852 1,80 9,33 6,04 Izoleucyna 131,2 2,32 9,76 Kwas asparaginowy 1331 1,99 9,90 3,90 Kwas glutaminowy 1474 2,10 9.47 4,07 Leucyna 131,2 2,33 9,74 Lizyna 146.2 2,16 9,06 10,54 Metionina 149,2 2,13 9,28 Prolina 115.1 1,95 10,64 Seryna 105,1 219 9,21 Treonina 119.41 2,09 9,10 Tryptofan 204,2 2,46 941 Tyrozyna 181.2 2,20 9,21 10,46 Walina V7.4 2,29 9,74Sekcja B - Aminokwasy i biatka B3 STRUKTURA BIAEKA | ao a A ae a a a a Bialko to liniowa sekwencja aminokwas6w polaczonych ze soba wiazaniami peptydowymi. Wiazanie peptydowe jest wiazaniem kowalencyjnym miedzy grupa a-aminowa jednego aminokwasu i grupa a-karboksylowa kolejnego. Wiazanie peptydowe ma czeSciowo charakter wiazania podwé6jnego i prawie zawsze wystepuje ww konfiguragji trans. Konformacja szkieletu laricucha polipeptydowego jest determinowana przez wartosci katéw rotacji wiazatt C.-N (fi, ) iCu-C (psi, y) wystepujacych w jego kazdej reszcie aminokwasowej. Przestrzennie dozwolone wartosci ¢ i y moéna odczyta¢ z wykresu Ramachandrana. Kiedy dwa aminokwasy sa polaczone wigzaniem peptydowym, tworza dipeptyd. Przylaczanie kolejnych aminokwas6w prowadzi do powstania oligopeptydéw i polipeptydow. Liniowa sekwencja aminokwas6w polaczonych ze soba za pomoca wiazania peptydowego jest nazywana struktura pierwszorzedowa bialka. W strukturze pierwszorzedowej bialka zawieraja sig rowniez. kowalencyjne wigzania dwusiarczkowe miedzy resztami cysteiny Struktura drugorzedowa bialka dotyczy regularnego pofaldowania rejonéw laticucha polipeptydowego. NajczeSciej wystepujacymi typami struktury drugorzedowej sa o helisa i struktura 8, a Helisa stanowi cylindryczne, spiraine ulozenie aminokwas6w w laficuchu polipeptydowym, utrzymywane dzieki wiazaniom wodorowym, przebiegajacym réwnolegie do osi helisy. W strukturze § wiazania wodorowe powstaja miedzy przylegajacymi czesciami polipeptydu, ktére sq ulogone w tym samym kierunku (rownolegla struktura p) lub w przeciwnych kierunkach (antyréwnolegla struktura B). Zwroty odwracaja kierunek przebiegu laticucha polipeptydowego i czesto lacza korice antyréwnoleglych struktur B. Struktura trzeciorzedowa to przestrzenne ulozenie wszystkich aminokwas6w w laricuchu polipeptydowym. Ta biologicznie aktywna, natywna konformacja jest utrzymywana dzi¢ki szeregowi wigzaf niekowalencyjnych. W przypadku bialek, w ktérych sklad wehodzi wigcej niz jeden Jaficuch polipeptydowy, wystepuje struktura czwartorzedowa. Dotyczy ona przestrzennego ulodenia polipeptydowych podjednostek inatury oddzialywaft miedzy nimi. ‘Obok wiazai peptydowych migdzy resztami poszczegéInych amino- kwas6w w stabilizacji struktury przestrzennej biatka uczestnicza wigzania niekowalencyjne (sily elektrostatyczne, odd:34 Sekcia 8 - Aminokwasy i bialke van der Waalsa, wiazania wodorowe, oddzialywania hydrofobowe) i wiazania kowalencyjne (wiazania dwusiarczkowe). Bialka falduja sig spontanicznie osiagajac natywna konformade, przy czym powstajaca struktura przestrzenna warunkowana jest przez ich strukture pierwszorzedowa. Faldowanie sig bialek zasilane jest glownie przez oddzialywania hydrofobowe, a w jego przebiegu moana wyr6znié uporzadkowany cig wydarzef. W komérce wystepuja bialka pomocnicze wspomagajace prawidlowe faldowanie innych bialek. Naleza do nich izomerazy dwusiarczkowe bialek, izomerazy peptydyloprolilowe cis-trans i molekularne chaperony. Strukture przestrzenng bialka mogna wyznaczyé za pomocq krystalografii rentgenograficznej i spektroskopii jadrowego rezonansu magnetycznego (NMR). Tematy pokrewne Aminokwasy (B1) Kolagen (B5) Mioglobina i hemoglobina (B4) __ Kod genetyczny (E11) Biatka sa liniowymi sekwencjami aminokwas6w polaczonych ze soba wiazaniami peptydowymi. Wiazanie peptydowe to chemiczne, kowalen- cyjne wiazanie powstajace miedzy grupa a-aminowa jednego a grupa ackarboksylowa kolejnego aminokwasu (rys. 1a) (patrz temat B1). Kiedy dwa aminokwasy zostang polaczone wigzaniem peptydowym, tworza dipeptyd, na ktérego koricach nadal znajduja sie wolna grupa aminowa i karboksylowa; kazda z nich moze sie polaczyé z kolejnym aminokwa- sem. Tak wigc, dlugie, nierozgalgzione Jaficuchy aminokwaséw moga zostaé polaczone ze soba wiazaniami peptydowymi do postaci oligopep- tyd6w (do 25 reszt aminokwas6w) i polipeptydéw (> 25 reszt aminokwa- s6w). Nalezy zauwazyé, ze polipeptyd nadal zawiera wolna grupe a-ami- nowa i wolna grupe a-karboksylowa. Zgodnie z przyjeta konwencja laticuchy peptydowe zapisuje sie w ten spos6b, ze wolna grupa a-aminowa jest umieszczana po lewej stronie, wolna grupa a-karboksylowa po prawej, a lacznik migdzy aminokwasami oznacza wigzanie peptydowe. Oligopeptyd *H3N-seryna-leucyna-feny- loalanina-COO- mozna zapisaé takze w prostszej postaci jako Ser-Leu- -Phe lub S-L-F. Dzigki bliskoSci wiazania podw6jnego miedzy weglem karbonylowym a tlenem, ktére umogliwia powstanie przedstawionych na rysunku 1b struktur rezonansowych, wigzanie peptydowe miedzy weglem i azotem wykazuje czeSciowo charakter wiazania podwéjnego. Z tego powodu wigzanie C-N jest takée krotsze niz zwykle pojedyneze wiazanie C-N. W zwiazku z tym grupa peptydowa, zbudowana z atoméw CO-NH, jest stosunkowo sztywna i plaska, ale modliwa jest swobodna rotacja wokét wigzati Cy-N i Ca-C (a wige wok6l wiazati po obu stronach wiazania pep- tydowego), co umoiliwia ustawienie sqsiednich grup peptydowych pod réanym katem (rys. 1c). Wodér grupy aminowej prawie zawsze znajduje sie w polozeniu trans (przeciwstawnym) wzgledem tlenu grupy karbony- lowej, a nie w polozeniu cis (przylegtym).83 - Struktura biatka 35 @ H tanebo HN=G— 0 pa R, o o) ° th mde aoe 4 9 7 a 7 + Hon + 10 4 D wigzanie peptydowe sztywne, plaskie grupy peptydowe a wife ]ufo ]u o 1 oti iit ou asthenia ae swobodna rotacja wokot wiazan CaNiCy-C ys. 1. (a) Tworzenie wiazania peptydowego, (b) stniktury rezonansowe wiazania peptydowego, (c) grupy peptycowe w obrebie polipeptydu Szkielet bialka tworza polaczone kolejno sztywne plaskie grupy pepty- dowe. Konformacja tego szkieletu jest determinowana przez katy rotacji lub katy torsyjne wiazan C.-N (fi, ¢) iCu-C (psi, ») wystepujacych w kaz- dej reszcie aminokwasowej. W plaskim, calkowicie rozciagnietym laficu- chu polipeptydowym wartos¢ kazdego z katow iy wynosi 180° i wzra- sta w ptzypadku rotagi zachodzacej zgodnie z ruchem wskazéwek zegara wzgledem Cu (rys. 2). Zakres kombinacji wartosci katéw torsyjnych ¢ iv w laricuchu polipeptydowym jest ograniczony z powodu przeszkody przestrzennej. Przestrzennie dozwolone wartosci i y mogna wyznaczyé obliczajac odleglosé miedzy atomami tripeptydu dla wszystkich wartosci pip wiazati Co-Ni C.-C, w kt6rych uczestniczy centralnie potozony Ca. Zakres wartosci katéw torsyinych mozna przedstawié za pomoca prze- strzennego wykresu konturowego nazywanego mapa konformacyjna lub wykresem Ramachandrana (rys. 3). Analizujac rysunek 3 mogna stwier- dzié, ze wiekszosé obszar6w na wykresie Ramachandrana (czyli wie- kszoSé kombinacji wartosci p ip) jest konformacyjnie niedostepna dla laficucha polipeptydowego. Tylko trzy male obszary przedstawionej mapy konformacyjne} sa fizycznie modliwe, a zawarte w ich granicach wartosci gy odpowiadaja prawoskretnej a helisie, r6wnolegiej i anty- réwnoleglej strukturze f oraz helisie kolagenowej (patrz. ponizej i temat BS). Earicuch polipeptydowy falduje sie, dzieki czemu powstaje specyfi- czny ksztalt (kon formacja) bialka. Konformacja to przestrzenne utozenie atoméw w strukturze, kt6re mozna wyznaczyé na podstawie sekwengji aminokwaséw. Istnieja cztery poziomy struktury bialek okreslane jako struktura pierwszorzedowa, drugorzedowa, trzeciorzedowa i wystepu- jaca czasami, lecz nie zawsze, czwartorzedowa.36 Sekcja B ~ Aminokwasy i hialke ys. 2. Fragment faficucha polipeplydowego prezentujacy katy torsyine wiazania GoW (p) i wigzania Cu-C fy) vv (stopnie) 180 3 4 (stopnie) ys. 3. Wykres Ramachandrana ukazujacy dozwolone wariosci katow torsyjnych la pol-t-alaniny (szare obszary). a, wartose! gy dozwotone da prawoskretne) helisy; B, antyrownolegta struktura B; 8" rownolegta struktura p; C, helisa kolagenowa Struktura Struktura pierwszorzedowa bialka to liniowa sekwencja aminokwaséw pierwszorzedowa polaczonych wiazaniami peptydowymi. Sekwencje te wyznacza sig na podstawie kolejnogci ulozenia zasad azotowych w genie kodujacym dane bialko (patrz temat H1). W strukturze pierwszorzedowej zawarte jest row- nieg polozenie wszystkich innych wiazan kowalencyjnych. Sa to glownie wiazania dwusiarcekowe migdzy resztami cysteiny, sasiadujacymi ze soba w przestrzeni, ale nie w sekwencji liniowej aminokwasow. Owe kowalencyjne wiazania poprzecane migdzy odrebnymi laricuchami poli- peptydowymi lub migdzy réanymi czeéciami tego samego laficucha83 Struktura biatke 37 Struktura drugorzedowa powstaja na skutek utlenienia grup SH w resztach cysteiny, sasiadujacych ze soba w przestrzeni (rys. 4). Powstaly dwusiarczek jest nazywany reszta cystyny. Wiazania dwusiarczkowe wystepuja czesto w bialkach ze- wnatrzkomérkowych, ale rzadko w bialkach wewnatrzkomérkowych. Niekt6re bialka, takie jak kolagen, zawierajq kowalencyjne wiazania poprzeczne miedzy laricuchami bocznymi reszt Lys (patrz temat BS). i i 1 “HN 6000) THN 8008 GH Gre ‘SH s ° 1 + 2H! r i GH he TUNES G00? UNG 080" t | Rys. 4. Tworzenio wigzan dwusiarczkowych miedzy dwoma resztami cysteiny, prowadzace do powstania cystyny Struktura drugorzedowa bialka to regularne pofaldowanie region6w laticucha polipeptydowego. Najczesciej wystepujacymi sposobami po- faldowania bialka sq a helisa i stuktura B. W przypominajacej cylinder a helisie aminokwasy ustawiajq sig w ten spos6b, Ze powstaje regularna konformacja okreslana potocznie jako spiralna (rys. 5a). Tlen karbonylowy kazdego wiazania peptydowego jest polaczony wiazaniem wodorowym z. wodorem grupy aminowej czwartego z kolei aminokwasu (rys. 5b), przy czym wiazanie wodorowe przebiega prawie réwnolegle do osi helisy. Na jeden obrot «. helisy przypada 3,6 aminokwaséw, co odpowiada 0,54 nm, natomiast odlegtosé miedzy dwoma aminokwasami wzdluz osi a. helisy wynosi 0,15 nm (rys. 5a). Wszystkie laricuchy boczne aminokwaséw znaj- duja sie na zewnatrz cylindrycznej helisy (rys. 5c). Pewne aminokwasy wystepuja w a helisie czeSciej niz inne. W szczegélnosci w a helisie rzadko wystepuje Pro, ktéra na skutek braku atomu wodoru zwigzanego 2 ato- mem azotu nie moze tworzyé prawidtowego ukladu wiazan wodoro- wych. Z tej przyezyny Pro wystepuje czesto na koricu « helisy, poniewaz, zmienia kierunek Jaficucha polipeptydowego i przerywa strukture he Roane bialka wykazuja rézny stopien pofaldowania laricucha polipepty- dowego w a helisy. Na przyklad mioglobina zawiera osiem « helis (patrz temat B4), W strukturze B wiazania wodorowe powstaja miedzy wiazaniami pep- tydowymi régnych lattcuchéw polipeptydowych lub régnych czesci tego samego laticucha polipeptydowego (rys. 62). Plaskie wiazanie peptydowe sprawia, Ze laricuch polipeptydowy przyjmuje postaé pofaldowanej kartki z laticuchami bocznymi aminokwaséw znajdujacymi sie powyZej lub ponizej je} plaszczyzny (rys. 60). Laficuchy polipeptydowe sasiadujace ze soba w strukturze Bp moga byé rownolegle lub antyréwnolegle, zaleznie38 Sekcja B - Aminokwasy { biatka « tomy C, kole|nych / reszt aminokwasow 3.6 aminokwaséw na obrot 0,1 nm (100*rotagji na reszte) olozenie szkieletu palipeptydowego zlozonego 2 atomow Ci O-N ‘wigzania peptydowego' wigzanie wodorowe ys. 5. Faldowanie sig fancucha polipeptydowego w « helise. (a) Model a helisy unzgledniajacy ty/ko atomy Ca laricucha; (b) wer helisie grupa CO reszty n jest potaczona wiazaniem wodorowym 2 grupa NH reszty (n+4); (c) przekr6j poprzeczny a helisy prezentujacy polagenie taricuchéw bocznych (grup R) aminokwasow na zewnatrz helisy od tego, czy przebiegaja one odpowiednio: w tym samym kierunku lub kierunku przeciwnym (rys. 6c). Earicuch polipeptydowy w obrebie struk- tury B jest do tego stopnia rozciagniety, ze odleglosé miedzy dwoma sasiednimi atomami C, wynosi 0,35 nm. Struktury B sa zawsze lekko zakrzywione i w obecnosci kilku laficuchéw polipeptydowych moga sie Sciegni¢ i utworzyé beczutke fp. Wielokrotne struktury B sq podstawa wytrzymatosci i sztywnoéci bialek strukturalnych, takich jak fibroina jed- wabiu, kt6ra prawie calkowicie sklada siez antyrownoleglych struktur B. Tworzac Scisle upakowana strukture bialka globulamego laficuch poli- peptydowy czesto zmienia kierunek przebiegu, formujac ,spinke do wlo- w” lub zwrot f. W zwrotach f tlen karbonylowy jednego aminokwasu jest polaczony wiazaniem wodorowym z wodorem grupy aminowej czwartego z kolei aminokwasu (rys. 7). Zwroty B czesto lacza korice antyréwnoleglych struktur p. Rejony aricucha polipeptydowego pozba- wione regularnej struktury drugorzedowej przyjmuja konformacje zwo- ju lub petli. Taka postaé moze przyja¢ ponad polowa taricucha poli- peptydowego typowego bialka globularnego. Strukeura Struktura trzeciorzedowa dotyczy przestrzennego ulozenia aminokwa- s6w zaréwno odleglych w sekwengji liniowej, jak i tych, ktére ze soba sasiaduja. Koficowa struktura przestrzenna jest determinowana przez83 ~ Struktura biatka 39 « wet! GHW —0—GH—=N—=G — CH HoOR ° wiggania : wodorowe —“! : i ii eT Hono N R R Row NTT # \ i | Poi Lf L rowmoleata Ls LA LY oo « NY e Na PoP $1 fantyrounolegia R R R ci " ys. 6. Faldowanie sig faricucha polipeptydowego w strukture 8. (a) Wigzania wodo- rows migazy dwoma ezesciam’ faricucha polipeptydowego tworzacego sirukture B; (b) widok z boku na facuch polipeptydowy pofaldowany w postacl struktury 8, prezentujacy potaczone z atomami Ca taricuchy boczne (grupy A) wystajace powyzej i ponizej plaszezyzny struktury; (c) poniewaz taricuch polipeptydowy wykazujo polarosé, moga powstawaé rownolegte lub antyrownolegte struktury B sekwencjg aminokwas6w (rys. 8). W przypadku rozpuszczalnych w wo- dzie bialek globularnych takich jak mioglobina (patrz temat B4), podsta~ wowa sila odpowiedzialna za faldowanie sig laticucha polipeptydowego jest energetyczny wymég oddzielenia niepolarnych aminokwas6w od wodnego, hydrofilowego otoczenia przez schowanie ich w hydrofobo- ‘wym wnetrzu. Earicuch polipeptydowy falduje sie spontanicanie w ten sposdb, ze wiekszosé jego hydrofobowych laricuchéw bocznych zostaje skierowana do wnetrza powstajace| struktury, a wigkszos¢ jego polarnych, abdarzo- taftcuch polipeptydowy wigzanie wodorowe ys. 7. Faldowanie sie tanicucha polipeptydowego w zwrot BSekcja B - Aminokwasy i hiatka Struktura czwartorzedowa Stabilnogé biatka (2) ~Arg~Val-Giu-Lys-Met~Val=Leu~Ala~ Gly (b) ( (a) Rys. 8 Cztory poziomy struklury biatka. (a) Siruktura pienwszorzedowa (sskwencja amipokwasowa), (b) struktura drugorzedowa (a heltsa), (c) struktura trzeciorzedowa, (d) straktura czwartorzedowa nych ladunkiem laricuch6w bocznych znajduje sig na je} powierzchni. Biologicznie aktywna (natywna) przestrzenna konformacja bialka jest utrzymywana nie tylko dzi¢ki oddzialywaniom hydrofobowym, ale takze przez sily elektrostatyczne, wiazania wodorowe i, jesli obecne, kowalen- cyine wiazania dwusiarezkowe. Sily elektrostatyczne obejmuja wiazania jonowe miedzy przeciwstawnie naladowanymi grupami i liczne slabe oddzialywania van der Waalsa miedzy écidle upakowanymi alifatycz~ nymi laricuchami bocznymi we wnetrzu bialka W przypadku bialek zawierajacych wigce| niz jeden laticuch polipepty- dowy, takich jak hemoglobina (patrz temat B4), wystepuje najwyzszy poziom organizagj bialka nazywany struktura cewartorzedowa (rys. 8). Struktura ta dotyczy przestrzennego ulozenia polipeptydowych podjed- nostek i natury oddzialywaft miedzy nimi. Tymi oddzialywaniami moga byé wiazania kowalencyjne (np. wiazania dwusiarczkowe) lub oddzia- tywania niekowalencyjne (sily elektrostatyczne, wigzania wodorowe § oddzialywania hydrofobowe). Natywna przestrzenna konformaga biatka utrzymywana jest przez ze staw wiazati niekowalencyjnych (sily elektrostatyczne, wiqzania wodo- rowe, oddzialywania hydrofobowe) i wiazania kowalencyjne, czyli wiazania dwusiarczkowe i wiazania peptydowe migdzy kolejnymi aminokwasami. @ Sily elektrostatyczne: to oddziatywania miedzy dwoma grupamijono- wymi przeciwstawnym jadunku, czesto nazywane rownied, para jonowa lub mostkiem solnym. Tego typu oddzialywanie zachodzi na przyklad miedzy grupa aminowa lizyny i grupa karboksylowa aspara-B3 ~ Struktura bialka a ginianu. Do tego typu oddzialywan zalicza sig takée niekowalencyjne polaczenia migdzy elektrycznie obojetnymi czqsteczkami okreslane Jacznie terminem oddziatywania van der Waalsa. Polegaja one na od- dzialywaniach elektrostatycznych migdzy trwatymi i/lub indukowa- nymi dipolami, takimi jak grupy karbonylowe w wiazaniach pepty- dowych. * Wigzania wodorowe: to najczesciej oddziatywania elektrostatyczne miedzy grupa donorowa bedaca slabym kwasem oraz akceptorowym atomem zawierajacym wolna pare elektronéw i posiadajacym dzieki temu czastkowy tadunek ujemny, co z kolei jest czynnikiem przy- ciagajacym atom wodoru. W ukladach biologicznych grupa donorowa jest atom tlenu lub atom azotu polaczony kowalencyjnie z atomem wodoru, a akceptorem jest atom tlenu lub azotu (rys. 9). Diugosé wiazant wodorowych wynosi 0,27-0,31 nm i wykazujq one scisle ukie- runkowany charakter. Jesli donor, atom wodoru i akceptor leza w jed- nej linii, powstaje wiazanie kolinearne. Wiazania wodorowe sa silniej- sze niz oddzialywania van der Waalsa, ale duzo slabsze niz wiazania kowalencyjne. Odgrywaja istotna role w tworzeniu struktury prze- strzennej nie tylko bialek, ale takze innych biologicznych makro- czasteczek, takich jak dwuniciowa helisa DNA (patrz temat Fl), lub ich zestaw6w, takich jak dwuwarstwa lipidowa (patrz temat El). Ponadto wiazania wodorowe sq podstawa zaréwno wlasciwosci wody, jak i jej roli jako rozpuszczalnika biochemicznego. « Oddziatywania hydrofobowe: to oddzialywania odpowiedzialne za minimalizowanie powierzchni kontaktu niepolamych czasteczek 2 ota- czajaca je woda. Mozna je tatwo zaobserwowaé w przypadku czaste- czek amfipatycznych, takich jak lipidy i detergenty, tworzacych micele w roztworze wodnym (patrz temat El). W procesie powstawania struk- tury przestrzenne} bialka dochodzi takze do eliminowania kontaktu miedzy niepolarnymi taricuchami bocznymi i roztworem wodnym. Dlatego oddzialywania hydrofobowe sq istotnym czynnikiem warun- kujacym strukture biatek, ich faldowanie sig i stabilnogé, Skutek dziatania oddzialywan hydrofobowych w przypadku bialek okreslany jest czesto terminem wiazan hydrofobowych, co sluzy podkresleniu Kluczowej roli oddzialywari hydrofobowych w procesie faldowania sie biatek. oh Ne oH 0 NH O==¢! OH -0=6) ys. 9. Preyklady wiazan wodorowych (przeastawionych w postaci kropkowaney lini)a2 Fatdowanie sig biatka Wyznaczanie struktury biatka Sekcja B ~ Aminokwasy i biatka Wigzania dwusiarczkowe: to wiazania kowalencyjne powstajace mie- dzy dwiema resztami cysteiny, polozonymi blisko siebie w kofcowe} strukturze przestrzennej bialka (patrz.rys. 4), ktorych funkcja polega na stabilizacji tej struktury. Wigzania dwusiarczkowe powstaja w utle- niajacym érodowisku retikulum endoplazmatycznego (patrz temat A2), j dlatego moina je gtownie znale#é w bialkach zewnatrzkomérkowych i podlegajacych sekrecji. W odpowiednich warunkach fizjologicznych bialka falduja si spontani- canie osiagajac natywna konformacje. Proces ten nie wymaga udzialu matrycy zewnetrznej, co oznacza, ze struktura przestrzenna biaika deter- minowana jest przez jego strukture pierwszorzedowa. Wyniki badasi nad bialkiem RNAza A dowodza, iz o faldowaniu sie bialka w natywna kon- formacje decyduja gléwnie jego reszty aminokwasowe kierowane do wnetrza powstajacej struktury. Uzyskana dzieki mutacjom zmiana reszt aminokwasowych zlokalizowanych na powierzchni ma bowiem mniejszy wplyw na proces faldowania sie biatka, niz. zmiana reszt znajdujacych si¢ wewnatrz. Stwierdzono take, iz glowna sila kierujaca faldowaniem si¢ ialka sa oddzialywania hydrofobowe. Bialka osiqgaja natywna konfor- macje dzicki uporzadkowanemu ciagowi wydarzefi, a nie metoda prob i bledow. Chociaz w warunkach in, vitro (w laboratorium) bialka moga si¢ fatdowaé bez udzialu bialek pomocniczych, proces ten jest dlugotrwaly (minuty—dni). W warunkach in vivo (w komérce) proces ten przebiega szybko (kilka minut), poniewaz komérki zawieraja bialka pomocnicze wspomagajace faldowanie sie polipeptyd6w i osiagnigcie natywnej kon- formacji. Wyrdznia sie trzy Klasy bialek pomocniczych wspomagajacych faldowanie sie bialek: « izomerazy dwusiarczkowe biatek ulatwiajac tasowanie mostkow dwu- siarczkowych w bialku umotliwiaja odnalezienie prawidlowych polaczert; « izomerazy peptydyloprolilowe cis-trans przyspieszaja, wolny w ich nieobecnosci, proces przeksztalcenia wiazania peptydowego X-Pro (X oznacza dowolny aminokwas) z konfiguragi cis w trans, co ulatwia faldowanie sig polipeptydéw zawierajacych proline. Inhibitorem jedne} z grup izomeraz peptydyloprolilowych cis-trans jest lek immunosupre- syjny, cyklosporyna A; « molekularne chaperony, do ktérych zalicza sie bialka szoku termicz~ nego (hsp70), chaperoniny i nukleoplazminy, zapobiegaja niepra- widtowemu faldowaniu si¢ bialek i ich agregacji, mogacych sig pojawi¢ w warunkach umodliwiajacych oddzialywania miedzy wewnetrznymi hydrofobowymi obszarami. Strukture przestrzenna bialka mozna wyznaczyé niemal na poziomie ato- mowym za pomoca technik krystalografii rentgenograficznej i spektro- skopii jadrowego rezonansu. magnetycznego (NMR). W krystalografii rentgenograficzne} badany krysztat bialka poddawany jest dzialaniu wiazki promieni rentgenowskich, a powstajacy w wyniku kontaktu pro- mieni rentgenowskich 2 krysztalem obraz dyfrakcyjny rejestrowany jestB3 ~ Struktura biatka 43 na filmie rentgenowskim. Intensywnos¢ dyfrakcji (natezenie plamek na filmie) stanowi punkt wyjgcia analizy matematycznej, pozwalajacej ustalié tréjwymiarowy obraz badanego krysztatu. Spektroskopia NMR pozwala na wyznaczenie struktury przestrzennej malych biatek (do okoto 30 kDa) w roztworze wodnym.Sekcja B - Aminokwasy i biatka B4 MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA SPERLESESRERSIN (Mesos OLeeeeesReRERwERS Hasta Bialka wigzace tlen | Mioglobina Wiazanie denu zhemem Mechanizm zmi allosterycenej Hemoglobina i mioglobina to dwva bialka wiazace tlen, wystepujace w duzych, wielokomérkowych organizmach. Hemoglobina transportuje ten we krwi i znajduje sig w erytrocytach; mioglobina stanowi magazyn tlenu w migsniach. Mioglobina to pierwsze bialko, ktérego strukture przestrzennq poznano dzieki wykorzystaniu rentgenografii. Jest to bialko globularne, utworzone przez pojedynczy taficuch polipeptydowy Zlogony ze 153 aminokwas6w i faldujacy sig w osiem a: helis. Grupa prostetyczna w postaci hemu jest umiejscowiona w hydrofobowym zaglebieniu pofaldowanego laficucha. Hemoglobina ma strukture czwartorzedowa, poniewai jest zbudowana z czterech taricuchéw polipeptydowych; dwéch Iaricuchéw a i dwéch laricuchéw f (as)h:), 2 ktorych kazdy zawiera grupe prostetyezng. Mimo niewielkiego podobienstwa struktury pierwszorzedowej, poszczegéine laticuchy polipeptydowe hemoglobiny wykazuja strukture przestrzenna niemal identyczna zlaticuchem polipeptydowym mioglobiny Hemowa grupa prostetyczna sklada sig z pierscienia protoporfiryny IX i centralnie polozonego atomu Fe”, ktory tworzy cztery wiazania z pierscieniem porfiryny. Poza tym, po jedntej stronie plaszezyzny pierScienia porfiryny Fe* tworzy wiazanie z histydyna proksymalna (His F8) — ésmym aminokwasem w helisie F hemoglobiny. Széstym. wiazaniem Fe™ laczy sig z czasteczka O>. W poblizu miejsca wiazania ©; majduje sig druga reszta histydyny, histydyna dystalna (His E7), ktéra bardzo skutecznie przeciwdziala wiazaniu sie tlenku wegla Hemoglobina jest biatkiem allosterycznym. Wiazanie O jest kooperatywne; zwiazanie O> z jedna podjednostka ulatwia jego wiazanie przez kolejne podjednostki. Krzywa dysocjagji tlenu dla hemoglobiny ma ksztalt sigmoidalny, natomiast dla mioglobiny — hiperbolicany. Mioglobina wykazuje wigksze powinowactwo w stosunku do O> niz hemogiobina. Struktura czwartorzedowa hemoglobiny utlenowanej rézni sig od struktury czwartorzedowe| hemoglobiny nientlenowanej. Zwiazanie O22 Fe’ znieksztatca grupe hemowa i przesuwa histydyne proksymalna. To z kolei powoduje przesunigcie helisy F i zmiane ‘oddziatywan migdzy czterema podjednostkami.84 - Miogiobina i hemoglobina 45 Tematy pokrewne Struktura bialka (B3) Hemyy i chlorofile (M4) Hi’, CO) i 2,3-bisfosfoglicerynian sq regulatorami allosterycznymi, ulatwiajacymi uwolnienie O, z hemoglobiny. H” i CO, wiaza sie z réénymi czeSciami taricuch6w polipeptydowych, a 2,3-bisfosfo- glicerynian wiaze sig w Srodkowej przestrzeni czasteczki miedzy czterema podjednostkami. Hemoglobina F (HbF) wystepujqca u plodu sklada sig z dwéch Jaicuch6w a. i dwéch laficuch6w y (az/2). HbF wigze 2,3-bifosfoglicerynian slabiej niz hemoglobina doroslych (HbA), dzieki czemu HbF wykazuje wieksze powinowactwo wzgledem O:, co ulatwia przenoszenie O: z krwi matki do krwi plodu. Poréwnanie sekwengji hemoglobin réznych gatunk6w doprowadzito do twierdzenia, Ze niezmiennych jest tylko dziewie¢ aminokwaséw. Niektre aminokwasy podlegaja konserwatywnej substytuji przez reszty 0 podobnych wiasciwosciach, inne w wyniku niekonserwa- tywnej substytucji zostaja zastapione przez reszty o innych wlasciwosciach. Hemoglobinopatie to choroby bedace skutkiem nieprawidiowej hemoglobiny. Najlepiej poznana choroba tego typu jest przekazywana genetycznie niedokrwistosé sierpowata. Jest ona wywolana niekonserwatywna substytucja glutaminianu przez waline, prowadzaca do powstania hydrofobowych lepkich miejsc na powierzchni bialka. Miejsca te sq odpowiedzialne za tworzenie sie dlugich agregujacych wiokien deformujacych ksztalt krwinek czerwonych. Heterozygoty wzgledem genu sierpowatosci sq bardziej odporne na malarie niz homozygoty wzgledem prawidlowego genu. Biatka wigzace tlen Mioglobina Hemoglobina jest jednym z dwéch biatek wiazacych tlen, ktére wyste- puja u kregowcéw. Funkca hemoglobiny jest przenoszenie O2 we krwi z pluc do innych tkanek ciala, w celu zaopatrzenia komérek w Or, ktéry jest im niezbedny do przeprowadzenia fosforylacji oksydacyjne} dostar- czonego pokarmu (patrz temat L2). Hemoglobina wystgpuje we krwi w erytrocytach (krwinki czerwone). Komérki te w istocie dzialajq jak worek sluzacy do przenoszenia hemoglobiny, poniewaz dojrzate erytro- cyty sa pozbawione jakichkolwiek organelli (jader, mitochondriéw itd.) Drugim bialkiem wiazacym tlen jest mioglobina, magazynujaca tlen w tkankach w postaci gotowej do uzycia przez komérki. Najwieksze steze- nie mioglobiny wystgpuje w migSniach szkieletowych i w sercu, ktére wymagaja znacznych ilogci Op do wytworzenia energii niezbednej do skurczu (patrz. temat N1). Mioglobina jest stosunkowo niewielkim bialkiem 0 masie 17,8 kDa, zbu- dowanym z pojedynczego laricucha polipeptydowego, ktory zawiera 153 aminokwasy. Byla ona pierwszym bialkiem, dla kt6rego w 1953 roku John Kendrew dzigki wykorzystaniu rentgenografii wyznaczy! strukture przestrzenng. Miogiobina jest typowym bialkiem globularnym, ponie- wai jej czasteczka jest bardzo écigle upakowana, przy czym wigkszoséSekcja B - Aminokwasy i biatka Hemoglobina Wiazanie tlenu z hemem reszt aminokwas6w hydrofobowych jest zanurzona w jej wnetrzu, a wiele reszt aminokwasow polarnych znajduje sig na powierzchni. Dzigki zasto- sowaniu rentgenografii ustalono, ze laricuch polipeptydowy mioglobiny przyjmuje konformacje « helisy (patrz temat B3). Doktadniej rzecz biorac, w mioglobinie wystepuje osiem o helis (oznaczonych A-H) (rys. 1a). W obrebie hydrofobowego zaglebienia utworzonego przez laficuch polipeptydowy znajduje sig prostetyczna grupa hemowa (rys. 1a). Ta niepeptydowa jednostka jest polaczona z mioglobina niekowalencyj- nie i odgrywa kluczowa role w biologiczne) aktywnosci bialka (4. wiazaniu O)). () » fi taiouch wy polipeptydowy hemowa, grupa prostetyezna ys. 1. Struktura (a) mioglobiny i (b) hemoglobiny ukazujaca fancuchy polipeptydowe a ip Strukture przestrzenna hemoglobiny okreslil w 1959 roku Max Perutz, kt6ry wykorzystal w tym celu rentgenografie. Dzi¢ki temu stwierdzono, de hemoglobina jest zbudowana z.czterech laricuchow polipeptydowych, przy czym struktura przestrzenna kazdego 2 nich jest bardzo podobna do wystepujace) w przypadku pojedynczego laricucha polipeptydowego mioglobiny (rys. 1b), ale ich sekwencje aminokwasowe r6znia sie w 83% pozycji. Fakt ten stanowi kolejne potwierdzenie obserwagj, ze bardzo réine struktury pierwszorzedowe umodliwiaja powstanie bardzo podob- nych struktur przestrzennych. Czasteczka podstawowego typu hemoglobiny wystepujacego u doro- slych (HbA) jest zbudowana z dwéch réénych laficuchéw polipeptydo- wych: Jaficucha @ zlozonego ze 141 aminokwas6w i taficucha B obe}- mujacego 146 reszt (cixB2; rys. 1). Kazdy z laticuchéw, podobnie jak ten w mioglobinie, tworzy osiem a helis i zawiera prostetyezna grupe hemowa (rys. 1b). Dlatego hemoglobina moze wiazaé cztery czasteczki O2. Cztery laficuchy polipeptydowe, dwa a i dwa B, sq upakowane écisle w ukladzie tetraedrycznym i tworza czasteczke o ksztalcie zblizonym do kuli, stabilizowana licznymi oddzialywaniami niekowalencyjnymi. Prostetyczna grupa hemowa w mioglobinie i hemoglobinie jest zbudo- wana z protoporfiryny IX, zawierajace} atom Zelaza w postaci jonu Zela- zawego (Fe2*) (patrz temat M4; rys. 2). W centrum pierécienia protoporfi- ryny jon Fe* wiaze sig z czterema atomami azotu i tworzy dwa dodat- kowe wiazania po kazdej stronie plaszczyzny pierscienia protoporfiryny. Jednym z tych dodatkowych wiazati jest polaczony z reszta histydyny,B4 ~ Mioglobina i hemoglobina 47 Allosteryeznosé <— elisa ———> ~~ CONH — CH —CONH ~~ CH, ~~ CONH — CH —CONH ~~ | I His a proksymaina Va " * car a ro Sw i | oH re tL NWF aA => I 7 Sa =r pierscien HN — cH C ome protoporiiynyiX of & Bud. \ 2 DOKU He, N gow ON No7 His o Ne 7 67 aysiaing f by, (een ba, | 1 “~~ CONH — CH — CONN ~~ ~~ conti — CH conH~ <——— holisae ———> ys. 2. Wigzanie O22 hemem. Fe tkwigcy w pierScieniu protoporfiryny wiaze sie 7 His F8, ale nie z potozona w pobiiéu His E7. Kiedy Fe** hemu wiaze On helisa F przesuwa sig w kierunku helisy E (szczegoly w tekscie) ktora zajmuje ésma pozyce w helisie F hemoglobiny’. Jest to tak zwana histydyna proksymalna (His F8) (rys. 2).Szste wiazanie sluzy polaczeniu z atomem tlenu w czasteczce O2 (rys. 2). W poblizu miejsca wiazania O2 z grupa hemowa znajduje sig druga reszta histydyny nazywana histy- dyna dystalna (His E7) (rys. 2). Pelni ona dwie bardzo waéne funkcje. Po pierwsze, chroni grupy hemowe sasiednich czqsteczek hemoglobiny przed kontaktem i utlenieniem do postaci Fe*, w ktérej nie moga one wiazaé Oz. Po drugie, przeciwdziata wiqzaniu tlenku wegla (CO) z Fe”* w najbardzie korzystnej dla tego pierwszego konfiguracji, przez co zmniejsza powinowactwo hemu w stosunku do CO. Jest to istotne z tego wagledu, e CO wiage sie z hemem nieodwracalnie i uniemodliwia wiazanie Oz. Podsumowujac, chociaz miejsce wiazania tlenu w hemoglo- binie i mioglobinie zajmuje tylko niewielka czeSé czasteczki bialka, lati- cuch polipeptydowy moduluje dzialanie prostetycznej grupy hemowe} Hemoglobina jest bialkiem allosterycznym. Oznacza to, Ze wiqzanie Op z jedna z podjednostek jest uzaleznione od jej oddzialywania z innymi podjednostkami. Scislej rzecz biorac, wiqzanie O2 do jednej z podjedno- stek hemoglobiny indukuje zmiany konformacyjne (patrz nize] i rys. 2), ktére przekazywane na sasiednie podjednostki zwigkszaja ich powino- wactwo wzgledem Oz, ulatwiajac w ten spos6b wiazanie tej czasteczki. Dlatego ted wiazanie O2 z hemoglobina okregla sig jako kooperatywne. Natomiast wiazanie O2 z pojedynczym laficuchem polipeptydowym mioglobiny jest niekooperatywne. Wynika to jasno z analizy krzywych dysocjaqji tlenu otrzymanych dla obu biatek: dla hemoglobiny krzywa ta * i mioglobiny (preyp. thm).Sekcja B - Aminokwasy i biatke Mechanizm zmiany allosterycznej Efekt Bohra ma ksztalt sigmoidalny, co odzwierciedla wiazanie kooperatywne, nato- miast w przypadku mioglobiny uzyskuje sie ksztalt hiperboli (rys. 3). Z przebiegu krzywej dysocjaqji tlenu mogna réwnied wywnioskowaé, Ze dla danej wartosci czastkowego cignienia tlenu stopien wysycenia Uenem jest wydszy dla mioglobiny nid dla hemoglobiny. Innymi stowy, mio- globina wykazuje wieksze powinowactwo wzgledem O» niz hemoglo- bina. Oznacza to, ze na przyklad w naczyniach wlosowatych miesni hemoglobina bedzie uwalniala O2, ktory po zwiazaniu przez mioglobing bedzie na miejscu magazynowany. miogiabina a) + hemoglobina 1 1 ' 1 1 1 i | PO: w naczyniach pO,w plucach | osowatych o4—|—______ er er cisrienie 0,(pO,; w torach) Ays. 3. Kreywe dysocjacfi lenu dla hemogiobiny 1 mioglobiny Rentgenografia pozwolila stwierdzi¢, ze hemoglobina utlenowana, forma wiazaca cztery czasteczki Or, wykazuje strukture czwartorzedowa zasadniczo rééna od wystepujace| w przypadku hemoglobiny nieutleno- wanej, formy nie zawierajacej O2. Gdy brak zwiazanego Oz, Fe” jest nieco wysuniety poza pierscief porfiryny, ktérego plaszczyzna jest lekko zakrzywiona (rs. 2). Kiedy czasteczka Op wiaze sie z prostetycznq grupa hemowa, weiaga Fe** w ptaszczyzne pierscienia porfiryny (rys. 2), ktora réwnoczesnie ulega wyprostowaniu. Przesuwajacy sie Fe** pociaga za soba histydyne proksymalna. To z kolei prowadzi do zmiany w potoze- niu helisy F i rejonéw faticucha polipeptydowego, znajdujacych sie po obu je| konicach. Tym sposohem ruch w srodku podjednostki zostaje przenie- siony na jej powierzchnie, czemu towarzyszy rozerwanie i odtworzenie w innym pologeniu oddzialywan jonowych miedzy podjednostkami. Uzyskane w ten spos6b zmiany w strukturze czwartorzedowej znajduja sw6j wyraz w kooperatywnym wiazaniu Oz przez Hb. Wigzanie O2 przez hemoglobing jest regulowane przez stezenie jonéw H* i CO, w otaczajacej tkance; jest to okreslane jako efekt Bohra. W tkance oszybkim metabolizmie, takiej jak migsien, stezenie tych dwéch substan- Gji jest stosunkowo dude. Powoduje to przesunigcie krzywej dysocjacji tlenu dla hemoglobiny w prawo, co odpowiada ulatwionemu uwalnianiu Oz. Prayezyna tego zjawiska tkwi w istnieniu miejsc wiqzania H*, gi6wnie His146 w tancuchu B, ktrych powinowactwo wzgledem H* jest wieksze w hemoglobinie nieutlenowanej niz w hemoglobinie utlenowanej. Zwigk-84 ~ Mioglobina i hemoglobina 49 2 ; & ys. 4 23-Bistosfoglicerynian Hemoglobina ptodowa hemoglobiny szenie ilosci COr prowadzi réwnied do wzrostu H* na skutek dzialania enzymu anhydrazy weglanowej katalizujacej reakcje: CO, +H2,O <—> HCO; +H Poza tym, CO2 mode reagowaé z pierwszorzedowymi grupami amino- wymi faricucha polipeptydowego i tworzyé obdarzony ladunkiem ujem- nym karbaminian. Ta zmiana ladunku z dodatniego na ujemny takze sprzyja konformacji przyjmowanej przez hemoglobing nieutlenowana. Kiedy krew powraca do pluc, gdzie stezenia H* i CO» sq stosunkowo mate, a O duge, omawiany proces ulega odwréceniu i hemoglobina wiaze Oz. Tym sposobem hemoglobina nie tylko przenosi Q2, ale takée doprowa- dza zwrotnie CO> do pluc, gdzie zostaje on wydalony. 2,3-Bisfosfoglicerynian to silnie anionowy fosforan organiczny, kt6- rego czasteczki towarzysza hemoglobinie w erytrocytach (rys. 4). Zwiazek ten ulatwia uwalnianie O, z hemoglobiny, na skutek zminiejszenia powi- nowactwa bialka wzgledem O2. 2,3-Bisfosfoglicerynian wiaze sie w male}, centralnie polozonej szczelinie, utworzone} przez cztery podjednostki W hemoglobinie utlenowanej szczelina ta jest zbyt mala, aby mogto dojsé do wiazania, natomiast w hemoglobinie nieutlenowanej jest wystar- czajaco duza, aby pomiescié pojedyncza czasteczke 2,3-bisfosfoglicery- nianu. W trakcie wiqzania w Srodkowej przestrzeni czasteczki hemoglo- biny nieutlenowanej tworzy ona wiqzania jonowe z obdarzonymi ladun- kiem dodatnim resztami aminokwas6w podjednostek 8, co prowadzi do stabilizagji struktury czwartorzedowe}. H*, CO2 i 2,3-bisfosfoglicerynian sq nazywane regulatorami allosterycznymi, poniewaz stabilizuja one konformacje hemoglobiny nicutlenowane] i w ten sposéb watwiaja uwal- nianie O2. Poniewaz czasteczki te oddziatuja na réine miejsca, skutki ich dzialania podlegaja sumowanin. U plodu wystepuje inny rodzaj hemoglobiny okreslany jako hemoglo- bina F (HbF). W odréanieniu od hemoglobiny doroslych (HbA, «20), HbF sklada sie z dwéch laticuch6w a i dwéch laricuch6w 7 (azy2). W warun- ach fizjologicznych HbF wykazuje wieksze powinowactwo wzgledem Q2 nid HbA, co stwarza optymalne warunki przenoszenia tlenu z krwi matki do krwi plodu poprzez lozysko. Przyczyna obserwowanej réznicy w powinowactwie wzgledem tlenu na poziomie molekularnym jest to, iz HDF wiage 2,3-bifosfoglicerynian slabiej ni HbA. Pod koniec zycia plodo- wego synteza taficucha y zostaje wylaczona i na je) miejsce zostaje wlaczona synteza laricucha B (wystepujacego w HbA) (rys. 5). Poréwnanie sekwencji pierwszorzedowych laricuch6w hemoglobin po- chodzacych od wigcej niz 60 réznych gatunkéw ujawnilo niezmiennosé tylko dziewigciu reszt. Do reszt tych naleza histydyny proksymalna i dys- talna, o funkcjach kluczowych dla prawidlowego dziatania bialka. Wiele z pozostalych reszt ulega podstawieniu przez reszty o podobnych wlasci- woéciach w wyniku tak zwanej konserwatywnej substytueji (np. hydro- fobowa walina zostaje zastapiona przez hydrofobowa izoleucyne lub polarna asparagina zastepuje polama seryne). Natomiast tylko niewiele reszt zostaje zamienionych u réanych gatunkéw w wyniku tak zwane} niekonserwatywnej substytucji na reszty 0 calkowicie odmiennych whas-Sekcia B - Aminokwasy i biatha 8 % calkowite| syntezy hemoglobiny |) 61 Oh GAB tygodnie Rys. 5. Praelaczenie syntezy larhouchow ludzkie/ hemogiobiny w okresio ‘okofoporodowym ciwoéciach (np. hydrofobowa leucyna na obdarzona jadunkiem dodatnim lizyne lub obdarzony ladunkiem ujemnym glutaminian na obdarzona ladunkiem dodatnim arginine), poniewaz taki typ zmiany mégiby wy- wrzeé silny wplyw na strukture i funkeje bialka Do tej pory scharakteryzowano kilkaset nieprawidtowych hemoglo- bin, stanowiacych przyklady patologii hemoglobiny. Prawdopodobnie najlepie| poznanym przypadkiem patologii hemoglobiny jest niedokrwi- stosé sierpowata (hemoglobina krwinek sierpowatych; HbS). Cecha cha- rakterystyczna tej choroby jest wystepowanie erytrocytow © ksztalcie _sierpa lub pétksigzyca. Na poziomie molekulamym je) przyczyna jest zastapienie reszty kwasu glutaminowego w pozycji 6 laftcucha B przez waline, a wigc zastapienie reszty polamej przez hydrofobowa. Ta niekon- serwatywna substytucja glutaminianu waling powoduje powstanie hydrofobowych lepkich miejsc na zewnetranej powierzchni laficuchow 8 HDS. Takie iepkie miejsce jest komplementame z miejscem hydrofobo- wym, znajdujacym sie migdzy helisami E i F laftcucha B HbS nieutleno- wanej (rys. 6). Zatem miejsce komplementame na powierzchni jedne| caasteczki HbS moze wiazaé miejsce lepkie na powierzchni drugic) caasteczki HbS, co prowadzi do powstania dlugich wiékien zbudowa- nych z czasteczek hemoglobiny, ktore znieksztalcaja erytrocyt. W utleno- wanej HbS miejsce komplementame jest maskowane, tak wige dlugie wiskna powstaja tylko wtedy, gdy wystepuje nagromadzenie nieutleno- wanej formy HbS. Niedokrwistosé sierpowata jest choroba hemolityczna przekazywana genetycznie. Krwinki sierpowate sq bardziej kruche niz prawidlowe ery- trocyty, latwie} wiec ulegaja lizie i wykazuja krotszy potowiczny czas trwania, co prowadzi do cigzkiej niedokrwistosci. Niedokrwistosé sierpo- wata jest przekazywana genetycznie, homozygoty zawieraja dwie kopie nieprawidlowego genu, natomiast heterozygoty maja jedna kopig pra widlowa ijedna nieprawidlowa. Homozygoty czesto zyja krécej wskutek infekgj, uszkodzenia nerek i serca lub zwigkszone) krzepliwoscl krwi, kt6- rych przyezyna jest zatrzymywanie krwinek sierpowatych w naczyniach wlosowatych, prowadzace do uszkodzenia tkanek. U heterozygot tym- czasem objawy te nie rozwijaja sie, poniewad tylko w przyblizeniu 1% ich84 - Mioglobina i hamogiobina 51 oksy-HbA oksy-HbS oO deoksy-HbS zastapienie ) aes. acdeen Glu przez Val H | hydrofobowe miejsce lepkie miejsce hydrofebowe Rys. 6. Molekularne podstawy agregacji czasteczek hemoglobiny nieutlenowanej w niedokrwistoSci sierpowatej erytrocyt6w to krwinki sierpowate, natomiast u homozygot ich udziat siega 50%. Czestos¢ wystepowania genu sierpowatosci, stosunkowo duza na pewnych obszarach Afryki, pokrywa sie z zasiegiem wystepowania malarii. Przyczyna tego zjawiska jest ochrona heterozygot przed najbar- dziej Smiertelnymi postaciami malarii, natomiast homozygoty wzgledem. prawidtowego genu sq bardziej podatne na te chorobe. Dziedziczenie genu nieprawidiowej hemoglobiny mozna obecnie kontrolowaé dzieki technikom rekombinacji DNA (patrz temat I1).Sekcja B - Aminokwasy i biatka 85S KOLAGEN PERE TAOAA EEE Funkeja i réznorodnosé Biosynteza: | prowadzenie |Sktad i modyfikacje} potranslacyine | Struictura | Kolagen jest nazwa nadanq calej rodzinie strukturalnie podobnych bialek, kt6re tworza mocne, nierozpuszczalne widkna. Kolageny sktadaja sie z trzech lancuchéw polipeptydowych, ktorych charakter i rozmieszczenie réénia sig w zaleznosci od typu kolagenu. W roznych miejscach organizmu wystepuja rééne typy kolagenu Polipeptydy kolagenu sq potranslacyjnie modyfikowane przez hydroksylacje i glikozylacje podczas ich transportu w szorstkim retikulum endoplazmatycznym i w aparacie Golgiego. ‘Trzy polipeptydy tworza trypletowo-helikalny prokolagen, ktory zostaje wydzielony z komérki. Przez usunigcie koficowych telopeptyd6w powstaje tropokolagen, ktéry nastepnie agreguje w mikrofibryle i ulega kowalencyjnemu usieciowaniu przez wiqzania poprzeczne, tworzac dojrzale wlokno kolagenowe. W kolagenie jedna trzecia reszt aminokwas6w stanowi Gly, a dalsza jedna czwarta — Pro. Zawierajace grupe hydroksylowa aminokwasy ‘hydroksyprolina (Hyp) oraz 5-hydroksylizyna (Hyl) powstaja potranslacyjnie dzialaniem hydroksylazy prolinowej i hydroksylazy lizynowej. Aktywnos¢ tych enzyméw zawierajacych Fe" wymaga obecnosci kwasu askorbinowego (witamina C). W chorobie wywolanej niedoborem witaminy C, szkorbucie, kolagen nie jest tworzony prawidlowo wobec niemoznosci hydroksylowania Pro i Lys. Reszty Hyl sa czesto modyfikowane potranslacyjnie przez dodanie cukrowe6w. Kolagen zawiera powtarzajace sig sekwencje tripeptydowe Gly-X-Y, gazie X jest ezesto reszta Pro, a Y — reszta Hyp. Kazdy polipeptyd ww kolagenie 2wija sie w helise 0 3,3 resztach na jeden obrét. Nastepnie tray laricuchy polipeptydowe zestawiaja sie ze soba tworzac trypletowo-helikalny sznur, w ktorym sq utrzymywane razem przez wigzania wodorowe miedzy laticuchami. Kazda co trzecia reszta wystaje do Stodka tripletowe) helisy, gdzie jest tak ciasno, ze moga pasowa¢ tylko male reszty Gly. Jedna z form osteogenesis imperfecta (lamliwosé kosci) jest powodowana przez mutace zamieniajaca Gly na inny aminokwas, co uniemodliwia prawidlowe zwinigcie sig trypletowo-helikalngj liny i wytwarza nieprawidtowy kolagen. ‘Telopeptydy obecne przy obu koficach (N i C) laricuchow polipeptydowych kieruja powstawaniem trypletowo-helikalnej i zapobiegaja przedwczesne} agregacji czasteczek prokolagenu w obrebie komérki. Dopiero po wydzieleniu z komérki peptydy te zostaja odcigte przez peptydazy, a powstajace w ten sposdb czasteczki tropokolagenu agreguja razem w zazebiajacy sie uklad. | iy85 - Kolayen 53 Kowalencyjne sieciowanie przez wiazania poprzecane w obrebie czasteczek tropokolagenu i migdzy nimi nadaje widknom kolagenu ‘moc i sztywnosé, Takie mostki poprzeczne powstaja migdzy Lys i je) aldehydowa pochodna, allizyna. Allizyna powstaje z Lys dzialaniem zawierajace| miedé oksydazy lizylowej, ktora do swej aktywnosci wymaga fosforanu pirydoksalu. Choroba latyryzm jest wywolana zahamowaniem oksydazy lizylowej przez zwiazek f-aminopro- pionitryl, wystepujacy w nasionach pachnacego groszku, i polega na powstawaniu nieprawidlowego kolagenu, wlasnie z powodu braku wigzan poprzecznych. ieee i] Pierwszym etapem powstawania kosci jest odkladanie sie hydroksyapatytu (fosforanu wapnia) w miejscach nukleagji pomiedzy koricami czasteczek tropokolagent Tematy pokrewne Struktura bialka (B3) ‘Synteza bialek (translacja) Mioglobina i hemoglobina (B4) u eukariotow (H3) Funkeja Kolagen, ktéry wystepuje we wszystkich organizmach wielokomérko- i réznorodnosé wych, nie jest pojedynczym bialkiem, ale rodzina bialek podobnych strukturalnie. Jest biaikiem wystepujacym u ssak6w w najwigksze] ilosci i obecny jest w wi¢kszosci narzadéw, gdzie stuzy do laczenia komérek w odrebne grupy. Jest rowniez glownym wléknistym skladnikiem skéry, koSci, Sciggien, chrzastki, naczyfi krwionosnych i zeb6w. Rééne typy bialek kolagenu maja bardzo zréznicowane funkcje. Niezwykle twarde struktury kosci i zebow zawieraja polimer kolagenu i fosforany wapnia. W Sciegnach kolagen tworzy podobne do lin wiékna o duzej wytrzy- malosci na rozciaganie, w sk6rze natomiast kolagen tworzy luéno utkanq sieé wiékien, kt6ra moze sie rozprzestrzeniaé we wszystkich kierunkach. Rééne typy kolagenu charakteryzuja sie odmiennym skladem polipepty- dowym (lab. 1). Kaédy kolagen jest zlozony z trzech laricuch6w polipepty- dowych, ktére moga byé wzgledem siebie identyczne (jak w typach II i III) lub rééne (typy I, IV, V). Pojedyncza czasteczka kolagenu typu I ma mase czasteczkowa 285 kDa, Srednice 1,5 nm i dlugosé 300 am. Tabela 1. Typy kolagenu Typ Sktad polipeptydow Rozmieszczenie 1 {oe1()]2 a2) skéra, koSci, Sciegna, rogéwka, naczynia krwionosne u [ats chrzastka, kazki miedzykregowe " {ols sk6ra ptodu, naczynia krwvionogne Vv {at(Vile @2(IV) sblona” podstawna v [aiV)}e 02¢v) tozysko, skoraSekcja B- Aminokwasy i hiatka Biosynteza: wprowadzenie Sktad i modyfikacje potranslacyjne Polipeptydy kolagenu, podobnie jak inne wydzielane bialka, sa syntetyzo- wane przez rybosomy na szorstkim retikulum endoplazmatycznym (RER; patrz temat H3). Nastepnie laficuch polipeptydowy przechodzi przez RER i aparat Golgiego, nim zostanie wydzielony. Wzdluz tej drogi ulega on modyfikacjom potranslacyjnym: reszty Pro i Lys ulegaja hydroksylagi i dodawany jest cukrowiec (rys. 1). Przed wydzieleniem trzy laticuchy polipeptydowe lacza sig razem w tripletowo-helikalng strukture o nazwie prokolagen. Nastepnie prokolagen zostaje wydzielony do miedzykomér- kowej przestrzeni tkanki lacznej, gdzie kraticowe odcinki laticuch6w poli- peptydowych przy obu koricach N i C (telopeptydy, peptydy wydtu- Zajace) sq usuwane przez peptydazy, przez co powstaje tropokolagen (rys. 1). Czasteczki tropokolagenu agreguja w mikrofibryle i ulegaja roz- leglemu usieciowaniu przez wigzanie poprzecene tworzac dojrzale wiékno kolagenu (rys. 1). synteza polipeptydu ' modyfikxacie potranstacyina wobrebie RER 1 Taparatu Geigiego firobiastu ttypletowo-helikaina nie prokalogenu. t wydziolanio ' Lusunigcie telopeptydow ' tropokolagen Ww obrebie migdzykomérkowe| przestrzeni tkankl faczne| agregacja w mikrofibryle ' usieciowanio + wlokna kolagenu ys. 1. Szlak biosyntezy kolagenu Sklad aminokwasowy bialek kolagenu jest bardzo charakterystycany. Pra- | wie jedi trzeciq ich reszt stanowi Gly, a z pozostalych jedng czwartq sta- nowi Pro, a wigc te dwa aminokwasy wystepuja w proporcji znacznie | wigkszej niz w innych biatkach. Tylko w kolagenie sq obecne hydroksylo- | wane aminokwasy 4-hydroksyprolina (Hyp) i 5-hydroksylizyna (Hyl) (rys. 2). Te hydroksylowane aminokwasy powstaja z wyjéciowych amino- kwas6w dzialaniem, odpowiednio, hydroksylazy prolinowej i hydroksy- lazy lizynowej (rys. 2). Enzymy te maja w swym miejscu aktywnym jon Fe” i do swe) aktywnoSci potrzebuja kwasu askorbinowego (witamina C). Kwas askorbinowy dziala jako przeciwutleniacz, utrzymujac jon Fe**BS - Kolagen 55 goo G00" Oty oH, NCH CO + Oy + 0, MACE tg too + by, + 00, 1 1 I * prolinowa I I I HQ. OH, G=0 Hye SoH, g=0 AA { V7 i cH coo pe o on Hon pralina eeketoglutaran hydroksyprotina bursziynian NGO NE FH 100 — Hy ‘oy o hydroksylaza sty, one + cckelogiutaran + 0, 1 + bursztynian + CO, on Mm A=" 0H ox, cH, i Ny NH lzyra hydroksylizyna ys. 2. Powstawanie hydroksyprotiny / hydroksylizyny Struktura w stanie zredukowanym. Hydroksylaza prolinowa i hydroksylaza lizy- nowa sq dioksygenazami, uzywajacymi czasteczki Oz. a-Ketoglutaran, intermediat cyklu kwasu cytrynowego (patrz temat L1), jest tu koniec: nym substratem, przemienianym podczas reakeji w bursztynian (rys. 2). Oba enzymy beda hydroksylowa¢ tylko reszty Pro i Lys wbudowane w laricuch polipeptydowy i to tylko wtedy, gdy na koticu N jest reszta Gly. Reszta Hyp ma istotne znaczenie przy slabilizagji struktury kolagenu przez tworzenie wiqzari wodorowych (patrz nizej). Pray niedoborze wita- miny C, Hyp (oraz Hyl) nie sa syntetyzowane, co powoduje oslabienie wiokien kolagenowych. Prowadzi to do uszkodzenia skéry, kruchosci naczyti krwionosnych i utrudnionego gojenia ran, kt6re to objawy charak- teryzuja szkorbut. Dalsza modyfikacja potranslacyjna jest glikozylacja kolagenu. W tym przypadku reszty cukrowe, zazwyczaj tylko glukoza, galaktoza i ich disa- charydy, sq przylaczane do nowo tworzonych hydroksylowych reszt Hyl, a nie do reszt Asn lub Ser/Thr, jak to wystepuje w znacznie bardzie) powszechnych N- i O-glikozylagach (patrz. temat H5). losé przylaczo- nych cukroweéw w kolagenie wynosi wagowo od 0,4 do 12%, w zalezno- Si od tkanki, w kt6rej zachodzi synteza Kolagenu. Pierwszorzedowa strukture kazdego polipeptydu w kolagenie charakte- ryzuje powtarzajqca sie tripeptydowa sekwencja Gly-X-Y, gdzie X jest czesto, ale nie wylacznie reszta Pro, a Y jest czesto reszta Hyp. Kazdy 2 trzech laricuchéw polipeptydowych w kolagenie zawiera okolo tysigca reszt i kaédy z tych laticuchéw skreca sie jako nié w helise, na kt6rej pelen skret przypada tylko 3,3 reszt, a nie 3,6 reszt przypadajacych na skret a helisy (patrz temat B3). Ta drugorzedowa struktura jest wyjatkowa dlaSekcja & - Aminokwasy i biatka kolagenu i nazywa sie ja czesto helisq kolagenowa. Trzy laricuchy polipe- ptydowe sq ulozone rownolegle i owijaja sig jeden wok6t drugiego z rozciagnietym, skierowanym w prawa strone skretem, podobnym do wystepujacego w linie, przez co tworzy sig trypletowo-helikalna lina (tréjniciowa helisa) (rys. 3). Kazda co trzecia reszta kazdego polipeptydu wehodzi w Srodek trypletowej helisy, kt6ry jest tak zatloczony, ze tylko male laficuchy boczne Gly moga do niego pasowaé. To wyjasnia bez- wzgledna koniecznosé obecnosci Gly jako co trzeciej reszty. Reszty w pozycjach X iY sa umieszczone na zewnatrz trypletowo-helikalnej liny, gdzie jest dosé miejsca dla obszernych laricuchéw bocznych Pro i innych reszt. Trzy laticuchy polipeptydowe sa takze przesuniete wzgledem siebie tak, Ze reszta Gly jednego laficucha jest zestawiona z reszta X drugiego Jaficucha oraz reszta Y Jaricucha trzeciego. Trypletowa helisa jest utrzymy- wana razem przez rozlegla sieé wiazatt wodorowych, szczegélnie tych miedzy grup aminowa Gly jednej helisy i grupa karboksylowa Pro w pozy¢ji X jednej z pozostalych helis. Dodatkowo w stabilizowaniu stru- ktury biorq udzial grupy hydroksylowe Hyp. Wzglednie nieelastyczne reszty Pro i Hyp réwniez wspomagaja sztywnosé struktury kolagenu. pojedynezy tarcuch polipeptyciowy ulozony w helise, na kore} jeden obr6t przypadajd 3.3 reszly aminokwasow tezy taftcuchy polipeptydowe splocione \ w trypletowa helise ys. 3, Ulozenie irzech taricuchéw polipeptydowych w kolagenio Znaczenie Gly jako co trzeciej reszty staje sie widoczne w sytuadji, gdy mutacja w DNA powoduje whudowanie odmiennego aminokwasu jud nawet tylko w jednej pozycji z tysiaca reszt laricucha polipeptydowego.85 ~ Kolagen Sekrecja iagregacja 57 Jesli na przyktad mutacja prowadzi do wbudowania Cys w miejsce Gly, trypletowa helisa zostaje rozerwana, poniewaz boczny laficuch -CH2-SH w Cys jest zbyt duzy, aby pasowaé do wnetrza trypletowej helisy. Prowa- dzi to do powstania struktury czeSciowo rozfaldowanej, kt6ra jest podat- na na rozlegla hydroksylacje i glikozylacje i kt6ra nie jest efektywnie wydzielana przez fibroblasty. To z kolei prowadzi do nieprawidlowe) struktury kolagenu, ktéra moze spowodowaé wystapienie tamliwosci koSci i znieksztalcen szkieletu. Znany jest szeroki zakres mutacji powo- dujacych wytwarzanie nieprawidlowego kolagenu i prowadzacych do wystapienia osteogenesis imperfecta (lamliwosci koSci) Pierwotnie po swej syntezie polipeptydy kolagenu maja po obu koricach N i C dodatkowe reszty aminokwaséw (100-300), ktrych nie ma juz w dojrzalym widknie kolagenowym (rys. 4). Telopeptydy (inaczej: pep- tydy wydluzajace; ang. extension peptides) czesto zawieraja reszty Cys, ktorych zazwyczaj nie ma w pozostalym laficuchu polipeptydowym. Telopeptydy pomagaja w poprawnym ulogeniu trzech polipeptydow, w czasie gdy zestawiaja si¢ one w trypletowa helise; proces ten moze byé wspomagany przez tworzenie wiazan dwusiarczkowych pomigdzy telo- peptydami sqsiadujacych Jaricuchéw_polipeptydowych. Telopeptydy zapobiegaja rownied przedwczesnej agregacji prokolagenu w trypletowe helisy w obrebie komérki. Po wydzieleniu z fibroblastu telopeptydy sa _ polipeptyd telopeptydy ——\ selon | trypletowa helisa a1 prokolagenu wydzielenie peptydazy SERDAR LAF RAIS opokolagen miejsca nukleacit dla tworzenia KoSci wiazania poprzeczne wokno kolagenu tropokolagen 67 nim 38nm ys. 4. Rola telogeptydéw w splatani i wydzielaniu prokolagenu. Zaraz po wyazieleniu prokolagenu z komdrki usuwane sq Z niego telopeptydy, a powstate w ten sposdb czasteczki tropokolagenu agregujg | ulegaja usieciowaniu wigzaniami poprzecznymi, tworzac mikrolibryleWiazania poprzeczne Tworzenie koéci Sekcia B - Aminokwasy I biatka usuwane dzialaniem peptydaz zewnatrzkomérkowych (rys. 4). Nastepnie powstajace ta droga czasteczki tropokolagenu agreguja ze soba w przesu- nigtym ustawieniu glowa do ogona, tworzac widkno kolagenowe (rys. 4). Wytrzymalos i sztywnosé widkien kolagenowych jest wynikiem kowa- lencyjnych wiazai poprzecznych, wytworzonych zar6wno wewnatrz caasteczek tropokolagenu, jak i pomigdzy nimi. Poniewaz w koricowym, dojrzatym kolagenie albo w ogéle nie ma reszt Cys, albo jest ich niewiele, te wigzania poprzeczne nie sq wiqzaniami dwusiarczkowymi, jak zwykle w bialkach, ale stanowia one wyjatkowe wiazania poprzeczne utworzone pomiedzy Lys a jej aldehydowa pochodna allizyna. Reszty allizyny powstaja z Lys dzialaniem monooksygenazy, oksydazy lizylowej (rys. 5) Ten enzym zawierajacy miedé wymaga do swe} aktywnosci obecnosci koenzymu, fosforanu pirydoksalu, pochodzacego z witaminy By (patrz temat M2). Nastepnie aldehydowa grupa allizyny reaguje spontanicznie albo 2 grupa aminowa bocznego laticucha Lys, albo z innymi resztami alli- zyny na innych laficuchach polipeptydowych, tworzac kowalencyjne wiazania migdzylaricuchowe. Nig co — no c0— oksycaza (Hy +0, Jat (Cy + NE HO t Tizyiowa I hws Ds oo oO layna alizyna ys. 5. Przemiana lizyny w allizyne przez oksydaze lzylowa Znaczenie wiqzaf poprzecenych dla prawidlowego funkcjonowania kolagenu jest wykazane w przypadku choroby latyryzmu. Wystepuje ona uludzi i zwierzat po spozyciu nasion groszku pachnacego (Lathyrus odore tus), kt6re zawieraja zwiqzek chemiczny f-aminopropionitryl. Zwiazek ten nieodwracalnie hamuje oksydaze lizylowa, a przez to uniemodliwia wytworzenie poprzecznych wiazat miedzy czasteczkami tropokolagent, co powoduje ciezkie nieprawidlowosci w kosciach, stawach i duzych naczyniach krwionognych wywolane kruchoscia (lamliwoscia) kolagent Jedna z choréb polegajacych na ubytku kolagenu, zesp6t Ehlersa-Dar- osa typu V, wywolana jest niedoborem oksydazy lizylowej i powoduie nadmierna ruchliwos¢ staw6w i nadwradliwoS¢ skéry. Prawdopodobnie taki niedobér kolagenu wystepuje u ,ludzi z gumy”, wystepujacydi w cyrkach. Praestrzenie miedzy koricami czasteczek tropokolagenu w widknie kolagenowym (patrz rys. 4) sq przy tworzeniu kosci miejscami nukleagi do odkladania sig specjalnej formy fosforanu wapnia, hydroksyapatytu,_ Hydroksyapatyt jest dodawany tak dlugo, az nastapi wzrost miejsc nukle | acji umodliwiajacy ich ztaczenie sie, co doprowadza do powstania do} rzatej struktury kosci. }Sekcja B - Aminokwasy i biatka BG OczyYSZCZANIE BIALEK HSS TLS Celem oczyszezania bialka jest wyizolowanie okreslonego biatka z mieszaniny bialek zawartej w materiale wyjéciowym. Stosuje sie tu kombinacje technik frakcjonowania, ktora wykorzystuje rozpuszezalnosé, mase czasteczkowa, Jadunek lub/i specyficzne dla danego biatka powinowactwo wiazania. Ze wzgledu na réanorodne rozmieszczenie biatek w materiale biologicznym, wybér materialu wyjSciowego do oczyszczenia danego biatka jest bardzo istotny. Material taki powinien byé latwo dostepny i zawieraé stosunkowo duzo poszukiwanego bialka Praed oczysaczeniem nalezy uzyskaé roztw6r biatka. Dlatego tez tkanki i komérki muszq zostaé rozbite na drodze homogenizacji lub lizy osmotycznej i nastepnie poddane wirowaniu roznicowemu w celu wyizolowania frakeji subkomérkowej zawierajacej dane bialko. W przypadku bialek zwiazanych z blonami ich uwolnienie wymaga rozbicia (solubilizagji) struktury biony detergentem. Nalezy przedsiewzia¢ pewne Srodki ostrognosci, aby w procesie oczyszezania unikna¢ denaturacji lub inaktywacji bialka, wywolanych dziataniem czynnikéw fizycanych lub chemicznych. Nalezy wiec kontrolowaé pH wykorzystywanych roztworéw, procedury prowadzié w niskiej temperaturze i stosowaé inhibitory proteaz, aby zapobiec niepozadanej degradagji biatka. Aby kontrolowaé skutecznosé procesu oczyszezania biatka, nalezy opracowa¢ metode pozwalajaca stwierdzié jego obecnosé. Zaleznie od bialka, metoda ta moze polegaé na pomiarze aktywnosci enzymatycznej lub wiazania liganda; ilosé obecnego biatka mozna réwniez wyznaczyé za pomoca przeciwcial skierowanych przeciw niemu. Rozpuszczalnosé bialek maleje wraz ze zwigkszaniem stezenia siarczanu amonu w roztworze. Steéenie siarczanu amonu, w ktérego obecnosci bialko wytraca sig z roztworu i ulega precypitacji, moze na tyle réznicowaé dane bialko od innych bialek znajdujacych si¢ w mieszaninie, Ze umodliwi jego skuteczne oddzielenie Biatka moana oddzielié od czasteczek o niewielkiej masie na drodze dializy przez pélprzepuszczalng blone, ktorej pory umozliwiaja przejécie malych czasteczek, ale nie biatek. Biatka, ktérych masy czasteczkowe rééniq sig zasadniczo, mozna rozdzielié na drodze wirowania warstwowego z zastosowaniem gradientu gestosci sacharozy.60 Sokcja B - Aminokwasy i biatka Tematy pokrewne Eukariota (A2) Elektroforeza bialek (B8) Rozdzielanie struktur Wprowadzenie do enzyméw (C1) komérkowych i Komérek (A4) _Bialka blonowe i weglowodany Chromatografia bialek (B7) (2) Zasady oczyszezania biatka Wybor érédta biatka Homogenizacja i solubilizacja elem oczyszczania bialka jest oddzielenie jednego, okreslonego bialka od innych zanieczyszczajacych bialek, tak aby moana byto bada¢ jego struk- ture i/lub inne wlasciwosci. Po ustaleniu odpowiedniego komérkowego frédta danego bialka jest ono uwalniane do roztworu i oddzielane od zanieczyszczen dzieki zastosowaniu serii réénych technik frakejonowa- nia (tozdziatu). Do rozdzielania wykorzystuje sig jedna lub wigcej z naste- pujacych wlasciwosci bialka: rozpuszczalnosé, masa czasteczkowa, ladu- nek lub specyfiezne dla danego bialka powinowactwo wiazania. W tym celu stosuje sie techniki chromatograficzne, takie jak chromatografia jonowymienna, filtracja zelowa lub chromatografia powinowactwa (patrz temat B7), chromatografia oddziatywait hydrofobowych, w ktorej przcbiegu bialko wiage sig z materialem hydrofobowym, lub techniki elektroforetyczne, takie jak ogniskowanie izoelektryczne (patrz temat B8). Inne metody elektroforetyczne, gléwnie elektroforeze w zelu poli- akryloamidowym (PAGE) w obecnosci dodecylosiarczanu sodu (SDS) (SDS-PAGE), ale takze PAGE (patrz temat B8) stosuje si¢ do kontroli stopnia oczyszczenia i do wyznaczenia masy czasteczkowej oraz budowy podjednostkowej oczyszezonego bialka. Przed przystapieniem do oczyszezania bialka nalezy dokonaé wyboru frédla materialu. wyjéciowego. Rozmieszczenie biatek w komérkach i tkankach jest rézne, dlatego tez, gdy dane bialko wystepuje w duzych ilo- $ciach w okreslonej tkance (np. nerki), te tkanke nalezy wykorzysta¢ jako material wyjéciowy. Nalezy takée wziaé pod uwage, Ze pewne Zr6dta sa latwie} dostepne niz inne. Obecnie, dzieki technikom rekombinacji DNA (patrz tematy I1 i 16), nawet rzadko spotykane bialka mozna poddaé ekspresji w bakteriach lub w komérkach eukariotycznych i uzyska¢ tym sposobem znaczne ilogci tych bialek. Po ustaleniu odpowiedniego érédla, koleinym etapem procesu oczyszcza~ nia bialka jest jego uwolnienie do roztworu. Etap ten moana pominaé w przypadku bialek wystepujacych w plynach ustrojowych, takich jak surowica krwi. Wieksz0sé bialek wymaga jednak rozbicia tkanek i komé- rek. Homogenizacje i p6éniejsze wirowanie réznicowe materialu biologi- canego opisano w temacie A4. Oprécz.tych metod prostym sposobem roz- bicia komérek nie majacych sztywnej éciany komérkowej i uwolnienia zawartosci cytoplazmy jest liza osmotyczna. Kiedy komérki zwierzat zostana umieszczone w roztworze hipotonicznym (takim jak woda lub bufor bez sacharozy), woda z otaczajacego roztworu dyfunduje do bar- dziej stezonego roztworu, jakim jest cytozol, powodujac pecznienie i rozer- wanie komérki. Nastepnie stosuje sig wirowanie réznicowe, aby usunaé abedne organelle komérkowe (patrz. temat Ad). Biatka zwiazane 2 blo- nami wymagaja dodatkowego etapu rozbicia blony (solubilizacji). Odpo- wiednia blona, po wyodrebnieniu dzieki wirowaniu réznicowemu, zosta-8G - Oczyszezania biatek 61 Stabilizacja biatek Kontrola obecnosci biatka Precypitacja siarczanem amonu je poddana dzialaniu detergentu, takiego jak Tryton X-100, co prowadzi do uszkodzenia dwuwarstwy lipidowej i uwolnienia do roztworu inte- gralnych bialek blonowych (dalsze szczegély — temat E2) Stosujac okreslong procedure oczyszczania nalezy przedsiewziaé kroki zapobiegajace zniszczeniu (inaktywacji lub denaturacji) danego bialka w wyniku dzialania czynnikéw fizycznych lub biologicznych. Wartosé pH stosowanych roztworéw powinna zostaé doprowadzona do poziomu zapewniajacego stabilnosé danego bialka i przy tym poziomie starannie zbuforowana (zwykle okolo pH 7). Temperatura czgsto powinna byé utrzymywana ponizej 25°C (zwykle okolo 4°C), aby uniknaé termicznej denaturagji i ograniczyé aktywnosé proteaz do minimum. W wyniku homogenizaci proteazy wystepujace w réinych czeéciach komérki zostajq uwolnione do roztworu i w trakeie Kontaktu z oczyszczanym Dialkiem moga doprowadzié do jego degradagi. Na przyklad kwasne hydrolazy wystepujace w liposomach (patrz temat A2) moga zostaé uwol- nione do roztworu i degradowaé oczyszczane bialka cytoplazmatyczne. Dlatego, oprécz prowadzenia calej procedury izolacji w niskiej temperatu- 1ze, do buforéw stosowanych na wezesnych etapach izolacii dodaje sie inhibitory proteaz, aby uniknaé niepozadanej proteolizy (patrz temat C4) Aby kontrolowaé skutecznosé kazdego etapu procesu oczyszczania, nalezy zastosowaé odpowiedni sposbb wykrywania obecnosci bialka. Najprost- szymi sposobami sq te stosowane dla enzyméw katalizujacych reakcje, ktérych produkty latwo wykryé (patrz temat C1). Obecnos¢ bialek nie bedacych enzymami moéna kontrolowaé wykorzystujac ich aktywnosé biologiczna. Na przyklad obecnoéé receptora mogna kontrolowaé przez pomiar zdolnosci wiazania specyficznego liganda. Stosowane czesto tech- niki immunologiczne wykorzystuja przeciwciala specyficznie rozpozna- jace okreglone bialko [np. test radioimmunologiczny, test immunoenzy- matyczny (ELISA — ang. enzyme-linked immunosorbent assay) lub tech- nika testu immunologicznego zwana Western blot (patrz tematy B8 i D5)] W pierwszym etapie oczyszczania powszechnie stosuje sie precypitacje siarczanem amonu. W technice te} wykorzystuje sig to, i w obecnosci dudego stezenia soli rozpuszezalnogé wiekszosci bialek maleje. Przy odpowiednio duzym stezeniu soli bialko wypada z roztworu (ulega pre~ cypitacj). Stezenie soli, w ktérego obecnosci zachodzi zjawisko wysole- nia, jest rézne w zaleznogci od rodzaju bialka. Stad tez jest mozliwe zasto- sowanie tej procedury do frakcjonowania mieszaniny bialek. Na przyklad 0,8 Msiarczan amonu wytraca z.surowicy krwi uczestniczacy w krzepni¢- ciu fibrynogen, natomiast do precypitacji albuminy dochodzi w obecnosci 2,4 M siarczanu amonu. Wysalanie stosuje sie rownied w poéniejszych eta- pach procesu oczyszczania, aby zagescié rozcieficzony roztwér bialka, poniewaz bialko po precypitacji moze zostaé ponownie rozpuszczone w mniejszej objetosci buforu. Bialka moina oddzielié od czasteczek © male| masie na drodze dializy przez potprzepuszczalna btong taka jak celofan (octan celulozy). Pory w takiej blonie pozwalaja na przejécie czasteczek o masie czasteczkowe|Sekeja B - Aminokwasy i biatka Ultrawirowanie do 10 kDa, natomiast czasteczki wieksze sa zatrzymywane w woreczku dializacyjnym (rys. 1). Poniewaz wiekszoéé biatka to czasteczki 0 masie wiekszej niz 10 kDa, technika ta nie pozwala na frakcjonowanie bialek, ale jest czesto stosowana do usuniecia z roztworu biatka malych czasteczek takich jak sole. Nalezy zauwazyé, Ze w stanie rownowagi stezenia malych czasteczek wewnatrz woreczka dializacyjnego i na zewnatrz sa sobie rowne (rys. 1b). Tak wigc, skuteczne zmniejszenie stezenia malych czaste- czek w roztworze bialka wymaga kilkukrotnej zmiany otaczajacego roztworu. Rys. 1. Rozdzial czasteczek metoda dializy na podstawie ich wielkosci. (a) Punkt wyiscia, (b) w stanie rownowagi Chociaz w przesztosci ultrawirowanie byto powszechnie uzywana meto- da izolacji, obecnie postep w innych technikach rozdziatu powaznie ogra- niczyt je} stosowanie. Bialka o zasadniczo réznych masach czasteczko- wych mozna rozdzielié wirowaniem warstwowym z zastosowaniem gra- dientu gestoSci sacharozy (patrz temat A4). Jednakze wiekszoéé bialek wykazuje zblizona gestosé i dlatego nie modzna ich rozdzieli¢ metoda wirowania w gradiencie gestosci (temat A4).Sekcja B - Aminokwasy i biatka BZ CHROMATOGRAFIA BIALEK LOLS aR LN Tematy pokrewne Oczyszczanie bialek (B6) Praeciwciala jako narzedzia Filtracja zelowa wykorzystujac kolumny upakowane porowatymi ziarnami umodliwia rozdzial bialek na podstawie ich masy czasteczkowej i ksztaltu, Bialka duze lub o wydluzonym ksztalcie nie moga wejsé w kanaliki ziaren i jako pierwsze ulegaja wymyciu z kolumny, natomiast bialka mniejsze wehodzac w kanaliki w ziarnach znajduja sig w plynie o wigkszej objetosci, co zwalnia ich ruch przez kolumne i prowadzi do opéénionego wyplywu. Filtragg Zelowa moina wykorzysta€ do odsolenia mieszaniny bialek lub wyznaczenia masy czasteczkowej bialka. W chromatografii jonowymiennej rozdziat bialek jest oparty na rOanicach ich wypadkowego ladunku. W chromatografii wymieniajacej aniony stosuje sig kolumne wypelniona ziarnami obdarzonymi ladunkiem dodatnim, z ktérymi wiaza sie bialka zwypadkowym ladunkiem ujemnym, natomiast w chromatografii wymuieniajacej kationy stosuje sig ziarna naladowane jemnie, z ktorymi wiada sie bialka o wypadkowym ladunku dodatnim. Zwiazane bialka wymywa sig z kolumny przez dodanie chlorku sodu lub zmiang pH buforu Chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzne wigzanie sig biatka z inna czasteczka, nazywana jej ligandem (np. inhibitor enzymu). Ligand unieruchamia sie na nierozpuszczalnym podlozu i upakowuje w kolumnie. Po nalozeniu mieszaniny bialek tylko okreslone biatko wiaze sie z ligandem. Wszystkie pozostale bialka wyplywaja z kolumny. Zwiazane bialko jest nastepnie uwalniane z unieruchomionego liganda w wysoce oczyszczonej formie. badaweze (D5) Filtracja zelowa W filtracji Zelowej (sqczeniu molekularnym lub chromatografii na sitach jekularnych) rozdzial czasteczek odbywa sig na podstawie ich wielko- ksztaltu. Mala objgtosé roztworu zawierajacego biatko naklada sie na szczyt kolumny wypelnione} porowatymi ziarnami (srednica 0,1 mm), wykonanymi z nierozpuszczalnego, ale wysoce uwodnionego polimeru, takiego jak poliakryloamid (Bio-Gel) albo weglowodany typu dekstran (Sephadex) lub agaroza (Sepharose) (rys. 1a). Mate czasteczki moga wejsé do kanalikéw w ziarnach, natomiast czasteczki wieksze lub o wydluzo-@ porowate iarna szklanal plastkowa kolumna = llos¢ biatka —= mieszanina biatok Yo objetose wyplywu (eluentu), —= Sekeja B - Aminokwasy i biatka nym ksztalcie — nie moga. Dlatego tez czqsteczki mniejsze znajduja sie w plynie o wiekszej objetosci: jest to zaréwno plyn otaczajacy porowate ziarna, jak i wypelniajacy znajdujace sie w nich kanaliki. Natomiast czaste- czki wieksze wystepuja tylko w plynie otaczajacym ziarna, co sprawia, ze przemieszczaja sig przez kolumne szybciej i wyplywaja (ulegaja elucji) z kolumny jako pierwsze (rys. 1a ib). Czasteczki mniejsze poruszaja sie wkolumnie znacznie wolniej i wyplywajaz kolumny pééniej. Dostepnesa ziarna o réénym rozmiarze poréw, co pozwala na skuteczny rozdziat bialek o rézne} wielkosci. Filtracja Zelowa jest stosowana czesto w celu odsolenia roztworu bialka (na przyklad w celu usunigcia siarczanu amonu po precypitacji siarczanem amonu; temat B6), poniewaé s6l wnika w kana- iki ziaren i wyplywa z kolumny p6éniej, natomiast bialko nie ma mozli- wosci wejécia w kanaliki ziaren i wyplywa z kolumny wezesnie} Filtracje Zelowa modna takée wykorzystaé do wyznaczenia masy czasteczkowej. Miedzy wzgledna objetoscia elucyjna bialka (Ve/ Vo, gdzie V. oznacza objetosé elucyjna danego bialka, a Ve — objetosé swobodng kolumny, czyli objetosé rozpuszezainika wypelniajacego przestrzen mie- dzy ziarnami; rys. 1b) a logarytmem jego masy czasteczkowe) wystepuje bulor podany na szczyt ouze probowka _— do zbierania ——~ biaka duze mate ozasteczhi 7 asteczk czasieea © Voy Veg Yoobietose 1 swobedna Ve cbietose Yee elucyjna bialka 0 logis masy czasteczkowej —e Rys. 1. Fillracja Zelowa. (a) Schemat przebiegu filragji Zelowe), (b) wykres wypiywu (elucji) ustrujacy rozdzial: (c) wykres zaleznosci weglednej objetosci elucyjnej od logasyimu masy czasteczkowe) dia znanych ialek z zaznaczeniem sposobu odezytania masy czasteczkowej biatka 0 znanej wzglednej abjetosci elucyjne}87 ~ Chromatografia hiatek 65 Chromatografia jonowymienna zaleznosé liniowa. Tak wige, stosujac biatka o znanej masie czasteczkowe), dla danej kolumny mozna wykreslié krzywa wzorcowa przedstawiajaca zaleznosé Ve/V. od logiy masy czasteczkowe). Znajac objetosé elucyjna bialka mozna wyznaczy¢ jego mase czasteczkowa przez odczytanie je) wartosci z krzywej wzorcowej (rys. 1c). W chromatografii jonowymienne rozdzial bialek nastepuje na podstawie ich wypadkowego (catkowitego) tadunku. Jesli w pH 7 wypadkowy Jadunek bialka jest ujemny, bialko to wiage sie z kolumna wypelniona ziarnami obdarzonymi ladunkiem dodatnim, natomiast bialko pozba- wione ladunku lub z wypadkowym ladunkiem dodatnim nie moze sie mjeszanina bulor Nac! co bialek ogre Zama biatka © Zladunkiem > 2 tfadunkiem Oo | esnin | iemmym OL seklana er 7 kolumna ‘ biatka biatke zladurkiem ~7® of “2 ladunivern dodatrim” — | gf —~ provi |“ emnym a zbierania o Bata | le 9 mata getose facunku wigksza gestae wemnege un ® bialko uiemnego zladunkiem | ‘ dodatnim gradient NaC t : 3 ‘objetose wyptywu (eluentuy ——e ys. 2. Chromatogratia jonowymienna. (a) Schemat przebiegu chromaiogratiijono- wymiennel: (b) wykres wyptywu (elucj) fustruigcy rozdziat 1) biatka o wypadkowym tadunky dodatnim, kre nie wiage sig z ziarnami o fadunku dodatnim i przechodzi swoboanie przez kolumne, 2) dwach bialek régnigcych sie tadunkiem ujermaym, Kore wiaza sie z ziamami o fadunku dodatnim i sa wymywane z kolumny przez 2wiekszajace sie stezenie NaC. Biatko 0 mniejsze) gestosc! fadunku ujernnego wymywane jest wozesniej niz biatko o wipkszej gestosc! fadunku ujemnegoChromatogratia powinowactwa Sekcja B ~ Aminokwasy { biatke zwiazaé. Obdarzone ladunkiem ujemnym bialko, kt6re zwiage sig z kolumna, mozna wymyé z kolumny przez je| przemycie roztworem chlorku sodu (jony Na*Cl*) o wzrastajacym gradiencie (zwigkszajacym sig stezeniu) i odpowiednim pH. Jony Cl konkuruja z bialkiem o wiazanie z obdarzonymi ladunkiem dodatnim grupami materialu kolummny. Bialka © malej gestosci ladunku ujemnego wyplywaja z kolumny szybciej niz bialka 0 wigkszej gestosci Jadunku ujemnego (rys. 2b). Do rozdzialu bialek o wypadkowym ladunku ujemnym (bialek aniono- wych) stosuje sie kolumny zawierajace obdarzone ladunkiem dodatnim grupy dietyloaminoetylowe (DEAE) (takie jak DEAE-celuloza lub DEAE- ~Sephadex). Ten typ chromatografii jonowymiennej nazywa sig chroma- tografia anionowymienna. Kolumny zawierajace obdarzone tadunkiem ujemnym grupy karboksymetylowe (CM) (takie jak CM-celuloza lub CM-Sephadex) stosuje sie do rozdzialu bialek 0 wypadkowym ladunku dodatnim (bialek kationowych). Ten typ chromatografii jest nazywany chromatografiq kationowymienna. Oprocz elucji_ gradientem NaCl, bialko mozna wymyé z kolumny wymieniajacej aniony zmniejszajac pH buforu, a z kolumny wymieniajacej kationy — zwiekszajac pH buforu, a wigc zmieniajac stan jonizacji laficuchow bocznych aminokwaséw (patrz temat B2) i, co za tym idzie, wypadkowy ladunek bialka. Chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficane, niekowalen- cyine i wykazujace duze powinowactwo wiazanie sie bialka z innq czasteczka, nazywana ligandem. Najpierw ligand jest wiazany kowalen- cyinie z obojgtnym chemicznie i porowatym nosnikiem (takim jak Sepha- rose). Mieszaning bialek przepuszcza sie przez kolumne z unieruchomio- nym (immobilizowanym) ligandem. OkreSlone bialko wiade sig z ligan- dem, natomiast pozostale przechodza swobodnie przez kolumne (rs. 3) Nastepnie kolumne przemywa sig intensywnie buforem, aby usuna¢ nie- specyficznie zwiazane bialka, a biatko wiazace sig z ligandem uwalnia sig z kolumny dwoma sposobami: przez przemycie kolumny roztworem zawierajacym ligand w wolnej postaci, ktéry konkurujez ligandem immo- bilizowanym o wiazanie z biatkiem, lub zmieniajac wlasciwosci buforu (zmiana pH lub stezenia soli). Jesli do elucji biatka z kolumny stosuje sig ligand w wolnej postaci, ligand ten musi zosta¢ nastepnie usuniety zwi¢k- | szej od niego czasteczki biatka. W tym celu czesto stosuje sig dialize (patrz temat B6). Chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzne, cze- sto wyjatkowe wtasciwosci bialka, umozliwia wigc jego wyodrebnienie z mieszaniny kilkuset innych bialek w trakcie pojedynczego etapu chro- matograficznego. Powszechnie stosowane w chromatografii powinowac- twa kombinacje immobilizowanych ligandéw i oczyszczanych bialek | obejmuja: inhibitor w celu oczyszczenia enzymu (patrz temat C4), prae- ciwciato w celu oczyszczenia antygenu (patrz temat D5), hormon (np. insulina) w celu oczyszczenia rozpoznajacego go receptora (patrz temat E5) i lektyne (np. konkanawalina A) w celu oczyszczenia glikopro- _ tein (patrz tematy E2 i H5)87 ~ Chromatografia biatek 67 migszanina o Roe roznych specyliczne & biatek biatko @ wiaze sie dodana woina zligandem posta liganda = '¢ : xe ms wm | ligand unieruchorviony S| nna niorozpuszczalnym ~ noériku upekowanym os \iatka 2bedne bialko specyticane w kolumnie @—> Pizechodza uloga wymyciu po ‘sobodnie zwigzaniu wolnego liganda ©) —_niespecyticane, nie 2wigzane biatka \ dodanie wolnego specyticzne liganda Pao los¢ biaika —» objetos¢ wyptywu (eluentu) ——> Ays. 3. Chromatogratia powinowactwa. (a) Schematycany przebieg chromatografii powinowactwa; (b) wykres wyplywu (elucii) ilustrujacy brak wiazania niespecyficznych blalek z unieruchomionym ligandem lich swoboane przejscie przez kolumne oraz wigzanie specylicznego biatka z unieruchomionym ligandem ijego wymycie z kolummy dopiero za pomoca woinego ligandaSekcja B - Aminokwasy i biatka 8&8 ELEKTROFOREZA BIALEK eae naan ama R RN PAGE | [__spsrace | ‘Opniskowanie | | eae ie bialek w elu ‘Tematy pokrewne Welektroforezie w zelu poliakryloamidowym (PAGE) biatka wprowadza sie w porowaty éel poliakryloamidowy i rozdziela w polu elektrycznym na podstawie ich wypadkowego ladunku ujemnego i masy czasteczkowej. Male czasteczki o wiekszym ladunku ujemnym migruja w elu dalej niz czasteczki wigksze 0 mniejszym Jadunku ujemnym Podczas SDS-PAGE bialka poddaje sig dzialaniu czynnika redukujacego, w celu zerwania wiqzan dwusiarczkowych, i detergentu anionowego dodecylosiarczanu sodu (SDS), ktory wywoluje denaturacje bialek, réwnoczeSnie nadajac im wypadkowy Jadunek ujemny. Nastepnie bialka frakcjonuje sig na drodze clektroforezy w Zelu poliakryloamidowym. Poniewaz w stosowanych warunkach wszystkie biatka wykazuja identyczny stosunek ladunku do masy, rozdzial odbywa sig na podstawie ich masy czqsteczkowe). Bialka najmniejsze migruja najszybcie). SDS-PAGE mosna zastosowaé do sprawdzenia stopnia czystosei preparatu danego bialka, wyznaczenia jego masy czasteczkowe| i liczby polipeptydowych podjednostek. W ogniskowaniu izoelektrycznym bialka poddaje sig elektroforezie w delu zawierajacym gradient pH. Rozdziat bialek odbywa sie na podstawie wzglednej zawartosci reszt aminokwas6w obdarzonych ladunkiem dodatnim i ujemnym, Kazde bialko zatrzymuje sie w Zelu po dotarciu do miejsca, w ktérym zanika jego wypadkowy ladunek, ezyli do miejsca 0 pH rownym wartosci jego punktu izoelektrycznego (pb. Bialka mozna uwidocznié w Zelu bezposrednio, stosujac wybarwianie barwnikiem o nazwie Coomassie brilliant blue lub barwnikiem srebrowym. Bialka znakowane promieniotworczym markerem uwidacznia sig nakladajac na Zel klisze rentgenowska i obserwujac zaczernienia na wywolanym autoradiogramie, ktére odpowiadaja znakowanym bialkom. Okreslone bialko mogna takze uwidocznié metoda testu immunologicznego nazywanego Western blot, polegajacej na przeniesieniu bialka z Zelu na nitroceluloze i inkubacji z przeciwcialem specyficznie je rozpoznajacym. To przeciwcialo, nazywane pierwszorzedowym, jest nastepnie wykrywane z zastosowaniem przeciwciala nazywanego drugorzedowym, ktore jest taczone z enzymem lub znakowane promieniotwérczym markerem. ‘Struktura biatka (B3) Przeciwciala jako narzedzia ‘Oczyszezanie bialek (B6) badaweze (D5)B8 - Elektroforeza biatok 69 PAGE W polu elektryeznym czasteczki obdarzone ladunkiem, takie jak bialka, poruszaja sie w kierunku jednej z elektrod, ktore to zjawisko nosi nazwe elektroforezy. Im wigkszy wypadkowy ladunek czasteczki, tym szybcie} sig ona porusza. W przypadku elektroforezy w zelu poliakryloamidowym (PAGE) rozdzial bialek jest oparty na régnicach zaréwno w masie czasteczkowej, jak i fadunku, poniewad. rozdzial elektroforetyczny jest prowadzony w elu dziatajacym jak sito molekularne. Male czasteczki przechodza swobodnie przez kanaliki w zelu, natomiast czasteczki wieksze sq zatrzymywane. Zele wykonuje sig na og6! z poliakryloamidu, substangji obojetne) chemicznie i powstajacej latwo w procesie polime- ryzacji akryloamidu. Wielkosé kanalikéw w Zelu moéna kontrolowaé przez, wyb6r odpo- wiedniego stezenia akryloamidu i odezynnika tworzacego wiazania po- przecane (sieciujacego) — metylenobisakryloamidu. Im wigksze zastoso- wane stegenie akryloamidu, tym mniejsze kanaliki w powstatym elu. Zel przygotowuje sie zwykle miedzy dwiema szklanymi plytami o powierz~ chni 7-20 cm?, oddalonych od siebie o 0,5-1,0 mm. Bialko naklada sig do Kieszonek na szczycie Zelu, ktore powstaja przez zanurzenie plastikowego grzebienia w roztworze Zelu przed jego zestaleniem (rys. 1). Prébe zawie- ajacq bialko miesza sie z niebieskim barwnikiem (blekitem bromofenolo- ‘wym), co ulatwia jej nalozenie na gel. Poniewaz czasteczki blekitu bromo- fenolowego sq male, substangja ta takze migruje szybko przez Zel podczas elektroforezy i dlatego jest wykorzystywana do wskazywania jej prze- biegu. W najprostszej postaci PAGE, pH buforu znajdujacego sie w zelu oraz w gérym i dolnym zbiorniku wynosi w przyblizeniu 9. W tych warunkach wigkszos¢ bialek wykazuje ujemny wypadkowy ladunek i migruje w kierunku anody umieszczonej w dolnym zbiorniku. Przemie- szczanie sig bialka w Zelu wywoluje sie przez przylozenie napiecia (okolo kieszonki ® satoda gory zbiornik na butor ~~ proba | ——warstwa zolu pollakryioamidawego migazy szklanymi pytami On A woe —|-doiny zoiomik ne butor Rys. 1, Elektroforeza w 2elu poliakryloamidowym. Biatka sq naktadane do kieszonek uformowanych na szczycie zelu. Po preytozeniu pola elektrycenego wedtué zolu, alka migruia w d6} elu. im mniejsze biatko / im wiekszy ego fadunek ujemny, tym dluzszq droge pokonuje70 Sekcja B - Aminokwasy i biatka SDS-PAGE 300 V) wadtuz Zelu (z. géry na dé}) na 30-90 min. Nastepnie Zel usuwa sie z aparatu, a znajdujace sie w nim bialka uwidacznia sig réznymi metodami. W SDS-PAGE biaika sa denaturowane i otaczane tadunkiem ujemnym [co jest wynikiem ich wigzania z czasteczkami dodecylosiarczanu sodu (SDS)], wskutek czego ich rozdziat jest oparty na réznicach w masie czasteczkowej. Mieszanine bialek poddaje sig najpierw dzialaniu czyn- nika redukujacego, takiego jak B-merkaptoetanol lub ditiotreitol, w celu usunigcia wszystkich wiqzan dwusiarczkowych (patrz temat B3). Nastep- nie stosuje sig silny detergent anionowy SDS, ktéry zrywa prawie wszyst- kie wiazania niekowalencyjne w bialku, co prowadzi do rozfaldowania sie Jaficucha polipeptydowego. Jedna czasteczka SDS, wiazaca sie ze szkiele- tem polipeptydowym dzieki hydrofobowemu laricuchowi alkilowemu, przypada w przyblizeniu na dwa aminokwasy. Tym sposobem zdenatu- rowane bialko wykazuje wypadkowy tadunek ujemny, ktéry jest propor- gjonalny do jego masy czasteczkowej. Mieszanine bialko/SDS naklada sig nastepnie do kieszonek znaj- dujacych sig w gérnej czeéci Zelu poliakryloamidowego, jak w PAGE (patrz rys. 1). Po przeprowadzeniu elektroforezy Zel usuwa sie z aparatu, a bialka uwidacznia (rys. 22). Bialka o male| masie czasteczkowej pokonuja w delu najdiuzsza droge, natomiast duze poruszaja si¢ znacznie wolniej, poniewaz sa zatrzymywane przez wiazania poprzeczne w éelu i pozostaja blisko jego gore} czesci. W tych warunkach ruchliwosé wiekszosci taficu- chow polipeptydowych zalezy liniowo od logarytmu ich masy. Dlatego ted mase czasteczkowa nieznanego bialka mozna wyznaczy¢ przeprowa- dzajac jego elektroforeze w obecnosci bialek o znanej masie czasteczkowe} (rys. 2b). Zwykle mozna odr6éni¢ bialka, ktérych masa czasteczkowa rozni sig 0 okolo 2% (np. 40 i 41 kDa, co odpowiada réénicy 10 aminokwas6w) SDS-PAGE jest metoda szeroko stosowana, szybka i o dudej czulosci, pozwalajaca na oszacowanie stopnia czystosci badanej préby, masy czasteczkowej nieznanego bialka i liczby polipeptydowych podjednostek w obrebie biaika (patrz temat B3). C3) logyomasy —» kiorunek elektroforezy codlegtos6, na ktéra —> nasiapita migracia Rys. 2, SDS-PAGE. (a) Obraz rozdziatu bialek metodla elektroforezy w Zeta poliakryloamidowym w obecnosci SDS. Sciezka 1, bialka 0 znanej masie ezasteczkowe] (wzorce masy czasteczkowel): Sciezka 2, nie oozyszozona mieszanina bialok; Sciezka 3, czgSciowo oczyszczone biatko; Sciezka 4, bialko cczyszezone do stanu homogennosci; (b) wyznaczenie masy czasteczkowe/ nieznanego bialka przez porownanie jego richiiwosci elektrotoretycznej (drogi migragii) z ruchliwosgoia wzorcéw masy czasteczkowe)86 - Elektroforeza biatek n Ogniskowani izoelektryczne Ogniskowanie izoelektryczne polega na elektroforetycznym rozdziale bialek na podstawie wzglednej zawartosci grup obdarzonych ladunkiem dodatnim i ujemnym. Kiedy bialko znajdzie sie w swym pl (patrz. temat B2), jego wypadkowy ladunek wynosi zero, co uniemozliwia dalszy ruch w polu elektryeznym. W ogniskowaniu izoelektrycznym stosuje sig zel poliakryloamidowy o duzym rozmiarze kanalikow (aby nie przeciwdzialaé migracji bialka), ktory zawiera mieszaning poliamfolitéw (malych polimeréw 0 duzej gestosci fadunku, ktére wykazujq wiele wartosci pl). Kiedy zel znajdzie sie w polu elektrycznym, poliamfolity migruja i tworza gradient pH. Roz~ dzial biatek metoda ogniskowania izoelektrycznego polega na elektrofo- rezie w takim Zelu. Kazde bialko zatrayma sie w Zelu w miejscu, ktérego PH odpowiada wartosci jego punktu izoelektrycznego (rys. 3). Jesli bialko dyfunduje z takiego miejsca do miejsca o inne} wartosci pH, jego wypad- kowy Jadunek ulega zmianie i powstajace sily elektroforetyczne powo- duja powrét bialka do miejsca jego punktu izoelektrycznego. Tym sposo- bem kazde bialko gromadzi sig w miejscu swego punktu elektrycznego w postaci waskiego prazka (ktorego szerokosé moze odpowiadaé nawet 0,01 jednostki pH). (@) ©) oO © E gE 70-4 704 a ina 5 2 604 604 5 so 504 © © Fiys. 3. Ogniskowanie izoelektryczne, (a) Przed przylozeniem pola elektrycznego. (0) po przylazeniu pola elekirycznego bialka migrujg do miejsca, w kiérym ich wypadkowy iadunek wynasi zero (punkt izoelektryczny, pl) Ogniskowanie izoelektryczne mona polaczyéz SDS-PAGE, co prowa- dzi do uzyskania metody rozdzialu o bardzo dugej rozdzielczosci, znanej jako dwukierunkowa elektroforeza w zelu. Probke bialka poddaje sig najpierw ogniskowaniu izoelektrycznemu w waskich paskach Zelu zawi rajacego poliamfolity. Paski te umieszcza sie nastepnie na szczycie Zelu poliakryloamidowego zawierajacego SDS i przeprowadza sig elektrofo- Teze, uzyskujac dwuwymiarowy uklad plamek, na ktory sklada sie roz- dzial na podstawie pH, przebiegajacy w kierunku poziomym, i rozdziat na podstawie masy czasteczkowej, przebiegajacy pionowo (rys. 4). Wynik calkowity to rozdzial bialek na podstawie zaréwno ich masy czasteczko- wej, jak j fadunku. ‘Tym sposobem dwa bialka o bardzo podobnej lub identycznej wartosci PH, tworzace pojedynczy prazek w ogniskowaniu izoelektrycznym, po przeprowadzeniu elektroforezy dwukierunkowej pojawiaja sie jako dwie72 Uwidocznienie biatek w zelu Sekcia B - Aminokwasy i biatka @ ccariskowanie izcelekiyozne bike __oH0 ne w poet azkoe @ eekrotoreza w Fela ‘w obecnasci SDS ° ° biatka w postaci e plamek © ys. 4. Dwukierunkowa eloktroforeza w Zelu. Bialko poddaje sie najpiorw | ogniskowaniu izoelektryeznemu i nasteonie rozdziatowi metoca SDS-PAGE, | tory przebiega w kierunku prostopadiym do poprzediiego | | odrebne plamki (rys. 4). Podobnie, biatka o zblizonej lub identycznej masie caasteczkowej, kt6re w wyniku SDS-PAGE pojawilyby sie jako pojedyr- czy praéek, na skutek poczatkowego rozdzialu metoda ogniskowania izo- elektrycznego take tworzq dwie rézne plamki. Poniewaé wigkszosci bialek nie mozna zobaczyé bezposrednio w Zelu, zachodzi koniecznosé zastosowania metody pozwalajacej na ich uwidocz- nienie po zakoriczonej elektroforezie. Najczescie} stosuje sie barwienie | deh barwnikiem 0 nazwie Coomassie brilliant blue. Zel zawierajacy toz- | dziclone biatka zanurza sie w kwasnym alkoholowym roztworze barw- | nika. Powoduje to denaturacje bialek, ich umocowanie w zelu tak, Ze nie | moga zostaé z niego wymyte, i zabarwienie dzieki zwiazaniu z barwni- kiem. Po usunigcitt nadmiaru barwnika, bialka zostaja uwidocznione w postaci odrebnych niebieskich prazk6w (patrz rys. 2a). Zastosowanie barwnika Coomassie brilliant blue pozwala na uwidocznienie juz tak malej ilosci bialka, jak 0,1-1,0 yg. Jeszeze czulsza metoda barwienia Zelu polega na jego nasaczeniu w roztworze soli srebra. Jednakze ta metoda jest trudniejsza w wykonaniu. Jesli bialka sq znakowane promieniotwér ezym markerem, moga zostaé uwidocznione na kliszy rentgenowskie), polozonej na powierzchni elu. Po uplywie pewnego czasu (godziny lub dni, zaleznie od poziomu promieniotwérczosci badanych bialek) emitor wane promieniowanie powoduje zaczernienie kliszy. Po wywolaniu kl szy powstajacy autoradiogram zawiera zaciemnione obszary odpowia dajace polozeniu znakowanych biatek. Innym sposobem uwidocznienia bialek jest zastosowanie przeciwciala skierowanego przeciwko danemu biaiku, co stanowi podstawe test immunologicznego nazywanego Western blot (patrz temat D5). W meto dzie tej bialko musi zostaé przeniesione na arkusz nitrocelulozy lub blony nylonowej. W celu dokonania przeniesienia (przez odcisnigcie — ang blotting) nitroceluloze kiadzie sig na Zelu i przyklada pole clektryczne ‘Tym sposobem nitroceluloza zawiera obraz rozdzialu identyczny 2 uzj skanym na Zelu. Nadmiar miejsc wiqzania na nitrocelulozie jest bloke8 - Elektroforeza biatete 7. wany roztworem niespecyficznego biatka, takiego jak mleko w proszku, po czym nitroceluloze umieszcza sig w roztworze zawierajacym przeciw- cialo rozpoznajace okreslone bialko (przeciwcialo pierwszorzedowe). Po usunigcit: nadmiaru nie zwiazanego przeciwciala, pierwszorzedowe przeciwciato zwiqzane specyficznie z okreslonym biatkiem wykrywa sig za pomoca przeciwciala drugorzedowego, ktore zostalo wyznakowane markerem promieniotw6rezym lub sprzegniete z enzymem. Przeciw- cialo to uwidacznia sie przez nalozenie na nitroceluloze kliszy rentgeno- wskiej (jesli zastosowano znakowanie markerem promieniotwérezym) lub podanie roztworu substratu przeksztalcanego w barwny nierozpusz~ czalny produkt przez enzym, z ktérym sprzegni¢to przeciwcialo. + Preciwcialo drugorzedowe mona take uwidocenié wykorzystujac zawisko wzmocnione| chemiluminescengji (tzw. metoda ECL —ang, enhanced chemiluminescence), c2yli wamocnione| emisfi swiatta przez zwiazek chemiczny ‘wprowadzony w stan webudzony na drodze reakcji chemicznej.Jedna z najlepie} poznanych reakcji tego typu jest utlenianie luminolu katalizowane przez peroksyda7e Wemocnienie chemiluminescengji nastepuje w wyniku utleniania luminolu w obecnofei wzmacniaczy typu fenoli(1000-krotne zwigkszenie emisji swiatla). Uzyskana emisja éwiatla wykazuyje czas polowicznego trwania rzedu 60 minut i moze zostae wykryta za pomoca kliszy rentgenowskie). Wykorzystanie metody ECL wymaga zastosowania przeciwciala drugorzedowego sprzezonego 2 peroksydaza (prayp. Hum.)Sekcja B - Aminokwa: B9 SEKWENCJONOWANIE BIALEK I SYNTEZA PEPTYDOW LLC RR mee R CIE Analiza sktadu Parstvedted Degiadacja TloSé kaédego aminokwasu w bialku moana wyznaczy¢ dzieki hydro- lizie kwasowej i rozdziatowi na poszczegdine aminokwasy metoda chromatografii jonowymienne}. Aminokwasy mozna nastepnie wykryé stosujac reakcje barwna z substratem typu ninhydryna lub fluoreskamina. Aminokwas z aminowego korica bialka mozna okreslié dzieki poprzedzajqcej hydrolize kwasowa reakcji bialka z chlorkiem dansylu lub dinitrofluorobenzenem, Sekwencje aminokwasowa bialka mozna wyznaczyé za pomoca degradacji Edmana, w toku ktérej dochodzi do usuwania kolenych aminokwas6w z kofica aminowego. W celu wyznakowania aminokwasu z korica aminowego stosui sie fenylo- izotiocyjanian, ktory tworzy odlaczana nastepnie fenylotichydanto- inowa pochodna aminokwasu, bedaca zwiazkiem cyklicznym. Aby przeprowadzié sekwencjonowanie bialka, laticuch polipeptydowy musi zostaé rozszczepiony na mniejsze fragmenty za pomoca odezyn- nikéw chemicznych (np. bromocyjanu) lub enzyméw (np. chymotryp- syny lub trypsyny). Powstajace mniejsze fragmenty sekwencjonuje sig metoda degradacji Edmana. Calkowita sekwencje sklada sig nastepnie z nakladajacych sig fragmentow uzyskanych przez rozszczepianie lay\- cucha réznymi czynnikami. Aminopeptydazy i karboksypeptydazy uwalniaja aminokwasy z. koricéw bialka, odpowiednio aminowego i karboksylowego. Polipeptydy wchodzace w sklad bialka zlozonego zwielu podjednostek musza zostaé najpierw od siebie odlaczone i nastepnie rozdzielone. W tym celu stosuje sie mocznik lub chlorowo- dorek guanidyny, ktore zrywaja wiazania niekowalencyjne, oraz B-merkaptoetanol lub ditiotreitol, likwidujace wiazania dwusiarczkowe, Sekwencja krdtkich polipeptydéw moe zostaé szybko poznana dzieki spektrometrii masowej wykorzystujacej bombardowanie rozpedzony- mi atomami (FAB-MS). Technika ta pozwala nie tylko na wyznaczenie sekwengji aminokwasowej peptydu, ale takée dostarcza informacje dotyezace modyfikacji potranslacyjnych. Sekwencje bialka mozna wyznaczyé stosujac technike rekombinagji DNA, pozwalajaca na znalezienie i ustalenie sekwengji fragmentu DNA Kodujacego dane bialko. Sekwencje aminokwasowa bialka mozna wydedukowaé na podstawie sekwengji DNA, opierajac sig na kodzie genetyeznym89 - Sekwencionowanie biatek i synteza peptydow 78 Sekwencja aminokwasowa bialka odslania nie tylko jego strukture pierwszorzedowa, ale take pozwala ustalié przynaleznosé bialka do danej rodziny lub grupy, jego zwiazki ewolucyjne, modliwe dluplikacje genu i potranslacyjne modyfikacje. Ponadto znajomosé sekwengji aminokwas6w umoéliwia wytworzenie specyficenych przeciwcial i sond DNA. W chemicznej syntezie peptydéw metoda fazy stalej uzyskuje sie peptydy dzieki dodawaniu wolnych aminokwas6w do unieruchomio- nego na stalym podiozu peptydu. Aby zapobiec niepozadanym reakcjom, grupe a-aminowg i reaktywne lafcuchy boczne wolnych aminokwas6w chroni sig lub blokuje chemicznie, po czym po przylaczeniu aminokwasu do rosnacego laticucha peptydowego czynniki ochronne lub blokujace sq usuwane. Tematy pokrewne Chromatografia bialek (B7) Kod genetyczny (H1) Elektroforeza bialek (B8) An amino- kwasowego sktadu Degradacja Edmana Analiza skladu aminokwasowego pozwala na wyznaczenie liczby kaz- dego rodzaju aminokwasu w bialku. Oczyszczona probe bialka poddaje sig hydrolizie do budujacych je aminokwasow, kt6ra prowadzi sie pod préénia, w zamknigtych probéwkach, w 6 M HCl i temperaturze 110°C przez 24 godziny. Powstajaca_mieszaning aminokwaséw (hydrolizat) rozdziela sie metoda chromatografii jonowymiennej (patrz temat B7) na kolumnie zawierajace) sulfonowa zywice polistyrenowa, co pozwala wyodrebnié 20 standardowych aminokwas6w (patrz temat Bl). Uzyskane amino- kwasy wybarwia sig i oznacza ilogciowo za pomoca reakcjiz ninhydryna. W wyniku tej reakcji a-aminokwasy daja niebieskie zabarwienie, nato- miast iminokwas prolina daje kolor Zélty. Hosé kazdego aminokwasu ww nieznanej prdbie moana ustalié przez poréwnanie uzyskanej absorban- ji ze znana ilosciq danego aminokwasu w probie wzorcowej. Zastosowa- nie ninhydryny pozwala na wykrycie 10 nmoli danego aminokwasu. Czul- szy system oznaczania (pozwalajacy na wykrycie 10 pmoli aminokwasu) wykorzystuje reakcje z fluoreskamina, kt6ra reaguje z grupa a-aminowa i tworzy fluoryzujacy produkt. Analiza skladu aminokwasowego po- zwala wyznaczy¢ ilos¢ kazdego aminokwasu w peptydzie, ale nie dostar- cza informagi dotyczace} kolejnogci ich ulozenia. Na przyklad sktad aminokwasowy oligopeptydu Val-Phe-Asp-Lys-Gly-Phe-Val-Glu-Arg przedstawia sig nastepujaco: (Arg, Asp, Glu, Gly, Lys, Phez, Val2) gdzie nawias i przecinki migdzy aminokwasami oznaczaja, ze mamy do czynienia ze skladem aminokwasowym, a nie sekwencja. Identyfikacje aminokwasu z aminowego korica biatka (korica N) mozna uzyskaé przeprowadzajac reakcje bialka ze zwiqzkiem tworzacym stabil-Sekcja B— Aminokwasy i biatka ne wigzania kowalencyjne, zanim bialko to zostanie poddane hydrolizie w 6M HCl. Wyznakowany aminokwas z kotica N moana zidentyfikowaé przez poréwnanie jego wiasciwosci chromatograficznych z. wzorcowymi pochodnymi aminokwas6w. Zwiazkami powszechnie stosowanymi w celu analizy korica N sq dinitrofluorobenzen i chlorek dansylu. jesli metode te zastosowano by w przypadku przedstawionego powyze) oligo- peptydu, udaloby sig zidentyfikowaé Val polozona na koricu N, lecz reszta sekwengji pozostalaby nieznana. Dalsza reakcja 2 chlorkiem dan- sylu nie pozwolilaby na identyfikacje kolejnych reszt, poniewaz rozpa- trywany peptyd ulegiby calkowite| degradacji w procesie hydrolizy kwasowej. Pehr Edman wynalazi metode pozwalajaca rozwiazaé powyészy pro- blem i umoéliwiajacq znakowanie aminokwasu zkorica N orazjego uwol- | nienie, bez zrywania wigzan peptydowych migdzy pozostalymi amino- kwasami. Tak zwana degradacja Edmana polega na koleinym odszczepia- niu reszt aminokwasowych z korica N bialka lub peptydu i ich identyfika- gi. Pozbawiona ladunku reszta aminokwasu znajdujacego sig na koficu N bialka reaguje z fenyloizotiocyjanianem, tworzac fenylotiokarbamoilowa pochodna uwalniana z bialka w Srodowisku lekko kwasnym w postaci fenylotiohydantoinowej (PTH) pochodnej aminokwasu, ktdra jest zwiazkiem cyklicanym (rys. 1). Skrécone o jedna reszte aminokwasowa bialko moze zostaé poddane kolejnemu cyklowi znakowania i odszczepia- nia, Uwolnione PTH-aminokwasy mozna zidentyfikowaé dzieki wysoko- cignieniowe} chromatografii cieczowej (HPLC). Opisana technika sek- fonyloizotiogyjanian RO Ro 1oit.t il rol oil Crises tinisieeciey —¢ ree 3 vn toy SS PN dot ae H HOH ‘ x ys. 1. Degradacja Edmana, Aminokwas z konica N bialka jest znakowany za pomoca fenyloizotiocyjanianu. W warunkach fagodnej hydrolizy kwasowoj aminokwas ten zostaje uwolniony w postaci pochodhej PTH, a skrocony 0 jedna reszie aminokwasowa peptyd mozna poddaé kolejnemu cyklowi znakowania JodszezepianiaB9 ~ Sekwoncjonowanie biatek i syntera peptydow 7 Strategia sekwencjo- nowa: wencjonowania zostala zautomatyzowana i udoskonalona do tego stop- nia, Ze jest mozliwe poznanie sekwengji okolo 50 aminokwaséw z korica N bialka, z uzyciem pikomolowych ilogci materialu wyjéciowego. Bialko Sredniej wielkosci (50 kDa) zawiera okolo 500 aminokwasow. Dla- tego ted, nawet z zastosowaniem wysoce oczyszczonego materiatu, meto- da degradacji Edmana umoiliwi poznanie sekwengj tylko jego dziesiate| czeSci, poczawszy od korica N. Aby ustalié sekwencje duzego biaika, naledy je najpierw rozszczepiéna mniejsze fragmenty wielkosci 20-100 reszt, kt6re nastepnie rozdziela sie i poddaje sekwencjonowaniu. Specyficzne rozszczepienie mozna osiagnaé metodami chemicznymi lub enzymatycznymi. Na przyklad bromocyjan (CNBr) rozcina taticuchy polipeptydowe po stronie karboksylowej reszt ‘Met, a enzymy trypsyna lub chymotrypsyna tnq wiazania po stronie kar- boksylowej aminokwaséw, odpowiednio: zasadowych (Arg, Lys) i aro- matycznych (Phe, Trp, Tyr). Po trawieniu trypsyna z biatka zawierajacego szesé Lys i pigé Arg otrzymuje sig 12 peptydow trypsynowych, z ktérych kazdy jest zakoriczony Arg lub Lys, z wyjatkiem peptydu z kotica karbo- ksylowego (korica C). Peptydy otrzymane przez chemiczne lub enzymaty- cene rozszezepienie bialka rozdzieia sig metoda chromatografii (np. chro- matografia jonowymienna; patrz temat B7), a sekwencje kazdego z nich ustala sie metoda degradacji Edmana. Poznanie sekwencji kazdego peptydu nie jest rownowadne z ustale- niem sekwengji tych peptydéw w bialku. Kolejnym etapem jest wigc wytworzenie nakladajacych sig fragment6w. W tym celu wyjéciowy lati- cuch polipeptydowy rozszczepia sig innym zwiazkiem lub enzymem (np. chymotrypsyna), a powstale fragmenty rozdziela sig i sekwencjonuje. Otrzymane peptydy chymotrypsynowe nakladaja sie na peptydy trypsy- nowe, co umozliwia ustalenie kolejnosci ulozenia badanych fragmentow (rys. 2). W ten sposéb mona ustalié sekwencje calego taricucha poli- peptydowego. peptydy trypsynowe peptydy chymotrypsynowe Gly ~ Phe ~ Val ~ Gu ~ Arg ‘Asp - Lys - Gly - Phe Val Phe ~ Asp Lys Val- Pre Val- Glu ~ Arg peptydy trypsynowe Val ~ Phe ~ Asp ~ Ly. ~ Gly ~ Phe ~ Val~ Glu ~ Arg peptydy chymotrypsynowe fiys. 2. Zastosowanio nakladajgoych sie fragmentow do wyznaczenia sekwencji epiyd, Proba biaika jest trawiona najpierw trypsyna, a powsiale peptydy rozdeiela Sie i podiaaje sekwencjonowaniu. Nastepnie kolejna probke tego samago bialka trawi ‘ie chymotrypsyna, a uzyskane peptydy ponownie rozdziela sig i poddaje sekwencjonowaniu. Kolejnosé ulozenia tragmentéw peptycow w biaiku ustala sie przez poréwnanie uzyskanych sekwencfi78 Sekwencjonowa- nie peptydéw metoda spektrometrii masowej Techni rekombinacji DNA Sokeja B - Aminokwasy i biatka W celu uzyskania informacji dotyczacych aminokwas6w koticowych (z koncéw laricucha polipeptydowego) stosuje sie specyficzne enzymy nazywane egzopeptydazami, kt6re uwalniaja po jednym aminokwasie z korica laicucha polipeptydowego. Aminopeptydazy usuwaja amino- kwasy z korica N; karboksypeptydazy — z korica C. Uwolniony amino- kwas mogna nastepnie zidentyfikowaé dzieki poréwnaniu ze znanymi standardami Aby ustalié sekwencje biatka zbudowanego z wielu podjednostek, nalezy najpierw doprowadzié do dysocjagi poszezegéinych taricuchéw polipeptydowych. W tym celu stosuje sie ezynniki denaturujace, takie jak mocznik lub chlorowodorek guanidyny, kt6re likwiduja oddziatywania niekowalencyjne. Nalezy rowniex zerwaé istniejace w bialku wiazania dwusiarczkowe, co uzyskuje sie na drodze redukgji zwiqzkami takimi jak f-merkaptoetanol lub ditiotreitol. Aby zapobiec rekombinacji reszt cyste- iny, stosuje sig jodooctan, z kt6rym aminokwas ten tworzy stabilng S-kar- ‘boksymetylowa pochodna. Nastepnie rozdziela sig poszczegéine laficu- chy polipeptydowe, na przyklad metoda chromatografii jonowymienne| (patrz temat B7), po czym ustala sig ich sekwencje. Obecnie mozna wyzna- czyé sekwencje pikomolowych ilosci bialka po jego rozdzieleniu metoda SDS-PAGE i to stosujac bezposrednio Zel poliakryloamidowy zawierajacy to bialko lub przenoszac je najpierw na nitroceluloze (patrz temat B8). Sekwencja polipeptydéw zawierajacych okolo 25 reszt moze zostaé usta- lona dzieki zastosowaniu metody spektrometrii masowej (MS) wykorzy- stujace technike jonizacyjna nazywana bombardowaniem rozpedzo- nymi atomami (FAB) w polaczeniu z tandemowym spektrometrem masowym (dwa spektrometry masowe seryjnie sprzezone). Sekwende polipeptydu wyznacza siena podstawie mas czasteczkow ych réznych fra- gmentow powstajacych w wyniku jonizacji w ciagu zaledwie kilku minut, podezas gdy jeden cykl degradacji Edmana trwa godzine. Ponadto spek- trometria masowa umosliwia zsekwencjonowanie kilku polipeptydow znajdujacych sig w mieszaninie, bez koniecznosci catkowitego oczyszcze- nia kagdego z nich przed przystapieniem do analizy. Inna zaleta spektro- metrii masowej jest mozliwos¢ jej wykorzystania do wyznaczenia sekwen- Gi peptydow z zablokowanym kofcem N. Blokada taka wystepuje na przyklad w piroglutaminianie, pochodnej glutaminianu, w ktérej grupa karboksylowa laficucha bocznego tworzy wiqzanie amidowe z pierwszo- rzedowa grupa aminowa (jest to wystepujaca powszechnie u organizméw eukariotycznych modyfikacja potranslacyjna uniemodliwiajaca zastoso- wanie degradacji Edmana). Spektrometria masowa pozwala takze schara- kteryzowaé inne modyfikacje potranslacyjne, takie jak glikozylacja czy fosforylacja Chociaz dzieki opisane} powyze) metodzie degradagi Edmana poznano sekwencje wielu bialek, jej zastosowanie w przypadku duzych bialek jest trudne i czasochlonne. Stosowana obecnie technika rekombinacji DNA pozwala na ustalenie sekwencji nawet bardzo duzych biatek. Najpierw wyznacza sie sekwengje odcinka DNA kodujacego dane bialko, a nastep- nie na podstawie kodu genetycznego odszyfrowuje sig sekwencje bialka (patrz temat H1). Jednakze bezposrednie sekwencjonowanie biatka jestjonowanie biatek i synteza peptydow 79 Informacje uzyskane na podstawie sekwenoji biatka Synteza peptydow nadal czesto stosowane w celu potwierdzenia prawdziwosci ustalonej sekwengji. Obecnie wigc sekwencje bialek wyznacza sie stosujac obie tech- niki, fj. sekwencjonowanie biatka i sekwencjonowanie DNA. Sekwencja aminokwasowa biatka dostarcza wigce) informagii niz tylko o strukturze pierwszorzedowej biatka. . Dana sekwencje mogna poréwnaé z innymi znanymi sekwencjami, aby okresli¢ ich podobienistwo. Na przyktad sekwencje hemoglobiny imioglobiny wskazuja, ze bialka te naleza do grupy globin lub rodziny bialek (patrz temat B4). 2. Poréwnanie sekwengji tego samego bialka w obrebie réinych gatun- k6w dostareza informacji na temat ich ewolucyjnego pokrewienstwa. 3. Obecnosé powtarzajacych sie w sekwengi odcinkéw pozwala wnio- skowaé, Ze biatko powstato na drodze duplikacji genu (np. czasteczki przeciwcial; patrz temat D2). 4. W obrebie sekwencji aminokwasowej moga wystepowaé specyficzne odcinki rozpoznawane jako sygnaly w procesie potranslacyjnej ob- r6bki bialka (np. glikozylacji lub obrébki proteolitycznej; patrz temat Ho). 5. Dane o sekwencji aminokwasowe} bialka wykorzystuje sig w celu uzyskania specyficznych przeciwcial, ktre mogna nastepnie zastoso- wa¢ w badaniach struktury i funkeji tego bialka (patrz temat D5). 6. Sekwencje aminokwasowa bialka mozna wykorzystaé do zaprojekto- wania sond DNA, specyficznych wzgledem genu kodujacego biatko (patrz tematy I2 i 16). Peptydy moga byé syntetyzowane chemicznie w wyniku kowalencyjne- go wiazania aminokwas6w do korica rosnacego laficucha peptydowego. W syntezie peptydéw metoda fazy statej wydiuzajacy sig laticuch pepty- dowy jest zwiazany kowalencyjnie swoim koricem C z nierozpuszczal- nym podlozem (np. ziarna polistyrenowe). Kolejny, przylaczajacy sig ami- nokwas oddzialuje z wolna grupa a-aminowa unieruchomionego pepty- du. Aminokwas ten jednak takze posiada wolna grupe a-aminowa, kt6ra moze uczestniczyé w niepozadanych reakcach. Aby temu zapobiec, gru- py a-aminowe w wolnych aminokwasach sq chemicznie chronione (blo- kowane), co uniemo#liwia ich reakcje z innymi czasteczkami. Po przy- laczeniu kolejnego aminokwasu jego grupa a-aminowa znajduje si¢ na koficu N rosnacego peptydu i po usunigciu czynnika ochronnego (blo- kujacego) uczestniczy w powstaniu kolejnego wiazania peptydowego. Kady cykl dodawania kolejnych aminokwas6w wymaga wiec etapu sprzezenia i etapu odblokowania. Ponadto, aby zapobiec niepozadanym reakcjom blokuje sie takze reaktywne laricuchy boczne.Sekcja C - Enzymy Ci WPROWADZENIE DO ENZYMOW Katalizatory Enzymy jako | Micjsce aktywne | Specyficznosé | substratowa Klasyfikacja | enzymow encanta Enzymy sq katalizatorami, ktre zmieniaja szybkos¢ reak¢ji, same nie ulegajac zmianie. Enzymy sa wysoce specyficzne, a ich aktywnosé moze byé regulowana. W zasadzie wszystkie enzymy sa bialkami, aczkolwiek zidentyfikowano pewne RNA czynne katalitycznie. Miejsce aktywne jest regionem enzymu, ktory wiade substrat, tworzy kompleks enzym-substrat i przeksztalca go w produkt. Miejsce aktywne ma wymiar przestrzenny i czesto stanowi w bialkowym ‘enzymie zaglebienie lub szczeling na powierzchni biatka, w kt6re} substrat zwiazany jest licznymi slabymi oddzialywaniami. Proponuje sie dwa modele wyjasniajgce sposéb, w jaki enzym wiaze sw6j substrat: model zamka i kiucza oraz model dopasowania indukowanego. O specyficanosci substratowej enzymu decyduja wlasciwosci i przestrzenne ulozenie reszt aminokwaséw tworzacych miejsce aktywne. Proteazy serynowe — trypsyna, chymotrypsyna oraz elastaza rozszezepiaja wiazania peptydowe w substratach biatkowych po stronie karboksylowe), odpowiednio — naladowanych dadatnio, aromatycznych i malych bocznych taficuch6w reszt aminokwas6w, dzigki komplementarnoéci reszt w aktywnych migjscach enzyméw: Enzymy dzieli sig na szesé glownych grup wedhug katalizowanych przez nie reakcji. Kaédy enzym ma charakterystyczny numer klasyfikacyjny skladajacy sig z czterech liczb, Oznaczanie enzymu polega na pomiarze przemiany substratu w produkt w warunkach obecnoéci kofaktorow i w okreslonym pH oraz, temperaturze, w ktérych enzym jest optymainie aktywny. Uzywa sig duaych stezen substratu, przez co poczatkowa szybkosé reake|i jest proporcjonalna do stezenia enzymu. Mierzy sig albo szybkosé powstawania produktu, albo szybkos¢ zuzywania substratu, czesto poslugujac sig zmianami absorbangji mierzonymi spektrofotometry- cznie. Do monitorowania reakcji enzymatycznej czesto uzywa sie zredukowanego dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADH) oraz zredukowanego fosforanu dinukleotydu nikotynoamido- adeninowego (NADPH), ktére absorbujq Swiatlo przy 340 nm. JeSli ani substrat, ani produkt reakcji katalizowanej enzymatycznie nie absorbuje swiatla przy dostepnej dia pomiaréw dlugosci fali, enzym moéna oznaczaé wiadac reakcje 2 reakcjq katalizowana przez inny enzym, w ktérej wystepuja zmiany absorbangji. Ten drugi enzym musi byé uzyty w nadmiarze, przez co etapem ograniczajacym w takim potaczonym pomiarze jest dzialanie pierwszego enzymu.Sekeja C ~ Enzymy Koenzymy i grupy| Pewne enzymy, aby funkcjonowaé, wymagaja obecnosci kofaktor6w prostetycane | malych jednostek niebialkowych. Kofaktorami moga byé | troenzymy nieorganiczne jony lub ztozone czasteczki organiczne, nazywane koenzymami. Kofaktor zwiqzany z enzymem kowalencyjnie jest nazywany grupa prostetyczng. Holoenzym jest katalitycznie aktywna forma enzymu 2 jego kofaktorem, natomiast apoenzym to tylko sama jego czeSé bialkowa. Wiele koenzyméw pochodzi z prekursorw, jakimi sa witaminy pobierane z pokarmem, ktérych niedobor powoduje okreslone choroby. Szeroko rozpowszechnionymi koenzymami, bioracymi udziat w reakcjach oksydoredukcyjnych, sa: dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD"), fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP), dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) i mononukleotyd flawinowy (FMN). Jzoenzymy sq réznymi formami danego enzymu, ktore katalizuja te sama reakcje, ale wykazuja odmienne wiasciwosci fizyczne lub Kinetyczne. Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej (LDH) moéna rozdzielié elektroforetycznie, co stanowi na przyklad podstawe Kliniczne| diagnozy zawalu migsnia sercowego, Tematy pokrewne Termodynamika (C2) Inhibicja enzyméw (C4) Kinetyka enzymow (C3) Regulacja aktywnoéci enzymatycznej (C5) Enzymy jako katalizatory Miejsce aktywne Enzymy sq katalizatorami, ktore zwigkszajq szybkosé reakcji chemicznei, same nie ulegajac zmianie. W nieobecnosci enzymu reakcja moze zacho- dziéniezwykle wolno, natomiast w jego obecnosci szybkosé reake}i znacz- nie wzrasta, nawet do 10” razy. Reakcje katalizowane przez enzymy zazwyczaj przebiegaja we wzglednie lagodnych warunkach (temperatura ponizej 100°C, cignienie atmosferyczne i obojetne pH) - w pordwnaniu 2 warunkami odpowiednich niekatalizowanych reakcji chemicznych Enzymy sq wysoce specyficzne wzgledem substrat6w, na ktére dzialaja, i produktw, ktére tworza. Poza tym aktywnosé enzymatyczna moze byé regulowana, zmieniajac sig w zaleznosci od stezenia substratow lib innych czasteczek (patrz temat C5). Prawie wszystkie enzymy sa biatka- mi, chociad zidentyfikowano ted kilka rodzajéw czasteczek RNA aktyw- nych katalitycznie. Miejsce aktywne enzymu jest regionem, ktéry wiaze substrat i przemie nia go w produkt. Zazwyczaj jest to wzglednie niewielka czesé cate) czasteczki enzymu i stanowi okreslona tréjwymiarowa przestrzen, utwo- rzona przez reszty aminokwas6w, kt6re w liniowym laricuchu polipepty- dowym moga leze¢ daleko od siebie (patrz, temat B3). Miejsce aktywne jest czesto szczelina lub zaglebieniem w czqsteczce enzymu, ktore tworzy sr0- dowisko w znacznym stopniu niepolarne, co ulatwia wiazanie substratu. Substrat(y) jest wiazany w miejscu aktywnym przez liczne stabe sity (oddzialywania elektrostatyczne, wiazania wodorowe, sily van der We- alsa, oddzialywania hydrofobowe; patrz temat B3), a w pewnych przy- padkach przez odwracalne wiazania kowalencyjne. Po zwiazaniu czaste-C1 ~Wprowadzenie do enzymow 83 substratowa czki substratu i utworzeniu kompleksu enzym-substrat, katalitycznie czynne reszty w obrebie aktywnego miejsca enzymu dzialajq na czaste- czke substratu tak, aby przeksztalci¢ go poczatkowo w stan przejéciowy (patrz temat C2), a nastepnie w produkt, ktory zostaje uwolniony do roz~ tworu. Potem enzym, juz wolny, moze zwiazaé kolejna czasteczke sub- stratu i rozpoczaé nowy cyk! katalityezny. Zaproponowano dwa modele wyjasniajace, jak enzym moze wiazaé sw6j substrat. W modelu zamka i klucza, zaproponowanym przez Emila Fischera w 1894 roku, ksztalt substratu i aktywnego miejsca enzymu mialyby pasowaé do siebie jak klucz do zamka (rys. 1a). Oba ksztalty sa uwazane za sztywne i utrwalone oraz pasujace do siebie idealnie po odpo- wiednim zestawieniu. W modelu indukowanego dopasowania, zapropo- nowanym w 1958 roku przez Daniela E. Koshlanda, Jr, zwiqzanie sub- stratu indukuje zmiang konformacyjna w aktywnym miejscu enzymu (rys. 1b). Poza tym enzym mode znieksztalcié substrat wymuszajac w nim konformacjg podobna do stanu przejéciowego (patrz temat C2). Na przy- klad, zwiazanie glukozy z heksokinaza indukuje taka konformacyjna zmiane w strukturze enzymu, Ze jego miejsce aktywne przyjmuje ksztalt komplementarny do substratu (glukozy) tylko po jego zwiazaniu z enzy- mem. Roane enzymy wykazuja cechy charakterystyczne dla obu modeli, a wigc pewna komplementamos¢ i pewne zmiany konformacji. G4—G [J+—G enzym — substrat_ —_-kompleks enzym —substrat_—_kompleks enzym-substrat enzyrn-substrat (a) Rys. 1. Wiazanie subsiratu do enzymu. (a) Model kiucza i zamka; (b) modet indukowanego dopasowania Wiasciwosci i ulogenie przestrzenne reszt aminokwaséw tworzacych aktywne miejsce enzymu determinuja rodzaj czasteczki, kt6ra moze zosta¢ zwiazana i staé sie substratem dla tego enzymu. O specyficznosci substratowej czesto decyduja zmiany stosunkowo niewielkiej liczby ami- nokwas6w w miejscu aktywnym. Wida¢ to wyragnie w trzech enzymach trawiennych: trypsynie, chymotrypsynie i elastazie (patrz temat C5). Te trzy enzymy naleza do rodziny enzyméw o nazwie proteazy serynowe — ,serynowe”, poniewaz maja w miejscu aktywnym reszte seryny, ktore} udzial w katalizie jest krytyczny, a _,proteazy”, poniewaz. katalizuja hydrolize wiazari peptydowych w bialku. Te trzy enzymy rozszczepiaja wiazania peptydowe w bialkowych substratach po karboksylowej stronie pewnych reszt aminokwasow. ‘Trypsyna rozszczepia (tnie) po karboksylowej stronie dodatnio nalado- wanych reszt Lys lub Arg, chymotrypsyna — po karboksylowej stronie duzych reszt aminokwaséw aromatycznych i hydrofobowych, a elastaza — po karboksylowej stronie reszt o krétkich, nie naladowanyeh laricu- chach bocznych. Rézna specyficznosé tych enzyméw jest narzucona przezKlasyfikacja enzyméow Oznaczanie enzymow cja C - Enzymy charakter grup aminokwas6w w miejscach wiazania substratu, komple- mentarnych wzgledem substratu, na ktéry dzialajq. Tak wigc trypsyna ma w swym miejscu wigzania substratu ujemnie naladowang reszte Asp, ktéra oddziatuje z dodatnimi ladunkami na bocznych laticuchach Lys i Arg substratu (rys. 2a). Chymotrypsyna ma w miejscu wiazania substratu reszty aminokwas6w o krétkich lartcuchach bocanych, takie jak Gly i Ser, co umozliwia wejscie do tych miejse duzych tafteuch6w bocznych sub- stratu (rys. 2b). Natomiast elastaza ma wzglednie duge, nie naladowane oczne laricuchy aminokwas6w Val i Thr, wystajace do miejsca wiazania substratu, co pozwala na wejscie do tego miejsca wylacznie krotkich laricuch6w bocznych Gly i Ala substratu (rys. 2c) @ ) Oy J Sv mieisce ‘c wigzace subsirat Asp Rys. 2. Schemat miejsc wiazacych subsirat w proteazach serynowych: (a) trypsynie, () chymotrypsynie 1 (c) elastazie Wiele enzyméw ma nazwy utworzone przez dodanie kortcéwki ,-aza" do nazwy substratu. Tak wige ureaza jest enzymem katalizujacym hydrolize mocznika (ang. urea), a fruktozo-1,6-bisfosfataza hydrolizuje frukto- zo-1,6-bisfosforan. Jednakze pewne enzymy, np. trypsyna i chymotryp- syna, maja nazwy nie odnoszace sie do ich substratow (nazwy zwycza- jowe). Sq tes enzymy, ktére maja po kilka réznych nazw. W celu ujedno cenia nazw enzym6w opracowano system nazewnictwa enzyméw, uzgo- dniony migdzynarodowo (Enzyme Commission — EC). System ten dzieli wszystkie enzymy na szesé gtéwnych Klas, opartych na typie prowadz0- ngj reakcji (Hab. 1). Nastepnie kazdy enzym zostaje zidentyfikowany przez czteroliccbowy numer. Tak wigc rypsyna ma numer (EC) 34.214, pray czym pierwsza liczba (3) oznacza, Ze jest ona hydrolaza, druga liczba (4) oznacza, ze jest proteaza, kt6ra hydrolizuje wiqzania peptydowe, trzecia licaba (21) oznacza, de enzym jest proteaza serynowa, majaca w miejscu aktywnym krytycang reszte seryny, a czwarta liczba (4) wskazuje, ze byt to czwarty enzym historycznie przypisany do tej Klasy. Dla porownania: chymotrypsyna ma numer EC 3.4.21.1, a elastaza 3.4.21.36 Hogé obecnego bialka enzymatycznego mozna oznaczyé mierzac uzyska- ny efekt katalityczny, a wigc ilosé substratu przetworzonego w produkt. Aby oznaczyé enzym (mierzyé jego aktywnos<), musimy znaé sumary- cane réwnanie katalizowanej reakcji i dysponowaé procedura analityczna umoéliwiajacq okreslenie albo ubytku substratu, albo pojawiania sig pro- duktu. Poza tym nalezy wziaé pod uwage, czy enzym wymaga jakichs kofaktoréw oraz zna¢ pH i temperature, w ktorych enzym jest optymalnie aktywny (patrz temat C3). Dla enzymow ssak6w optimum takie przypada€1~- Wprowadzenie do enzymow Tabela 1. Miedzynarodowa klasyfikacja enzymow Klasa Nazwa Typ katalizowane} reakji 1 Oksydo- przenoszenie elektranéw A +B+A+B reduktazy 2 Transterazy —_przenoszenie grup funkcyinych AB +C +A+ BC 3 Hydrolazy ——_reakcje hydrolizy AB +H.O > A-H + B-OH 4 Liazy rozszczepianie wiazanC-C,C-O, A-B-+A=B+X-Y C-Niinnych, ezesto tworzenie | | podwojnego wigzania ay 5 Izomerazy —_przenoszenie grup w obrebie A-BOA-B riod ozasteczki Lats 6 Ligazy tworzenie wiazan sprzezone A+B>AB (syntetazy) 2 hydroliza ATP 85 Praykiad dehydrogenaza alkoholowa heksokinaza trypsyna dekarboksylaza pirogronianowa izomeraza maleinianowa karboksylaza pirogronianowa zazwyczaj na 25-37°C. Istotne jest rownied, aby mierzona szybkosé reakeji stanowila miare badanej aktywnosci enzymatycznej i nie byla ograni- czona niedostatecznym doplywem substratu. Dlatego tez zwykle sa konieczne duze stezenia substratu tak, aby poczatkowa szybko$¢ reakeji, ktora wlasnie mierzy sie doswiadczalnie, byta proporcjonalna do stegenia enzymu (patrz temat C3). Zazwyczaj enzym oznacza sie przez pomiat szybkosei pojawiania sig produktu lub szybkoSci zuzywania substratu. Jesli substrat (lub produkt) absorbuje swiatlo o specyficzne} dlugosci fali, to zmiany stezenia tego zwiazku moéna mierzyé Sledzac zmiane absorbancji przy tej dlugosci fali. Dokonuje sig tego zazwyczaj za pomoca spektrofotometru. Poniewad absorbancja jest w okreslonym zakresie proporcjonalna do stezenia, szyb- kosé zmiany absorbangji jest proporcjonalna do aktywnosci enzymu wyrazonej w molach zuzytego substratu (lub wytworzonego produktu) w jednostce czasu Czasteczkami najezesciej uzywanymi do pomiaréw absorbancji w celu oznaczania enzyméw sq dwa koenzymy: zredukowany dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH) oraz zredukowany fosforan dinu- Kleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH) (patrz ponizej), ktore absorbuja w obszarze ultrafioletu (UV) przy 340 nm, Jesli wigc w prze- biegu reakcji zostaje wytworzony NADH lub NADPH, nastapi odpo- wiedni wzrost absorbangji przy 340 nm, a jesli reakcja dotyczy utleniania NADH do NAD* lub NADPH do NADP*, wystapi odpowiedni padek absorbangji, poniewaz te utlenione formy nie absorbuja promieniowania przy 340 nm. Na przyklad pomiaru aktywnosci dehydrogenazy mlecza- nowej z mleczanem jako substratem mozna dokonaé sledzac wzrost absorbangji przy 340 nm, zgodnie z nastepujacym réwnaniem: CH;CH(OH)COO” + NAD* «—s CH,COCOO° + NADH+H! mieczan pirogronianSekeja € - Enzymy Pomiar potaczo- nych reakeji enzymatycznych Koenzymy igrupy prostetyczne Substraty i produkty wielu reakcji nie absorbuja swiatla o dlugosci fali dogodnej do zmierzenia. W tym przypadku czesto pomiar enzymu katali- zujacego te reakcje jest modliwy dzieki zwiazaniu (lub sprzezeniu je)) z druga reakcja enzymatyczna, w kt6rej zachodzi charakterystyezna zmiana absorbangji. Na przyklad dzialanie enzymu oksydazy glukoz0- wej, czesto stosowane do pomiaréw stezenia glukozy we krwi u pacjen- téw cierpiqcych na cukrzyce, nie powoduje Zadnej zmiany absorbangj podczas przemiany substratu w produkt (rys. 3). Jednake wytworzony w tej reakcji nadilenek wodoru mona poddaé dzialaniu kolejnego enzymu, peroksydazy, przemieniajace| rownoczesnie zwiazek bezbarwny w barwny (chromogen), ktérego absorbancj mozna juz latwo mierzyé (rys. 3). JeSli aktywnosé pierwszego enzymu (oksydazy glukozowej) ma byé mierzona dokladnie, to drugi enzym (peroksydaza) oraz jego dalsze sub- straty lub koenzymy musza byé podane w nadmiarze, tak aby ten drugi enzym nie stanowil ograniczajacego etapu w tym zlqczonym pomiarze. Zachowanie tego warunku spowoduje, ze szybkosé powstawania barw- nego chromogenu bedzie proporconalna do szybkosci powstawania H20z, ktéra to szybkos¢ jest z kolei proporcjonalna do aktywnosci oksy- dazy glukozowe). glukoza + 0,+H,0 | oksycaza glukozowa kwas glukonowy +20» zwiazek bezbarwny peroksydaze Uutloniony produkt barwny H:0 Rys. 3. Do pomiary poziomu glukozy w prébce krwi mozna uzye wiazanej reakc}! enzymatyczne}, obejmujace) dzialanie cksydazy glukozowe| | peroksydazy Wiele enzyméw wymaga do swego specyficznego dzialania obecnosei malych jednostek niebialkowych 0 nazwie kofaktory. Kofaktorami moie byé jeden lub wigcej jonéw nieorganicznych, np. Zn? lub Fe’, albo zlogona czasteczka organiczna o nazwie keenzym. Taki metal lub koen- zym, ktéry jest kowalencyjnie zwiazany z enzymem, nazwa sie grupa pro- stetyczna (np. hem w hemoglobinie; patrz. temat B4), Calos¢ katalitycznie aktywnego enzymu wraz zjego koenzymem lub jonem metalu okresla si¢ jako holoenzym. Sama bialkowa czes¢ enzymu bez jego kofaktora jest nazywana apoenzymem. Pewne koenzymy, takie jak NAD", sa wiazane i uwalniane przez enzym w czasie jego cyklu katalitycznego i dlatego dzialaja one wiasciwie jako kosubstraty. Wiele koenzyméw jest pochod nymi prekursoréw — witamin (tab. 2), ktére sa czesto istotnym skladni kiem pogywienia, a ktérych niedostateczny doplyw wywoluje choraby zniedoboru. Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD*) oraz fosforan dint. kleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP*) sq koenzymami ma jacymi wspélng strukture oparia na adeninie, dwéch czasteczkach rybozyC1 - Wprowadzonie do enzymow 87 Tabela 2, Niektore powszechnie wystepujace koenzymy, ich witaminowe prekursory i choroby spowodowane ich niedoborem Koenzym Prekursor Choreby z niedoboru Koenzym A kwas pantotenowy zapalenia skory FAD, FMN ryboflawina (witamina Bz) niedobor werastu NAD-, NADP* nigeyna pelagra Pirofosforan tiaminy tiamina (witamina 8;) beri-beri Tetrahydrofotian kwas foliowy niedokrwistoss Deoksyadenozynokobalamina kobalamina (witamina 8:2) _niedoknwistos¢ ztosliwa Kosubstraty do hydroksylacii proliny kwas askorbinowy szkorbut Ww kolagenie (witamina C) Fostoran pirydoksalu pirydoksyna (witamina Be) _zapalenia skory (cukru) powiazanych grupami fosforanowymi i pierscieniu nikotynoami- dowym (rys. 4). NADP” réénisig od NAD* dodatkowa grupa fosforanowa przylaczona do jednej z czasteczek rybozy (rys. 4). Oba te koenzymy pelnia jedng z podstawowych funkcji, jaka jest przenoszenie elektrondw i udzial w reakcjach oksydoredukcyjnych. NAD* jest czeSciej uaywany w reakcjach katabolieznych (rozktadu), natomiast NADP* jest uzywany w reakcjach anabolicznych (biosyntezy). Reaktywna czgsciq obu czaste- czek jest pieréciefi nikotynoamidowy, ktéry mode wystepowaé w formie albo zredukowanej, albo utlenionej, a w ten spos6b dzialaé w reakcji enzy- matycznej jako akceptor lub donor elektronéw: NAD* + H* + 2e” <—>» NADH CONM, ° - ee +H “0—P—0—cH, cs ae Ht ° OH OH NH psn “OPO GH WN ° INAD* ono nfo NADP A ys. 4. Struktura koenzyméw NAD? | NADP"lzoenzymy Sekcja € ~ Enzymy Dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) oraz mononukleotyd flawi- nowy (FMN) réwniez sq przenosnikami elektronéw i maja podobna strukture chemiczna (rys, 5).Oba te koenzymy zawieraja jednostke mono- nukleotydu flawinowego, ktéra ma miejsce reaktywne. FAD ma dodat- kowa grupe cukrowa i zasade adeninowa, powiekszajace jego strukture. FAD oraz FMN reaguja z dwoma protonami oraz z dwoma elektronami, oscylujac miedzy stanem utlenionym i zredukowanym: FAD +2H*+2e <—» FADH Tzoenzymy (izozymy) sa réénymi formami enzymu, ktére katalizuja te sama reakcje, ale wykazuja odmienne wlasciwosci fizycane lub kinety- cane, takie jak punkt izoelektryczny, optimum pH, powinowactwo do substratu lub wradliwosé na inhibitory. Rézne formy izozymow danego enzymu pochodza zazwyczaj z r6énych genow i czesto wystepuja w 162- nych tkankach ciala Przykladem enzymu, ktory ma r6ine formy izozymowe, jest dehydro- genaza mleczanowa (LDH), katalizujaca odwracalne przeksztalcenie rogronianu w mleczan w obecnogci NADH jako koenzymu (patrz wyz¢). LDH jest tetramerem dwéch réznych typéw podjednostek okreslanych jako H oraz M, ktére wykazuja male réznice w sekwengji aminokwas6w, Podjednostki moga sie laczyé ze soba kombinatorycznie, tworzac pigé izo- enzyméw o skladzie Hy, HyM, H2Mz, HMg i My. Te pigé izoenzyméw moéna rozdzieli¢ elektroforetycznie (patra temat BS). Podjednostka M dominuje w migsniach szkieletowych i watrobie, natomiast podjednostka H dominuje w sercu, Izoenzymy Hy oraz H3M wystepuja gléwnie w sercu i erytrocytach; H2Mp jest obecny gléwnie w mézgu i nerkach; natomiast HM oraz M; wystepuja przede wszystkim w watrobie i miesniach szkie- 4 rm 9 26 + 2H" , Lg SOoK. = Dooce Wowie Ho Swng | I ae eH Lod H—C—H ak NH N a cs ob o-ay0 Sb ° FAD On OH Riys. 8. Siruktura koenzymow FAD i FMNC1 ~ Wprowadzenie do enzymow 89 letowych. Tak wiec wz6r izoenzyméw jest charakterystyczny dla danej tkanki, co ma ogromne znaczenie diagnostyczne w medycynie. Zawal miesnia sercowego, zdltaczka zakaéna i choroby miesni powoduja w uszkodzonej tkance smieré komérek, kt6rych zawartos¢ przedostaje sig do krwi. Poniewaz LDH jest rozpuszczalnym bialkiem cytozolowym, Jatwo zostaje w tych warunkach uwolniona do krwi, ktéra normalnie zawiera mato LDH. Dlatego tez wz6r izozyméw LDH we krwi wskazuje, z kt6rej tkanki izozymy pochodza, i mozna go uzyé do postawienia dia- gnozy, np. zawalu migsnia sercowego, oraz do monitorowania przebiegu leczenia.Sekcja C - Enzymy C2 TERMODYNAMIKA ceeee men [embdypaida | Znslomasétermodynamili, stanowiaos) opis relagji miedzy r6znymi La formami energii i wplywu energii na materig, pozwala rozstrzygnaé, cay dany proces fizyczny jest modliwy. Elementem wiazacym pierwsza i druga zasade termodynamiki jest funkcja termodynamiczna okreslana mianem energii swobodnej (G). Jesli zmiana energii swobodnej (AG) reakcji ma wartosé ujemna, reakcja ta moée zajéé spontanicznie. Jesli AG reakeji ma wartos¢ dodatnia, do je) przebiegu niezbedny jest doplyw energii z zewnatrz. Jednostka energii jest dzul J) lub kaloria (cal). Energia aktywagi | Aby zaszta reakcja biochemiczna, musi zosta¢ pokonana bariera ian przejéciowy | energetyczna zwiazana z przeksztalceniem czasteczki substratu w stan ~ przejsciowy. Stan przejéciowy ma w przebiegu reakcji najwieks2q energie swobodna. Réznica energii swobodnej miedzy substratem a stanem przejéciowym nazywana jest energia aktywacji (AG!), Enzym stabilizuje stan przejéciowy i zmniejsza wartos¢ AG?, zwigkszajac przez to szybkos¢ przebiegu reakgji. Tdalaed banigit) Ré2nica poziom energii migdzy substratem a produktem nazywana odnej pea jest zmiang energii swobodnej (Gibbsa) (AG). Ujemna wartosé AG oe wskazuje, Ze reakcja jest termodynamicznie korzystna we wskazanym kierunku, ale dodatnia wartosé AG wskazuje, ze reakcja jest termodynamicznie niekorzystna i aby zajé¢ we wskazanym kierunku, wymaga nakiadu energii. Reakcja energetycanie niekorzystna jest czesto napedzana przez, powiazanie jej z reakcja energetycznie Korzystna, taka jak hydroliza ATP. [Réwnowaga reakeji| _Reakcja chemiczna czgsto znajduje sie w stanie rownowagi eee dynamiczne. Stala rownowagi (K) okresla stosunek stezen substratu i produktu w momencie rownowagi. Enzymy nie zmieniajq polozenia rownowagi, ale przyspieszaja jej osiagnigcie zwiekszajac szybkosé reakgji w kierunku zaréwno wprost, jak i odwrotnym Tematy pokrewne Wprowadzenie do enzyméw (Cl) _Inhibicja enzyméw (C4) Kinetyka enzyméw (C3) Regulaca aktywnosci enzymatycznej (C5) Termodynamika — Znajomosé termodynamiki pozwala stwierdzié, cay dany proces fizyczny jest modliwy i jest niezbedna do zrozumienia, dlaczego bialka falduja sit osiagajac natywna strukture przestrzenna, dlaczego niektére reakcje katz lizowane przez enzymy wymagaja doplywu energii, w jaki sposéb mies nie wytwarzaja sile mechaniczna itd. Termodynamika (z greckiego: ther |62 = Termadynamika 1 ime, cieplo; dynamis, sita) stanowi opis relaci migdzy réznymi formami energii i wplywu energii na materie na poziomie makroskopowym. Ponie- wai dotyczy to réwnied biochemii, termodynamika jest najczesciej stoso- wana do ustalenia warunkéw, w ktérych obecnosci procesy zachodza spontanicznie (same z siebie). W termodynamice uktad definiowany jest jako materia zawarta w okreslonej przestrzeni. Materia pozostale| czesci wszechswiata nazy- wana jest otoczeniem. Wedlug pierwszej zasady termodynamiki, sta- nowiacej matematyczne wyrazenie prawa zachowania energii, energia calkowita ukladu jego otoczenia jest stala: AE = Ey~Ex=Q-W. gdzie E, to energia ukladu na poczatku procesu, a Ey—na koficu procesu. Qoznacza cieplo pochtoniete przez uklad, a W to praca wykonana przez ten uklad. Zmiana energii ukladu zalezy tylko od stanu wyjgciowego ikoficowego, a nie od drogi przemiany. Procesy, w ktorych wyniku uklad uwalnia cieplo (co oznacza ujemna wartosé Q), nazywane sa procesami egzotermicznymi; te, w ktérych wyniku uklad pochlania cieplo (co ozna- cza dodatnia wartosé Q) nazywane sq procesami endotermicznymi W ukladzie SI jednostka energii jest dzul (J), ale nadal czesto stosuje sig kalorig (1 kcal = 4, 184 kK). Na podstawie pierwszej zasady termodynamiki nie mozna przewi- dzieé, czy dana reakcja przebiegnie spontanicznie, poniewaz niektore reakcje przebiegajace spontanicznie charakteryzuja sie dodatnia wartoscia AE. Dlatego do opisu reakcji nalezy postuzyé sig funkcja inna niz AE.Jednq z takich funkcj jest entropia (), stanowiaca miare stopnia przypadkowo- Sci lub nieuporzadkowania ukladu. Entropia ukladu wzrasta (AE jest dodatnia), kiedy uktad staje sig bardzie nieuporzadkowany. Wedlug dru- gie| zasady termodynamiki proces moze zajé¢ spontanicznie tylko wtedy, gdy suma entropii ukladu i jego otoczenia wzrasta (co mogna réwnied wyrazié stwierdzeniem, ze wszech$wiat zmierza w kierunku maksymal- nego nieuporzadkowania). Tak wiec: (ASurdadu + ASctorzenis) > 0 dla procesu spontanicznego Jednakie trudno jest zastosowaé entropie jako kryterium modliwosci spontanicznego przebiegu procesu biochemicznego, poniewaé zmiany entropii reakcji chemicznych nie sq Jatwo mierzalne. Ponadto obok zmian entropii ukladu konieczna jest znajomosé zmian entropii otoczenia. Trud- nosci te moana pominaé stosujac inna funkcje termodynamicana, nazy- wana energia swobodna (G). Zostala ona zaproponowana przez Josiaha Willarda Gibbsa, kt6ry za jej pomoca powiazal pierwsza i druga zasade termodynamiki: AG = AH~- TAS gdzie AG to zmiana energii swobodnej ukladu podczas przemiany przy stalym cisnieniu (P) i temperaturze (7), AH — zmiana entalpii (zawartosé ciepina) tego ukladu, a AS zmiana entropii tego ukladu. Zmiang entalpii moéna wyrazi¢ za pomoca réwnania: AH = AE + PAV92 Energi aktywagji i stan przejéciowy Sekeja € -Enzymy Zmiana objetosci (AV) jest niewielka prawie dla wszystkich reakgj bioche- micznych i dlatego AH jest prawie rowna AE. Tym sposobem AG = AE - TAS AG reakgji zalezy wige zarowno od zmiany energii wewngtrznej, jak i od zmiany entropii ukladu. Zmiana energii swobodnej (AG) reakgji stanowi bardzo dobre kryterium spontanicznosci jej zajécia: * reakcja moze zajSé spontanicznie tylko wtedy, gdy wartosé AG jest ujemna; * uklad znajduje sie w stanie rownowagi, jesli AG * reakcja nie moze zajs¢ spontanicznie, jesli warto Przebieg takiej reakcji wymaga doptywu energii; # AG reak¢ji nie zalezy od drogi przemiany; * AG nie dostarcza informacji o szybkosci przebiegu reakcji é AG jest dodatnia. Zmiany energii zachodzace w przebiegu reakcji biochemicznej przedsta- wiono na rysunku 1. Dla wszystkich reakgji istnieje bariera energetyczna, ktora nalegy pokona¢, aby umo/liwi¢ przebieg reakcji. Jest to ilogé energii potrzebna do przeprowadzenia czasteczek substratu w stan przejsciowy, ktory jest niestabilna forma chemiczna, prowadzacq od substratéw do produktow. Stan przejéciowy ma najwieksza energie swobodna ze wszys- tkich zwiazkow w drodze reakeji. Energia aktywacji (AG?) réwna jest r62- nicy w energii swobodne} migdzy stanem przejéciowym a substratem (rys. 1). Enzym dziala w drodze stabilizowania stanu przejéciowego re- akcji chemicznej i zmniejsza AG# (rys. 1). Enzym nie zmienia poziomu energii zaréwno substratu, jak i produktu. Tak wige enzym zwigksza szybkos¢ przebiegu reakcji, ale nie wplywa na ogélna zmiane energii w tej reakgji Zmiana energii swobodnej (Gibbsa) decyduje, czy reakcja bedzie energe- tycznie korzystna, czy niekorzystna. Na rysunkw 1 przedstawiono przy- Klad, w ktorym sumaryczna zmiana energii reakgji czyni ja energetycznie korzystna (tzn. produkty maja niészy poziom energii nid substraty, a AG ma wartos¢ ujemna). Nalezy zaznaczyé, Ze AG jest pojeciem innym nia. reakcja nie katalizowana enzymatycznie stan preeisciowy P= produkty S = substraly roakcia katalizowana enzymalycznie energia suobodna przebieg reakcji ys. 1. Zmiany energil zachodzace podezas przebiegu reakcji biochemiczne}€2 - Termodynamike 93 '——— adenozyna 4 ap : $$$ ape — Rys. 2, Struktura adenozynotrifosforanu (ATP), adenazynaoitostoranu (ADP), adenozynomonotostoranu (AMP) i adenozyny AGt. Warto$é AG reakgji jest niezalezna od drogi reakcji i nie dostarcza Zadngj informagji o szybkosci reakcji, poniewaz 0 szybkosci reakcji decy- duje AGt. Ujemna wartos¢é AG wskazuje, ze reakcja jest termodynamicznie korzystna we wskazanym kierunku (fj. ma duza szanse przebiegu sponta- nicznego, bez. doptywu energii), natomiast dodatnia wartosé AG wska- zuje, Ze reakcja jest termodynamicznie niekorzystna i wymaga nakladu energii, aby zajSé we wskazanym kierunku. W ukladach biochemicznych ten naklad energii uzyskuje sig czesto przez sprzezenie reakcji energetycz- nie niekorzystnej zreakcjq energetycznie korzystna (reakcje sprzezone). Czesto jest korzystne odwolywanie sig do wartosci AG aktualne} dla standardowego zestawu warunkéw, jakimi sa jednakowe stezenia (1,0 M) zaréwno substratéw, jak i produkt6w reakeji oraz przebieg reakcji w sta- lym pH 7,0. W tych warunkach wartos¢ stwierdzana dla AG jest nieco odmienna nig w innych warunkach i jest okreslana jako AG”. Przykladem reakcji energetycznie korzystne), 0 dude} ujemnej wartosci AG” i czesto uzywanej do napedzania reakcji energetycznie niekorzystnych jest hydro- liza adenozynotrifosforanu (ATP; rys. 2), tworzqca adenozynodifosforan (ADP) i woiny fosforan nieorganicany (P;): ATP + H20 + ADP + P; AG® = -30,5 kJ mol 7,3 kcal mol"! Réwnowaga Reakcja chemiczna istnieje zazwyczaj w stanie réwnowagi dynamiczne}, reakeji w ktorej mimo ustawicznego przeksztalcania nowych czasteczek sub- stratu i tworzenia nowych czasteczek produktu, proporcja substratu do produktu pozostaje stala Rozwazmy nastepujaca reakcje 1o4 Ae >BSekeja G- Enzymy gdzie szybkoéé reakeji w kierunku wprost (od A do B) wynosi 107 na sekunde (s"!), a szybkoé¢ reakeji w kierunku odwrotnym wynosi 10° s". W réwnowadze stosunek stezeri substratu i produktu stanowi wartosé stala, znana jako stata r6wnowagi (K). Stata r6wnowagi dla danej reakcji definiuje sie jako: [produkty]., _ [Bl., ich ded, [substraty].,,, [A], gdzie prostokatne nawiasy oznaczajq stezenie. Stala r6wnowagi jest okreSlona przez stosunek szybkosci reakcji w kierunku wprost (k;) do szybkosci reakoji w kierunku odwrotnym (kp): 4 K=*. 2107 _ 499 k, 10° Tak wiec dla tej reakcji w stanie rownowagi istnieje 100 razy wigcej pro- duktu B niz substratu A, niezaleznie od tego, czy enzym jest obecny, czy nie. Dzieje sie tak dlatego, ze enzymy nie zmieniaja polozenia rownowagi reakcji, ale przyspieszaja szybkosé reakcji w obu kierunkach w tym samym stopniu. Innymi slowy, enzymy przyspieszaja osiagniecie stanu réwnowagi, ale nie przesuwaja jego potozenia. W przypadku pokazanej tu hipotetycznej reakeji, w nieobecnosci enzymu reakcja moze potrzebo- wat wiecej niz godzine do osiagniecia stanu r6wnowagi, natomiast w obecnoéci enzymu moze osiqgngé stan réwnowagi w czasie krétszym niz 1 sekunda.