Introduccin

En la lucha contra las enfermedades infecciosas, la microbiologa clnica necesita optimizar a nivel de
especificidad, sensibilidad y rapidez, las mejores tcnicas diagnsticas tendientes a ejecutar los
programas ms adecuados en materia de prevencin, control y tratamiento. Entre las alternativas
diagnsticas propuestas a estos retos, se sealan las tcnicas basadas en los principios de la biologa
molecular cuya introduccin en los laboratorios asistenciales (humano y animal), busca brindar apoyo
en la obtencin de resultados altamente confiables, acortando adems, los tiempos de entrega de los
mismos. [1].
Aunque el progreso en las diferentes ramas de la ciencia parece ser lento y su evolucin resulta una
letana de paso a paso, en el caso de la biologa molecular ha sucedido lo contrario. Esta disciplina
ha sido afortunada con grandes cambios en tiempos relativamente cortos. Una poca nutrida de dichos
cambios fue la dcada de 1970, en la que se produjo un gran nmero de descubrimientos, como el de
las enzimas de restriccin, la clonacin de genes en plsmidos y fagos, y las tcnicas de hibridacin
en filtro para ADN y ARN, conocidas como Southern y Northernblot., respectivamente; as como las
invenciones de las tcnicas de secuenciacin qumica y enzimtica para el ADN. Otro salto tecnolgico
ocurri en 1983, cuando Kary Mullis desarroll una nueva tcnica que hizo posible la sntesis de
grandes cantidades de un fragmento de ADN sin tener que clonarlo: la reaccin en cadena de la
polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en ingls) [2].
Esta tcnica es considerada la ms revolucionaria del ltimo cuarto del siglo XX con sta se consigue
copiar millones de veces, en un par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de una mezcla de
ADN tan compleja como el propio genoma humano, donde la secuencia de inters representa tan slo
una diezmillonsima parte [3].
La PCR es un mtodo in vitro de sntesis de ADN con el que un segmento particular de ste es
especficamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean.
Su copiado se logra en forma exponencial a travs de repetidos ciclos de diferentes periodos y
temperaturas de incubacin en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable[4].
La reaccin consta, por lo regular, de una treintena de ciclos repetitivos conformados cada uno de tres
pasos: el primero consiste en la ruptura de los puentes de hidrgeno del ADN para desnaturalizarlo,
para lo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95C, por un minuto. Este paso expone las
bases nitrogenadas del ADN blanco. En el segundo ocurre la hibridacin de las cadenas
desnaturalizadas del ADN blanco con los denominados cebadores o iniciadores (ADN sinttico de
hebra sencilla), a una temperatura que facilita el apareamiento de las bases nitrogenadas
complementarias de ambas clases de ADNs. Esta temperatura depende de la temperatura de fusin
(Tm) de los iniciadores, la cual puede calcularse mediante una frmula (ver ms adelante), pero
generalmente oscila entre 50 y 60C. El tercer paso se efecta a 72C, temperatura a la que la
polimerasa extiende la longitud de los cebadores, aadiendo los diferentes nucletidos libres en el
orden que le va dictando la secuencia de nucletidos de la cadena que acta como molde [5].
El uso de esta tcnica molcula es muy amplia dentro de la microbiologa, la PCR permite identifica
agentes infecciosos independientemente de su respuesta serolgica, lo que representa una gran
ventaja en casos donde los anticuerpos aparecen luego de un largo perodo de infeccin y a veces en
forma impredecible. Tambin en aquellos numerosos casos donde se quiere distinguir si la presencia
de anticuerpos es seal de infeccin antigua o activa, como ocurre ante el hallazgo de anticuerpos
contra el virus de la hepatitis C, y la necesidad de precisar si el virus est presente o no [6]. Tambin

puede servir para medir la expresin de un determinado gen. Para ello se utiliza ARN mensajero como
material de partida para la amplificacin. Al partir de ARNm en vez de ADN genmico, se est
estimando la expresin de un determinado gen que incluso pude llegar a realizarse de una manera
semicuantitativa [7] esta tcnica ha han revelado confiabilidad y certeza ya que su uso como
alternativa de solucin diagnstica ha servido para la identificacin de algunos de los principales
agentes causales que provocan problemas en salud pblica (8).
Del mismo modo ha sido utilizada para generar secuencias de genes a lo largo de la evolucin y
establecer el grado de relacin entre especies y poder construir as rboles filogenticos ya que
permite el estudios de evolucin entre poblaciones humanas, llegando a una conclusin del origen de
nuestra especie, gracias al estudio del ADN mitocondrial [9].
Otra herramienta que ayuda a la identificacin de ADN que se utiliza en la PCR es la electroforesis
tcnica en la cual es posible separar molculas biolgicas en dependencia fundamentalmente de su
carga bajo la influencia de un campo elctrico. Fue empleado por primera vez por Tiselius en el ao
1937. Raymond y Weintraub en 1959 emplearon como soporte para la electroforesis un gel de
poliacrilamida (PAGE), posteriormente el mtodo fue perfeccionado por varios investigadores como
Davis y Ornstein. La popularidad de este creci rpidamente y se logr un aumento de la resolucin. El
dodecil sulfato de sodio (SDS) se introduce en esta tcnica en 1970, y ya en 1972 se emplean agentes
reductores y SDS en la determinacin del peso molecular de protenas en lo que se denomin
electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). En este trabajo se da un bosquejo
general de la electroforesis, si se tiene en cuenta el desarrollo desde su surgimiento hasta el presente.
Se dio una visin general de la electroforesis en geles de poliacrilamida para protenas en condiciones
nativas o desnaturalizadas.[10] Es de destacar que a escala analtica, los mtodos electroforticos son
de alta sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como mtodo de separacin de
mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y otras biomolculas, donde aportan un potente
criterio de pureza. Es til adems para determinar otros parmetros como peso molecular, punto
isoelctrico y nmero de cadenas polipeptdicas de las protenas [11].
Estas tcnicas metodolgicas presentan rapidez, parmetro que demanda su uso en laboratorios
clnicos. Ambas tcnicas requieren estrategias de planificacin, mltiples intentos y optimizacin de
las condiciones de reaccin a fin de prevenir la aparicin de problemas.

Objetivos
Determinacin de la existencia de ADN mediante la tcnica de electroforesis.
Amplificacin de fragmentos de ADN mediante la tcnica de Reaccin en cadena de
Polimerasa.
Identificacin de bacterias mediante la aplicacin de tcnicas moleculares.

Bibliografia
[1]Bolivar, A. M., Rojas, A., & Garcia-Lugo, P. (2014). PCR y PCR-Mltiple: parmetros
crticos y protocolo de estandarizacin (PCR and PCR-Multiplex: critical parameters and
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[2] Rodrguez Snchez, I. P., & Barrera Saldaa, H. A. (2004). La reaccin en cadena de la
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[10] Garca HM.2000. Adaptacin de geles de poliacrilamida a sistema PhastSystem. Tesis de

Maestra. Facultad de Biologa UH
[11]Gaal O, Medgyesi GA, Vereczkey L. Electrophoresis in the separation of biological
macromolecules. Akademiai Kiado Budapest and John Wiley & Sons. 1984