TPHA

REACTIFS BIOLABO
www.biolabo.fr

TEST srodiagnostique de la SYPHILIS

FABRICANT :
BIOLABO SA,

Test dhmagglutination pour la dtermination qualitative et semi-quantitative

des anticorps de Treponema pallidum dans le srum ou le plasma humain.

02160, Maizy, France

REF 4500100 : 100 tests

R1

REF 4500200 : 200 tests

R1 2 x 20 mL R2

20 mL

R2

SUPPORT TECHNIQUE ET COMMANDES

Tel : (33) 03 23 25 15 50

7,5 mL

R3 7,5 mL

2 x 7,5 mL

R4

1,0 mL

R5

1,0 mL

R3 2 x 7,5mL R4 1 x 1,0mL R5 1 x 1,0 mL

Fax : (33) 03 23 256 256

IVD USAGE IN VITRO

INTERET CLINIQUE (1) (2)

REACTIFS ET MATERIEL COMPLEMENTAIRES

La Syphilis est une maladie vnrienne cause par un micro-organisme

spirochaete T. pallidum. Ce micro-organisme ne pouvant tre cultiv sur
milieu artificiel, le diagnostic de la syphilis est bas sur la corrlation des
donnes cliniques et la dtection danticorps spcifiques par des tests
srologiques. Les tests de dpistage de la syphilis utilisant la cardiolipine
associe la lcithine comme antigne sont simples demploi mais des faux
positifs sont frquents en raison de la nature non-trponmique des
antignes.

1. Pipette de prcision adquate pour distribuer 10, 25, 75, 190 BL.
2. Plaque de microtitration fond en U.

Les tests TPI (Treponema pallidum Immobilisation) et FTA-ABS (Fluorescent

Treponema Assay) utilisent le Treponema pallidum pathogne comme
antigne mais prsentent quelques dsavantages pour les tests de routine.
Le test TPI ncessite dutiliser T. pallidum pathogne vivant et le test
FTA-ABS require lutilisation dun microscope fluorescence. De plus, ces
tests ncessitent un niveau lev de comptences.
Le test TPHA est reconnu pour sa commodit dutilisation et sa spcificit
pour le diagnostic des infections trponmiques, sa spcificit est
comparable celle du test TPI et sa sensibilit proche de celle du test
FTA-ABS. Il ne ncessite quun minimum dinstruments de laboratoire et est
trs simple raliser.

PRINCIPE
Le test TPHA est un test dhmagglutination indirect (IHA) pour la
dtermination danticorps de T. pallidum dans le srum/plasma humain. Des
rythrocytes aviaires stabiliss sont sensibiliss par des composants
antigniques de T. pallidum pathogne (souche de Nichol). Ces cellules
test agglutinent en prsence danticorps spcifiques de T. pallidum et
forment une image (voile) caractristique dans les puits dune plaque de
microtitration.
Toute raction non spcifique est dtecte par lutilisation des cellules
Contrle qui sont des rythrocytes aviaires non sensibiliss.
Les anticorps de trponme non pathognes sont adsorbs par un extrait de
trponmes de Reiter, inclus dans la suspension de cellules Test.
Le rsultat du test est obtenu en 45-60 minutes et le voile caractristique de
lagglutination cellulaire est facilement lisible et persistante.

REACTIFS

Flacon R1 Tampon de dilution

Diluant pour la prdilution des spcimens

Flacon R2 Suspension de cellules Test

Erythrocytes aviaires stabiliss sensibiliss avec lantigne de T. pallidum.

Flacon R3 Suspension de cellules Contrle

Erythrocytes aviaires stabiliss.

Flacon R4 Srum de contrle Positif (prdilu au 1/20)

Srum humain contenant des anticorps contre T. pallidum.
Prt lemploi. Le test quantitatif donne un rsultat quivalent un titre de
1/640 1/2560.

Flacon R5 Srum de contrle Ngatif (prdilu au 1/20)

Srum humain exempt danticorps contre T. pallidum.

PREPARATION DES REACTIFS

Les ractifs sont prts lemploi.

Version : FT 4500100 TPHA 29 10 2008

Fabricant

Date de premption

IVD

Usage in vitro

STABILITE ET CONSERVATION
Stocker 2-8C et labri de la lumire
En labsence de contamination, stocks dans le flacon dorigine et utiliss
comme indiqu dans la notice, les ractifs sont stables jusqu la date de
prremption indique sur ltiquette du coffret.
Les flacons contenant les ractifs doivent tre stocks lendroit.
Rejeter tout ractif contamin ou qui ne donne pas des rsultats corrects
avec les srums de contrle.
Ne pas utiliser les ractifs aprs la date de premption.
Les ractifs contenus dans chaque coffret ont t standardiss pour
produire la raction attendue et ne doivent donc pas tre interchangs
avec dautres lots.

PRECAUTIONS
Les ractifs BIOLABO sont destins du personnel qualifi, pour un usage
in vitro.
Utiliser des quipements de protection (blouse, gants, lunettes).
Ne pas pipetter avec la bouche.
Ne pas utiliser de ractifs endommags ou contamins.
En cas de contact avec la peau ou les yeux, rincer abondamment leau
et consulter un mdecin.
Les ractifs contiennent de lazide de sodium (concentration < 0,1%) qui
peut ragir avec les mtaux tel que le cuivre ou le plomb des
canalisations . Rincer abondamment.
Les contrles sont raliss base de srums humains. Chaque srum
humain utilis dans la fabrication des contrles a t analys et a donn
des rsulats ngatifs pour lantigne de surface de lhpatite B (HBsAg),
les anticorps de lhpatite C (anti-HCV) et du VIH 1 et VIH 2. Cependant
comme aucun test ne peut garantir de faon absolue labsence de tout
agent infectieux, traiter ce produit comme potentiellement infectieux.
Pour plus dinformations, la fiche de donnes de scurit peut tre
obtenue sur simple demande.
Elimination des dchets : respecter la lgislation en vigueur. Les
accessoires rutilisables doivent tre striliss par une mthode
approprie aprs utilisation. Les accessoires usage unique doivent tre
considrs comme des dchets potentiellement infectieux et incinrs ou
autoclavs. Des dversements accidentels de matriel potentiellement
infectieux doivent tre absorbs et traits comme ci-dessus. La surface
potentiellement contamine doit tre dsinfecte avec un dsinfectant ou
de lalcool 70%.
Par mesure de scurit, traiter tout spcimen comme potentiellement
infectieux, dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire. Respecter la
lgislation en vigueur.

PRELEVEMENT ET PREPARATION DU SPECIMEN

Srum : Prlever un chantillon de sang de patient et laisser coaguler.
Centrifuger le sang coagul et sparer le srum clair. Travailler
imprativement sur srum frachement prlev.
Plasma : Prlever un chantillon de sang de patient dans un flacon de
collecte de plasma. Centrifuger le spcimen et sparer le plasma clair.
Travailler imprativement sur plasma frachement prlev.
Ne pas utiliser de srum ou plasma hmolys, contamin ou lipmique qui
sont susceptibles dinterfrer avec le test.
Le srum peut tre conserv 2-8C pendant au moins 7 jours.
Pour une dure prolonge, stocker -20C (une fois seulement).
Homogniser les chantillons congels avant utilisation.

Temprature de conservation

REF

Rfrence du produit

Consulter la notice

LOT

Numro de lot

INTERFERENCES

INTERPRETATIONS DES RESULTATS

Les anticorps dvelopps lors dune Syphilis peuvent persister aprs la

gurison. Cest pourquoi un test TPHA positif peut indiquer une infection
prsente ou passe.
De mme que dautres tests de srodiagnostic le test TPHA ne permet pas
de distinguer la syphilis dautres infections trponmiques (ex : pian).
Les signes cliniques doivent tre pris en considration.
Bien que le test TPHA soit trs spcifique, des rsultats faux positifs ont t
constats chez des patients souffrant de lpre, mononuclose infectieuse et
troubles du tissu conjonctif.
Le test FTA-ABS permet la diffrentiation entre les IgG et les IgM plus
prcoces et peut donc tre utilis pour confirmer le test TPHA. Ce test est
aussi trs utile dans le cas de Syphilis trs prcoce o le test
dhmagglutination peut rendre des rsultats ngatifs.

Mthode qualitative :

CONTRLE DE QUALITE
Contrles positif et ngatif inclus dans le coffret.
Programme externe de contrle de la qualit.
Il est recommand de contrler dans les cas suivants :
Au moins un contrle par srie.
Au moins un contrle par 24 heures.
Changement de flacon de ractif.
Si les rsultats du contrle sont incorrects, appliquer les actions suivantes:
1. Rpter le test en utilisant le mme contrle.
2. Si les rsultats sont encore incorrects, utiliser un autre flacon de contrle
et rpter le test.
3. Si les rsultats sont encore incorrects, utiliser un autre flacon de ractif et
rpter le test
4. Si les rsultats sont encore incorrects, contacter le service technique
BIOLABO ou le revendeur local.

PERFORMANCES
Spcificit : deux tudes indpendantes sur 2900 srums de donneurs
appartenant une population faible risque ont montr chacune 100% de
consensus avec des mthodes pr-existantes. Le taux de ractivit initiale
tait de 0,1% et le taux de ractivit rpt tait de 0%.
Une tude indpendante sur srum antnatal montre 100% de spcificit
(avec 95% de confiance, 98,04%-100%).
Sensibilit : Une tude interne ralise sur 110 spcimens dtermins
comme positifs donne 100% de rsultats positifs (avec 95% de confiance,
98,04-100%)

MODE OPERATOIRE (TECHNIQUE MANUELLE)

METHODE QUALITATIVE
Prvoir 3 puits de la plaque de microtitration par chantillon.
1. Ramener chacun des composants temprature ambiante.
2. Ajouter 190 BL de diluant dans le puits 1.
3. Ajouter 10 BL de srum dans le puits 1.
4. A laide dune micropipette, mlanger le contenu du puits 1 et transfrer
25 BL de cette dilution 1/20 dans les puits 2 et 3.
5. Remettre en suspension par retournement les cellules Test et Contrle.
6. Ajouter 75 BL de cellules Contrle dans le puits 2.
7. Ajouter 75 BL de cellules Test dans le puits 3.
8. Homogniser mcaniquement ou manuellement le contenu des puits.
9. Couvrir la plaque et la placer labri de la lumire, de la chaleur et de
toutes sources de vibration.
10. Incuber 45-60 minutes temprature ambiante. Lire les rsultats.
11. Les rsultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et si les
prcautions ci dessus sont respectes.
12. A la fin du test, jeter les plaques usages (voir Prcautions).

RESULTATS

CELLULES TEST

Fortement Positif

Voile de cellules couvrant la

totalit du fonds du puits.
Voile de cellules couvrant
environ 1/3 du fonds du puits.
Voile de cellules avec un trou
central bien visible
Cellules compactes en un
bouton central, habituellement
avec un petit centre clair.
Raction Positive

Lgrement
Positif
Indtermin
Ngatif
Non-spcifique *

CELLULES
CONTROLE
Pas dagglutination,
bouton compact
Pas dagglutination,
bouton compact
Pas dagglutination,
bouton compact
Pas dagglutination,
bouton compact
Raction Positive

Mthode quantitative :

Ngatif

1/80

1/160

1/320

1/640

1/1280

+/-

1/2560

1/5120

Le titre correspond la plus forte dilution conduisant une agglutination.

Tout spcimen donnant une agglutination infrieure +/- est ngatif.
Tout spcimen donnant une agglutination suprieure +/- doit tre
considr provisoirement comme Positif. Le Test doit tre rpt en
duplicate, en ajoutant les cellules Contrle dans la premire srie de puits
et les cellules test dans lautre srie.
Si lagglutination est plus forte dans la srie de cellules test que dans la
srie de cellules Contrle, le spcimen contient des anticorps antitrponmiques et sera soumis dautres tests de confirmation.
Si lagglutination dans la srie de cellules Contrle est suprieure ou gale
celle de la srie de cellules test, la procdure ci-dessous pour absorption
non spcifique doit tre applique.
Procdure en cas dadsorption non spcifique :
1. Transfrer 100 BL de srum tester dans un petit tube puis ajouter 400 BL
de cellules Contrle. Bien mlanger et laisser incuber une heure.
2. Centrifuger 15 minutes 1000 tpm et tester le surnageant avec la
mthode qualitative.
Remarque: Le spcimen est ainsi dilu au 1/5, ceci doit tre pris en
considration pour prparer les dilutions. Si le rsultat est nouveau non
spcifique, rpter le test avec une autre mthode : ex. Ragine ou
FTA-ABS.
Interprtations des rsultats :
Des ractions fortement positives peuvent conduire des pliures en bordure
du voile cellulaire.
Quand le puits Test est positif, il faut galement observer le puits Contrle.
Les cellules Contrle se tassent en un bouton compact. Elles ne doivent en
aucun cas servir de rfrence en tant quimage de non-ractivit car les
cellules Contrle apparaissent sous la forme dun bouton plus compact que
les cellules Test non ractives.
Une agglutination dans le puits de contrle indique la prsence
dagglutinines non-spcifiques dans le spcimen, un tel rsultat doit tre
considr comme NON VALIDE. Un srum donnant ce type de rsutat doit
tre adsorb en utilisant les cellules Contrle comme indiqu dans la
Procdure en cas dadsorption non spcifique . Une raction douteuse
avec les cellules Test est considre comme INDETERMINEE. Ce rsultat
peut correspondre un dbut de Syphilis primaire ou un pian. Ces
spcimens doivent dans un premier temps tre tests nouveau avec la
mthode qualitative puis ultrieurement pour vrifier si le titre augmente ou
non. Il est galement recommand de raliser un test de confirmation
Ragine et/ou un autre test (FTA-ABS) pour complter le tableau
diagnostique.

METHODE SEMI-QUANTITATIVE
Prvoir 8 puits de la plaque de microtitration par chantillon. Les identifier de
A H.
1. Distribuer 25 BL de diluant (flacon R1) du puits B H inclus.
2. Transfrer 25 BL de srum dilu 1/20 du test de dpistage dans les puits
A et B. Bien mlanger le contenu du puits B.
3. Prlever 25 BL de srum dilu du puits B et diluer en aliquots de 25 BL
de manire rpte du puits B H inclus, en rejetant 25 BL de la dilution
du puits H.
4. Sassurer que les cellules test sont bien remises en suspension. Ajouter
75 BL de cellules test du puits A H inclus. Ceci conduit a une dilution
1/80 dans le puits A jusqu 1/10240 dans le puits H.
5. Homogniser mcaniquement ou manuellement le contenu des puits.
6. Couvrir la plaque et la placer labri de la lumire, de la chaleur et de
toutes sources de vibration.
7. Incuber 45-60 minutes temprature ambiante. Lire les rsultats.
8. Les rsultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et si les
prcautions ci dessus sont respectes.
9. A la fin du test, jeter les plaques usages (voir Prcautions).

Version : FT 4500100 TPHA 29 10 2008

REFERENCES
(1) Rathlev T. - Haemagglutination tests utilizing antigens from pathogenic and
apathogenic Treponema pallidum WHO/VDT/RES 1965 ; 77 : 65.
(2) Tomizawa T, Kasamatsu S. - Haemagglutination tests for diagnosis of syphilis. A
preliminary report. Japan. J. Med. Sci. Biol. 19, 305-308, 1966.
(3) Rathlev T. - Haemagglutination test utilizing pathogenic Treponema pallidum for the
serodiagnosis of syphilis. Br J Vener Dis 1967 ; 43 : 181-5
(4) Tomizawa T. Kasamatsu S. Yamaya S. - Usefulness of the haemagglutination test
using Treponema pallidum antigen (TPHA) for the serodiagnosis of syphilis. Jap J Med Sci
Biol 1969 ; 22 : 341-50.
(5) Sequeira P,J,L. Eldridge A,E. - Treponemal Haemagglutination test. Br J Vener Dis
1973 ; 49 : 242-8.
(6) Larsen S.A., Hambie E.A., et coll., Specificity, sensitivity and reproducibility among
the fluorescent treponemal antibody absorption test, the microhemagglutination assay for
Treponema pallidum antibodies, and the hemagglutination treponemal test for syphilis. J.
Clin. Microbiol., 1981 ; 14 : 441 445.
(7) Paris Hamelin, A., Dreux P. et coll. Trponmatoses : aspects cliniques et
biologiques. Feuill. Biol. 1991a ; 23 : 88-89.
(8) Houng H. - Syphilis : new diagnostic directions. Intern. J. STD and AIDS 1992 ; 3 :
391-413.
(9) Sluis J.J. Van Der. - Laboratory Techniques in the diagnosis of syphilis : a review.
Genitourin Med. 1992 ; 68 : 413-9.
(10) Daguet G.L. - Diagnostic Biologique de la Syphilis. Technique et Biologie, 1995 ; 120
:5-30.
(11) North ML et Guntz Ph. Srodiagnostic de la syphilis. La Revue Franaise des
Laboratoires, 1997 ; 294 : 51-58.