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TECNICAS
ANALITICAS
PARA VINOS
Juan Garca Barcel
TECNICAS ANALITICAS PARA VINOS
TECNICAS ANALITICAS
PARA VINOS
Juan Garca Barcel
Presentacin
Todas las obras deben ser fruto de una experiencia, de un conocimiento y de una reflexin. En esta ocasin el lector tiene en sus manos
un libro que rene los tres requisitos apuntados. Adems tiene como
mrito que ha sido elaborado para servir a un profesional que hace de
su quehacer diario un arte: el enlogo.
Con el inters, por consiguiente, que fuera til en la bodega, este libro
posee la ventaja de haber sido escrito por un enlogo que ha prestado
servicio a un buen nmero de bodegas, que ha vivido vendimias y
vinificaciones, y conocido la utilidad del control analtico sobre un
producto en periodo de evolucin.
Publicado por:
GAB
C/ Sant Jordi, 30 - Tel. (+34) 93 817 18 42 - Fax. (+34) 93 817 14 36
08734 MOJA-OLRDOLA (Barcelona}
1 Edicin - Octubre 1990
ISBN 84-404-7827-5
Depsito Legal B-36.850/90
Diseo:
NEXOS I. &S.
Fotocomposicin y montaje:
Peneds Edicions, S.A. - Vilafranca del Peneds
Impreso por:
Romany/Valls, S.A. - Capellades
Una obra como esta, no se escribe sin un buen bagaje de conocimientos. El autor que ha desarrollado sus conocimientos como tcnico
analista durante muchos aos, en una Estacin de Viticultura y
Enologa, concretamente en la de Vilafranca del Peneds, es claro
ejemplo del servicio que estas instituciones, repartidas por todo el
territorio espaol, ofrecen al sector vitivincola.
En las Estaciones Enolgicas la funcin de los tcnicos, como el
autor, no se circunscribe tan solo en realizar su trabajo de analista,
debe tambin ejercer otras funciones: estar debidamente informado de
las novedades analticas, de los problemas que vive el sector y de sus
posibles soluciones, transmitir la informacin a la institucin, colaborar
en los proyectos de investigacin o experimentacin y tambin, en la
medida de lo posible, crear escuela.
La personalidad del autor de este libro, le ha permitido cumplir con

creces muchos de estos encargos tcitos, siendo adems evidente su
inquietud por ampliar conocimientos y transmitirlos, hecho que todos
los que con l nos relacionamos podemos constatar.
se precie de actual, debe recoger la metodologa analtica de la Comunidad Econmica Europea, cuyos mtodos son en su mayor parte
propuestos o aprobados por la Oficina Internacional de la Via y el Vino
(O.I.V.).
Este minucioso trabajo es tambin consecuencia de la reflexin que

conlleva el conocer, profundamente, a quin va dirigido. Es fcil
localizar en la memoria del lector, tres obras de este autor que han
formado parte de la biblioteca de numerosos laboratorios enolgicos.
Debe hacerse mencin tambin que esta obra adquiere un nivel
ptimo, en cuanto a metodologas actuales en anlisis de control
rutinario y de investigacin. Es decir sirve al enlogo en su labor diaria y
permite, a l y a otros estudiosos, penetrar en trabajos de control
mucho ms sofisticados y con tcnicas ms fiables.
Como toda obra de ste carcter es difcil decir que un trabajo ha

salido a la luz totalmente a gusto del autor y actualizado al mximo. Sin
embargo, este libro aporta una de las recopilaciones ms exhaustivas
que sobre anlisis de productos vincolas se han realizado en los
ltimos tiempos. Es a mi modo de entender un buen trabajo, un buen
servicio a la enologa y a la analtica y un magnfico nexo de unin entre
ambas.
Se recogen en esta obra, los mtodos analticos de la mayora de

compuestos que pueden formar parte de una caracterizacin enolgica, tanto aquellos que se encuentran tras un proceso normal de
vinificacin como aquellos que son contaminantes, bien sean accidentales (estireno, residuos antocriptogmicos, etc.) o voluntarios (cido saliclico, edulcorantes sintticos, etc.).
No estn contemplados todos los componentes del vino porque ello
supondra entrar dentro del mbito de la investigacin, utilizando el
anlisis como finalidad ms que como herramienta para el apoyo a la
produccin. Aunque la componente prctica de la obra resalta en
cualquiera de sus pginas, hace despertar en las personas ms
receptivas, la inquietud hacia el mundo de la enologa y les introduce en
la complejidad de los productos vitivincolas, cuyo mximo exponente
es el vino, y siempre en constante evolucin bioqumica.
Con relacin a sus trabajos anteriores el autor en esta obra da entrada a mtodos instrumentales: cromatografa de gases, espectrofotometra de absorcin atmica, espectrofotometra visible y ultravioleta, etc. Es decir, aquellas metodologas que ya comienzan a estar
presentes en laboratorios de grandes empresas y de todos los centros
oficiales. Otras tcnicas, incluida la cromatografa lquida de alta
resolucin, espectrofotometra de infrarrojo, etc. han sido soslayadas
por el autor y lmites de esta obra.
La situacin poltica en la que est inmersa nuestra comunidad vitivincola, hace que las referencias a los mtodos oficiales, deban surgir
de su misma organizacin. Por ello, todo tratado como ste, que
Santiago Mnguez Sanz

Estacin de Viticultura y Enologa
Institut Catal de la Vinya i el Vi
Vilafranca del Peneds, mayo de 1990.
Introduccin
Este libro pretende ser una ayuda al analista de vinos, enlogo y

bodeguero, al presentar una serie de metdicas que han sido escogidas, de las mltiples que existen, pensando en la exactitud y sencillez
de trabajo. Se ha procurado evitar las tcnicas instrumentales ms
complejas, como: Resonancia Magntica Nuclear, Espectrofotometra
en Infrarrojo, Radioqumica y en ella se incluiran las tcnicas con el
carbono radioactivo (C14), etc. A pesar de ello, es de esperar que cumpla
con la idea en la que fue concebido este libro: ser til.
La disposicin de los captulos se ha efectuado por orden alfabtico
de temas globales de anlisis. En cada uno de ellos se describen varias
tcnicas analticas que pueden ser aplicadas segn las disponibilidades de equipo y personal.
En cuanto se refiere a la distribucin de cada anlisis, se ha procurado separar perfectamente el principio del mtodo, los reactivos necesarios, la tcnica operativa y los clculos. En algunas tcnicas, se ha
introducido un apartado de comentarios, para ampliar el tema tratado.
Tambin se resumen algunas notas aclaratorias del autor, en el
apartado de observaciones.
En lo referente a reactivos, los productos que se indican debern ser
de la calidad: reactivo para anlisis. Cuando se hace referencia al agua,
para diluciones u otras aplicaciones, siempre se refiere a: agua
destilada.
Todos los volmenes que deben medirse con exactitud, en el libro

se expresan con dos decimales, por ejemplo: 10.00 mL.
Al final del texto, se recogen una serie de tablas que pueden ser
de gran ayuda para el lector.
He de agradecer, sobremanera, a D. Santiago Minguez Sanz, Doctor Ingeniero Agrnomo, Director de la Estacin de Viticultura y Enologa de Vilafranca del Peneds, el aceptar presentar esta humilde
aportacin, a la ardua labor del analista.
El Autor
INDICE GENERAL
ACIDEZ
ACIDOS
ADITIVOS QUIMICOS
ALCOHOLES
AZUCARES
CARACTERISTICAS CROMATICAS
COMPUESTOS CARBONILICOS
COMPUESTOS FENOLICOS
COMPUESTOS NITROGENADOS
ESTERES
GASES
METALES
OTROS COMPUESTOS
REGLAS ENOQUIMICAS
SOLIDOS SOLUBLES
UNIDADES INTERNACIONALES
PESTICIDAS Y FUNGICIDAS
TABLAS
CAPITULO 1
CAPITULO 2
CAPITULO 3
CAPITULO 4
CAPITULO 5
CAPITULO 6
CAPITULO 7
CAPITULO 8
CAPITULO 9
CAPITULO 10
CAPITULO 11
CAPITULO 12
CAPITULO 13
CAPITULO 14
CAPITULO 15
CAPITULO 16
CAPITULO 17
2. ACIDOS
TARTARICO
METODO C.E.E., referencia
TEST VOLUMETRICO DE COMPARACIN
METODO REBELEIN
METODO REBELEIN modificado
METODO RAPIDO O.I.V
METODO COLORIMETRICO
2.5
2.6
2.7
2.9
2.10
2.12
2.14
CITRICO
METODO UNICO DE LA C.E.E
METODO SCHNEYDER
METODO ENZIMATICO
2.16
2.16
2.21
2.22
MALICO
METODO AMERICAN SOCIETY OF ENOLOGISTS
METODO O.1 V (Af 33)
METODO ENZIMATICO
2.24
2.25
2.26
2.28
LACTICO
METODO AMERICAN SOCIETY OF ENOLOGISTS
METODO ENZIMATICO
2.31
2.31
2.33
ASCORBICO
METODO C.E.E. ascrbico total
METODO C.E.E., rpido
METODO ENZIMATICO
2.35
2.35
2.39
2.40
SUCCINICO
METODO PEYNAUD-LAFON
METODO M. CASTINO
METODO ENZIMATICO
2.43
2.43
2.45
2.48
ACIDO GLUCONICO
METODO PEYNAUD Y CHARPENTIE
METODO ENZIMATICO
2.50
2.50
2.54
VARIOS ACIDOS A LA VEZ

METODO KUNKEE
METODO DE CAPA FINA
2.56
2.56
2.58
2.3
Tartrico
COMENTARIOS
La mayor parte de la cantidad de los cidos contenidos en la uva y en

el vino, corresponde al cido tartrico. Ms de la mitad de la acidez
total, es debida a este cido y a sus sales. Concretamente, a un pH de
2.98, de la totalidad del in tartrato presente, el 50% se halla en forma
de cido libre.
Es el ms fuerte de los cidos existentes en las uvas, y por ello,
tampona el valor de pH del mosto o vino. Esta propiedad, es de gran
importancia para la resistencia a las enfermedades, en el color y, en el
sabor cido del vino.
El contenido de tartratos en la uva o en el mosto, es muy variable y
depende de la variedad, estado de madurez y regin geogrfica o
climatolgica de su cultivo. Los lmites extremos, pueden oscilar entre 2
y 9 gramos por litro, expresados como cido tartrico.
2.5
METODO CEE, referencia

Principio del mtodo
El cido tartrico, es valorado por pesada del racemato clcico precipitado. Esta determinacin, puede completarse por otra volumtrica
de comparacin. Deben existir ciertas condiciones para la precipitacin, como son: pH, volumen total empleado, y concentracin de
iones precipitantes, de tal manera, que la precipitacin del racemato
sea total y, el levotartrato de calcio, permanezca en solucin. Si el vino
ha sido adicionado de cido metatartrico, ser necesaria una hidrlisis
previa.
Reactivos
SOLUCION DE ACETATO CALCICO que contenga 10 gramos
de calcio por litro. Se prepara con 25 gramos de carbonato
clcico, 40 mL de cido actico, reactivo anlisis y suficiente
agua destilada hasta el volumen de un litro.
RACEMATO DE CALCIO CRISTALIZADO. Se colocan en un
vaso de 400 mL, 20 mL de una solucin de cido tartrico
dextro de 5 g/L, 20 mL de una solucin de tartrato amnico levo
a 6.126 g/L y 6 mL de solucin de acetato clcico de 10 g de
calcio por litro. Dejar en reposo, para que precipite, durante
dos horas. Recoger el precipitado en un embudo filtrante de
vidrio poroso nmero 4, lavar por tres veces consecutivas con
30 mL de agua destilada. Secar a la estufa a 70 C, hasta peso
constante. Con las cantidades de reactivo indicadas, se
obtienen aproximadamente 340 mg de racemato clcico
cristalizado. Conservar en frasco tapado.
SOLUCION DE PRECIPITACION (pH.= 4.75). Se prepara con
150 miligramos de tartrato amnico levo, que se disuelven en
900 mL de agua, se aaden 8.8 mL de solucin de acetato de
calcio de 10 g de Ca por litro y completar a un litro con agua.
Dado que el racemato es ligeramente soluble en esta solucin,
se procede a saturarlo de la siguiente forma: aadir 5
miligramos de racemato de calcio al volumen anterior, agitar y
dejar reposar 12 horas y filtrar.
2.6
Tcnica operativa
1. Se colocan en un vaso de vidrio de unos 600 mL, 500 mL
de solucin de precipitacin y 10.00 mL de la muestra del vino
a analizar.
2. Con el extremo de una varilla de vidrio, frtense las paredes
del vaso. Se deja en reposo durante 12 horas.
3. Filtrar sobre filtro de vidrio poroso nmero 4, previamente
tarado y situado en un erlenmeyer Kitasato, para poder filtrar al
vaco, por succin con una trompa de agua. Lavar el vaso con el
mismo lquido filtrado, repetidamente, hasta que todo el
precipitado se haya pasado al filtro.
4. Secar en estufa a 70 C, hasta peso constante.
5. Pesar el precipitado y sea P el peso del racemato de calcio
(CaC4O6H4), cristalizado con 4 molculas de agua.
Clculos
Una molcula de racemato clcico, corresponde a media molcula
de cido tartrico dextro, en el vino.
La cantidad de cido tartrico presente en el vino, viene determinada
por las siguientes frmulas:
384.50 x P se expresa en miliequivalentes del cido tartrico por
litro de vino.
28.84 x P se refiere en gramos de cido tartrico por litro de vino.
36.15 x P expresado en gramos de bitartrato potsico por litro de
vino.
TEST VOLUMETRICO DE COMPARACION

Reactivos
ACIDO CLORHIDRICO DILUIDO 1:5 (v/v), equivalente apro
ximadamente a 82 g/L.
2.7
SOLUCION DE EDTA 0.05M. Se emplea la sal disdica del

cido etilendiamino tetractico o complexon III. Se pesan
18.61 gramos y se disuelven en agua destilada hasta un litro.
METODO REBELEIN
SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO a/ 40% (p/v).
Principio del mtodo
INDICADOR ACIDO CALCONCARBONICO, preparado con 1

gramo de 2-hidroxi-4sulfo-1-naftilazo-3-naftoico y 100 gramos
de sulfato sdico anhidro. Mzclese ntimamente en el
mortero.
Puede utilizarse tanto para mostos, como para vinos. Al vino se aade
directamente: nitrato de plata, vanadato amnico, carbn decolorante y
subsiguiente filtracin. Se eliminan as las sustancias colorantes y el
exceso de vanadato. No se perjudica en absoluto la coloracin rosa,
debida a la reaccin entre el cido tartrico y el vanadato. La reaccin
coloreada se mantiene estable durante algunas horas. La gran ventaja
de este mtodo, aparte la rapidez, es que los azcares, alcohol, cidos
orgnicos e inorgnicos presentes en el vino, no interfieren en la
determinacin. Es muy especfico del cido tartrico. Esta tcnica se
recomienda como mtodo de control, dada su rapidez, exactitud y
facilidad de realizacin.
Tcnica operativa
1. El embudo filtrante del anlisis anterior, despus de haber
tomado nota de su peso, se coloca sobre un erlenmeyer y se
aaden 10 mL de cido clorhdrico diluido, para disolver el
precipitado.
2. Se lava el filtro con 50 mL de agua destilada. Se aaden 5 mL
de solucin de hidrxido sdico al 40% y 30 miligramos del
indicador.
3. Valorar con la solucin de EDTA 0.05 M, hasta viraje del indicador. Sea n el nmero de mililitros gastados.
Reactivos
SOLUCION DE NITRATO DE PLATA 0.1 M, en cido actico al 30%.
SOLUCION DE VANADATO AMONICO al 1 %, preparada con
10 gramos de vanadato amnico, disueltos en 150 mL de
hidrxido sdico 1 M, 200 mL de acetato sdico al 27% y
completar el volumen a un litro, con agua destilada.
Tcnica operativa
Clculos
La cantidad de cido tartrico por litro de vino, se halla
por las siguientes frmulas:
5 x n si se expresa en miliequivalentes por litro.
0.375 x n expresado en gramos de cido tartrico/L.
1. En un erlenmeyer de 200 mL se vierten 10.00 mL del vino a

ensayar o 3.00 mL si es mosto. A continuacin 15.00 mL de
solucin de nitrato de plata 0.1 M y 0.5 g de carbn
decolorante.
2. Agtese unos 15 segundos. A continuacin, sin dejar de agitar, se aaden 15 mL de solucin de vanadato amnico.
3. Filtrar a travs de un filtro de papel, despreciando los 5 mL
primeros, luego se recogen 10 mL y se dejan reposar 30
minutos.
0.470 x n expresado en gramos de bitartrato potsico

por litro de vino.
1. H. Rebeiein, Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm., 2, pginas 33-38, (1973).
2.8
2.9
4. Se prepara el espectrofotmetro, para determinar la densidad

ptica en una cubeta de 10 mm de paso de luz, a la longitud de
onda de 530 nm.
5. Se realiza un ensayo en blanco, con el empleo de agua destilada en vez de vino.
6. Deber confeccionarse una curva patrn, con soluciones de
cido tartrico, reactivo anlisis, de concentraciones
conocidas.
7. Se coloca el lquido a analizar en una cubeta y se mide la
densidad ptica. El valor se compara con la grfica obtenida
con las soluciones patrn.
Clculos
SOLUCION 2. Solucin de metavanadato. Disolver 10 gramos

de metavanadato amnico en 150 mL de hidrxido sdico 1 M.
aadir 200 mL de solucin de acetato sdico al 27% y
completar con agua destilada hasta un litro.
SOLUCION 3. Disolver 4.5 gramos de cloruro amnico en 150
mL de hidrxido sdico M y 200 mL de solucin de acetato
sdico al 27% y agua destilada hasta un litro. Mzclense
volmenes iguales de esta solucin y la de cido actico al
30%. Se corrige el pH al mismo valor que el que tenga una
mezcla de volmenes iguales de cido actico al 30% y
solucin 2, mediante el empleo de una solucin de hidrxido
sdico 1 M.
Tcnica operativa
Slo es necesario comparar las lecturas de la densidad ptica y

pasarlas a la grfica patrn, leyendo la concentracin del cido
tartrico.
1. Se preparan cuatro tubos de ensayo, asignados como A, B, C

y D.
2. A cada uno de los tubos se aaden los volmenes que se
indican en el siguiente cuadro:
METODO REBELEIN modificado

Principio del mtodo
Es un perfeccionamiento del mtodo anterior, para eliminar las interferencias debidas a la presencia de antocianinas en los vinos tintos.
Esencialmente es una correccin del color del vino, con lo que se evita
el empleo del carbn, para eliminar el color.
Reactivos
SOLUCION ACETATO SODlCO al 27%. Se pesan 270 gramos de acetato sdico para anlisis y se disuelve con agua
hasta completar un litro.
SOLUCION 1. Acido actico al 30 por ciento.
2. M. Vidal y J. Blouin, Ref. Fr. Oenol., 70, pginas 39-46, (1978).
2.10
Vino o mosto
Agua
A
1
0
Cantidad en mL
B C
0
1
1
0
D
0
1
Solucin 1
10
10
Solucin 2
Solucin 3
10
0
10
0
0
20
0
20
3. Mzclese bien cada tubo y djese reposar durante 15 minutos.

Se procede a la determinacin de la densidad ptica en el
espectrofotmetro, en la longitud de onda de 530 nm y con
cubetas de 10 mm de paso de luz.
4. Preparacin de las soluciones patrn para el trazado de la
grfica. Se prepara una solucin standard con 10 gramos de
cido tartrico, reactivo anlisis, disueltos en un litro de agua
destilada. En 10 matraces aforados de 100 mL, se vierten en
cada uno de ellos 5.00, 10.00, 20.00, 30.00....90.00 mL de la
solucin standard, completando con agua hasta el enrase. La
solucin de cada matraz tendr una concentracin
2.11
de cido tartrico de: 0.5, 1.0, 2,....9 gramos por litro. La solucin standard sin diluir, corresponde a una concentracin de
tartrico de 10 gramos por litro.
SOLUCION DE LAVADO, preparada en un matraz aforado

de un litro, disolviendo 150 g de cloruro potsico, 200 mide
alcohol etlico y completar a volumen con agua destilada.
5. Se prepara una curva con patrones desde 0 a 5 gramos de

cido tartrico por litro. Las soluciones de los tubos B y D no
son necesarias, si el vino es blanco o, cuando se emplean los
patrones.
AZUL DE BROMOTIMOL, disolviendo 1 g del indicador en

100 mL de alcohol etlico.
HIDROXIDO SODICO 0.1 M.
Clculos
Para el clculo de la absorbancia, hay que anotar la diferencia entre
las absorbancias A y C (o sea A - C), en el caso de vinos blancos. En
vinos tintos, la absorbancia o densidad ptica a considerar ser:
(A-B)-(C-D).
METODO RAPIDO O.I.V.

Principio del mtodo
Tcnica operativa
1. En un tubo de centrfuga, se colocan 10.00 mL de vino, 0.4 mL
de cido actico, 7.5 mL de solucin de precipitacin y 2 mL de
etanol.
2. Con un agitador de vidrio, se agita hasta que aparezca un
enturbiamiento cristalino. Esto requiere aproximadamente
unos 10 minutos.
3. Dejar el tubo en reposo durante una hora, a la temperatura
de 8 C, aproximadamente.
Se puede determinar el cido tartrico, por precipitacin en forma de

tartrato cido de potasio, en condiciones tales, que se reduzca al
mnimo su solubilidad.
4. Despus de transcurrido el tiempo, se agita con un agitador de

vidrio, teniendo cuidado de mezclar el precipitado con el
lquido. Esta agitacin es indispensable para obtener una
precipitacin completa.
Reactivos
5. Dejarlo una hora en el frigorfico.
ACIDO ACETICO CONCENTRADO.

SOLUCION DE PRECIPITACION, obtenida colocando en un
matraz aforado de un litro, 300 g de cloruro potsico puro, 5.75
g de sal de Seignette (tartrato de sodio y potasio) 1.25 g de
oxalato potsico, disolver con agua destilada y completar a
volumen. Si la temperatura es baja, pueden aparecer cristales
en el fondo del envase, que debern redisolverse calentando
ligeramente, antes del uso.
ALCOHOL ETILICO 96%.
3. P. G. Garoglio, Enc. Vitic. Mond., vol. 5, pgina 63, (1973).
2.12
6. A la salida del refrigerador, se centrifuga y se decanta el

lquido que sobrenada, que debe estar perfectamente
lmpido.
7. Lavar el precipitado, dos veces, con aproximadamente 2 mL
de la solucin de lavado.
8. Centrifugar otra vez y despreciar el lquido.
9. Pasar el precipitado, con ayuda de un chorro de agua destilada, a un vaso.
10. El bitartrato potsico se analiza por alcalimetra, con la solucin 0.1 M de hidrxido sdico, en presencia de unas gotas
de indicador de azul de bromotimol (cambio de color de
amarillo a azul).
2.13
Clculos
Si el volumen gastado de hidrxido sdico 0.1 M es n, la cantidad
de cido tartrico se halla por las frmulas:
1.5 x n - 2 en gramos tartrico por litro.
13.33 (1.5 x n - 2) en miliequivalentes por litro.
1.254 (1.5 x n - 2) en bitartrato potsico.
METODO COLORIMETRICO
Principio del mtodo
Es esencialmente un mtodo colorimtrico, fundamentado en el

5
mtodo de Matchett y otros por reaccin del cido tartrico y el
metavanadato. Esta modificacin presenta un mtodo que mejora
su precisin.
Reactivos
RESINA ANIONICA DUOLITE A101D.
3. Preparar el grifo de salida de la columna, de modo que el flujo

de salida del lquido sea de 2.5 a 5 mL por minuto. Lavar la
resina con 30 mL de cido actico al 0.5% y finalmente con 50
mL de agua destilada.
4. Colocar en la cabeza de la columna, 10.00 mL de vino y arrastrar la muestra con 25 mL de cido actico al 0.5%.
5. Lavar con 50 mL de agua destilada.
6. Eluir los cidos adsorbidos con solucin de sulfato sdico 0.5
M.
7. El cido lctico eluye en los primeros 30 mL y el cido tartrico
en la fraccin comprendida entre los 46 y 75 mL.
8. Recoger las muestras en probetas graduadas.
9. Colocar en un matraz aforado de 50 mL, 25.00 mL de la fraccin recogida entre 46 y 75 mL bien mezclada, que contiene el
cido tartrico.
10. Aadir 0.5 mL de cido actico concentrado y 2 mL de la
solucin de metavanadato sdico y completar a volumen con
agua destilada.
ACIDO ACETICO CONCENTRADO.

SOLUCION ACIDO ACETICO a/ 30%.
SOLUCION SULFATO SODICO 0.5 M.
SOLUCION METAVANADATO SODICO al 3 %.
Tcnica operativa
1. Preparar una columna de vidrio Pyrex de 500 mm de longitud y 12 mm de dimetro.
2. Cargar la columna utilizando 20 mL de la resina, mezclada
con 20 veces su volumen de cido actico al 30%.
11. Se mezcla bien y se deja en reposo durante unos 80 minutos a

la temperatura ambiente.
12. Se mide la absorbancia a travs de una cubeta de 10 mm de
paso de luz y en el espectrofotmetro a la longitud de onda de
480 nm.
13. Realcese un ensayo en blanco, con 25.00 mL de solucin de
sulfato sdico 0.5 M, 0.5 mL de cido actico concentrado y 2
mL de solucin de metavanadato, diluido con agua hasta 50
mL.
14. Se prepara una grfica con soluciones patrn de cido tartrico y la absorbancia de la muestra se compara con los
valores de la grfica.
4. G. Hill y A. Caputi Jr., Am. J. Enol. Vitic., 21, pginas 153-161, (1970).
2.14
2.15
Ctrico
plomo IV, formndose en presencia del cido diazosulfanlico, un

compuesto amarillo, que se cuantifica colorimtricamente a 420 nm.
Reactivos
AMONIACO CONCENTRADO (densidad = 0.910).
SOLUCION DE CLORURO BARICO al 20%, preparada por
disolucin de 20 gramos de cloruro de bario, reactivo anlisis, en
agua destilada, enrasando a volumen de 100 mL.
SOLUCION DE LAVADO. Mezclar 140 mL de agua destilada
con 300 mL de alcohol de 96%.
COMENTARIOS
SOLUCION DE SULFATO SODICO al 7.1 %, por disolucin de

71 gramos de sulfato sdico anhidro, reactivo anlisis, en agua
destilada hasta un litro.
CARBON ACTIVO.
La presencia de este cido en las uvas es muy escasa, de un orden

mximo de 0.08%. En los vinos normales, es muy extrao hallar valores
superiores a 0.5 g/L. En general oscilan entre 0.1 a 0.3 gramos por litro.
En algunos pases, est limitada la cantidad de cido ctrico presente
en los vinos. La legislacin espaola y la de la CEE, no permiten
cantidades superiores a un gramo de cido ctrico por litro de vino. El
cido ctrico, es un producto que se aade a los vinos para aumentar la
acidez y para complejar el hierro presente, evitando con ello posibles
enturbiamientos.
METODO UNICO DE LA CEE

Principio del mtodo
El cido ctrico, es precipitado por el in bario, en medio
hidroalcohlico y alcalino. Despus de la decoloracin de la solucin
acuosa del precipitado brico, por el carbn activo, se oxida con el
acetato de
2.16
SOLUCION DE ACETATO SODICO al 27%, obtenida por disolucin de 270 gramos de acetato sdico anhidro, reactivo
anlisis, en agua destilada hasta el volumen de un litro.
SOLUCION DE NITRITO SODICO al 2%, por disolucin de 2
gramos de nitrito sdico cristalizado, reactivo anlisis, en agua
hasta 100 mL (sta solucin se conserva por algn tiempo en
frascos de color topacio).
SOLUCION DE ACIDO SULFANILICO. Disolver 1.5 gramos de
cido sulfanlico, en 50 mL de cido actico concentrado y llevar
a volumen de 250 mL con agua destilada. Agitar frecuentemente
despus de la preparacin, y dejar en reposo durante una noche.
Mantngase en frascos oscuros y en estas condiciones su
conservacin es ilimitada.
SOLUCION SATURADA DE ACETATO DE PLOMO IV. Se colocan en un erlenmeyer de 500 mL unos 50 gramos, aproximadamente, de acetato de plomo IV (plomo tetracetato
humectado en cido actico cristalizable) y se aaden 250 mL de
cido actico tambin cristalizable. Se deja en reposo hasta que
aparezca un lquido claro sobrenadante. Esta solucin
mantenida en frasco oscuro, se conserva indefini2.17
damente. En el anlisis slo se emplea el lquido claro, por ello

se deber aadir, cuando sea necesario, una cantidad de
cido actico, con objeto de mantener la solucin saturada,
disponible para el anlisis.
SOLUCION DE ACETAT DE PLOMO IV al 1 %, preparada
con 5 mL de la solucin anterior, que se colocan en un erlenmeyer de 250 mL, al que se aadirn, con rapidez, 50 mL
de una solucin de ioduro potsico al 10%. Valorar inmediatamente, con una solucin 0.05 M de tiosulfato sdico, en
presencia de engrudo de almidn, como indicador. Sea n el
nmero de mililitros gastados.
Tomar un volumen de la solucin saturada de acetato de
plomo IV, igual a la cifra resultante de la siguiente frmula:
2.25 x 1000/n en mL
y colocarlo en un matraz aforado de 1 litro, completando el
volumen con cido actico puro. Guardada en frascos oscuros, esta solucin se conserva indefinidamente.
Tcnica operativa
1. Introducir en un tubo de centrfuga, de una capacidad de 40 a
50 mL. 5.00 mL del vino o mosto a analizar, 1 mL de amonaco
concentrado y 1 mL de solucin de cloruro brico al 20%.
Mezclar bien, mediante el empleo de una varilla de vidrio.
Despus de aproximadamente dos minutos de agitacin, se
aaden 15 mL de alcohol de 96%, mezclar bien de nuevo con la
varilla y dejar reposar 5 minutos.
2. Centrifugar durante 3 a 4 minutos. Despreciar el lquido sobrenadante y lavar el precipitado de la forma siguiente: tomar 2
mL de solucin de lavado con una pipeta de 2 mL, apoyar la
punta de la misma en la parte superior interior de la pared del
tubo y verter el lquido soplando por la pipeta, imprimiendo al
mismo tiempo un movimiento de rotacin del tubo alrededor de
su eje. Poner en suspensin el precipitado, empleando una
varilla de vidrio con goma en la punta. Lavar la varilla por dos
veces con 2 mL de solucin de lavado cada vez, de forma, que
no quede ninguna partcula del precipitado adherido a la goma
de la varilla. Centrifugar de nuevo.
2.18
3. Tirar el lquido y efectuar un segundo lavado del precipitado

de igual forma.
4. El precipitado, todava hmedo, del lquido de lavado, se recubre con unos 10 mL de la solucin de sulfato sdico al 7.1 %.
Se coloca el tubo en un bao de agua hirviente, durante 10
minutos, agitando con una varilla, de manera que no se
formen grumos en el precipitado.
5. Todava caliente, el contenido del tubo se pasa cuantitativamente a un matraz de 50 mL, con la ayuda de la solucin de
sulfato sdico al 7.1 %. Se deja enfriar y se lleva a volumen
con la misma solucin. Se mezcla bien.
6. Se pasa el lquido a un erlenmeyer de 100 mL, que contiene
0.2 gramos de carbn activo. Agitar. Se deja en reposo durante 5 minutos y se filtra sobre papel tupido.
7. Esta es la solucin que se emplea para el anlisis, que representar el cido ctrico del vino o del mosto, diluida diez
veces.
8. Se emplean dos erlenmeyers de 50 mL, asignados como A y
B, que contienen cada uno, 10 mL de solucin de acetato
sdico al 27%. Aadir a cada uno de ellos, 2.00 mL de la
solucin a analizar.
9. Preparar en un tubo, la solucin de diazoacin, aadiendo,
con agitacin, 5 mL de la solucin de cido sulfanlico y 1 mL de
la solucin de nitrito sdico. Con agitacin, verter en el
erlenmeyer A, 2 mL de esta solucin recin preparada y 5 mL
de cido actico cristalizable. En el erlenmeyer B, se vierten 2
mL de la solucin de diazoacin y 5 mL de solucin de acetato
de plomo IV al 1 % y poner en marcha, inmediatamente, un
reloj avisador para 13 minutos.
10. Aproximadamente a los 5 minutos, filtrar el contenido de los
erlenmeyers, sobre filtro de papel plegado. Poco tiempo antes
de los 13 minutos, verter los lquidos filtrados en las cubetas
espectrofotomtricas de 30 mm de paso de luz y colocarlas en
el espectrofotmetro a la longitud de onda de 420 nm. Cuando
se cumpla el tiempo de 13 minutos, se toma la lectura de la
densidad ptica de la cubeta B, actuando la cubeta A cmo
ensayo en blanco.
2.19
11. Si la solucin a analizar es muy concentrada en cido ctrico y

la absorbancia es elevada, diluirla con solucin de sulfato
sdico al 7.1 %. Las lecturas se contrastan con la curva de
calibrado, que indicar la cantidad de cido ctrico en gramos
por litro de vino.
12. En un matraz de 100 mL, se disuelven 273.4 miligramos de
cido ctrico monohidrato (equivalente a 250 mg de cido
ctrico anhidro) con solucin de sulfato sdico al 7.1 %, llevar a
volumen con la misma solucin. Tomar 10.00 mL de esta
solucin obtenida, pasarla a un matraz de 100 mL y enrasar a
volumen con solucin de sulfato sdico. Con esta solucin
preparar las siguientes diluciones, empleando el sulfato
sdico al 7.1 % cmo disolvente:
5.00 mL se completan a volumen de 200 mL
5.00 mL
id
id
100 mL
5.00 mL
id
id
50 mL
10.00 mL
id
id
50 mL
20.00 mL
id
id
50 mL
Estas diferentes diluciones, corresponden a las soluciones a
analizar, equivalentes a vinos que contengan 0.065, 0.125,
0.250, 0.500 y 1 gramos por litro.
13.Tmense 2.00 mL de cada una de estas diluciones, que se
colocan en los erlenmeyers marcados A y B, procediendo al
anlisis tal como se ha indicado anteriormente. El punto cero
de la curva de tarado, se obtiene colocando en los citados
erlenmeyers, solamente solucin de sulfato sdico. La
representacin grfica de las absorbancias, en funcin de la
concentracin de cido ctrico, no es lneal y presenta una
ligera curvatura.
METODO SCHNEYDER
Principio del mtodo

El vino tratado con una solucin acuosa de bromuro potsico y otra
cida de bromato, forma un precipitado que se elimina por centrifugacin. Al lquido claro, se vuelven a aadir de nuevo, las soluciones anteriores ms una de anhdrido vandico. En caliente, se forma
una opalescencia, que se mide con el espectrofotmetro a 590 nm.
Mediante una grfica de tarado, se halla la concentracin de cido
ctrico.
Reactivos
SOLUCION A. Disolver 10 g de bromuro potsico en agua
destilada, contenida en un matraz aforado de 100 mL y

enrasar.
SOLUCION B. En un matraz de 100 mL, se disuelven 2.5 gra-
mos de bromato potsico, con unos 50 mL de agua destilada,

se aaden 2.5 mL de cido sulfrico concentrado y se
completa, cuando est fro, con agua destilada.
SOLUCION C. Disolver 1 gramo de anhdrido vandico, en 25 mL
de cido sulfrico concentrado. Verter esta solucin, poco a poco

y con agitacin, sobre 75 mL de agua destilada.
Tcnica operativa
1. En un tubo de centrfuga, se vierten 10.00 mL de vino, 2.5
mL de solucin A y 2.5 mL de solucin B.
2. Se tapa el tubo y se agita durante 20 minutos. Durante este
tiempo tiene lugar la reaccin.
3. Se centrifuga a 2000 r.p.m., durante 10 minutos.
4. Se toman 2 mL del lquido claro y se introducen en un tubo de
ensayo, con adicin de 1 mL de la solucin A, 1 mL de la B y 2.5
mL de la solucin C, agitando despus de cada adicin. Se
tapa y se sumerge en un bao de agua a 25 C.
6. J. Schneyder, Mitt. Robe Wein Obstau, Fruechteverwert. (Klosterneuburg), 19, pginas 122123, (1955).
2.20
2.21
5. La opalescencia formada, se mide en el espectrofotmetro a

la longitud de onda de 590 nm, en comparacin con agua
destilada.
6. Se prepara una grfica de tarado, empleando soluciones patrn entre 0.1 a 0.5 gramos de cido ctrico por litro. La densidad ptica medida en el anlisis del vino, se compara con los
valores de la curva patrn.
7. El vino a analizar, no debe contener una cantidad mayor de
0.5 gramos de cido ctrico por litro.
METODO ENZIMATICO
de evitar contaminaciones. El espectrofotmetro con lmpara

de tungsteno, se sita a 340 nm de longitud de onda.
3. Efectuar una dilucin del vino de diez veces, si la concentracin de cido ctrico sobrepasa 0.4 g/L.
4. Seguir paso a paso las indicaciones del folleto adjunto al test
de anlisis.
Clculos
El clculo de la concentracin de cido ctrico, se determina por la
diferencia de las absorbancias ledas, siguiendo las instrucciones
dadas en el folleto.
Puede expresarse el cido ctrico hallado como, anhidro o
monohidrato, para ello las frmulas a aplicar sern:
c = 0.460xAc g/L anhidro
Principio del mtodo

El cido ctrico, o sus sales, se convierten en oxalacetato, reaccin
que es catalizada por la enzima citrato liasa (CL). La cantidad de NADH
oxidada, se corresponde cuantitativamente, con la cantidad de citrato.
Se mide a la longitud de onda de 340 nm.
Reactivos
Test-combinacin de la firma Boehringer Mannheim, nmero
de catlogo 139076, para 30 determinaciones, que contiene lo
siguiente: 2 frascos con reactivos, que debern reconstituirse
con agua destilada. La conservacin de estos reactivos, as
como su reconstitucin, se indica en el folleto que acompaa a
cada test.
Tcnica operativa
1. La determinacin del cido ctrico libre, que es la forma normal
en que se encuentra el cido en el vino, puede realizarse en
vinos blancos o tintos sin dilucin ni decoloracin alguna.
2. Se preparan las cubetas de 10 mm de paso de luz, que se
recomiendan sean de plstico para un solo uso con objeto
2.22
c = 0.503 xAc g/L monohidrato

siendo Ac la diferencia de absorbancias ledas.
Observaciones
a) Para determinar el cido ctrico total, en el que se incluye el cido
salificado, se procede como sigue: En un matraz provisto de refrigerante de reflujo, se colocan 20.00 mL de vino y 6 mL de solucin
alcohlica de hidrxido potsico, aproximadamente 2 M, y se hierve
durante 10 minutos. Se deja enfriar a temperatura ambiente y se
neutraliza con cido sulfrico 2 M. Cuantitativamente se pasa a un
matraz de 50 mL y se enrasa con agua. De este lquido se toman 10.00
mL y se llevan a volumen de 100 mL con agua destilada. Esta dilucin
es la que se emplea en el anlisis. En caso de que sea muy
concentrada, se diluyen 5.00 mL a 100 mL. Los clculos son los
mismos, que en la determinacin del cido ctrico libre.
b) Esta metdica, como todas la enzimticas, son muy especficas y
por ello el gran inters de su aplicacin en la determinacin del cido
ctrico en el vino. La laboriosidad del mtodo qumico, hace
problemtico el resultado, dada la gran cantidad de manipulacin necesaria para llevarlo a cabo.
2.23
Mlico
METODO AMERICAN SOCIETY

8
OF ENOLOGISTS
Principio del mtodo
Se utiliza la enzima L-mlico dehidrogenasa, para catalizar la reaccin entre el cido mlico y la NAD (nicotinamida adenina dinucletido),
formando cido oxalactico y la forma reducida del dinucletido
(NADH). El cido oxalactico se fija por la hidracina, en solucin
alcalina. La reaccin se mide por el cambio en el coeficiente de extincin a 340 nm, debido a la reduccin del NAD a NADH.
Reactivos
COMENTARIOS
Por su concentracin, es el segundo cido de importancia en la uva.

En el fruto verde, su presencia es elevada y disminuye a medida que
avanza la maduracin, principalmente durante los meses de julio y
agosto. En la madurez, la cantidad presente puede ser de un 10 al 35%,
mientras que cuando est verde, alcanza hasta un 65% de la acidez.
7
Peynaud considera que la desaparicin del cido mlico durante la

fermentacin es debida a la separacin de los dos tomos de hidrgeno
y, posterior decarboxilacin del cido oxalactico a etanal, que acta
como acceptor de hidrgeno y se transforma en alcohol.
El cido mlico es de importancia en el vino, ya que es el ms fcilmente atacable por microrganismos, en comparacin con el tartrico
o succnico. En los vinos que han sufrido la fermentacin malolctica,
puede darse el caso de total ausencia de este cido. Puede suceder
tambin que, en vinos obtenidos de cosechas verdes, la concentracin
de cido mlico alcance los 6 gramos por litro.
TAMPON DE pH 9.5. En un matraz aforado de 100 mL, se

colocan 7.5 gramos de glicina, 5.2 gramos de sulfato de hidracina y 0.2 gramos de EDTA, un poco de agua para que
queden en suspensin y luego se aaden 51 mL de hidrxido
sdico 2 M, enrasando al volumen con agua destilada. Esta
solucin es estable durante una semana, si se mantiene a una
temperatura inferior a 4 C.
SOLUCION NAD, disolver 420 miligramos de NAD en 12 mL
de agua destilada. Esta solucin se conserva cuatro semanas
a 5 C.
SOLUCION DEHIDROGENASA MALICA, por disolucin de
10 miligramos en 2 mL de agua. Esta suspensin es estable
durante un ao a 5 C.
Tcnica operativa
1. En un tubo de ensayo pequeo, se colocan 0.9 mL del tampn
de pH 9.5. Se aade 1 mL de agua destilada y 1.00 mL del vino o
mosto a analizar, con un contenido de cido mlico entre 10 y
40 microgramos. Para ello hay que diluir la muestra de 100 a
200 veces.
2. Se aaden a continuacin, 0.1 mL de NAD (35
miligramos/mL) y se mezcla bien.
7. E. Peynaud y A. Mauri, Ann. Inst. natl. recherche agran., serE4, pginas 111-139,
(1956).
2.24
8. B. Gump, S. Saguandeekui y otros, Am. J. Enol. Vitic., 36, 3, pginas 248-251, (1985).
2.25
3. En el espectrofotmetro se colocar una cubeta con paso de

luz de 10 mm con la muestra anterior y se leer la absorbancia
a 340 nm. Este valor de absorbancia se asigna con la letra A1.
4. Se aaden seguidamente 4 microlitros de la solucin de
dehidrogenasa mlica y se mezcla. Se coloca en la estufa a 37
C, durante 30 minutos.
5. Transcurrido el tiempo indicado, se enfra a 25 C durante 6
minutos y se lee la absorbancia de nuevo. Sea A2 el valor
ledo.
6. Se prepara una grfica con soluciones patrn de cido mlico,
a partir de una solucin standard que contenga 40 gramos por
litro.
Reactivos
SOLUCION ACIDO CROMOTROPICO al 5%. Es necesario
prepararla en el momento del uso, disolviendo 500 miligramos de cromotropato sdico, en 10 mL de agua destilada.
ACIDO SULFURICO al 96%. Se parte del cido del 98%, previa valoracin y de ste se prepara exactamente, la solucin
del 96% de cido sulfrico.
SOLUCION DE SULFATO SODICO al 7.1% preparada con
71 gramos de sulfato sdico anhdro y agua destilada hasta
el volumen de un litro.
SULFATO SODICO 0.5 M.
Clculos
ACIDO ACETICO al 30%. ACIDO ACETICO al 0.5%.
La absorbancia causada por el cido mlico, se calcula segn la

frmula siguiente: A2-A1. Este valor se lleva a la grfica y de ella se
deduce la concentracin de cido mlico, que deber ser multiplicada
por el factor de dilucin que haya tenido lugar.
RESINA ANIONICA FUERTE, 11/ MERCK.

Tcnica operativa
1. Colocar la resina en una columna de vidrio. La resina debe
estar en suspensin en cido actico al 30%.
2. Se lava con cido actico al 0.5% varias veces.
METODO O. I. V. (Af 33)

Principio del mtodo
El cido mlico, separado mediante el empleo de una columna cambiadora de aniones, se determina colorimtricamente en el eludo que
tambin contiene cidos tartrico y lctico. Por la accin del cido
sulfrico concentrado y el cido cromotrpico, se forma una coloracin
amarilla. La intensidad de este color depende en gran manera de la
concentracin del cido sulfrico, por ello es necesario regularla con
mucha precisin. El cido lctico y el cido mlico provocan, junto con
el cido tartrico, una reaccin interferente que colorea de azul-violeta
el cido cromotrpico debido al metanal formado. El resultado de la
medida deber corregirse, previa determina cin de las
concentraciones del cido tartrico y lctico.
2.26
3. Despus del lavado, se vierten en la columna 10.00 mL de

vino, se abre el grifo de la columna y se deja fluir el lquido a
una velocidad de 1-1.5 gotas por segundo.
4. Se lava la resina con agua.
5. Con la solucin de sulfato sdico, se eluyen los cidos fijados en la resina.
6. En un tubo con tapn esmerilado, de una cabida aproximada
de 50 a 60 mL, se coloca 1.00 mL del lquido eludo de la
resina.
7. En un tubo igual, se prepara un ensayo en blanco, colocando en l, 1 mL de solucin de sulfato sdico.
8. A cada uno de los tubos se aade 1 mL de cido cromotrpico
y 10 mL de cido sulfrico. Tapar y agitar, de forma que se
obtenga una homogeneidad perfecta, pero sin que el lquido
llegue a mojar el tapn.
2.27
9. Sumergir los tubos en un bao de agua, en enrgica ebullicin, manteniendolos as durante 20 minutos exactos.
10. Enfriar los tubos a 20 C. Despus de 90 minutos exactos,
desde el enfriamiento, medir la densidad ptica con respecto
al ensayo en blanco. La longitud de onda de trabajo del
espectrofotmetro, en 429 nm.
Clculos
Leer en la grfica de tarado, el valor del cido mlico en bruto y
asignado como M. El valor real de cido mlico, se deduce por la
siguiente frmula:
M= (0.15xTL)
1-(0.02xT)
en la que T igual a la concentracin de cido tartrico en la muestra
y L igual al cido lctico de la misma.
Para preparar la grfica patrn, se disolvern 250 miligramos de
cido mlico puro, racmico o levgiro, (los dos dan la misma reaccin), en solucin de sulfato sdico 7.1 %, llevando el volumen a 500
mL. Tomar 5.00, 10.00, 15.00,... 35.00 mL de esta solucin, verterla en
matraces de 50 mL y completar a volumen con la solucin de sulfato
sdico. Las soluciones obtenidas, corresponden a un eluado de vino
que contiene 0.5, 1.0, 1.5,... 3.5 gramos de cido mlico por litro.
La cantidad de NADH formada, es esteoquimtrica con la concentracin de I-malato. La NADH es la que provoca la absorbancia en la
longitud de onda de 340 nm.
Reactivos
de catlogo 139068, para 25 determinaciones. Contiene 4
frascos con reactivos, alguno de los cuales se debe reconstituir con agua destilada. La conservacin de estos reactivos, as como su reconstitucin, se indica en el folleto que
acompaa a cada test analtico.
Tcnica operativa
1. Se preparan las cubetas de 10 mm de paso de luz, recomendndose que sean de plstico de un solo uso, con objeto de
evitar contaminaciones. El espectrofotmetro, con lmpara de
tungsteno, se sita a 340 nm de longitud de onda.
2. Si la concentracin del cido mlico en el vino o mosto, no
sobrepasa los 2 g/L, se diluye de la siguiente forma: 10.00 mL
de vino en un matraz aforado de 100 mL y se completa el
volumen con agua destilada. Si la concentracin del cido en
la muestra es superior a los 2 g/L se efecta una dilucin de
1.00 mL a 100 mL.
3. Como lo importante es la determinacin del cido libre, se
efecta el anlisis sobre la dilucin.
4. Seguir paso a paso, las indicaciones del folleto adjunto al
test analtico.
Clculos
METODO ENZIMATICO
A partir del dato de la absorbancia, se calcula la concentracin del

cido mlico, de acuerdo a la frmula:
c=0.472xAm en g/L
Principio del mtodo

En presencia de I-malato dehidrogenasa, el cido l-mlico o sus
sales, es oxidado por el NAD a oxalacetato. La reaccin, catalizada por
la enzima glutamato-oxalacetato-transminasa (GOT), el oxalacetato se
convierte en I-aspartato, en presencia de I-glutamato.
2.28
deber tenerse en cuenta el factor de dilucin, efectuado al iniciar el

anlisis.
Observaciones
Para determinar el cido mlico total, en el que se incluyen sus
sales, se procede de la siguiente forma: En un matraz provisto de
2.29
refrigerante de reflujo, se colocan 20.00 mL de vino y 6 mL de solucin

acuosa de hidrxido sdico 2 M, se hierve durante 30 minutos. Djese
enfriar a la temperatura ambiente y seguidamente se neutraliza con
cido sulfrico 1 M, empleando papel indicador. Cuantitativamente se
traspasa a un matraz aforado de 50 mL y se completa al volumen con
agua destilada. Esta solucin es la que se emplear para el anlisis,
considerando siempre la dilucin efectuada.
Lctico
COMENTARIOS
No existe este cido en la uva, y es slo un subproducto minoritario
de la fermentacin alcohlica, cuya concentracin puede oscilar entre
0.02 y 0.8 gramos por litro. Cantidades mayores de cido lctico, son
consecuencia de la transformacin del cido mlico por la fermentacin
malolctica o, por una excesiva actividad bacteriana.
En el caso de la accin biolgica anteriormente indicada, en un vino
tinto pueden alcanzarse valores variables entre 3 y 6 gramos de cido
lctico por litro.
METODO AMERICAN SOCIETY

OF ENOLOGISTS9
Principio del mtodo
Es una reaccin colorimtrica, que tiene lugar por oxidacin del
cido lctico a etanal, por la presencia de p-hidroxifenilo. Este mto
9. G.J. Pilone y R.E. Kunkee, Am. J. Enoi. Vitic., 21, pginas 12-18, (1970).
2.30
2.31
do es sensible para concentraciones de cido lctico comprendidas

entre 1 y 10 microgramos por mL (equivalentes a 1 y 10 mg por litro).
La presencia de los cidos tartrico, mlico, ctrico, actico, etanol,
glucosa, fructosa y dixido de azufre, no producen interferencia en el
anlisis.
Reactivos
SOLUCION DE SULFATO DE COBRE al 20%. Preparada por
disolucin en agua, de 20 gramos de sulfato cprico cristalizado con cinco molculas de agua, hasta 100 mL.
HIDROXIDO CALCICO EN POLVO.
SOLUCION DE SULFATO DE COBRE al 4%. En un matraz de
100 mL, se colocan 4 gramos de sulfato cprico pentahidrato.
Se lleva a volumen con agua destilada.
ACIDO SULFRICO CONCENTRADO.
7. Al lquido fro, se aade, 0.1 mL de la solucin de phidroxifenilo

y se agita. Se coloca el tubo en estufa a 30 C durante 15
minutos, despus de este tiempo se agita, y de nuevo se
coloca en la estufa 15 minutos ms.
8. Se retira de la estufa y se sumerge en un bao de agua hirviente, durante 1.5 minutos, para disolver el precipitado. Luego se enfra el tubo al chorro del agua.
9. Cuando fro, se lleva al espectrofotmetro, para leer la densidad ptica a 560 nm en cubeta de 10 mm de paso de luz.
Clculos
Para preparar la curva patrn, se emplearn soluciones de lactato de
litio en agua, con concentraciones equivalentes a 0, 10, 20, 30, 50 y 70
miligramos de cido lctico por litro.
SOLUCION DE p-HIDROXIFENILO al 1.5%, en solucin de

hidrxido sdico al 0.5%.
Tcnica operativa
1. Se diluye el vino con agua, de forma que la concentracin de
cido lctico en la muestra est comprendida entre 10 y 100
microgramos/mL (10 a 100 miligramos por litro).
2. En un tubo de ensayo de 20 x 180 mm, se coloca 1.00 mL de la
muestra diluida, 1 mL de solucin de sulfato de cobre al 20% y
8 mL de agua destilada.
3. Mezclar. Aadir 1 gramo, aproximadamente, de hidrxido
clcico en polvo. Agitar vigorosamente y dejar en reposo durante 30 minutos.
METODO ENZIMATICO
Principio del mtodo
El cido lctico, en presencia de I-lactato-dehidrogenasa (l-LDH), es
oxidado por la nicotinamida-adenina dinucletido (NAD) a piruvatos. La
cantidad de NADH formada, es proporcional a la concentracin de
cido I-lctico. Este aumento de la NADH se determina por su
absorbancia a 340 nm.
4. Despus de transcurrido el tiempo indicado, se centrifuga.

5. En otro tubo de ensayo igual, se coloca 1.00 mL del lquido
claro centrifugado y 0.05 mL de sulfato de cobre al 4%. Con
agitacin del tubo, se aaden 6 mL de cido sulfrico
concentrado.
6. Se coloca el tubo de ensayo en un bao de agua hirviente y se
deja 7 minutos. Se enfra a temperatura inferior a 20 C, en un
bao de hielo y agua.
2.32
Reactivos
de catlogo 139084, para 25 determinaciones. Contiene 4
frascos con reactivos, alguno de los cuales se debe reconstituir con agua destilada. La conservacin de estos reactivos,
as como su reconstitucin, se indica en el folleto que
2.33
Tcnica operativa
1. Se preparan las cubetas de 10 mm de paso de luz, recomendndose que sean de plstico de un slo uso, con objeto de
tungsteno, se situa a 340 nm de longitud de onda.
Ascrbico
2. Si la concentracin de cido lctico en el vino o mosto no

sobrepasa los 2 gramos por litro, se diluye de la siguiente
forma: 10.00 mL de vino en un matraz aforado de 100 mL y se
completa el volumen con agua destilada. Si la concentracin
del cido en la muestra es superior a los 2 g/L, se efecta una
dilucin de 1.00 mL a 100 mL.
3. Se efecta el anlisis de estas diluciones, siguiendo los detalles indicados en el folleto que acompaa los tests
analticos.
Clculos
A partir del dato de la absorbancia, se calcula la concentracin del
cido lctico, de acuerdo a la frmula:
c= 0.320 xA/ en g/L
deber tenerse en cuenta el factor de dilucin, efectuado al iniciar el
anlisis.
Observaciones
Para la determinacin del cido lctico total, incluidas sus sales, se
prepara un matraz con refrigerante de reflujo y se introducen 20.00 mL
del vino y 2 mL de solucin de hidrxido sdico 2 M. Se hierve durante
15 minutos, se deja enfriar a temperatura ambiente y se neutraliza con
cido sulfrico 1 M. Se pasa cuantitativamente a un matraz de 50 mL y
se completa con agua destilada el volumen. Se utiliza esta muestra
para el anlisis, siempre considerando la dilucin efectuada. Vinos con
alto contenido de azcar, se debern hervir con agua en vez de la
solucin de hidrxido sdico, y el tiempo de ebullicin el mismo.
2.34
COMENTARIOS
Como sucede con el cido ctrico, slo se encuentran pequeas
cantidades de cido ascrbico en el mosto (de 1 a 18 mg por 100
gramos de uvas). En los vinos, el nivel normal es de unos 2 miligramos
por litro.
Las cantidades pueden ser muy superiores en muchos vinos, pero
en tal caso, ha sido por adicin como agente antioxidante. Es interesante hacer notar que, cantidades del orden de 25 a 50 mg/L,
mantienen el potencial redox (o valor ITT), durante un perodo de 15 a
20 meses. Este producto no puede sustituir al dixido de azufre, por no
bloquear el etanal, como efecta el sulfuroso.
METODO CEE. Ascrbico total

Principio del mtodo
Anlisis del cido ascrbico total. Este cido, se oxida por el iodo,
a cido dehidroascrbico, que se precipita por la 2,4dinitrofenilhidracna en bis (2,4-dinitrofenilhidrazona). Despus,
separacin por cromatografa en capa fina y solubilizacin en medio
2.35
actico. Este ltimo compuesto se colorea en rojo y se determina

espectrofotomtricamente a 500 nm.
Reactivos
SOLUCION ACIDO METAFOSFORICO al 30% (p/v). Pesar
en un mortero, 30 gramos de cido metafosfrico. Lavar
rpidamente con agua destilada, con agitacin. Tirar el agua
de lavado. Disolver el cido lavado, en agua destilada, con
ayuda de agitacin. Pasar a un matraz de 100 mL y completar
a volumen con agua destilada. Esta solucin es aproximadamente del 30% y su conservacin mxima es de una
semana, mantenida en el refrigerador.
SOLUCION ACIDO METAFOSFORICO al 3%. Esta solucin
se prepara extemporneamente, a partir de la dilucin de la
solucin del 30%.
SOLUCION ACIDO METAFOSFORICO al 1%. Tambin se
prepara en el momento del uso, a partir de la solucin del 30%.
SUSPENSION DE POLIAMIDA. Se pesan 10 gramos de polvo de poliamida para cromatografa. Se mezclan con 60 mL de
agua destilada y se dejan en reposo durante 2 horas. Esta
cantidad es suficiente para 4 determinaciones.
TIOUREA.
SOLUCION 0.05 M DE IODO.
SOLUCION DE 2,4-DINITROFENILHIDRACINA al 6%, en
una mezcla a partes iguales de cido actico y cido sulfrico.
La 2,4-fenilhidracna se pone en suspensin, en 50 mL de
cido actico cristalizable. La solubilizacin se obtiene por
adicin del mismo volumen de cido sulfrico concentrado.
ACETATO DE ETILO adicionado de 2% (v/v) de cido actico cristalizable.
CLOROFORMO.
GEL DE SILICE G, para cromatografa. ALMIDON
SOLUBLE, en solucin al 0.5%.
2.36
DISOLVENTE: Preparado con 50 partes (en volumen) de acetato de etilo, 60 partes de cloroformo, y 5 partes de cido
actico cristalizable. Antes del empleo, hay que dejarlo reposar un mnimo de 12 horas.
ACIDO ASCORBICO.
Tcnica operativa
Oxidacin a cido dehidroascrbico
1. En un matraz de 100 mL, se colocan 50.00 mL de vino al que
se aaden 15 mL de suspensin de poliamida y se enrasa con
la solucin de cido metafosfrico al 3 %. Se deja en reposo
durante 1 hora, agitando frecuentemente.
2. Filtrar sobre papel de filtro plegado. Colocar 20 mL del filtrado
en un tubo de centrfuga, de unos 50 mL de capacidad con
tapn esmerilado. Aadir 1 mL de solucin 0.05 M de iodo. Se
mezcla bien y despus de 1 minuto, se reduce el exceso de
iodo, por adicin de unos 25 mg de tiourea.
Formacin y extraccin de la bis (2,4-dinitrofenilhidrazona) del
cido dicetogulnico
3. Colocar el tubo en un bao de agua a una temperatura comprendida entre 5 y 10 C. Aadir 4 mL de solucin de 2,4dinitrofenilhidracina. Mezclar suavemente, evitando mojar el
tapn. Dejar de inmediato el tubo, bien tapado, en un bao de
agua a 20 C, durante 16 horas (una noche).
4. Introducir 15 mL de acetato de etilo con actico, en el tubo.
Tapar bien y agitar enrgicamente, durante 30 segundos.
Inmediatamente centrifugar 5 minutos a 1000-2000 revoluciones por minuto.
5. Tomar con una pipeta, 10.00 mL del acetato de etilo
centrifugado y colocarlo en un erlenmeyer pequeo, con
tapn esmerilado.
6. Se introducen en el tubo, 5 mL de acetato de etilo con actico,
agitar de nuevo durante 30 segundos y centrifugar otra vez a la
misma velocidad. Se toman 5.00 mL del acetato de etilo de
extraccin y colocarlos en el erlenmeyer en donde se hallan
los 10 mL anteriores. Mezclar bien.
2.37
Separacin de la bis (2,4-dinitrofenilhidrazona) por cromatografa

en capa fina
7. Sobre una placa Merck o equivalente de gel de slice y a 2 cm
del borde, colocar a lo largo de la lnea de partida, 0.2 mL del
acetato de etilo de extraccin.
8. En la cuba de cromatografa, se coloca el disolvente hasta una
altura de 1 cm. Una vez tapada la cubeta, dejar que la
atmsfera interior se sature de los vapores.
9. Se coloca luego la placa cromatogrfica en el interior y, una
vez tapado, se deja ascender el disolvente hasta casi el borde
superior de la placa. Esta separacin cromatogrfica debe
realizarse dentro de las dos horas de efectuada la extraccin.
10. Se seca la placa en medio bien ventilado, durante 1 hora. Se
coloca la placa en posicin vertical, sobre un papel satinado o
parafinado, y con una esptula, se raspa la zona coloreada en
rojo por la bis (2,4- difenilhidrazona), de tal manera, que se
recoja todo el polvo cuantitativamente, por lo tanto debern
evitarse las corrientes de aire.
11. Colquese el polvo recogido, en un pesa muestras de tapn
esmerilado, que contendr 4 mL de cido actico cristalizable.
Dejar en reposo durante 30 minutos, con agitacin frecuente.
12. Se filtra directamente sobre la cubeta espectrofotomtrica de
10 mm de paso de luz, con papel de filtro plegado, repasando
el filtrado, hasta que el lquido est perfectamente lmpido.
13. Medir la absorbancia a 500 nm, empleando cido actico como lquido de referencia.
Clculos
Trazado de la curva de referencia. Preparar una disolucin de cido
I-ascrbico al 1 %, empleando cido metafosfrico al 1 %, cmo
disolvente. De esta solucin, se toman 5.00, 10.00 y 15.00 mL que se
colocarn en sendos matraces de 100 mL, completando el volumen
con cido metafosfrico al 1 %, como diluyente.
Con 50.00 mL de cada una de las soluciones anteriores, que contienen 50, 100 y 150 mg de cido ascrbico por litro, se efectan las
reacciones indicadas anteriormente, para trazar la grfica correspondiente. Esta resulta ser una recta que pasa por el origen.
METODO CEE, rpido

Principio del mtodo
La cantidad de cido ascrbico activo, todava reductor, puede ser
determinada aproximadamente, por iodometra directa sobre el vino,
en el cual, el dixido de azufre ha sido bloqueado mediante la adicin
de etanal o propanal.
Reactivos
SOLUCION DE ETANAL al 6.9%. Obtenida por destilacin de
metaldehdo o paraldehdo, en presencia de cido sulfrico,
valorada por el mtodo del sulfito sdico. Se ajusta esta
solucin al 6.9%, de forma que 1 mL se combine con 10
miligramos de dixido de azufre.
ACIDO SULFURICO 1/10 en volumen (180 g/L).
ENGRUDO DE ALMIDON a 5 g/L, al que se ha aadido 200
gramos de cloruro sdico por litro, para su conservacin. Esta
solucin debe hervirse durante 10 minutos, para su
preparacin.
SOLUCION DE IODO 0.025 M.
Tcnica operativa
1. En un erlenmeyer de 250 mL, se vierten 50.00 mL de vino y 5
mL de la solucin de etanal. Tapar y dejar en reposo 30
minutos, previa agitacin.
2. Aadir 3 mL de cido sulfrico al 1/10, valorando con solucin
de iodo, hasta viraje del engrudo de almidn.
2.38
2.39
3. Sea n el volumen de solucin de iodo gastado en la valoracin.

Clculos
Un mililitro de la solucin de iodo 0.025 M, oxida a 4.4 miligramos de
cido ascrbico. El clculo de la concentracin de cido ascrbico, se
halla por la frmula: 88 x n, expresado en miligramos de cido
ascrbico por litro de muestra.
Observaciones
a) Ciertas sustancias del vino son tambin oxidadas por el iodo en
medio cido, pero el volumen gastado de iodo 0.025 M, para esta
oxidacin es del orden de unos 0.3 mL. Este mtodo permite reconocer
los vinos que han sido adicionados de cido ascrbico en cantidad
superior a los 20 mg/L y que no ha sido transformado en productos de
oxidacin.
b) Para los vinos tintos, es interesante iluminarlos adecuadamente,
para la valoracin, con una luz amarilla, obtenida por interposicin
frente a una lmpara blanca, de una solucin de cromato potsico o
bien una lmpara de vapor de sodio.
c) Es ms fcil preparar la solucin de aldehdo, mediante el empleo
del aldehdo proplico. Para ello, basta pesar exactamente, 10 gramos
de propanal y llevarlo al volumen de un litro, con agua destilada.
de oxgeno. El dehidroascorbato formado no reacciona con MTT/PMS.

La absorbancia leda, es proporcional a la cantidad de ascorbato
presente en la muestra. El parmetro de medicin es el MTT/formazan
formado, que se mide a 578 nm.
Reactivos
409677, para 20 determinaciones. Contiene 3 frascos con
reactivos, que se usarn tal como vienen en el test. La conservacin de estos reactivos es de un ao, si se mantienen
a la temperatura de 4 C.
Tcnica operativa
2. Si la concentracin de cido ascrbico no sobrepasa los 200
mg/L, no es necesario efectuar dilucin alguna, pero s se
seguir lo indicado en 3). Si es mayor, la dilucin deber ser de
10 veces y efectuada en las siguientes condiciones: Tratar
primeramente como en 3) y emplear como diluyente una
solucin de cido m-fosfrico al 1.5% (p/v) ajustada previamente a pH 3.5-4.0 con KOH (5 mol/L).
METODO ENZIMATICO
3. El dixido de azufre presente en el vino deber ser tratado

cmo sigue: Mezclar 10.00 mL de vino con una gota de formol
(aproximadamente 5% p/v), mezclar y dejar reposar 5 minutos
a la temperatura ambiente.
Principio del mtodo
4. Seguir las instrucciones del folleto que se adjunta al test,

para la realizacin del anlisis.
El cido ascrbico y algunas sustancias reductoras, actan sobre la

sal de tetrazolio (MTT) en presencia del reductor PMS a pH 3.5, para
obtener formazan. En el ensayo en blanco, slo la fraccin ascorbato,
como parte de todas las materias reductoras, es eliminado por
oxidacin con la oxidasa del cido ascrbico (AAO), en presencia
Clculos
El contenido de cido ascrbico, se calcular de acuerdo a la siguiente frmula:
c = 0.2814 x Aa en g/L
Si la muestra ha sido diluida durante la preparacin, ser necesario
multiplicar el resultado por el factor de dilucin.
2.40
2.41
Observaciones
Despus de la adicin de la solucin 3, contenida en el test, la reaccin es sensible a la luz, por ello es necesario que las cubetas no estn
expuestas a la luz diurna u otra luz intensa.
Succnico
COMENTARIOS
Este es un cido producto de la fermentacin, por ello aparece exclusivamente en el vino. Como regla general, el contenido normal en
cido succnico, es del orden de 1 % del alcohol presente en el vino. As,
un vino con un contenido alcohlico del 10%, la cantidad aproximada
de cido succnico es de 1 g/L.
Durante la fermentacin, la cantidad formada de este cido, depender del tipo de levadura y clase de mosto. Es un cido muy resistente al ataque bacteriano.
METODO PEYNAUD-LAFON
10
Principio del mtodo

Se procede a la extraccin directa del vino con ter, y luego se
procede a una oxidacin de los cidos extrados. Una vez elimina-
10. E. Peynaud y otros, Trait d Oenologia, vol 1, Analyse et Contrle des Vins, (1977).
2.42
2.43
dos los cidos voltiles, el cido succnico se valora potenciomtricamente. Parte del cido cetoglutrico, tambin viene valorado por
este procedimiento.
Reactivos
ACIDO SULFRICO al tercio en volumen.
9. Alcanzado el valor de pH 4.18, se procede a la valoracin

con hidrxido de bario 0.025 M, hasta llegar al valor de pH
7.50.
Clculos
SOLUCION SATURADA DE PERMANGANATO
La cantidad de cido succnico, se halla por aplicacin de la

siguiente frmula:
VxMx 33.734
V
POTASICO.
en donde:
SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 0,05 M.
SOLUCION DE HIDROXIDO DE BARIO, 0.05 M.
V= volumen gastado de hidrxido de bario 0.025 M.
SOLUCION DE HIDROXIDO DE BARIO saturada.
M= molaridad de la solucin de hidrxido de bario.
SOLUCION SULFITO ACIDO DE SODIO, solucin
v= volumen de la muestra.
saturada. ETER ETILICO.

Tcnica operativa
1. Verter 20.00 mL de vino en un vaso de 100 mL y colocarlo
en un bao de vapor, para reducir el volumen a unos 10 mL.
2. Enfrar y verter el contenido a un extractor lquido-lquido,
lavando el vaso con 1 mL de cido sulfrico al 1/3 y 9 mL de
agua destilada.
3. Aadir 10 mL de agua y extraer con ter, durante 5 horas. Este
tiempo depende de la eficiencia del extractor y deber ser
establecido de antemano.
4. Evaporar el ter.
5. Aadir 1 mL de cido sulfrico al 1/3, 10 mL de solucin de
permanganato y dejar hervir durante 15 minutos.
6. Enfriar la solucin y aadir unas gotas de solucin saturada
de sulfito, para eliminar el exceso de permanganato.
7. Para eliminar los cidos voltiles, se destila con arrastre de
vapor, hasta recoger 300-400 mL de destilado. Ahora la solucin residual, slo contiene cido sulfrico y succnico.
8. Con un medidor de pH se ajusta a pH 4.18, con adicin, en
primer lugar, de solucin saturada de hidrxido de bario y
luego con la solucin de bario 0.05 M.
2.44
11
METODO M. CASTINO
Principio del mtodo
Separacin mediante una resina aninica, oxidacin permangnica

de las sustancias orgnicas extraas, extraccin con ter y determinacin colorimtrica del complejo formado, con el cloruro frrico e
hidroxilamina.
Reactivos
SOLUCION ACUOSA DE CARBONATO AMONICO, al 6%
aproximadamente.
CARBONATO AMONIO 0.15M, preparada por dilucin de la
solucin al 6%, de forma que neutralice exactamente a una
solucin de cido sulfrico 0.15 M.
PERMANGANATO POTASICO, solucin saturada.
11. M. Castino, Vini ltal., 11, pginas 509-521, (1969).
2.45
SOLUCION SULFATO FERROSO al 40 % (p/v).

ETER ETILICO, recientemente destilado sobre hidrxido
sdico.
ETILENGLICOL.
ACIDO SULFRICO DILUIDO 1:1, (v/v) con agua destilada.
SOLUCION CLORHIDRATO HIDROXILAMINA al 10% (p/v).
SOLUCION HIDROXIDO SODICO, 4.5 M.
REACTIVO FERRICO, preparado con 20 gramos de cloruro
frrico cristalizado con 6 molculas de agua, disueltos en
aproximadamente 500 mL de agua destilada. Se aaden 20
mL de cido sulfrico concentrado y se completa a volumen
de un litro con agua.
Aparatos
Extractor lquido-lquido para disolventes ms ligeros que el agua.
Dos columnas de vidrio iguales, unidas entre ellas y colocadas una
sobre la otra, de 65 mm de longitud y 8 mm de dimetro interior cada
una. Una de las columnas se rellena con resina cambiadora catinica
fuerte, en ciclo cido, Dowex 50W-X8 (o equivalente) de 50/100 mallas
y la otra columna con resina aninica fuerte, Dowex 1X8, de 100/200
mallas, en ciclo carbonato.
Tcnica operativa
1. Se diluye la muestra de vino, tomando 2.00 mL y llevando a
volumen de 20 mL con agua destilada. La muestra de vino o
mosto debe estar perfectamente filtrada.
2. Se hace pasar esta dilucin, por la columna catinica, que es
la que est situada en la parte superior, y seguidamente
circula tambin por la resina aninica. En la primera columna
quedan retenidos los aminocidos y los cationes, mientras
que en la segunda quedan fijados los cidos del vino.
3. Se separan las dos columnas, y se eluye el cido succnico de
la columna aninica, con el empleo de 35 mL de carbonato
amnico 0.15 M.
4. El eluado, recogido en un matraz de 100 mL, se lleva a ebullicin durante unos minutos, tiempo necesario para descomponer la mayor parte del carbonato amnico.
2.46
5. Se acidifica con 2 mL de cido sulfrico 5 M y se aade gota a

gota, la solucin de permanganato potsico, hasta un
abundante precipitado, persistente, de meta-hidrxido
mangnico.
6. Se concentra la solucin, por ebullicin, hasta unos 7-8 mL.
Despus de fro se elimina el exceso de permanganato, con
algunas gotas de solucin de sulfato ferroso.
7. Se pasa cuantitativamente la solucin al tubo del extractor,
lavando el matraz con una pequea cantidad de agua
destilada.
8. Se pone en marcha el extractor y al cabo de unas 12 horas,
puede suspenderse la extraccin.
9. El extracto etreo, se pasa en pequeas porciones a un cristalizador de 4 cm de dimetro, colocado sobre una placa ligeramente caliente, para ir eliminando el ter, lavando el baln del extractor, por tres veces, con unos 2 mL de ter cada
vez.
10. Evaporado el disolvente, se coloca el cristalizador en una
estufa regulada de 70 C, durante 30 minutos.
11. El residuo se disuelve con 2 mL de hidrxido sdico 0.25 M
(el succinato sdico es ms soluble que el cido succnico).
12. La solucin as obtenida es la que se emplea para la determinacin colorimtrica. La cantidad de muestra, permite
efectuar el anlisis por duplicado.
13. En un tubo de ensayo, con tapn esmerilado, se introducen
0.5 mL de la solucin, (que contendr de 0.4 a 1.5 gramos de
cido succnico por litro), 1.5 mL de etilenglicol y 0.2 mL de
cido sulfrico 1:1. Se mezcla bien y se sumerge el tubo en un
bao de agua hirviente, durante 20 minutos.
14. Cuando fro, se aade 0.5 mL de la solucin de hidroxilamina y
2 mL de la solucin de NaOH 4.5 M. Se agita durante 1 minuto
y despus se adicionan 10 mL del reactivo frrico y se agita
enrgicamente. Se pone el tubo al chorro de agua fra.
15. Transcurridos 5 minutos, se hace la lectura en el espectrofotmetro a la longitud de onda de 500 nm. Se efecta una
prueba en blanco, con todos los reactivos.
2.47
16. Las cubetas espectrofotomtricas, tendrn un paso de luz de

20 mm. Si la concentracin de cido succnico es baja, podr
hacerse uso de cubetas de 40 a 50 mm de paso de luz.
Clculos
Tcnica operativa
1. Para el anlisis, no es necesaria la dilucin ni la decoloracin de la muestra de vino.
Se prepara una grfica, con el empleo de cido succnico puro, reactivo para anlisis, contrastando las lecturas de absorbancia de las
muestras, con la curva obtenida con soluciones patrn.
2. Se preparan cubetas de plstico de 10 mm de paso de luz. El

espectrofotmetro con lmpara de tungsteno, se sita a 340
nm de longitud de onda.
Observaciones
3. Seguir las instrucciones del anlisis, en el folleto que se

La columna de resina catinica, se regenera con 50 mL de cido

clorhdrico 2 M. La aninica, con 50 mL de solucin de carbonato
amnico al 6%, lavadas despus con agua destilada, hasta neutralidad
del eluyente. Con el uso, la resina aninica cambia de color, debido a
las sustancias polifenlicas del vino, pero ello no modifica de ninguna
forma, su propiedad de trabajo. Se recomienda sustituir las resinas,
despus de unas 30 determinaciones.
Clculos
Para hallar la concentracin del cido succnico en la muestra, de
acuerdo a las instrucciones, deber anotarse la diferencia de absorbancias y aplicarla a la siguiente frmula:
Acido succnico = 0.613 x As en g/L
METODO ENZIMATICO
Principio del mtodo
En presencia de succinil-CoA sintetasa (SCS), inosina-5'-trifosfato
(ITP) y la coenzima A (coA), el cido succnico se convierte a succinilCoA, con formacin simultnea de inosina-5'-difosfato (IDP). Este ltimo se transforma a piruvato y es reducido por la NADH. La cantidad de
NADH oxidada es estequiomtrica con la cantidad de cido succnico.
Reactivos
de catlogo 176281, para 10 determinaciones, que contiene
cuatro frascos con reactivos, algunos de los cuales debern
reconstituirse con agua destilada. La conservacin de estos
reactivos, as como su reconstitucin, se indica en el folleto
que acompaa a cada test.
2.48
2.49
minar polifenoles, gomas y pectinas, tanto de los vinos como en los

mostos. El cido glucnico, se precipita en forma de sal clcica. Hay
que eliminar cualquier traza de azcar, que sera una causa importante
de error y, por ello, se procede a una segunda precipitacin. Este
segundo precipitado, es el que se oxida con el cido peridico,
efectuando luego, el anlisis colorimtrico del metanal.
Acido glucnico
Reactivos
CARBON ACTIVO, de fuerte poder decolorante.
ACIDO CLORHIDRICO.
ALCOHOL ETILICO de 96% y 72%.
FENOLFTALEINA al 1%.
SOLLICION CLORURO CA LCICO al 20%.
SOLUCION ALCALINA, preparada con: 100 mL de amonaco
concentrado, 40 gramos de hidrxido sdico y agua destilada
hasta un litro.
COMENTARIOS
Este cido aparece, principalmente, cuando la uva ha sido atacada
por Botrytis. Esto es debido a la enzima glucosa-oxidasa, que provoca
la oxidacin de la funcin aldehdica de la glucosa, con formacin de
cido glucnico. Esta enzima, tambin puede ser aportada por el
Acetobacter, Penicillium, Aspergillus, Mucor y Fusarium.
Es muy importante disponer de un mtodo analtico, aplicable a los
mostos adems de los vinos, pues de esta forma puede tenerse
conocimiento de si la uva ha sido atacada por la Botrytis. Si ste anlisis
se efecta en los vinos y, el resultado es positivo, indica que ha sido
obtenido de uvas podridas.
METODO PEYNAUD Y CHARPENTIE
12
SOLUCION AZUL DE BROMOTIMOL.

ACIDO SULFRICO CONCENTRADO. ACIDO
SULFRICO al 1/3.
ACIDO PERIODICO N/50.
SOLUCION DIOXIDO DE AZUFRE, a 1 gramo por litro.
REACTIVO CROMOTROPICO, preparado con: 50 gramos de
cido cromotrpico (cido dihidro-1-3-naftalendisulfnico-36) y agua destilada suficiente para un litro. Este reactivo se
conserva unos diez das en lugar oscuro y a una temperatura
de 0 C.
Tcnica operativa
Principio del mtodo

Se basa en la produccin de metanal, por oxidacin peridica del
cido glucnico. Es necesario efectuar una defecacin previa, para eli-
Defecacin de la muestra
1. Se decolora un volumen de vino o mosto, con la cantidad
necesaria de carbn activo de enrgico poder decolorante. De
esta forma se separan las antocianinas, hetersidos, flavonas
y taninos, que por la accin oxidante del cido peri-
12. E. Peynaud y Y. Charpenti, Ann. Falsif. Fraudes., 46, 14, (1953).
2.50
2.51
dico, produciran pequeas cantidades de metanal. El cido

glucnico no es absorbido, aunque se utilice un exceso de
carbn activo.
2. Se toman 5.00 mL del vino decolorado y se colocan en un tubo
de centrfuga de unos 50 mL de cabida. Se acidifica con 2
gotas de cido clorhdrico, para liberar los cidos. Se aaden
25 mL de alcohol de 96%. Se mezcla y se deja en nevera 24
horas. Las gomas y materias pcticas se precipitan durante
este tiempo.
3. Se centrifuga y decanta el lquido a un pequeo erlenmeyer. Al
residuo del tubo se aaden nuevamente 5 mL de alcohol de
96%, se pone en suspensin el residuo y de nuevo se
centrifuga, reuniendo el alcohol que sobrenada con el primer
lquido.
Precipitacin doble del cido glucnico
4. Se aade a la solucin alcohlica anterior, que contiene el
cido glucnico de la muestra, algunas gotas de solucin de
fenolftalena, 1 mL de solucin de cloruro clcico y solucin
alcalina, gota a gota, hasta viraje de la fenolftalena. Se
mezcla bien y se deja en la nevera.
5. El precipitado que se obtiene, se separa por centrifugacin, y
lavado por dos veces con 10 mL de alcohol del 72 %, cada vez.
El residuo centrifugado, se trata con 5 mL de cido clorhdrico
0.5 M, aproximadamente. El precipitado se disuelve completa
y rpidamente.
6. De nuevo se vuelve a precipitar, por adicin de 1 mL de solucin de cloruro clcico. Se aade solucin alcalina, lentamente, hasta cambio de color de la fenolftalena. Se aaden
25 mL de alcohol de 96%. La coloracin rosa desaparece,
pero el pH debe permanecer con el valor de 8.0 (se comprueba el toque con la solucin de bromotimol, que debe
permanecer azul). Se mezcla y se deja en reposo de nuevo en
la nevera, durante 4 horas.
7. El precipitado formado durante el reposo se lava con 10 mL
de alcohol de 72%.
8. Con un chorro de agua destilada se traslada, con la ayuda
de un embudo, a un matraz de 50 mL.
2.52
Oxidacin peridica del cido glucnico

9. Antes de completar el volumen en el matraz anterior, se acidifica con 5 mL de cido sulfrico al 1/3 y se completa el
volumen con agua destilada. Se agita bien.
10. Segn el contenido de cido glucnico en la muestra, la oxidacin se lleva a cabo con 1 2 mL del lquido del matraz, que
representa un volumen de muestra de 0.1 0.2 mL.
11. Se aade 1 mL de cido peridico N/50, en tubos de ensayo
provistos de tapn esmerilado o matraces aforados de 25 mL.
Se deja que la oxidacin acte por unos 20 minutos a la
temperatura ambiente. El rendimiento de metanal es cuantitativo, trabajando en las anteriores condiciones.
Dosado colorimtrico del metanal
12. Al matraz se introduce una solucin sulfurosa de 1 g/L de
dixido de azufre, gota a gota, para reducir el exceso de cido
peridico y los iodatos formados en la reaccin. Se libera el
iodo y el lquido toma un color amarillo. Se van aadiendo las
gotas de solucin sulfurosa, hasta que una ltima gota
decolore definitivamente el lquido. Se debe evitar un exceso
de sulfuroso que modificara posteriormente la coloracin
final.
13. Se aade ahora al tubo o matraz, 5 mL de reactivo cromotrpico y se completa con cido sulfrico concentrado, reactivo para anlisis.
14. Despus de la adicin del reactivo, se calienta en bao mara
hirviente, durante 30 minutos. Se formar una coloracin
violeta, cuya intensidad depender de la cantidad de metanal
en la muestra. Es necesario efectuar cada vez un anlisis en
blanco, con agua destilada en vez de la muestra y un ensayo
con cido sulfrico, sin cido cromotrpico.
15. Transcurrido el tiempo anterior, se enfra y se completa a 25
mL con agua destilada, agitando bien.
16. El lquido se lleva a la cubeta de 10 mm de paso de luz del
espectrofotmetro, midiendo la absorbancia a la longitud de
onda de 540 nm.
2.53
Clculos
Se necesita preparar una curva patrn, empleando soluciones conocidas de cido glucnico puro, con el que se proceder a la oxidacin
peridica directamente. La absorbancia obtenida, con la correccin
debida a los ensayos en blanco, se compara en la grfica y, de ella, se
deduce la cantidad de cido glucnico en la muestra.
METODO ENZIMATICO
3. Con una solucin de hidrxido potsico 2 M, se lleva a pH 1011. Se deja en reposo 10 minutos a la temperatura ambiente.
Se comprueba si el pH es el mismo y en caso contrario, se
corrige. Durante este tiempo, la glucono-5-lactona se
transforma en cido glucnico libre, que se valora.
4. Se ajusta la solucin a pH 7.5-8.0 con cido clorhdrico 1 M y
se diluye con agua hasta el volumen de 100 mL. Con esta
dilucin pueden analizarse muestras con un contenido entre
0.6 y 6.0 gramos de cido glucnico por litro.
5. Seguir las instrucciones que se indican en el folleto adjunto
al test analtico.
Clculos
Principio del mtodo

En presencia de la enzima gluconato kinasa, el cido glucnico y
gluconatos son fosforilados por la adenosina-5'-trifosfato (ATP) a
gluconato-6-fosfatasa. En la reaccin se forma nicotinamida-adenina
dinucletido fosfato, en forma reducida (NADP-H). La cantidad de este
ltimo compuesto es proporcional al gluconato o cido glucnico
presente en la muestra de vino o mosto. Se mide a la longitud de onda
de 340 nm, con cubetas de paso de luz de 10 mm.
La concentracin de cido glucnico se halla por la frmula:

c = 0.9462 x Ag en g/L
Deber considerarse la dilucin que se haya realizado durante la
preparacin de la muestra, para tenerla en cuenta cuando se calcula la
concentracin.
Reactivos
Test-combinacin de la firma Boehringer Mannheim, nmero de
catlogo 428191, para 25 determinaciones. Contiene 3 frascos con
reactivos, uno de los cuales debe reconstituirse con agua destilada. La
conservacin de estos reactivos, as como su reconstitucin, se indica
en el folleto que acompaa a cada test.
Tcnica operativa
2. En un matraz de 100 mL, se colocan 10.00 mL de vino y
unos 25 mL de agua destilada.
2.54
2.55
Varios cidos a la vez
lugar la separacin de los componentes, por reparto entre la humedad y

el disolvente que fluye. Se puede designar como fase estacionaria el
papel de filtro, y fase mvil al disolvente.
En la cromatografa de papel, el movimiento del compuesto objeto de
anlisis viene determinado por la solubilidad relativa entre la fase mvil
y la estacionaria. Si los componentes a analizar son solubles en el
disolvente, emigrarn a la misma velocidad que ste, y si son
totalmente insolubles, permanecern en el lugar donde se coloc la
muestra. En la velocidad de migracin, hay otros factores que influyen
en la misma, principalmente la adsorcin.
COMENTARIOS
La propiedad, por la que tanto la cromatografa en papel como en

capa fina tiene su gran aplicacin, es la siguiente: en un sistema dado,
en igualdad de condiciones, la migracin de un compuesto en relacin
con el frente de avance del disolvente es una propiedad caracterstica y
reproducible. El movimiento de un compuesto es un valor que se
designa como Rf, que corresponde a la relacin entre la distancia
recorrida por el compuesto, y la recorrida por el disolvente.
Reactivos
Una tcnica para separar los cidos no voltiles del vino o mosto es
la cromatografa en papel o capa fina. Esta aplicacin puede hacerse
semicuantitativa, midiendo la intensidad y tamao de la mancha. Con el
uso meticuloso, pueden obtenerse cromatogramas para poder situar
varios cidos conjuntamente.
METODO KUNKEE13
Principio del mtodo
Es una autntica cromatografa de reparto. El papel o capa de gel de
slice es el que sirve de soporte. En el caso del papel, ste est formado
por numerosas fibras de celulosa que contienen un porcentaje de
humedad. Se puede considerar que las partes individuales de cada
fibra, junto con su humedad, son clulas elementales. Tiene
FASE MOVIL.. Se prepara en un embudo de decantacin, de

500 mL de cabida, al cual se aaden: 100 mL de n-butanol,
reactivo anlisis, 100 mL de agua destilada, 10.7 mL de cido
frmico y 15 mL de solucin acuosa al 1 % de verde de
bromocresol. Se agita enrgicamente y se deja en reposo,
hasta que se separen perfectamente las dos fases lquidas, no
miscibles. Se elimina la fase inferior, acuosa, y se utiliza la
capa alcohlica superior, perfectamente lmpida.
Tcnica operativa
1. Se prepara una hoja de papel para cromatografa de 20 x 30
cm, Whatman nmero 1, o bien Schleicher and Schull Nm.
2043-B.
2. A 2.5 cm del borde de mayor longitud, se traza una lnea con
lpiz de grafito, que servir de gua para depositar las
muestras.
3. Con una micropipeta o jeringuilla, se colocan 10 microlitros de
la muestra y sta adicin se repite cinco veces, con la
precaucin de que antes de cada adicin se haya secado per-
13. R.E. Kunkee, Wines Vines, 49, 3 pginas 23-24, (1968).
2.56
2.57
fectamente la anterior. Si se efectan varios anlisis simultneamente, la separacin entre las manchas ser de 3 cm.
4. En la cubeta cromatogrfica, se coloca la solucin de fase
mvil, de forma que haya una altura de lquido entre 12 a 15
mm.
5. Se introduce el papel, en forma de cilindro, se tapa la cubeta y
se deja que el disolvente ascienda por el papel, hasta casi
llegar a unos 2-3 cm del borde superior. Segn la temperatura
ambiente, el tiempo empleado es de unas seis horas.
6. Se retira el papel de la cubeta cromatogrfica y se seca en un
ambiente bien ventilado y ausente de vapores cidos. Se
observarn en el papel diversas manchas amarillas, repartidas diferentemente a lo largo de cada muestra colocada en la
lnea de origen. Pueden identificarse segn el Rf.
Observaciones
a) A continuacin se indican algunos valores de Rf de distintos
cidos:
Acido tartrico
Acido ctrico
Acido mlico
T artrato cido de etilo
Acido lctico
Acido succnico
Malato cido de etilo
Frente del disolvente
0.28
0.45
0.51
0.59
0.78
0.78
0.80
0.87
b) Puede hacerse una comprobacin, empleando soluciones patrn de los cidos que interesen, mediante preparacin de soluciones al 0.3%, a partir de los productos qumicamente puros.
rial plstico, sobre la cual se ha depositado una capa fina de gel

de slice u otro soporte.
Reactivos
FASE MOVIL, se prepara utilizando la mezcla de 400 mL de nbutanol, 200 mL de cido frmico y 500 mL de agua destilada,
se mezcla bien y se deja en reposo el tiempo suficiente para
que se separen perfectamente las dos capas. Se emplea la
capa alcohlica superior, cuando est lmpida.
Tcnica operativa
1. Se coloca sobre la placa, colocada horizontalmente, un microlito de la muestra.
2. Se efecta la separacin, colocndola en una cubeta adecuada para la medida de la placa, en la que se habr colocado
el disolvente en una altura de unos 15 mm.
3. El tiempo de separacin es mucho ms rpido que en el
papel.
4. Se retira la placa y se procede a su secado en un ambiente
exento de vapores cidos.
5. A continuacin se efecta el revelado, pulverizando sobre la
placa una disolucin de acridina al 0.02% en alcohol al 50%
con agua.
6. Las manchas de los distintos cidos se observan con luz ultravioleta de longitud de onda de 254 nm.
Observaciones
a) Los Rf de los distintos cidos se indican a continuacin: Tartrico 0.13, ctrico 0.23, mlico 0.35, lctico 0.76 y succnico 0.86.
METODO DE CAPA FINA

Principio del mtodo
Prcticamente es el mismo que en la metdica anterior, con la excepcin de que el soporte se ha sustituido por una lmina de mate-
2.58
b) Con esta tcnica, se tiene la ventaja de que los dos cidos: lctico
y succnico, que en la metdica anterior eran coincidentes, con la
utilizacin de placa con gel de slice, existe suficiente separacin para
no confundirlos.
c) Puede tambin emplearse la fase mvil del mtodo anterior.
2.59

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TECNICAS

TECNICAS ANALITICAS PARA VINOS

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SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO a/ 40% (p/v).

Principio del mtodo

INDICADOR ACIDO CALCONCARBONICO, preparado con 1

1. En un erlenmeyer de 200 mL se vierten 10.00 mL del vino a

0.470 x n expresado en gramos de bitartrato potsico

4. Se prepara el espectrofotmetro, para determinar la densidad

SOLUCION 2. Solucin de metavanadato. Disolver 10 gramos

Slo es necesario comparar las lecturas de la densidad ptica y

1. Se preparan cuatro tubos de ensayo, asignados como A, B, C

METODO REBELEIN modificado

2. M. Vidal y J. Blouin, Ref. Fr. Oenol., 70, pginas 39-46, (1978).

3. Mzclese bien cada tubo y djese reposar durante 15 minutos.

SOLUCION DE LAVADO, preparada en un matraz aforado

5. Se prepara una curva con patrones desde 0 a 5 gramos de

AZUL DE BROMOTIMOL, disolviendo 1 g del indicador en

METODO RAPIDO O.I.V.

Se puede determinar el cido tartrico, por precipitacin en forma de

4. Despus de transcurrido el tiempo, se agita con un agitador de

5. Dejarlo una hora en el frigorfico.

ACIDO ACETICO CONCENTRADO.

3. P. G. Garoglio, Enc. Vitic. Mond., vol. 5, pgina 63, (1973).

6. A la salida del refrigerador, se centrifuga y se decanta el

Es esencialmente un mtodo colorimtrico, fundamentado en el

3. Preparar el grifo de salida de la columna, de modo que el flujo

ACIDO ACETICO CONCENTRADO.

11. Se mezcla bien y se deja en reposo durante unos 80 minutos a

plomo IV, formndose en presencia del cido diazosulfanlico, un

SOLUCION DE SULFATO SODICO al 7.1 %, por disolucin de

La presencia de este cido en las uvas es muy escasa, de un orden

METODO UNICO DE LA CEE

damente. En el anlisis slo se emplea el lquido claro, por ello

3. Tirar el lquido y efectuar un segundo lavado del precipitado

11. Si la solucin a analizar es muy concentrada en cido ctrico y

Principio del mtodo

destilada, contenida en un matraz aforado de 100 mL y

mos de bromato potsico, con unos 50 mL de agua destilada,

de cido sulfrico concentrado. Verter esta solucin, poco a poco

5. La opalescencia formada, se mide en el espectrofotmetro a

de evitar contaminaciones. El espectrofotmetro con lmpara

Principio del mtodo

c = 0.503 xAc g/L monohidrato

METODO AMERICAN SOCIETY

Por su concentracin, es el segundo cido de importancia en la uva.

Peynaud considera que la desaparicin del cido mlico durante la

TAMPON DE pH 9.5. En un matraz aforado de 100 mL, se

3. En el espectrofotmetro se colocar una cubeta con paso de

ACIDO ACETICO al 30%. ACIDO ACETICO al 0.5%.

La absorbancia causada por el cido mlico, se calcula segn la

RESINA ANIONICA FUERTE, 11/ MERCK.