Monitorizacin de

frmacos

ESTADO DEL ARTE

EN LA
MONITORIZACIN DE FRMACOS

17 de Marzo 2010

EVA MENNDEZ ALONSO

QIR de 2 ao de BIOQUMICA
CLNICA

FASE ANALTICA



MTODOS ANALTICOS
UTILIDAD DE LA DETERMINACIN DE
FRMACO LIBRE

La evolucin de TDM se ha visto facilitada por el

desarrollo de nuevas tcnicas analticas de alta
Sensibilidad y Especificidad

MTODOS INMUNOQUMICOS
MTODOS CROMATOGRFICOS
OTROS MTODOS
MTODOS DE DETERMINACIN DE FRMACO LIBRE

MTODOS
INMUNOQUMICOS

INMUNOENSAYOS

Tcnicas que utilizan la reaccin Ag-Ac para el anlisis

cualitativo/cuantitativo de sustancias en fluidos biolgicos









Ac policlonales / Ac monoclonales
Competitivos / No competitivos
Heterogneos / Homogneos

RIA Radioinmunoanlisis
FPIA Inmunoensayo de polarizacin fluorescente
MEIA Inmunoensayo por micropartcula
ECLIA Inmunoensayo electroquimioluminiscente
CMIA Inmunoensayo magntico quimioluminiscente
EMIT Inmunoanlisis de multiplicacin enzimtica
CEDIA Inmunoanlisis por clonado de dador

RADIOINMUNOANLISIS

Aos 60 RIA: permiti la cuantificacin de frmacos en ng/ml

Inmunoanlisis heterogneo/competitivo

Usa istopos radiactivos como marcaje

Istopos actividad especfica elevada (125I, 14C, 3H)

Inconvenientes

Gran complejidad
Larga duracin
Problema de eliminacin residuos
No se puede aplicar a todos los frmacos
Radioistopos se degradan con el tiempo

FLUOROINMUNOANLISIS

Aos 80 aparecen FPIA

Inmunoensayo homogneo/competitivo
de polarizacin fluorescente

Usa 3 conceptos clave para la medicin



Fluorescencia: Usa como marcador la

fluorescena (absorbe luz 490nm y la libera a
520nm como luz polarizada)
Rotacin de molculas en solucin: distintas
velocidades de rotacin (grandes/lentas)
Luz polarizada: distintas propiedades de
polarizacin entre Ag-F y Ag-F-Ac

ENZIMOINMUNOANLISIS

Aos 90 se introducen plataformas analticas que consolidan los

diferentes tipos de inmunoensayos de 3 generacin

EIA: utiliza las propiedades catalticas del enzima para la cuantificacin

Enzima: alta actividad especfica/no encontrarse en medio reaccin

EMIT, CEDIA
El reactivo se conjuga con un enzima

Peroxidasa

En los
ltimos aos investigando uso -lactamasa

Fosfatasa alcalina
y pirofosfatasa
enzimas con altos nmeros de

Glucosa-6-P-deshidrogenasa
recambio
y buena estabilidad trmica

-galactosidasa
Medicin depende de inhibicin, activacin o
cambio conformacional que sufra el enzima

EMIT

Homogneo/Competitivo
Fundamento: la sustancia marcada se une al Ac especfico
produciendo inhibicin del enzima por impedimentos
estricos
El enzima libre reacciona con un sustrato generando un
producto coloreado
Sensibilidad determinada por:



Cambios en la actividad enzima

Sustancias que interfieran en la
actividad enzimtica
Constante de afinidad del Ac en la reaccin

CEDIA

EIA por clonado del dador: usa los principios de la tecnologa

recombinante
Fundamento: fraccionamiento mediante tcnicas de ADN
recombinante, de la -galactosidasa
La sustancia a determinar se liga al dador evitando su unin al
fragmento aceptor e inactivando el enzima
Medicin: tasa de hidrlisis

EIA homogneo mas sensibles (10-11mol/L)





Semiautomticos/automticos
Bajos tiempos de procesamiento y preparacin de la muestra
Reactividad cruzada

EIA

DESVENTAJAS


Medicin de la actividad
enzimtica en algunos casos
compleja
La actividad enzimtica puede
verse afectada
Algunos ensayos
homogneos baja
Sensibilidad
Baja Especificidad, posible
reactividad cruzada con
metabolitos o pro-frmacos
(SOBREESTIMACIN)

Farm. Hosp. Vol 30.N3 pp 142-148-2006

VENTAJAS





Alta sensibilidad
Mltiples ensayos
Fcilmente automatizables
Ampliamente utilizados
en laboratorios de rutina
para monitorizacin de
frmacos

INMUNOENSAYO POR
MICROPARTCULAS
 Tcnicas no competitivas tipo sndwich
 Micropartculas de fase slida con Ac
 El marcaje, etapa de separacin y tecnologa de medicin difieren

CMIA






Micropartcula magntica
Imn
Compuesto quimioluminiscente
Detector de quimioluminiscencia
Reaccin quimioluminiscente ofrece
alta sensibilidad y facilidad para la
medicin.

MEIA





Micropartculas de ltex
Matriz de fibra de vidrio
Enzima
Detector de fluorescencia

Electroquimioluminiscencia
ECLIA

Proceso en el que se generan especies reactivas en la superficie de

un electrodo a partir de precursores estables (Ru), volviendo luego
al estado basal mediante una reaccin quimioluminiscente.



Sndwich/competitiva
El complejo tipo sndwich se fija a una fase slida (micropartculas de
poliestireno)

Se aplica una corriente elctrica y se produce la reaccin

quimioluminiscente.
Rpido y sencillo


Corto tiempo de anlisis


Alta capacidad de amplificacin de la seal
a partir de una molcula marcada.


Bajos lmites deteccin y amplios
intervalos de medicin

MTODOS
CROMATOGRFICOS

Tcnicas de separacin basada en las distintas velocidades de

desplazamiento de los analitos, al ser arrastradas por una fase mvil a
travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria

La separacin se logra porque la movilidad de cada analito depende de un

equilibrio en la distribucin entre ambas fases en base a:




Cargas
Tamao molecular
Polaridad.

Gran variedad de tcnicas

El proceso cromatogrfico, se basa en una compleja

unin de fenmenos tales como hidrodinmica,
cinticos, termodinmicos, qumica de superficie
y difusin

Varios sistemas de deteccin




UV
ESPECTROMETRA DE MASAS

CROMATOGRAMA: recoge la respuesta del detector en funcin del tiempo

que tardan los distintos compuestos en salir de la columna
Amuestra= rea del analito en el cromatograma de la muestra
Astandard= rea del analito en el cromatograma de la calibracin
ISmuestra= rea del standard en el cromatograma de la muestra
ISStandard= rea del standard en el cromatograma de la calibracin
CStandard = Concentracin que tiene el analito en la calibracin

Concentracin del analito g/ml = (Amuestra x ISStandard ) / (Astandard x

ISmuestra ) x CStandard

Tiempo de retencin (cualitativo)

rea de pico (cuantitativo)

CROMATOGRAFA
GASEOSA

Separacin de compuestos voltiles que fluyen en una corriente gaseosa

a travs de una fase estacionaria fijada a una columna
Frmacos: mayor aplicacin la cromatografa lquido-gas (CGL).


Las columnas empacadas son bastante verstiles y permiten el anlisis de un

amplio nmero de frmacos en fluidos biolgicos.
Las capilares otorgan mucho mayor eficiencia, sensibilidad y resolucin

Los detectores usados son verstiles y de alta sensibilidad: detector de

ionizacin de llama (FID), detector de captura electrnica (ECD) y detector
de espectrometra de masa (MSD).


La optimizacin de la separacin se realiza
variando la naturaleza de fase mvil y
la temperatura de trabajo (isotrmica o programada).

Permite separacin del frmaco de sus metabolitos y posibles

interferentes
Se plante la posibilidad de su implantacin sistemtica

Principales ventajas de la CG:

o
o

El potencial de separacin es enorme gracias a las columnas capilares

La espectrometra de masa, como detector, le otorga la mxima
especificidad y gran sensibilidad
Cuenta con una escala unificada de tiempos de retencin

La necesidad de:

Grandes volmenes de muestra

Derivatizacin qumica para garantizar la volatilidad del analito
Pretratamiento antes de aplicar la tcnica cromatogrfica.

Supuso un freno en su implantacin

en laboratorio clnico

HPLC

Los componentes de la muestra son llevados a

travs de la f. estacionaria mediante el flujo de
una f. mvil a alta presin
Para el anlisis de los frmacos la tcnica ms
empleada es la Fase Reversa
Los eluyentes ms usados, son mezclas de
agua o tampones con metanol, acetonitrilo o
tetrahidrofurano.
Los detectores ms empleados: VIS-UV,
fluorimtrico, electroqumico y MS
Es posible trabajar de forma isocrtica (una fase
mvil) o en gradiente (se vara polaridad, fuerza
inica o pH).

Caractersticas:

Selectividad

Reproducibilidad

Sensibilidad

Rapidez
Parmetros:

Naturaleza de la f.
estacionaria

Tamao de partcula

Eluyente (composicin y flujo)

Detector
Tipos :

Fase Directa

Fase Reversa

Tcnica verstil con mnima preparacin y bajos

volmenes de muestra

Eficiencia mxima a bajas velocidades de flujo,

bajo tamao de partcula o altas temperaturas

Buena Sensibilidad y Especificidad

ALTERNATIVA A GC frente a los inmunoensayos

Se puede combinar con espectrmetros de masa

en tndem, HPLC-MS, hecho que ha
revolucionado el anlisis de frmacos

Se usa actualmente en inmunosupresores,

antirretrovirales y cuantificacin de frmaco
antimictico

Enferm Infecc Microbiol Clin 2008;26(4):230-9

HPLC-MS mtodo de
referencia validado
para ensayos de TDM

La unin de HPLC con espectroscopa de masas ha suministrado

una herramienta con una alta sensibilidad, selectividad y
especificidad

La sensibilidad de la deteccin depende de la fuente de ionizacin




APCI (ionizacin qumica a presin atmosfrica)

ESI (ionizacin por electrospray)

Su eleccin depende de propiedades fsico-qumicas del analito

(polaridad/acidez)

Tras la separacin cromatogrfica el eluato se introduce en el

detector de masas
Se eliminan los componentes de la fase mvil y se ionizan los
analitos para proceder a su anlisis
y deteccin en funcin de su relacin masa
carga (m/z)

Debido a la complejidad de las muestras es frecuente el uso de 2

cuadrupolos en serie HPLC-MS-MS
El in seleccionado en el 1 cuadrupolo es fragmentado y analizado
en el 2, permitiendo la deteccin simultnea de iones que coeluyan
de la columna
La identificacin del analito se basa en:




Tiempo de retencin
Masa del in correspondiente al analito( pico base)
Masa de los iones fragmentados del in molecular

La ausencia de iones que interfieran con el in molecular propicia

que la relacin seal ruido sea ptima

HPLC-MS-MS se esta incorporando cada vez ms a los laboratorios

clnicos

Bajos costos reactivos

Alta disponibilidad de kits comerciales
Mnima preparacin de muestras
Rendimiento mejorado
Mediciones simultneas
Mayor linealidad








Inconvenientes:

Necesidad de personal cualificado y bien

entrenado para su manejo
Alto coste equipos

Ther Drug Monit 2008;30 292-300

OTROS MTODOS
DE ANLISIS

Electroforesis capilar

Tcnica de separacin basada en la migracin

diferencial de molculas sujetas a un campo
elctrico a travs de un capilar
El uso de altos campos elctricos reduce
tiempos de anlisis (alta eficiencia y resolucin).
La existencia del flujo electro-osmtico, posibilita
el anlisis simultneo de todos los analitos
Flujo electro-osmtico mueve la
disolucin extremo + al separando
las molculas por su carga

Carga+ > neutras > carga

EC es una tcnica sensible y altamente

verstil muy utilizada en investigacin farmacutica

Electrodo selectivo iones

Litio (espectrofotometra de absorcin
atmica, fotometra de emisin de llama
e ICP-MS)

Tcnica de referencia EAA e ICP-MS

Potenciometra: diferencia de potencial
existente entre un electrodo selectivo y
un electrodo de referencia en ausencia
de corriente externa

Electrodo de vidrio para cationes
monovalentes (Li+) , medida
potenciomtrica proporcional
a concentracin Li en la muestra

DETERMINACIN
DE FRMACO
LIBRE

CUANTIFICACIN DE LA
FRACCIN LIBRE DE
FRMACO

Frmacos teraputicos con mas 80% de unin a protenas

Determinacin de la fraccin libre del frmaco compleja.

Cada vez ms habitual en laboratorios de rutina

Clin. Chem. Lab. Med 2010;48(4)

A. Dasgupta. Clinica Chimica Acta 377 (2007) 1-13

Unin a protenas de los frmacos mas frecuentemente monitorizados

Frmaco

% unin a protenas

Amicacina
Etosuximida
Procainamida
Teofilina
Fenobarbital
Fenitoina
Carbamacepina
Acido Valproico
Primidona

< 5%
0%
10-15 %
40 %
40 %
90 %
80 %
90-95 %
15 %

Digoxina

25 %

Quinidina
Lidocaina
Ciclosporina
Tacrolimus
Acido Micofenlico

80 %
60-80%
98 %
97 %
92 %

Tipo de protena

Monitorizar
frmaco libre?

__
__
Albmina
Albmina
Albmina
Albmina
Albmina
Albmina
Albmina

No
No
No
No
No
Si
Si
Si
No

1-glicoprotena cida
Lipoprotenas
Lipoprotenas
Albmina

Si
Si
Si
Si

Inters en intoxicaciones
Albmina
tratadas
con FAB (DigiBind)Si
cida Si
FAB1-glicoprotena
interfieren con inmunoensayos

CUANTIFICACIN DE LA
FRACCIN LIBRE DE
FRMACO

Frmacos teraputicos con mas 80% de unin a protenas

Determinacin de la fraccin libre del frmaco compleja.

Cada vez ms habitual en laboratorios de rutina

Mtodos


Dilisis en equilibrio , microdilisis, ultrafiltracin

y ultracentrifugacin


Recientemente se ha introducido el mtodo SPME

Clin. Chem. Lab. Med 2010;48(4)

Ultrafiltracin/dilisis: Procesos de separacin

basados en membranas de polmeros controlados
por la velocidad



Tcnica simple y rpida

Mtodo actual mas usado, puede combinarse
con detectores UV o MASAS

Parmetros cruciales:


Tiempo de centrifugacin

Temperatura

Volumen de la muestra

Volumen directamente proporcional a

tiempo de centrifugacin e inversamente
proporcional a [ALB] suero

Clinical Biochemistry 40 (2007) 752-764

SPME

Mtodo prometedor, rpido, simple

Extraccin y pre-concentracin


Pequea fibra de slice fundida instalada en un soporte, recubierta de

una fase polimrica (extractante)
La SPME esta basada en el reparto de los analitos entre dos fases: la
muestra y la fase polimrica. Consiste en la adsorcin selectiva de los
analitos presentes en la muestra.
Una vez finalizada la etapa de adsorcin, la fibra puede ser inyectada
directamente en el detector

Puede conectarse en lnea a un CG, LC o electroforesis capilar

La combinacin de SPME y LC-MS excelente mtodo de screening

y determinacin de drogas y metabolitos en suero, plasma u orina






Fcil uso
Automatizacin on-line
Bajos volmenes de muestra (10l)
Costes de anlisis bajos
Bajos tiempos de procesamiento

M. Adbel-Rehim, J. Chromatogr.A (2009), doi:10.1016/j,chroma.2009.09.053

CONCLUSIONES

Optar por HPLC/HPLC-MS, siempre que las condiciones de trabajo lo

requieran, cuando se tenga personal bien cualificado y las casas
comerciales tengan buen servicio tcnico que responda inmediatamente
ante cualquier problema
Los laboratorios deben participar en programas de control de calidad
internos y externos que garanticen la validez y utilidad del dato emitido
Todas las caractersticas del mtodo analtico deben ser documentadas
en los procedimientos tcnicos (PNTs) que utilice el laboratorio. En ellos
se indicarn claramente todas las caractersticas del mtodo y
requerimientos de la muestra a utilizar as como sus limitaciones.

Farm. Hosp. 2008;32(2) 113-123

GRACIAS POR
VUESTRA ATENCIN