Qumica Biolgica 2110. Microbiologa y Tcnico de Laboratorio. Ao 2008.

Trabajo Prctico N 7: Estudio de la actividad enzimtica y especfica de fosfatasa

cida de Pseudomonas fluorescens C.
Objetivo:
Determinar la actividad especfica de fosfatasa cida (AcPasa) en distintas fracciones
obtenidas por fraccionamiento salino de extracto periplsmico y evidenciar en cual de ellas
la enzima se encuentra ms enriquecida.
Introduccin:
Las enzimas son catalizadores biolgicos que actan acelerando las reacciones
qumicas, permitiendo que ocurran en un tiempo adecuado. Bsicamente, la enzima (E) se
une al sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato [ES] donde ocurren cambios en
la molcula de sustrato dando origen al producto (P), sin alterar la enzima.
E + S

[ES]

P + E

La actividad de una enzima se determina como la cantidad de producto formado, o de

sustrato consumido, en un tiempo dado. Si se cuenta con un mtodo especfico para detectar
la aparicin del producto o la desaparicin del sustrato, se podr medir cuantitativamente la
actividad de la enzima. Si el producto es coloreado, absorbe luz en la regin visible del
espectro. As, si la concentracin de producto aumenta, tambin aumentar la absorcin de
luz, Absorbancia (A) o Densidad ptica (DO), indicando un aumento de la actividad
enzimtica.
Para cuantificar el producto por medidas de Absorbancia, a una determinada longitud de
onda, se utiliza la Ley de Lambert y Beer:
A = . b . C (mol/l) a
: coeficiente de extincin molar o de absortividad molar.
b: longitud de la celda, de 1cm.
C: concentracin de la sustancia, en este caso, el producto.
La actividad de una enzima se expresa en Unidades por ml (U.mL -1) que se definen
como los nanomoles de producto formado por minuto por mililitro de solucin (nmol.min 1.mL-1).
La relacin entre la actividad de una enzima con el total de protenas presente en una
muestra se define como la actividad especfica (AE). Esta es una expresin muy utilizada
que nos indica la pureza relativa de la enzima en una solucin, y se expresa como la
actividad enzimtica, en Unidades, por mgr de proteina (U.mgr-1).
Como ya se ha visto en TP anteriores, si se agregan grandes cantidades de una sal muy
soluble a una solucin proteica, disminuye la interaccin protena-H2O predominando la
interaccin protena-protena y se produce la precipitacin de las mismas. Como la

concentracin salina a la cual se produce la precipitacin no es igual para cada protena, se

puede utilizar esta propiedad para la separacin y purificacin de alguna protena en
particular a partir de extractos complejos. Una de las sales ms utilizadas para este
procedimiento es el (NH4)2SO4, debido a su gran solubilidad, la cual vara poco con la
temperatura.
La enzima Fosfatasa cida (AcPasa) con la cual se trabajar en el TP, es una enzima
periplsmica. Previamente los docentes, realizaron una extraccin de las protenas
periplsmicas y al extracto obtenido se le realiz un fraccionamiento salino agregando
(NH4)2SO4 en un 30 %, 60 % y 95% de saturacin.
En el presente TP se deber determinar la AE en el Extracto Periplsmico (EP) sin tratar
y en la fracciones 30%, 60% y 95%. Para ello se determinar la actividad enzimtica a cada
una de las fracciones mencionadas. Por otro lado, la concentracin de protenas de estas
fracciones fue determinada en el TP anterior y corresponden a las muestras denominadas
como soluciones problemas P1, P2, P3 y P4.
Medicin de la enzima fosfatasa cida, AcPasa.
En el trabajo prctico se estudiar la enzima utilizando un sustrato artificial. La AcPasa
cataliza la hidrlisis del sustrato p-nitrofenil fosfato (p-NPP), incoloro, en fosfato
inorgnico (Pi) + p-nitrofenol (p-NP), ste producto es coloreado en medio alcalino y
absorbe en la regin visible del espectro de luz.

AcPase
Mg
p-NPP
(incoloro)

2+

PO43 -

p-NP
(amarillo)

La actividad se determinar midiendo la A del p-NP a 410nm y se expresar en (U.ml -1).

Pero el sustrato p-NPP se hidroliza espontneamente, entonces, no slo se medir la A del
p-NP producto de la accin enzimtica sino tambin la de la propia hidrlisis. Esto se
corrige realizando un blanco de reaccin, que consistir en colocar la mezcla de reaccin
pero sin la muestra de enzima. Se descontar la A de este tubo a todos los dems.
Tcnica.
1.- Rotular 5 tubos como: Blanco (B), EP, 30, 60, 95.
2.- Para cada determinacin, la reaccin enzimtica se realizar colocando las siguientes
soluciones:

Solucin:
Buffer AcH/AcNa pH 5,0 (0,2 M)
MgCl2 (100mM)
p-NPP (50 mM)
Muestra de enzima
H2O
(c.s.p. 500 l)

Volumen
250 l
10 l
50 l
10 l
180 l

Concentracion final
0,1 M
2 mM
5 mM

500 l

Volumen final de reaccin

3.- Homogeneizar en vortex cada tubo y colocar en bao de H2O a 37C durante 15 min.
4.- Transcurrido el tiempo, sacar los tubos del bao y dejarlos en hielo. Agregar 500 l de
Na(OH) 2 N.
5.- Medir la DO a 410 nm en espectrofotmetro.
6.- A cada medicin restar la DO del tubo B, esto se considera DO corregida, y es la DO
producto de la actividad enzimtica, nicamente.
7.- Calcular la actividad de la enzima en U.ml-1 utilizando la siguiente frmula y registrarlos
en el cuadro al final de la gua:
1000 L

DOcorregida
U . mL-1 =

.
15 min

10 L

p-NPP a 37C = 0,0161142

8.- Calcular AE de cada una, relacionando este dato con la concentracin de protenas
obtenida en el TP anterior.
Actividad enzimtica (U . mL-1)
AE (U.mgr-1) =
mgr de protenas (mgr. mL-1)
9.- Concluir en que fraccin se encuentra ms enriquecida la AcPasa.