INFORME DE LABORATORIO BIOTECNOLOGA

PRACTICA # 1: TCNICAS DE MEDICIN DE BIOMASA

OBJETIVO: Lograr comprender los diferentes mtodos de medicin de biomasa ms comunes
en la prctica para hongos (o levaduras) y bacterias e identificar sus ventajas y desventajas.
MATERIALES Y REACTIVOS
Equipos:
-

Centrifuga
Eppendorfs (2ml)
Microscopio
Cmara de Newbauer.
Micropipeta
Espectrofotmetro
Balanza
Horno a 100C
Cajas petri estriles.
Tubos de ensayo estriles.
Erlenmeyers 250ml estriles.
Reactivos:

Medio de cultivo Sabouroud y caldo nutritivo.

Agua estril.
Bacterias: Bacillus thuringiensis
Levadura: Rhodotorula sp.

PROCEDIMIENTO:
Con 12h de anticipacin hacer dos preinculos de Bacillus thuringiensis en caldo nutritivo y de
Rhodotorula sp. en Medio Sabouraud.

Conteo de unidades formadoras de colonias.

Preparar las siguientes muestras de la siguiente forma:

Solucin
mL
H2O
Dilucin

A
1mL cultivo
9
Dilucin 1/10

B
1mL A
9
1/100

C
1mL B
9
1/1.000

D
1mL C
9
1/10.000

E
1 mL D
9
1/100.000

F
1 mL E
9
1/1.000.000

Sembrar 0.1 ml de las soluciones D, E, y F en 3 cajas de petri respectivamente por duplicado.

Luego de 24 horas aproximadamente contar las colonias en cmara cuenta colonias.
Las unidades resultantes al hacer las lecturas de colonias en esos equipos son: ufc/mL
(unidades formadoras de colonia / ml).

Peso seco:

Seque en un horno a 60C cuatro eppendorfs marcados (dos para Bacillus thuringiensis y
dos para Rhodotorula sp.) vacos de 2ml por 24h aproximadamente, pselos y gurdelos en
un disecador con anhdrido de calcio (CaSO4).
Agite el erlenmeyer que contiene el preinculo para resuspender el cultivo uniformemente.
Tome 1.5 mL de muestra y virtala en el eppendorf previamente pesado.
Centrifuge las muestras a 14000rpm por 20 minutos. Descarte el sobrenadante
cuidadosamente y coloque los erlenmeyers en el horno a 60C. Pselos peridicamente
hasta lograr peso constante (puede tomar de 2 a 24 horas aproximadamente, dependiendo
del horno y el espesor de la pasta). En algunas ocasiones suele realizarse uno o dos
lavados del pellet con agua destilada para retirar productos (e.g. polmeros etc) formados
por el microorganismo. En este caso obviar este paso por cuestiones de tiempo.
Calcule la diferencia en peso y exprese el peso seco en g/L.

Densidad ptica (DO):

Curva de calibracin (DO vs peso seco):

La curva de calibracin debe realizarse para cada microorganismo ya que cada especie pose
diferente forma, coloracin, tamao etc. Adicionalmente debe tenerse en cuenta que las curvas
de calibracin dejan de ser lineales a partir de una densidad ptica determinada dependiendo
del estado fisiolgico de las clulas.
Para este caso en particular, se realizar una curva de calibracin con Levadura comercial
(Sacchacaromyces cerevisiae) para ambos microorganismos, sin embargo analizar los
inconvenientes que podra causar esta suposicin.
-

Preparar una solucin de 1g / L de levadura (Sacchacaromyces cerevisiae) (100 mL):

solucin P.
Diluir la muestra patrn (1g/L) como se muestra
A
1 mL P
9 mL H2O
0.1g / L

B
2 mL P
8 mL H2O
0.2 g/L

C
3 mL P
7 mL H2O
0.3 g/L

D
5 mL P
5 mL H2O
0.5g /L

E
10 mL P
0 mL H2O
1g/L

F
Blanco
10 mL H2O

Leer en el colormetro a una longitud de onda ( = 640 nm) t realizar la curva de DO vs

concentracin.

NOTA : Absorbancia = 2 Lg Tramitancia.

Medicin de muestra:

Agite el cada erlenmeyer que contiene el preinculo para resuspender el cultivo

uniformemente. Tome dos muestras de 1.5 mL de cada cultivo y virtalas en eppendorfs
marcados apropiadamente.

Centrifuge las 4 muestras (2 para Bacillus thuringiensis y 2 para Rodothorula) a 14000

rpm por 20 minutos, y resuspenda el pellet en 1.5 mL de agua destilada.

Vierta la muestra en la cubeta del espectrofotmetro y lea la absorbancia a 640nm. La

precisin del mtodo es mxima para absorbancias entre 0.1 a 0.5. Si la absorbancia
leda se sale de la escala de la curva de calibracin, diluir la muestra y tomar nota del
factor de dilucin.

Realizar el clculo en g/L segn la curva de calibracin.

Cmara de Neubauer

Diluir el cultivo de en 1/5.

A continuacin se presentan los resultados arrojados en la prctica, a manera de

artculo:

TCNICAS DE MEDICIN DE BIOMASA

Informe No. __

1. Marco Terico
El crecimiento microbiano, es un incremento en el nmero de clulas o aumento de la biomasa
de un microorganismo. En mltiples situaciones prcticas es necesario el control de la
poblacin celular, dado que el conocimiento de cmo se expande es til para el diseo de
mtodos que permitan su control (UDEA, 2004). Este crecimiento, se ve afectado por mltiples
factores fsicos y qumicos tales como: temperatura, pH, aireacin, fuentes nutricionales y sus
concentraciones, los cuales deben ser adecuados para facilitar el desarrollo del microorganismo
en el medio de cultivo (Pedroza et al, 2007).
La determinacin del crecimiento de una poblacin microbiana puede realizarse a travs de
diversos mtodos, siendo posible cuantificar el nmero de clulas o el aumento de la masa
celular. Tal medicin puede llevarse de manera directa o indirecta. En la medicin directa se
cuenta el nmero total de clulas en un volumen conocido y as se estima el nmero total en la
poblacin. Hacen parte de los mtodos directos el recuento de viables en placa, peso seco,
turbidimetra y conteo en cmara. Los mtodos indirectos son aquellos que utilizan parmetros
distintos del nmero de clulas, pero que pueden relacionarse de forma directa con ste; hacen
parte de estos la determinacin de protenas, polisacridos, DNA, entre otros (Barton, 2005)
El recuento en placa, es quiz el mtodo mas utilizado para determinar el nmero de clulas
viables. Esta tcnica se basa en el principio de que una poblacin de clulas puede extenderse
a travs de un medio slido de tal manera que cada una de ellas puede dar origen a una
colonia. Clulas que formen cadenas, aglomeraciones o hifas, no pueden ser contadas por este
mtodo. El conteo directo en cmara es un mtodo que indica el total de clulas, pero no
cuantifica el nmero de clulas viables a menos que se realice una coloracin. El uso de esta
tcnica requiere de habilidad para distinguir y contar clulas individuales, siendo inaplicable
para microorganismos que formen micelio (Dutta, 2008).
La masa celular puede medirse tambin pticamente mediante la determinacin de la cantidad
de luz dispersada por una suspensin de clulas. La tcnica llamada turbidimetra, se basa en

el hecho de que pequeas partculas dispersan la luz proporcionalmente a su concentracin,

esto dentro de ciertos lmites. Tiene la desventaja de no diferenciar entre clulas vivas y clulas
muertas, pero tiene a su favor el ser un mtodo rpido y no destructivo. La medicin de
biomasa por peso seco es probablemente la mas fiable y reproducible. Sin embargo, consume
tiempo y es relativamente insensible a pequeas variaciones de la masa celular. Esta tcnica
slo puede utilizarse con suspensiones densas, y las clulas deben ser lavadas completamente
para evacuar todo material extrao (Barton, 2005).
2. Objetivos
General
Evaluar mtodos directos de medicin de biomasa para una bacteria y una levadura, a saber
Bacillus thuringiensis y Rhodotorula sp. respectivamente, y determinar la tcnica ms apropiada
para cada uno de los microorganismos.

Especficos

Determinar el nmero de clulas y la biomasa de los microorganismos de trabajo

mediante mtodos directos como son recuento en placa, peso seco, turbidimetra y
cmara de Neubauer, partiendo de un cultivo de 12h de fermentacin.

Determinar las ventajas y desventajas del uso de cada mtodo para la medicin de
biomasa de los microorganismos.

3. Resultados
3.1. Recuento de viables en placa: Se prepararon diluciones de 10-1 a 10-6 de un cultivo de 12h
para ambos microorganismos. Posteriormente se sembraron en superficie las diluciones de 10 -4
a 10-6 con rplica. Despus de 24h se realiz la lectura, los resultados se especifican en las
tablas 3.1 y 3.2.
Dilucin

No.
colonias

UFC/ml

10-5 (R1)

186

19x107

10-5 (R2)

209

21x107

10-5 (R3)

157

16x107

10-6 (R1)

27

27x107

10-6 (R2)

37

37x107

Promedio
(UFC/mL)

Error
Estndar

18x107

1.5x107

32x107

5x107

Tabla 3.1. Recuento en placa de Rhodotorula sp.

Dilucin

No.
colonias

UFC/ml

Error
Estndar

No Determinado
Tabla 3.2. Recuento en placa de Bacillus thuringiensis

3.2. Peso seco: Se tomaron 4 eppendorfs secos y se registr su peso. Posteriormente se

adicionaron a cada uno de ellos 1.5mL del cultivo de cada microorganismo. Fueron
centrifugados y una vez descartado el sobrenadante, fueron puestos a 60C hasta peso
constante. Los valores arrojados por este mtodo se presentan en las tablas 3.3 y 3.4.

Muestra
No.

Peso
vaco (g)

Peso con
pellet (g)

Peso
pellet (g)

Peso seco
(g/L)

1.1489

1.1569

0.008

5.33 (1)

1.1593

1.1671

0.0078

5.20

Promedio
(g/L)

EE

5.27

0.067

Promedio
(g/L)

EE

1.17

0.1

Tabla 3.3. Peso seco para Rhodotorula sp

Muestra
No.

Peso
vaco (g)

Peso con
pellet (g)

Peso
pellet (g)

Peso seco
(g/L)

1.1551

1.157

0.0019

1.27

1.1408

1.1424

0.0016

1.07

Tabla 3.4. Peso seco para Bacillus thuringiensis

(1)

Este valor se hall de la siguiente manera:

Peso _ sec o g / L

0.008
1000
1 .5
g
L

Peso _ sec o 5.33

De la misma manera fueron calculados los otros valores de peso seco.

3.3. Turbidimetra: Se adicionaron 1.5mL de muestra de cada cultivo a 4 eppendorfs para ser
centrifugados. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en agua destilada para leer
absorbancia a 640nm. En los casos donde se present absorbancia mayor a 1 se realiz
dilucin hasta obtener valores inferiores a ste. Los resultados se especifican en las tablas 3.5 y
3.6.
Muestra
No.
1

Absorbancia

Promedio

EE

2.247

0.005

2.241

2.252

Dilucin

Absorbancia

1.881

1.883

Tabla 3.5. Absorbancia para Rhodotorula sp

Muestra
No.
1

Absorbancia
1.52

1.52

Promedio

EE

1.52

Dilucin

Absorbancia

0.759

0.709

Tabla 3.6. Absorbancia para Bacillus thuringiensis

3.4. Cmara de Neubauer: Se tomaron 12L de la dilucin 10-2 de ambos microorganismos para
el llenado de cada una de las reas de la cmara. Una vez verificada la ausencia de espacios o
burbujas, se realiz el enfoque de los cuadrantes iniciando en 4X hasta 40X, donde finalmente
se llev a cabo el conteo de las clulas en los 5 cuadrantes internos. Los resultados del conteo
se especifican en las tablas 3.7 y 3.8.
Dilucin

No. clulas

Clulas/ L

10-2

81

405x103 (2)

No. clulas

Clulas/ L

10-2

Promedio
(cl/ L)

EE

335x103
70x103
53
265 x103
Tabla 3.7. Recuento en cmara de Rhodotorula sp

Dilucin

Promedio
(cl/ L)

EE

No Determinado
Tabla 3.8. Recuento en cmara de Bacillus thuringiensis

(2)

El resultado se obtuvo de la siguiente manera:

Clulas
Clulas

L
Pr ofundidad _(mm) Superficie _ contada _(mm 2 ) Dilucin
Clulas
81
clulas

405 103
1
L
L
0.1mm 5 x0.04mm 2

100

3.5. Representacin grfica de los resultados:

Grfica 1. Unidades formadoras de colonia (UFC/mL)

-5

Grfica 2. Valores de biomasa en peso seco (g/L) para

-6

para Rhodotorula sp. en las diluciones 10 y 10 .

Rhodotorula sp. y Bacillus thuringiensis.

Grfica 3. Valores de absorbancia para las muestras

Grfica 4. Recuento en cmara de Neubauer para

de Rhodotorula sp. y Bacillus thuringiensis.

Rhodotorula sp.

4. Anlisis de resultados
Rhodotorula sp. son levaduras que se caracterizan por su morfologa esferoidal y su
incapacidad para formar hifas (Garca et al, 2004). Esta caracterstica le confiere a estos
microorganismos la posibilidad de aplicar tcnicas de medicin de biomasa como recuento en
placa y conteo de clulas en cmara de Neubauer. Tal como lo especifica Dutta (2008), estos
mtodos son tiles siempre y cuando no se presenten aglomeraciones o formacin de micelio
durante el crecimiento. La tabla 3.1 especifica las unidades formadoras de colonia para
Rhodotorula sp. Tal como lo supone la tcnica, es de esperarse que entre diluciones
consecutivas se visualice una disminucin de 10veces en el conteo de las colonias, situacin
que fue posible apreciar de una manera aproximada en el momento de registrar los resultados
de dicho conteo. Para la dilucin 10-5 se obtuvo en promedio un nmero de 184 colonias,
mientras que para la dilucin 10-6 el promedio fue de 32 colonias. Esto da como diferencia
6veces el nmero de colonias, valor relativamente cercano a lo esperado por la tcnica, el cual
pudo verse afectado por el manejo de diluciones, descalibracin de micropipetas o por el error
propio del investigador. La grfica 1, correspondiente a la tcnica de recuento en placa para
Rhodotorula sp., permite visualizar de manera clara el efecto que tiene, en la variabilidad de los
datos, la toma de diversas rplicas para el anlisis de biomasa. En la dilucin 10 -5 fueron
realizadas 3 rplicas, mientras que para la dilucin 10 -6 se realizaron 2 rplicas. Debido a que el
error estndar es inverso al tamao de la muestra, la variabilidad de los datos ser menor para
muestras grandes, lo cual pudo apreciarse en la toma de resultados donde los datos de la
dilucin 10-6 presentaron una variabilidad 3.3veces superior a los datos de la dilucin 10 -5, por
diferencia de una rplica.
Las bacterias del gnero Bacillus, que durante se duplicacin tienen una tendencia baja a
permanecer unidos, pueden presentar un tipo de agrupacin denominada estreptobacilos, esto
es, cadenas de bacilos (Martnez, 2006). Posiblemente esta caracterstica y el tiempo de
incubacin que permanecieron las cajas con Bacillus thuringiensis, dificultaron el recuento de
colonias para la determinacin de biomasa por este mtodo. De acuerdo con un estudio
realizado por Chang et al (2007), el conteo de colonias para dicha cepa puede realizarse en un
tiempo prudencial de 12horas, en donde las colonias se encuentran completamente
desarrolladas. Para la prctica se llev a cabo el recuento despus de 24horas de incubacin,
encontrando el microorganismo extendido en gran parte de la superficie de la caja. Adems de
ello, cabe resaltar que la homogenizacin y el manejo correcto de las diluciones resultan ser

factores determinantes para la obtencin de colonias en la aplicacin del mtodo, pudiendo ser
alguna de ellas la falencia que impidi el correcto desarrollo de las colonias de dicho
microorganismo. La diferencia en el tiempo de duplicacin y desarrollo entre bacterias y
levaduras pudo notarse en la prctica, en donde esta ltima no present inconvenientes para el
conteo de colonias dado que su crecimiento se da en das.
Para algunos autores, la medicin de biomasa por peso seco es probablemente la mas fiable y
reproducible (Barton, 2005). Sin embargo, su insensibilidad a pequeas variaciones de la masa
celular condiciona el mtodo a volmenes elevados, dado que diferencias del orden de
miligramos representan el peso de un gran nmero de clulas. Tal como se especifica en las
tablas 3.3 y 3.4, ambos microorganismos presentaron variabilidad en la medicin de su
biomasa, a saber 0.067 y 0.1 para Rhodotorula sp. y Bacillus thuringiensis, respectivamente.
Aunque dichos valores resultan ser pequeos, pueden traducirse en una cantidad considerable
de biomasa celular, debido al volumen de trabajo utilizado y al tamao de los microorganismos
de estudio. Las levaduras son microorganismos que se caracterizan, entre otras cosas, por ser
de un tamao superior a las bacterias. Mientras una levadura puede medir entre 6 y 12m, una
bacteria tan solo mide de 0.2 a 4m (Martnez, 2006). Esta diferencia puede verse reflejada en
el valor promedio de biomasa seca obtenida para cada microorganismo, siendo 4.5veces
superior la de Rhodotorula sp. en comparacin a Bacillus thuringiensis. La grfica 2 permite
visualizar de manera clara dicha diferencia.
La medicin de biomasa por turbidimetra, resulta ser un mtodo rpido para la determinacin
de la concentracin celular de un cultivo, esto contando con la respectiva curva de calibracin
del microorganismo de estudio. Esta tcnica resulta muy confiable para valores pequeos de
absorbancia, en donde puede presentar proporcionalidad directa con la concentracin de
clulas (Annimo1, 2006). Durante la prctica, la lectura de la absorbancia arroj valores por
encima de la unidad, posiblemente por una elevada densidad celular en las muestras. Para
ajustarla a valores ms pequeos se realizaron diluciones, en donde pudo apreciarse que la
disminucin en los valores de absorbancia no sigue un comportamiento lineal respecto a la
dilucin realizada, tal como lo demuestran los datos registrados en las tablas 3.5 y 3.6, siendo
necesario ajustar experimentalmente los valores de absorbancia en el rango establecido
mediante diluciones seriadas, si es el caso. En la grfica 3 es posible apreciar como para esta
tcnica la variabilidad de los datos fue casi nula para Rhodotorula sp. e igual a cero para
Bacillus thuringiensis, lo que podra traducirse en la toma de muestras significativas y buena

10

homogenizacin de las mismas al momento de realizar la medicin. Por razones expuestas

anteriormente, posiblemente el tamao de clulas superior de Rhodotorula sp. llev a un valor
de absorbancia promedio 1.48veces superior al arrojado por Bacillus thuringiensis.
La medicin de biomasa mediante el conteo de clulas en cmara de Neubauer, ha sido
utilizado por diversos autores en sus estudios con Rhodotorula sp. (Albelo et al, 2008; Libkind y
Broock, 2006; Bobrowski et al, 2001). El tamao de las clulas y su coloracin por el pigmento
carotenoide, facilitan la visualizacin de las mismas a travs del microscopio. Caso contrario se
present con la muestra de Bacillus thuringiensis. El tamao de estos microorganismos resulta
ser pequeo para lograr una visualizacin clara en el objetivo trabajado (40X). Bobrowski et al
(2001), llev a cabo un procedimiento previo al conteo en cmara de Neubauer con una cepa
de Bacillus thuringiensis. Despus de una centrifugacin para remover componentes
extracelulares, realiz diluciones hasta alcanzar la concentracin deseada visualizando las
clulas en un objetivo de 400X. Adems del tamao de clula, el tipo de agrupacin en cadena
que pueden presentar los bacilos resulta un inconveniente para la aplicacin de esta tcnica en
este tipo de microorganismos.
En general, de los resultados obtenidos en las cuatro tcnicas de medicin de biomasa, solo
tres resultan ser viables para el anlisis, debido a la ausencia de la curva de calibracin para los
microorganismos que arroja los datos de concentracin celular para el mtodo de turbidimetra.
En cuanto a la variabilidad de resultados, la cmara de Neubauer present un valor elevado en
su escala, seguido por el recuento en placa y finalmente peso seco. En caso tal de que ambos
microorganismos hubieran respondido a todos los mtodos, la tcnica de turbidimetra seguida
de la medicin en peso seco, seran las ms indicadas para obtener mediciones con menor
variabilidad. Sin embargo, su desventaja de no diferenciar entre clulas viables y no viables
podra limitar su uso en algunas aplicaciones industriales. La cmara de Neubauer es una
opcin fcil y relativamente rpida pero requiere de equipos de alta precisin y acercamiento
que permitan determinar correctamente el nmero de clulas. Igualmente, resulta importante
conocer si debe llevarse a cabo un tratamiento previo a la muestra para aplicar dicha tcnica en
ciertos microorganismos. En cuanto al recuento en placa, la ventaja de conocer la viabilidad de
las clulas lo hace un mtodo muy comn para la determinacin del crecimiento celular. Sin
embargo, el material requerido y el tiempo necesario para realizar la lectura pueden llevarlo a
un segundo plano para algunas aplicaciones donde se requiere conocer resultados de manera
inmediata y donde el presupuesto llega a ser limitado. Es importante considerar al momento de

11

utilizar esta tcnica, hacer el recuento despus de un periodo de incubacin prudente de tal
manera que sea posible diferenciar fcilmente las colonias. La manipulacin de micropipetas,
las diluciones en serie y el propio investigador, pueden asociar error en la utilizacin de dicha
metodologa.
5. Conclusiones

Las tcnicas de medicin de biomasa que involucran conteo como son UFC y cmara de
Neubauer, no resultan ser apropiadas para Bacillus thuringiensis debido a su forma de
crecimiento y tamao que dificultan la distincin de las clulas.

La naturaleza de Rhodotorula sp. hace este microorganismo apto para la determinacin de

su crecimiento mediante mtodos directos, siendo determinante el uso de estos de acuerdo
a las necesidades del proceso, esto es, si requiere el conocimiento de clulas viables o
resulta indiferente.

La aplicacin de los mtodos de medicin de biomasa depende de factores como tiempo y

costos, que pueden limitar su uso tanto a nivel de laboratorio como a nivel industrial.

Para realizar un estudio del crecimiento celular, la toma de varias rplicas tiene un impacto
en la variabilidad de los datos, siendo menor con el aumento del nmero de muestras
tomadas.
6. Bibliografa

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13