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PRACTICA N 1
Cuantificacin de la Concentracin de Esporas
La cuantificacin de la concentracin de esporas permite determinar el nmero de unidades infectivas por unidad
de peso o volumen existentes en una formulacin y sirve de base para establecer la dosificacin de un producto.
PROCEDIMIENTO:
Para los patrones B.bassiana (Bb9205) y M.anisopliae (Ma9236) se toma una botella al
azar, de un cultivo de 25 das de desarrollo. Remover las esporas con la ayuda de una esptula de madera, despus
adicionar agua con Tween 80 al 0.1% hasta un volumen conocido (500 o 1000ml). De esta forma queda preparada
la suspensin madre de la cual se toman 4 submuestras de 1ml y se depositan en tubos con 9 ml de ADE, quedando
de esta manera preparada la dilucin 10 1, se repite el procedimiento llevando 1 ml de esta dilucin (10 1) a tubos
con 9 ml de ADE, es decir, 10 2 y as sucesivamente hasta obtener una dilucin 10 4 o la dilucin apropiada que
permite el conteo para estimar el nmero de esporas por mililitro de la suspensin.
Para el recuento de esporas se utiliza la cmara de Neubauer o hemocitmetro. La cmara esta dividida en 2
retculos y cada uno se subdividen en 9 cuadrados de 1mm 2 cada uno, o sea que cada retculo tiene una superficie
total de 9mm2. El cuadrado central aparece de nuevo subdividido en 25 cuadrantes ms pequeos.
El volumen (V) en mm3 de cada uno de los cuadrantes es el siguiente:
Volumen = ancho x largo x profundidad
V = 1mm x 1mm x 0.1mm = 0.1mm3( Volumen del cuadrante en el cual se realiza el

conteo de esporas).

El nmero de esporas se obtiene en ml, por tanto, se debe realizar la conversacin de mm3 a ml, entonces:
1 ml 10 3 mm 3

1ml x 0.1 mm3

X

X - 0.1 mm
X = 10 1 x 103 = 10 4

0.1 ml
= 0.1x103

=
3

10 mm
ml (Factor de la cmara )

10

El recuento se determina sumando el total de esporas presente en los 25 cuadrantes centrales de la cmara. A cada
submuestra se le realiza tres veces este procedimiento para un total de seis lecturas. La concentracin de esporas se
calcula multiplicando el promedio del nmero de esporas obtenido por el inverso de la dilucin empleada para el
conteo (Si la dilucin empleada fue 10 3 el inverso es 103) y por el inverso del factor de la cmara (104).
Si N es el nmero promedio de esporas por cuadrante, entonces la concentracin que se desea conocer, denominada
C, se estima de la siguiente manera:
C = N x Dilucin empleada x Factor de Cmara
Antes de proceder al recuento de esporas el hemocitmetro debe ser lavado y secado. El tubo de la dilucin de la
muestra de la cual se va a hacer el conteo de esporas se agita en un vrtex durante 30 segundos e inmediatamente se
toma la muestra de 10 ul (0.01ml) con una micropipeta y se deposita con cuidado, de manera que el lquido entre
por capilaridad sin que se formen burbujas en la cmara. Si esto ocurre, se retira el cubre objetos, se lava, se seca la
cmara y se repite el proceso.
En cada compartimiento de las cmaras se depositan 10ul de la dilucin 10 -4 o de aquella que facilite un conteo de
10 a 50 esporas por cuadrante. Se deja reposar medio minuto antes de proceder al conteo. Luego se lleva la cmara
al microscopio y con el objetivo 10x se localiza en el campo visual el cuadrante central, se enfoca en tal forma que
se observen ntidamente los cuadrantes y luego se pasa el objetivo 40x.
Para el clculo del nmero de esporas por gramo se debe terminar previamente el peso del sustrato arroz agua
utilizado para el cultivo del hongo.
Para obtener el nmero de esporas por gramo del producto, se multiplica el promedio del nmero de esporas por
mililitro obtenido en el recuento, por el volumen empleado en la preparacin de la suspensin madre y se divide
por el peso de la muestra ocupada (Formato 1).

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Con relacin a las muestras producidas en sustrato arroz por los Comits Departamentales de Cafeteros y entidades
particulares, las cuatro submuestras se obtienen a partir de cuatro botellas seleccionadas por fecha o lote de
produccin y se prepara la suspensin madre segn la metodologa citada para el patrn de comparacin.
Cuando se trata de una formulacin en polvo se toma una muestra representativa del lote que se va a examinar, se
procede de la siguiente manera:
1.- Tomar 19 gramos de cada recipiente (lote) y se prepara una mezcla de la cual se extraen cuatro submuestras de 1
gramo.
2.- Cada submuestra es depositada es tubos de ensayo calibrados que contienen 10ml de tween 80 al 0.1% en ADE
(suspensin madre= 100), agitar en un vrtex o manualmente durante un minuto.
3.- Mezclar, un mililitro de la suspensin madre con 9ml de ADE (dilucin 10 -1) y un mililitro de la dilucin 10 -1
con 9ml de ADE hasta obtener la dilucin 10 -2. Se continua de igual manera hasta obtener una dilucin apropiada
que permita fcilmente el recuento de esporas.
4.- El nmero de esporas por gramo producto, se obtiene multiplicando el promedio del nmero de esporas por
mililitro, obtenido en el recuento, por el volumen empleado en la preparacin de la suspensin madre (10ml) y se
divide por el peso de muestra utilizada (1g).
Normalmente las formulaciones en materiales inertes contienen muchos artefactos que impiden hacer los recuentos
en diluciones muy bajas. Por tanto, es necesario hacer los estimados en diluciones mayores que permitan observar
bien las esporas.
Cuanto se evalan formulaciones lquidas, se toman 10 ml de cada recipiente y se realiza una mezcla (suspensin
madre 100), de la que toma cuatro submuestras se preparan las diluciones de la forma antes descrita para estimar el
nmero de esporas por mililitro de formulacin.

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PRACTICA N 2
Germinacin de Esporas
Esta prueba establece la viabilidad del hongo y en combinacin con el estimativo del nmero de esporas se puede
calcular la cantidad de esporas viables de una formulacin por unidad de peso o volumen. Este estimativo se hace
con cada una de las cuatro submuestras preparadas para determinar la concentracin de esporas.
PROCEDIMIENTO:
1.

Preparar de 10 a 15 ml de Agar-agua al 1.5% sin acidificar en cajas de petri. Marcar 5 puntos en la

superficie externa inferior de la caja, correspondientes a los puntos en los cuales se depositarn las
alcuotas que contienen las esporas.

2.

De la dilucin 10-3 de cada submuestra preparada en la prueba anterior y previamente agitada, tomar 5ul
para depositar en las cajas petri, a razn de 5 alcuotas por caja por submuestra. Incubar las cajas de petri
inoculadas a 25(+-) 2C durante 24 horas.

3.

Transcurrido el tiempo de incubacin agregar una gota de azul de lactofenol a cada alcuota con el
propsito de detener la germinacin y a la vez teir las esporas del hongo, luego cortar las alcuotas
depositndolas sobre una lmina portaobjetos y cubrir con una laminilla.

4.

La observacin se hace con el objeto 40X contando un mnimo de 100 esporas (registrar germinadas y no
germinadas) por alcuota. Con los datos obtenidos en las cuatro submuestras calcular el porcentaje de
germinacin (Formato 2).

Una formulacin comercial debe tener una germinacin superior al 85% en un tiempo de incubacin de 24 horas.
Lo anterior, debido a que al asperjar el hongo en el campo debe tener un rpido efecto sobre la poblacin del
insecto que esta atacando y un corto perodo de exposicin a condiciones ambientales adversas.

4
PRACTICA N 3
Prueba de Pureza
La prueba de pureza tiene como finalidad establecer la proporcin del agente biolgico en la formulacin e
identificar los microorganismos contaminadores, contribuyendo a mejorar el proceso de produccin y formulacin
de los entomopatgenos. Para realizar esta prueba se realiza el siguiente procedimiento.
PROCEDIMIENTO:
1.

Preparar SDA ms cloranfenicol (0.016%) de la siguiente manera: 0.25 gramos de cloranfenicol en 100ml
de agua destilada estril, de esta solucin tomar 1ml que se agrega a 150ml de SDA previo al vaciado en
las cajas de petri esterilizadas, es decir cuando alcance una temperatura de 40C. Verter el medio en
cantidades de 10 a 15 ml por caja.

2.

Luego tomar los tubos de la dilucin 10 -4 de cada una de las submuestras del patrn y se agitan en un
vrtex durante un minuto, inocular 0.1ml en la superficie de dos cajas por submuestra, dispersando el
inculo con la ayuda de un rastrillo o pipeta esterilizada. En el caso de los productos comerciales tomar
una dilucin 10-3 o 10-4, dependiendo de la concentracin del producto.

3.

Las cajas inoculadas someter a incubacin a una temperatura de 25( +-) 2C con el fin de promover el
desarrollo de unidades formadoras de colonia (UFC).

4.

Diariamente y durante 7 das se contabiliza el nmero de UFC de cada microorganismo en cada una de las
submuestras. Al final de las lecturas, se identifican los microorganismos presentes. Anotar el nmero
estimado, el porcentaje del entomopatgeno en estudio, otros hongos, bacterias y levaduras encontrados
(Formato 3).

El porcentaje de pureza (P) se calcula de la siguiente manera:

UFC del hongo
evaluado
%P =

X 100
UFC totales

Se considera que las frmulas comerciales deben tener un porcentaje de pureza superior al 90%.

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PRACTICA N 5
PRUEBA DE PATOGENICIDAD
Esta es la prueba ms importante en el anlisis de calidad de una formulacin, ya que determina si el patgeno
realmente ataca la plaga para la cual esta recomendado. Sin embargo, no asegura que bajo condiciones de campo su
eficacia va a ser igual a la registrada en laboratorio. Requiere el desarrollo de una metodologa para criar y
manipular los insectos en el laboratorio y asegurar que permanezcan vivos en el tratamiento testigo durante la
prueba. Las pruebas se disean para proporcionar condiciones ideales en el momento de la exposicin al patgeno,
para que ocurra la germinacin e invasin del hospedante, y en la conidiognesis , para favorecer la esporulacin
del hongo sobre el insecto muerto y poder confirmar que la mortalidad se debi al tratamiento con el holgo.
PROCEDIMIENTO:
Seleccionar adultos de broca del caf de menos de 8 das de edad, provenientes de una
cra libre de patgenos. Desinfectar previamente con una solucin de hipoclorito de sodio al 0.5% durante 10
minutos y lavar en ADE usando mallas de tul esterilizadas que sirven de colador. De estas brocas seleccionar las
que mayor actividad presenten.
Comparar las formulaciones que se deben evaluar con el patrn (Bb 9205). La concentracin de inculo empleado
debe ser de 1x107 e/ml suspendidas en ADE, tanto para el patrn como para cada uno de los productos comerciales
formulados y no formulados. Para la evaluacin de cada producto tomar 40 brocas al azar, distribuidas en 4
repeticiones, cada una con 10 individuos. Para cada evaluacin utilizar un testigo compuesto de adultos de broca
que no entran en contacto con el hongo.
Sumergir las brocas en una suspensin de esporas del hongo 1x10 7 e/ml durante 2 minutos, la cual se mantiene en
agitacin manual. Luego, colocar una broca por vial de vidrio (frasco antibitico), con un disco de toalla de papel
previamente humedecido con ADE y tapar con una mota de algodn esterilizada bien ajustada a la boca del vial.
Al cabo de 24 horas adicionar, como sustrato a cada vial, un grano de caf pergamino seco de agua (45% de
humedad), es decir, sin ningn proceso de secado mecnico.
Diariamente y durante 10 das se evala la mortalidad causada por el hongo en estudio, observando al estereoscopio
los sntomas y signos de enfermedad en las brocas. Las brocas vivas o muertas deben permanecer en los viales para
no interrumpir el desarrollo normal del hongo en el insecto. Con una jeringa desechable diariamente adicionar ADE
hasta humedecer el disco de papel evitando la presencia de agua libre. La humedad puede ser considerada como el
factor ms importante en el desarrollo de una micosis en la etapas de germinacin de las esporas y conidiognesis.
Con el registro diario de patogenecidad (Formato 4) establecer el ciclo del desarrollo del hongo sobre la broca, el
porcentaje de mortalidad (Formato 5) y el promedio del tiempo de mortalidad (Formato 6), que constituyen otros
criterios importantes en la calidad biolgica del hongo en estudio.
El tiempo de evaluacin vara para cada hongo entomopatgeno estudiado, dependiendo del ciclo biolgico del
hongo en el insecto y de la supervivencia del insecto no tratado bajo las condiciones del ensayo. Los productos
comerciales deben causar mortalidades superiores al 80% en esta prueba.

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PRACTICA N 6
PRUEBAS FISICOQUMICAS
A.

pH

Mediante este, se determina la acidez o la alcalinidad de una formulacin.

PROCEDIMIENTO:
Preparar una mezcla en proporcin 1:10 (muestra: agua destilada), homogenizar y dejar
reposar durante una hora. Con un potencimetro previamente calibrado con soluciones Buffer, se determina el pH
(Formato 7). El valor del pH influye en la germinacin del hongo, retardndola en valores extremos. Se consideran
intervalos ptimos de pH los valores entre 5.5 y 7.0.

B.

Porcentaje de Humedad

Los valores de humedad encontrados en las producciones artesanales que utilizan como sustrato de arroz, tanto del
hongo B. bassiana como M. anisopliae son muy variables y oscilan entre el 30 y 80% y en general no afectan la
germinacin y patogenicidad de los hongos. Humedades mayores del 80% proporcionan condiciones favorables
para el desarrollo de microorganismos tales como bacterias y levaduras que entran en a competir con el agente
biolgico y reducen su viabilidad.
En el caso de productos liofilizados o formulados en inertes como talco, bentonita, leche y tierra de diatmaceas, se
presentan porcentajes de humedad entre 3.0 y 15%, que retardan ligeramente el proceso de germinacin.
PROCEDIMIENTO:
La determinacin de humedad se puede realizar mediante la utilizacin de un desecador
infrarrojo Lj-16, al cual se le adapta un censor que registra la prdida de humedad del producto cada 5 minutos y
compara la lectura actual con la anterior hasta el momento en que se estabiliza la humedad, registrando el
porcentaje de prdida o estableciendo previamente los tiempos de secado de acuerdo al producto inerte, ej: sustrato
arroz 70 minutos, y talcos o bentonitas 40 minutos (Formato 7).
Otra forma de determinar la humedad se consigue secando una cpsula de porcelana a 150 C durante dos horas.
Tomar luego con una pinza metlica y enfriar durante 30 minutos en un desecador de vidrio con cloruro de calcio,
el cual favorece la presencia de humedad constante. Transcurrido este tiempo, se pesa la cpsula vaca (PC) en una
balanza analtica y se toma una muestra de 1g de formulacin que se deposita en la cpsula. Luego registrar su peso
(Peso Cpsula + Muestra Hmeda = PCMH). Posteriormente, la cpsula ms la muestra hmeda se lleva a la estufa
a 105 c, durante 24 horas. Al finalizar el secado, sacar de la estufa y trasladar a un desecador durante 30 minutos.
Por ltimo, pesar la cpsula ms la muestra seca ( Peso Cpsula + Muestra Seca, PCMS) (Formato 8).
El porcentaje de humedad se determina como en el siguiente ejemplo:
PC = 10.8919 g
PCMH = 20.7688 g
PCMS = 20.7220 g
Peso hmedo (PH) = (PCMH) (PCMS) = 00.468 g
Peso muestra (PM) = (PCMH) (PC) = 9.8769
Porcentaje de humedad = % H = PH x 100/PM
%H = 0.0468 x 100 / 9.8769 = 0.47%

C.

Humectabilidad

Determina el tiempo que tarda un polvo mojable en humedecerse completamente.

PROCEDIMIENTO:
Pesar 5 g de la formulacin que se va a evaluar y depositar en un punto fijo en la
superficie de un vaso de precipitacin de 250ml y 7cm de dimetro interno, que contiene 200ml de agua destilada.
Con un cronmetro medir el tiempo transcurrido entre el momento de agregar la muestra y el instante en que esta
desaparece de la superficie (Formato 7). Esta prueba se realiza solo a productos industriales formulados en polvos,
talcos, bentonitas, tierra de diatomceas y leche, entre otros.

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PRACTICA N 7
PRUEBAS FISICOQUMICAS
Suspensibilidad
Determina la concentracin de esporas del producto en suspensin despus de un tiempo de preparada la mezcla,
con el fin de asegurar la homogeneidad de la concentracin del producto durante la aspersin.
PROCEDIMIENTO:
1.

Para el patrn de referencia (Bb 9205) se utiliza el hongo producido en arroz con 25 das de desarrollo
(aislamiento reactivado en broca e incubado a 25 +- 2 C). Con este hongo preparar una suspensin
adicionando a una botella (100g de arroz con hongo) 10ml de aceite de uso agrcola y un poco de agua
destilada estril, removiendo las esporas con la ayuda de una esptula.

2.

Verter la suspensin en un erlenmeyer y completar hasta un litro, adicionando agua destilada. As se

obtiene la suspensin madre.

3.

Tomar de la suspensin madre 50ml y llevar a un volumen total de un litro (suspensin de esporas (SE)),
conservando la relacin gramo de producto formulado por volumen de agua recomendado (100g de arroz
con hongo / 20L de agua), en aspersiones en el campo.

4.

Agitar el volumen total de suspensin de esporas, se filtra a travs de una malla 60 mesh o colador de red
pequea que permita solamente el paso de las esporas del hongo y elimine los residuos de arroz. Agitar la
muestra, se toma 1ml y llevar a un tubo con 9 ml de ADE (10 -1), realizando las diluciones respectivas.
Contar las esporas en el hemocitmetro y se calcula la concentracin inicial (CI) de esporas por mililitro
en el volumen total de la suspensin.

5.

El volumen restante de la suspensin distribuir en cuatro probetas de 250ml, agitando previamente. Dejar
en reposo en un sitio que no este sometido a vibraciones a movimientos que alteren el proceso de
sedimentacin normal de las esporas.

6.

Al cabo de 50 minutos introducir lentamente a cada una de las probetas, una pipeta de 10ml, cuya punta
penetre 15cm desde la graduacin superior de la probeta. De este sitio se toman 10ml de la suspensin de
esporas y depositar en tubos de vidrio.

7.

A partir de estas suspensiones preparar diluciones (10 -1,10-2 o la dilucin que permita el conteo de
esporas), preferiblemente la dilucin en la cual se efectu el conteo para determinar la concentracin
inicial. Hacer el recuento de esporas en el hemocitmetro tres veces consecutivas, para un total de seis
lecturas estableciendo la concentracin final (CF). Con esta informacin proveniente de las cuatro
probetas, calcular el promedio de esporas presentes en cada una de las suspensiones del patrn (Formato
9).

La suspensibilidad de formulaciones en otros portadores se determina en forma similar, teniendo en cuenta la dosis
y el volumen por rea, recomendado por el fabricante, para establecer la concentracin del producto. El volumen
final de la suspensin que se va a evaluar debe mantener la misma relacin gramo de producto formulado por
volumen de agua recomendado.
La suspensibilidad de las preparaciones y formulaciones de B.bassiana y M.anisopliae se calcula considerando el
nmero de esporas por mililitro presentes al cabo de 50 minutos, teniendo como base la concentracin de esporas
de suspensin inicial. De esta forma, se obtiene el porcentaje de esporas suspendidas en cada una de las
preparaciones y formulaciones del hongo.
La frmula que se debe aplicar para el % de suspensibilidad es:
% Suspensibilidad (%S) = CF x 100 / CI
Ejemplo:

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6.5 x 107 e/ml (concentracin inicial (CI)) 100%
4.4 x 107 e/ml (concentracin final (CF)) X
X= 67.7
En donde X=67.7% es el porcentaje de esporas suspendidas al cabo de 50 minutos, lo que corresponde al tiempo
que se demora una aspersora de 10 litros de presin previa retenida, para evacuar su contenido con una boquilla de
190 cc/min de descarga.

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INFORME DE PRACTICAS
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Los datos de cada prueba sirven para presentar la informacin al usuario y mantener un archivo de las evaluaciones
realizadas en el laboratorio. En este registro se debe anotar, en la seccin de observaciones, informacin pertinente
que contribuya a tener un mejor conocimiento del entomopatgeno objeto de la investigacin y produccin
(Formato 11).
Las pruebas de calidad se deben realizar en todas las etapas, tanto de produccin como de distribucin y
almacenamiento de las formulaciones de los hongos, para contar con informacin que permita corregir los factores
que deterioran la calidad. De esta forma, las pruebas ayudan a mantener los estndares de calidad de los productos.

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REACTIVACION DEL HONGO
Para la reactivacin del hongo sobre adultos de la broca del caf se procede como sigue:
1.
2.

3.
4.

5.

Seleccionar brocas activas de una colonia, especialmente aquellas que se observan volando.
Desinfectar las brocas con hipoclorito de sodio al 0.5% el cual se prepara tomando 9.52 ml de cualquier
producto comercial (5.25%), llevndolo a 100ml con agua destilada estril (ADE). Sumergir las brocas
durante 10 minutos en esta solucin, luego se lavan tres veces con ADE sobre mallas de tul esterilizadas,
que sirven de colador. Luego con la ayuda de un pincel colocar sobre una toalla de papel esterilizada.
Posteriormente se realiza la infeccin de las brocas por inmersin durante dos minutos en 10ml de la
suspensin madre del hongo y colocar en una caja galletera o en un frasco de boca ancha que contenga
una toalla de papel esterilizada, la cual debe permanecer hmeda. El recipiente se debe mantener tapado.
Despus de 10 das, es decir, cuando el hongo se ha desarrollado completamente sobre el cuerpo de las
brocas, tomar individualmente estas con un pincel desinfestado, someter a una nueva desinfestacin con
hipo clorito de sodio comercial al 5.25% por un minuto y sin lavar, se pasan inmediatamente sobre la
toalla de papel esterilizada para retirar el exceso de hipoclorito.
Finalmente las brocas infectadas con el hongo se colocan individualmente en tubos de ensayo con 8ml de
medio de cultivo inclinado, Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) o tres brocas en una botella de arroz, cuando
el hongo obtenga su mximo crecimiento y esporulacin en el medio se inicia la produccin masiva a
partir de este.