1.

EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS

BACTERIAS
1.1. CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y BIOMOLCULAS
Se puede definir la radiacin como la propagacin de energa por el
espacio. Los principales tipos de radiaciones que pueden tener
efectos sobre los seres vivos son:
radiacin electromagntica

(longitudes de onda, en nm)

Radiacin infrarroja (IR)

800-106

Radiacin visible

380-800

Ultravioleta (UV)

13,6-380

Rayos X

0.14-13.6

Rayos

0.001-0.14

Rayos csmicos

< 0.001

La radiacin particulada, con carga y masa consiste en:

rayos (ncleos de He)
rayos (electrones)
Como se recordar, la radiacin electromagntica presenta un doble
aspecto: ondulatorio y cuntico (=paquetes discretos de energa,
cuantos o quanta).
Cuando una molcula absorbe la energa de un cuanto de radiacin
electromagntica, se pueden producir una serie de cambios en los
niveles energticos de algunos de sus tomos.
La energa de un cuanto (E) est inversamente relacionada con su
longitud de onda ( , en nm), segn la ecuacin de Planck:
E = hc/
siendo h= constante de Planck (6.6210-27 ergseg-1) y c= velocidad de
la luz (2.991017nmseg-1)

Teniendo en cuenta los valores de las constantes y la equivalencia 1

eV=1.5910-12 erg, la ecuacin de Planck se puede expresar como:
E = 1240/ (en eV)
Sustituyendo por sus valores concretos correspondientes a distintos
tipos de radiaciones electromagnticas, se calculan fcilmente los
respectivos rangos de energa:
rayos X: 9000-91 eV
luz UV: 91-3.3 eV
visible: 3.3-1.5 eV
Fuentes de radiaciones:
Las fuentes naturales nos llegan desde el espacio: radiaciones de la
luz solar (visible + UV) y los rayos csmicos. Sin embargo, la capa de
ozono de la alta atmsfera sirve de pantalla, evitando que lleguen a
la biosfera las longitudes de onda del ultravioleta de menos de 190
nm, que son las ms energticas.
Los UV generados artificialmente son apantallados por material de
vidrio.
Los rayos csmicos tampoco llegan a la superficie terrestre.
Las principales fuentes artificiales de radiaciones (aparte de las
visibles) son:
mquinas de rayos X;
radioistopos (como el Co-60);
reactores nucleares;
aceleradores de partculas.

1.2. CLASES DE EFECTOS DE LAS RADIACIONES

El nmero de cuantos absorbidos por un sistema biolgico es
proporcional al producto de:duracin de la radiaci por

la intensidad de la radiacin y por el coeficiente de absorcin del

material.
Los efectos derivados de la absorcin de esa radiacin dependen de:
la energa de la radiacin absorbida;
la naturaleza del material.
Hagamos un tratamiento del tema en funcin de que la radiacin
provoque o no ionizaciones en el material, lo cual depende de la
energa de los cuantos:
1) Si la energa es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes:
son los rayos X y los rayos .
El fotn de gran energa incide sobre el tomo, provocando la
expulsin de un electrn de gran energa (fotoelectrn), y quedando
el tomo en forma ionizada (cargado positivamente). El electrn
expulsado suele tener energa suficiente para originar una nueva
ionizacin, de la cual surge otro electrn de alta energa, etc...
producindose unacadena de ionizaciones, con transferencia linear
de energa, hasta que sta se disipa en el material: el ltimo
electrn de la cadena es captado por otro tomo o molcula, que
queda cargado negativamente. El resultado final es que se forman
pares de iones(uno positivo y otro negativo).
A su vez, esos iones originados tienden a experimentar
reorganizaciones electrnicas ulteriores, que dan pie a cambios
qumicos en el sistema que se haba sometido a la irradiacin.
2) Si la energa es E<10 eV, no se producen ionizaciones: los
electrones del tomo o molcula pasan transitoriamente (de 10 -8 a 1010
segundos) a un nivel energtico superior (entonces se habla de que
el tomo o molcula estn excitados), pero enseguida dicho electrn
vuelve al estado energtico inicial.
En su regreso a su nivel energtico previo, el electrn puede dar
origen a una variedad de fenmenos:
fluorescencia: emisin de energa a una longitud de onda
mayor que la del fotn incidente;
fotosensibilizacin: la energa se transfiere a otra molcula;

 reacciones fotoqumicas: se origina un cambio qumico;

emisin de calor: la energa simplemente se disipa en
colisiones entre molculas.
La luz visible y UV pueden dar origen a reacciones fotoqumicas,
aparte de calor. Pero la radiacin infrarroja slo conduce a disipacin
de calor, si bien ciertas bacterias fotosintticas anoxignicas pueden
aprovechar el infrarrojo para la fotosntesis.

1.3. EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS

APLICACIONES
Los efectos de las radiaciones ionizantes dependen de la dosis de
exposicin, o sea, de la cantidad de radiacin a que se somete un
material. Se suele medir en unidades Roentgen (R):
1 R = energa de absorcin de 83 ergg-1 de aire.
Por otro lado, la dosis de absorcin es la fraccin de la dosis de
exposicin que realmente se absorbe por el sistema biolgico (es
decir, es la dosis biolgicamente efectiva). Se suele medir en rads:
1 rad = energa de absorcin de 100 ergg-1 de aire.
En la prctica, la unidad que se emplea en Biologa es el megarad
(Mrad), equivalente a un milln de rads, y que es el rango de la dosis
requerida para esterilizaciones. Tambin se emplea el Gray (1Gy
equivale a 100 rads).
En general, los microorganismos son ms resistentes a las radiaciones
ionizantes que los seres superiores. Por ejemplo, la dosis de
reduccin decimal (D10) para las endosporas de ciertas especies
de Clostridium es de 2000-3000 Gy. Las clulas vegetativas de la
bacteriaDeinococcus radiodurans (observe el nombre especfico) es
de 2.200 Gy. Otras especies ms "normales" poseen una dosis de
reduccin decimal en torno a 200-600 Gy. Compare estos datos con el
valor de slo 10 Gy como dosis letal para humanos.
Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos X, los
rayos y los radioistopos, como el Co60 o el Cs137.

Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos

como indirectos, as como mutagnicos. Los efectos letales directos
se logran a altas dosis de radiacin, mientras que los letales
indirectos y mutagnicos se consiguen a menores dosis.
1. Efecto letal directo: por impacto de cuantos de radiacin
ionizante sobre alguna molcula esencial para la vida. Los
estudios cuantitativos demuestran que debe de existir una
molcula vital nica que, al ser alterada, provoca la muerte
(teora del golpe nico). Esta molcula debe ser el ADN (ya que
obviamente es absolutamente esencial y suministra una sola
copia de la mayora de los genes bacterianos), y no las
protenas, de las que existen muchas copias en la clula, y que
podran regenerarse. Los daos al ADN son, principalmente:
roturas en ambas cadenas, y entrecruzamiento entre dichas
cadenas, que no puedan repararse.
2. Efecto mutagnico: deriva de la produccin de daos menores
al ADN que pueden repararse por mecanismos propensos a
error (vase apartado 1.4).
3. Efecto letal indirecto: este tipo de efecto es el ms
importante, y deriva de laradiolisis del agua que provoca la
aparicin de radicales hidroxilo (OH-) e hidrgeno naciente
(H+). El hidrgeno naciente o radical H libre es un potente
reductor, y el radical hidroxilo es un potente oxidante. El
radical hidroxilo reacciona fcilmente con macromolculas,
sobre todo con ADN, provocando roturas en ambas cadenas, lo
cual se traduce en efectos de letalidad. Si, adems, la bacteria
est expuesta al oxgeno mientras se la est irradiando, el
efecto es an ms intenso, debido a que el O2 reacciona con los
radicales libres, originando cadenas de reacciones
deautooxidacin, muy destructivas, y promoviendo
la formacin de perxidos y epxidos, asimismo letales:
H + O2 ------> HO2
2 HO2 ------> H2O2 + O2

Las principales aplicaciones de las radiaciones ionizantes son la

esterilizacin de:
material farmacutico;

 material mdico-quirrgico (guantes de cirujano, suturas de

nylon, jeringas desechables, agujas, bistures, catteres,
prtesis, etc);
alimentos envasados (aunque en algunos pases an sigue
abierta la polmica po r parte de ciertos grupos sobre la
seguridad de este tratamiento).
La dosis de esterilizacin por radiacin se suele establecer en 12
veces la dosis de reduccin decimal (12 D10) requerida frente a las
endosporas de Clostridium botulinum. Debido al gran poder
penetrante de las radiaciones hay que mantener unas normas y
controles de seguridad muy estrictos en su manipulacin: planchas
protectoras de plomo y revisiones peridicas de los manipuladores.

1.4 EFECTOS DE LAS RADIACIONES ULTRAVIOLETA

La radiacin UV tiene un efecto letal y mutagnico, que depende de
su longitud de onda. Ello se debe a la absorcin selectiva de
longitudes de onda por parte de ciertas molculas biolgicas:
Las protenas tienen dos picos (es decir, mximos) de absorcin:
uno a 280 nm, debido a los aminocidos aromticos (Trp, Tyr,
Phe), y otro a 230 nm, debido a los enlaces peptdicos.
El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble
entre las posiciones 4 y 5 de las bases pricas y pirimidnicas.
Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios
qumicos en las molculas absorbentes, de modo que aparecen
molculas alteradas denominadas genricamente fotoproductos. Los
fotoproductos originan la inactivacin de macromolculas, aunque,
como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos para paliar
o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas.
Las consecuencias de inactivar protenas o ARN no se dejan sentir a
efectos de letalidad, ya que existen muchas copias de cada uno de
estos tipos de macromolculas, y se pueden volver a sintetizar.
En cambio, la inactivacin del nico cromosoma de la bacteria tiene
efectos letales primarios y efectos mutagnicos secundarios. Por lo

tanto, el espectro de accin biolgica de la luz UV equivale al de

absorcin del UV por el ADN (260 nm).

1.4.1. FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ UV

Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan
principalmente de alteraciones en las bases pirimidnicas (citosina,
timina):
a. dmeros de pirimidina (anillo ciclobutano)
b. fotoproducto de la endospora (5-timinil-5,6-dihidrotimina)
c. hidratos de pirimidina
Los dmeros de pirimidina son los fotoproductos ms importantes en
las clulas vegetativas bacterianas. El principal es el dmero de
timina (T-T), aunque tambin se producen T-C y C-C. Se trata de
aductos (uniones) entre dos pirimidinas adyacentes en la misma
hebra de ADN, mediante la creacin de un anillo de ciclobutano. Su
efecto principal es la distorsin local de la configuracin de la doble
hlice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases
complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los
procesos de replicacin y transcripcin, y secundariamente en el
crecimiento y la respiracin.
A dosis muy altas de rayos UV se forman tambin dmeros entre
pirimidinas de las dos cadenas, es decir, se provocan
entrecruzamientos de las dos hebras que igualmente afectan a la
replicacin y a la transcripcin, aunque este tipo de daos reviste
menos significacin biolgica.
El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. Como
vimos en el captulo 12, se forma en la endospora bacteriana debido
al alto grado de deshidratacin, pudiendo ejercer igualmente efectos
inactivantes.
Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se
forman a altas dosis de luz UV. Tienen efecto mutagnico (no letal),
favoreciendo la aparicin de transiciones T=A a C=G.

1.4.2. MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS

Debido al carcter esencial del ADN como molcula central
informativa de los seres vivos, la evolucin ha desarrollado una serie
de mecanismos capacitados para enfrentarse con los posibles daos
ocasionados por la luz ultravioleta. Los principales mecanismos
hallados en bacterias se pueden agrupar as:
1. Mecanismos prerreplicativos:
a. reparacin fotoenzimtica o fotorreactivacin, que
permite la reparacin directa del dao en s
b. reparacin por escisin y resntesis
2. Mecanismos posreplicativos:
a. reparacin por recombinacin
b. reparacin inducible de emergencia (SOS)

A) Reparacin fotoenzimtica
Se debe a la actuacin de una enzima denominada fotoliasa o
enzima fotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de
manera constitutiva. Las fotoliasas reparandirectamente los dmeros
de pirimidina, en una reaccin que requiere luz visible de 300-500
nm de longitud de onda (luz azul). Estas enzimas poseen dos grupos
prostticos coloreados (cromforos):
flavina reducida (FADH2)
una pterina.
Mecanismo
1. La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La
fotoliasa reconoce el dmero de pirimidina, y se une a l,
formando un complejo enzima-sustrato [E-S].
2. La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de
luz ( =300-500), se excita, y dona electrones al anillo de

ciclobutano del dmero de pirimidina, rompindolo, y

regenerando las dos pirimidinas sin alterar.
Aunque se sabe que el segundo cromforo (la pterina) favorece la
reparacin, no est claro cul es su papel exacto.
No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en
cambio la fotorreparacin est muy extendida entre eucariotas.

B) Reparacin por escisin-resntesis

La distorsin en la doble hlice provocada por el dmero es
reconocida por un complejo proteico con actividad de endonucleasa
correctora, conocido como correndonucleasa o escinucleasa. El
dao se repara indirectamente (es decir, no se acta sobre el propio
fotoproducto), sino que las bases daadas se eliminan (se escinden)
formando parte de un oligonucletido, y el hueco resultante se
rellena por resntesis reparadora de ADN.
Mecanismo:
1. Un complejo formado por dos subunidades de la protena UvrA
y una de la UvrB (Uvr[A2B]) se une cerca del dmero de
pirimidina, usando la energa de la hidrlisis del ATP, y merced
a su actividad helicasa, desenrolla localmente la doble hlice.
2. Se une la protena UvrC, con lo que se completa el
complejo Uvr[A2BC], es decir, la correndonucleasa, unido a la
cadena daada del ADN, cerca del dmero.
3. La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada
por el dmero: corta el 8 enlace fosfodister "a la izquierda"
del dmero (o sea, hacia el lado 5') respecto de la localizacin
del dmero y corta el 4 o 5 enlace fosfodister "a la derecha"
(en direccin 3' del dmero). Por lo tanto, se produce y libera
un fragmento de unos 12 nucletidos de longitud, que incluye
al dmero de pirimidina, al mismo tiempo que se retira la
escinucleasa, que se separa en sus polipptidos constituyentes.
4. Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este
hueco es ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADNhelicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la sntesis
de nuevo ADN para rellenar el hueco (por supuesto, en sentido

5'--->3'), tomando como molde la cadena intacta, y usando

como cebador ("primer") el extremo 3'-OH que se haba
generado en la fase anterior.
5. Finalmente, la actuacin de la ADN-ligasa sella la cadena
(regeneracin del enlace fosfodister del lado 5').

C) Reparacin por recombinacin

Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que
normalmente replica el cromosoma) se encuentra, en la cadena que
est usando como molde, con un dmero de pirimidina, deja de
replicar esa zona, y "salta" unos 1000 nucletidos ms adelante para
seguir la replicacin. Por lo tanto, deja un gran hueco o mella de
unos 1000 nucletidos. Esta discontinuidad (llamada mella postreplicativa) se puede rellenar por el mecanismo de reparacin por
recombinacin general, recurriendo a la protena RecA, que verifica
una recombinacin con la hebra parental homloga intacta (veremos
ms detalles de esta recombinacin en el captulo 24).
Mecanismo:
1. Numerosas unidades de protena RecA recubren la zona de
cadena sencilla de la mella posreplicativa, formando
estructuras helicoidales.
2. La protena RecA promueve emparejamiento homlogo de la
cadena sencilla a la que recubre con la doble cadena "hermana"
intacta.
3. Se produce un intercambio recproco de cadenas.
4. El extremo 3'-OH libre de la cadena daada (que merced al
intercambio recproco est ahora emparejada con la cadena
complementaria procedente de la doble hlice "hermana") sirve
de cebador a la ADN-polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo
usando como molde la cadena complementaria intacta del
dplex.
5. Ligacin e isomerizacin espontneas, que produce la llamada
"estructura de Holliday", una figura en "X" donde hay dos
sobrecruzamientos ("crossing-over") que mantienen unidos
entre s a los dos duplex.

6. Resolucin de los dos sobrecruzamientos por sendas roturas y

religaciones, lo cual genera dos dobles hlices ininterrumpidas.
Como se ve en la figura, uno de estos dplex lleva el dmero de
pirimidina, y el otro es una doble cadena intacta, aunque parte
de ella contien ADN de nueva sntesis.
Como se puede ver, el mecanismo de reparacin por recombinacin
no repara por s mismo la lesin en el ADN, pero logra reparar la
mella postreplicativa, evitando que se detenga la replicacin del
cromosoma. Al final del proceso el dmero como tal sigue sin reparar,
pero ahora tendr una oportunidad de ser reparado por algn otro
mecanismo, como el de escisin-resntesis.

D) Reparacin de emergencia (SOS) propensa a error

Cuando la bacteria se somete a dosis elevadas de luz UV o a
determinados agentes qumicos que daan severamente el ADN, o
que interfieren seriamente con la replicacin, puede ocurrir que los
sistemas de reparacin que hemos visto hasta ahora no sean
suficientes para reparar todos los daos; en estas circunstancias se
pone en marcha un nuevo mecanismo, que es inducible y que
calificamos como de emergencia, ya que tiende a salvaguardar la
viabilidad de la clula, a costa de acumular mutaciones con
frecuencia elevada (y por eso lo llamamos tambin propenso a
error).
El sistema SOS en realidad consiste en una serie de
funciones "de emergencia" ante estrs, una de las cuales
es este tipo de reparacin de ADN propenso a error. Otras
funciones del sistema SOS son:

o Induccin de varios profagos (lo veremos en la seccin de

Virologa, al tratar el fago l).

o Retraso en la formacin del tabique transversal, por lo

que las clulas se alargan anormalmente. (El significado
adaptativo de esta respuesta de inhibicin de la
septacin parece ser el impedir la segregacin de ADN sin

reparar a la clula hija, lo que podra ocasionarle la

muerte).

o Desconexin de la respiracin.

o Incremento de la degradacin de protenas.

Descripcin del sistema en una clula normal (no sometida a daos
al ADN):
El gen lexA posee un nivel basal de expresin, de modo que codifica
la protena LexA, que acta como represor sobre su propio gen
(represin autgena), as como sobre los genes recA, uvrA, B, C,
umuDC. La represin no es total, sino que se da un nivel basal de
produccin de los polipptidos correspondientes a estos genes. As,
por ejemplo, el nivel de protena RecA es suficiente para efectuar los
procesos normales de recombinacin, y los niveles de UvrABC son
suficientes para reparar pequeos daos en el ADN.
Descripcin del sistema en una clula severamente daada:
Una clula seriamente afectada por un agente que daa el ADN o
interfiere con su replicacin poseer zonas de cromosoma con ADN de
cadena sencilla (c.s.) sin reparar. Pues bien, este ADN de c.s.
constituye una seal de situacin de emergencia para la protena
RecA: dicha protena se une a esas regiones de c.s., de modo que
adquiere una actividad proteasa muy especfica (para distinguir esta
actividad, usamos la nomenclatura RecA*). La protena RecA*
(activada como proteasa) induce la proteolisis del represor LexA
(rompindolo entre dos aminocidos concretos hacia la mitad de la
molcula). Por lo tanto, ya no hay suficiente protena LexA intacta
como para seguir reprimiendo a los genes citados (recA, uvrABC,
umuDC). Dichos genes (llamados genricamente genes SOS) se
pueden expresar ahora a altos niveles, de modo que:
Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de
la eficiencia de la reparacin por recombinacin;
Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr[A 2BC]), lo que
supone mejorar la reparacin por escisin-resntesis;

 Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento

de la mutagnesis. Pero )por qu aumenta la mutagnesis? El
mecanismo exacto no est claro. Se sabe que en esta situacin
de emergencia algunos dmeros de pirimidina son procesados
con la intervencin de los productos de recA y
de umuD y umuC, de modo que hay una sntesis de emergencia
de ADN que acarrea la frecuente introduccin de bases
incorrectas (es decir, es un proceso de reparacin propenso a
error).
Hay dos hiptesis principales sobre este respecto:
1. Los genes umuD,C codificaran una nueva polimerasa de
emergencia con menor fiabilidad de copia que las polimerasas
habituales;
2. O bien, los productos de umuDC modificaran alguna polimerasa
normal (como la ADN-pol-III) de manera que sta "relajara" su
capacidad correctora de pruebas (exonucleasa 3' 5'), de
modo que ante ausencia de molde, o ante un molde afectado
por el dao colocara nucletidos "al azar", lo que sera la base
de las frecuentes mutaciones.
Hay pruebas que favorecen a esta segunda hiptesis.

De esta manera, la clula salvara su integridad en esta situacin

"lmite", pero a costa de adquirir frecuentes mutaciones.

1.4.3. APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV

La luz UV se puede producir artificialmente en lmparas de vapor de
mercurio de baja presin, que emiten el 90% de su radiacin a 254
nm. La unidad de energa de radiacin se mide en watts/(segcm 2).
Por ejemplo, una lmpara de 15 watios emite una energa
de 38m wattscm-2seg-1, a una muestra situada a 1 metro
de la lmpara.
La luz UV es efectiva sobre bacterias Gram-positivas y Gramnegativas. La dosis letal para clulas vegetativas suele estar entre
1800 y 6500 wattcm-2, pero las endosporas requieren 10 veces ms
dosis.

El uso prctico de la luz UV como agente esterilizante est limitado,

ya que tiene poco poder penetrante: no entra en objetos slidos, y
adems se ve apantallada por el cristal y penetra poco en los
lquidos. Su aplicacin concreta ms frecuente es en el control de
infecciones por va area: lmparas de desinfeccin en salas de
hospitales y de laboratorios de investigacin. En Microbiologa se
emplea la luz UV como agente mutagnico en bacterias (en muchos
estudios que requieran obtener mutantes correspondientes a
cualquier tipo de fenotipos, para conocer las correspondientes bases
genticas).

1.5. EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE

A diferencia de la UV, la luz visible es de baja energa, y adems, sus
cuantos no tienen efectos selectivos sobre el ADN, por lo que no sera
de esperar, en principio, que este tipo de radiacin tuviera efectos
negativos sobre las bacterias. Sin embargo, la luz visible puede
ejercer un efecto negativo indirecto, en el fenmeno
de sensibilizacin fotodinmica.
1.5.1. Sensibilizacin fotodinmica natural
La luz visible de fuerte intensidad (p. ej., exposicin a pleno sol) es
capaz de matar las bacterias, debido a que ciertas molculas de stas
(riboflavinas, porfirinas, citocromos) absorben la energa de los
cuantos y se excitan durante 10-6-10-8 seg, tras lo cual reemiten la
energa a otras molculas, originando fotooxidaciones en residuos
His y Trp de las protenas y en las bases de los cidos nucleicos.
Tambin se puede generar oxgeno singlete (1O2), que es un radical
muy reactivo, oxidante, que puede destruir la clula con rapidez.
As pues, en la prctica de laboratorio habitual, no es conveniente
exponer las bacterias en cultivo a la luz, sino que habrn de
cultivarse en oscuridad (salvo el cultivo de las bacterias fototrofas).
Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintticas, y las que se propagan
va area) poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las
protegen de estos efectos fotosensibilizadores. (Los carotenoides
captan la energa del oxgeno singlete y la reenvan al estado basal,
no excitado).
1.5.2. Sensibilizacin fotodinmica artificial:

Si a una suspensin de bacterias aadimos ciertos pigmentos

artificiales fluorescentes (colorantes), como el rosa de Bengala, el
azul de metileno, la eosina, etc, la energa del visible absorbida por
dichos pigmentos no la reemiten como fluorescencia, sino que
provoca cambios en protenas y cidos nucleicos. Esto conduce a
efectos de esterilizacin, sobre todo por desnaturalizacin de
protenas.

2. EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS

Las ondas sonoras audibles para los humanos poseen un rango de
frecuencias entre los 9 kilociclos y los 20 kilociclos/segundo. Por
encima de 20 Kc se sitan las ondas supersnicas (hasta los 200
Kc/seg) y las ultrasnicas (desde 200 hasta 2000 Kc/seg). Estos tipos
de ondas de frecuencias superiores a las audibles (sobre todo las
ultrasnicas) tienen el efecto de desintegrar las clulas.
El fundamento de esta accin es el siguiente: el paso del sonido a
travs de un lquido produce cambios de presin alternantes (por los
sucesivos frentes de ondas), que a grandes frecuencias originan
cavidades (burbujas de gases disueltos) de unos 10 m de dimetro
(fenmeno de cavitacin). Dichas cavidades van aumentando de
tamao y terminan colapsando violentamente, dando lugar
a enormes presiones locales (de hasta 1000 atmsferas o 10
Tm/cm2). Las consecuencias del colapso son:
la clula se desintegra;
si existe oxgeno en el lquido de suspensin, se forman
perxidos (como el H2O2);
despolimerizacin de macromolculas;
cortes en ambas hebras del ADN.
Las bacterias son variables en cuanto a su susceptibilidad a las
vibraciones sonoras. En general, son ms sensibles las Gram-negativas
y ms resistentes las Gram-positivas. Sin embargo, ante un
tratamiento por ultrasonidos siempre cabe la posibilidad de que

sobrevivan algunos individuos, por lo que este mtodo no tiene

utilidad para la esterilizacin.
El uso habitual de los supra- y ultrasonidos en laboratorio es para la
llamada "sonicacin" o disrupcin ultrasnica de clulas para
obtener extractos celulares, en investigaciones bioqumicas. El
tratamiento se realiza en un aparato llamado generador de
ultrasonidos o "sonicador", que opera en un rango de frecuencias
desde 9 hasta 100 Kc/seg.

3. EFECTO DE LA PRESION HIDROSTATICA

La mayor parte de las especies bacterianas de hbitats continentales
no pueden crecer (e incluso mueren) cuando son sometidas a altas
presiones (unos 600 Kg/cm2). Ello se debe a los siguientes efectos
adversos:
aumento de la viscosidad del citoplasma;
disminucin de la capacidad de las enzimas de unirse a sus
respectivos sustratos;
(posiblemente) interferencia en procesos de transporte a nivel
de membrana;
(posiblemente) interferencia en la biosntesis de protenas;
interferencia en la divisin celular: las bacterias se alargan, se
filamentan, pero sin produccin de tabique transversal
(crecimiento sin divisin celular).
Sin embargo, existen bacterias (sobre todo marinas) que toleran o
requieren altas presiones (barotolerantes y barfilas,
respectivamente):
Bacterias barotolerantes:
Crecen a la presin atmosfrica, pero aguantan hasta unas 500
atmsferas. Su hbitat son las aguas ocenicas, entre los 2000 y los
4000 metros de profundidad.

Bacterias barfilas:
Crecen ptimamente a ms de 400 atmsferas. Podemos distinguir
entre barfilas moderadas (facultativas) y barfilas extremas
(obligadas):
Las barfilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a
presin atmosfrica, aunque su ptimo est a unas 400 atmsferas.
Habitan profundidades entre los 5000 y 7000 metros.
Las barfilas extremas presentan ptimos de crecimiento a muy altas
presiones (por encima de 600-700 atmsferas), y son incapaces de
crecer a presin atmosfrica. Se han llegado a aislar a ms de 10000
metros de profundidad. Debido a que a esas profundidades la
temperatura del agua es de slo 2-3oC, suelen ser simultneamente
crifilas. Este tipo de bacterias est empezando a ser investigado
actualmente, y su manejo es engorroso, ya que hay que cultivarlas en
cmaras especiales presurizadas que suministran las altas presiones
que requieren.
Aplicacin prctica de las altas presiones a bacterias barosensibles:
La llamada prensa de French (que frecuentemente se denomina
incorrectamente como prensa francesa) es un aparato de laboratorio
que permite aplicar grandes presiones y brusca descompresiones, lo
que logra la rotura mecnica de las bacterias, con objeto (al igual
que la sonicacin) de obtener extractos libres de clulas.

4..EFECTOS DE LA PRESIN OSMTICA

(Repasar en el captulo 16, el concepto de potencial de agua o
actividad de agua, aw)
Exceptuando los micoplasmas, que carecen de pared celular, las
bacterias pueden vivir en medios tanto hipotnicos como
hipertnicos, debido a la proteccin de una pared celular rgida y a la
membrana citoplsmica semipermeable.
Normalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridad
ligeramente superior a la del entorno, lo que garantiza el paso de
agua al interior. La presin de turgor es relativamente constante

porque la membrana citoplsmica se topa con la rigidez de la pared

celular. Esta presin de turgor permite que la bacteria aguante
cambios bruscos de concentracin de solutos en su entorno (dentro
de ciertos lmites). Pero esto plantea una pregunta (que intentaremos
responder a continuacin): cmo logra la bacteria ajustar su
osmolaridad interna a esos cambios exteriores?
A) En medios hipotnicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared
celular la que ejerce todo el papel: su rigidez se opone a la entrada
de agua, y por lo tanto, evita que la membrana citoplsmica tienda a
sufrir una presin de turgor excesiva.
Recordemos que las bacterias Gram-negativas poseen dos
compartimentos acuosos: el citoplasma y el periplasma. Como
se dijo oportunamente (captulo 5), en el periplasma existe un
oligosacrido especial, derivado de la membrana (el MDO,
consistente en 6-10 unidades de -D-glucosa unidas por enlaces
(1 2), y con residuos de fosforilcolina y fosfatidiletanolamina), que interviene en regular la osmolaridad. Sus
grupos negativos estn contrarrestados por contraiones
positivos, que igualmente colaboran en la regulacin osmtica.
En un medio con baja osmolaridad (p. ej., aguas fecales)
aumenta la concentracin del MDO, lo cual supone un aumento
de la osmolaridad del periplasma, que presiona contra el
peptidoglucano. De esta manera la presin de turgor del
protoplasto se transmite al periplasma y de l al
peptidoglucano, que es la estructura ms resistente.
B) En medios hipertnicos (cuando la aw del exterior es menor que la
del citoplasma). Las bacterias poseen mecanismos compensatorios
por los que tienden a aumentar la osmolaridad interior por encima de
la del medio (para garantizar la entrada de agua del ambiente y
mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando
la concentracin de un soluto muy soluble en agua en el interior
celular, soluto llamado genricamente soluto compatible, lo cual se
puede lograr por varios posibles mecanismos:
bombeando iones al interior;
sintetizando una molcula orgnica osmticamente activa;
bombeando sustancias osmoprotectoras.

1. En el caso de los iones, el in bombeado suele ser el potasio

(K+), por un sistema de antiporte K+/H+. Ahora bien, para que
no se desequilibre la fuerza inica, la entrada de K + suele ir en
paralelo con una salida de otros cationes, que suelen ser
poliaminas (como la putrescina). Se ha propuesto que existe un
sistema de antiporte K+/putrescina que en ciertas bacterias
tiende a mantener la fuerza inica mientras aumenta la
tonicidad interior, como sistema para compensar la alta
tonicidad del medio. La seal que desencadena el transporte
de iones potasio es directamente la presin de turgor de la
membrana y no la osmolaridad externa.
2. Como ejemplos de sntesis de solutos orgnicos compatibles y
osmticamente activos tenemos el glutamato, la glutamina y la
trehalosa.
Muchas bacterias Gram-negativas
sintetizan glutamato ante grandes concentraciones
extracelulares de iones Na+. El mecanismo es el siguiente:
al aadir grandes cantidades de Na+, se produce un eflujo
(salida) de H+ al exterior de la clula, lo que supone la
alcalinizacin del citoplasma. En estas condiciones se
activa la enzima glutamato-deshidrogenasa (GDH), que
sintetiza grandes cantidades de glutamato, que funciona
como soluto compatible que equilibra la osmolaridad del
medio.
En ciertas enterobacterias lo que ocurre es una inhibicin
del uso metablico del glutamato, por lo que este se
acumula.
Igualmente se da una acumulacin de trehalosa por
induccin de una ruta biosinttica e inhibicin de la ruta
catablica.
La ectona es un derivado cclico de la prolina,
sintetizado como soluto compatible por ciertas
anoxifotobacterias purpreas.
Ahora bien, si el medio es muy hipertnico, estos mecanismos
ya son incapaces de evitar la salida de agua desde el citosol, lo
cual conlleva una retraccin de la membrana citoplsmica. La
prdida de agua puede suponer la deshidratacin del
citoplasma, lo que conlleva la detencin del crecimiento.

 En Gram-positivas se produce una plasmolisis

autntica (retraccin de la membrana citoplsmica respecto de
la pared rgida suprayacente)
En Gram-negativas no existe autntica plasmolisis, ya que la
pared celular y la membrana citoplsmica se retraen al mismo
tiempo. Las bacteria entricas crecen lentamente por encima
de 0.65M de NaCl.
3. Sin embargo, las bacterias pueden crecer a osmolaridades
superiores a la mxima terica, si en el medio existen
determinados compuestos llamados osmoprotectores. La
bacteria bombea esos compuestos a su interior, usndolos como
solutos compatibles.
Ejemplos de osmoprotectores:
Prolina (p. ej., en Salmonella typhimurium y Staphilococcus
aureus)
Betana (glicnbetana), un derivado trimetilado de la glicocola
(en cianobacterias y en algunas Gram-positivas).
Colina (en Escherichia coli).
Ectona en enterobacterias.
Por ejemplo, S. typhimurium crece muy lentamente en
1M de ClNa, pero mejora si al medio se aade 1mM de
prolina. Un mtodo normal de aislarS.aureus es
comprobar el crecimiento en medio con 7.5% de ClNa en
presencia de prolina.
Algunas bacterias han desarrollado evolutivamente sistemas
inducibles de transporte de estas sustancias, muy eficaces para
garantizar su utilizacin como solutos compatibles. Es el caso
de la colina en E. coli, que una vez introducida se metaboliza
hasta el autntico soluto compatible, la glicnbetana.
Algunas bacterias patgenas, al destruir tejidos de su
hospedador, provocan la liberacin de sustancias, algunas de las
cuales les sirven como osmoprotectores ante la alta
osmolaridad de los fluidos corporales.

Otro mecanismo de control ante variaciones de presin osmtica

presente en algunas bacterias Gram-negativas, es la variacin en la
proporcin de porinas de membrana externa (repasar cap. 5,
apartado 2.7.1).
Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios
hipertnicos, y en general se llaman osmfilos. Entre los osmfilos
podemos distinguir los sacarfilos y los halfilos.
Uno de los ejemplos de microorganismos sacarfilos no es una
bacteria, sino las levaduras, que viven en jugos vegetales, nctares,
zumos, etc. Utilizan como solutos compatibles polioles como el
sorbitol, el ribitol, etc.
Entre los organismos halfilos, podemos distinguir los halfilos
moderados y los halfilos extremos o hiperhalfilos.
Halfilos moderados: suelen ser bacterias marinas que viven en 3.5%
de NaCl, y que ven inhibido su crecimiento a concentraciones
mayores o menores de sales. Los halfilos moderados tienen
requerimientos concretos de una aw equivalente a la de agua de mar,
as como concentraciones determinadas de iones Na +. El papel jugado
por este Na+ es:
mantenimiento de los sistemas de membrana citoplsmica y
transporte;
estabilizacin de la pared celular;
requerimiento por parte de muchas enzimas.
Halfilos extremos (hiperhalfilos), representados
paradigmticamente por las arqueas de la
familia Halobacteriaceae (halobacterias), que viven en (y de
hecho requieren) concentraciones saturantes de sales (salitrales,
lagunas salinas). Usan como soluto compatible el K +, concentrndolo
a partir del medio donde viven, hasta que el citoplasma queda
prcticamente saturado con l (4 a 7 M). Esta gran concentracin de
potasio es esencial para mantener la estabilidad y actividad de sus
ribosomas, enzimas y sistemas de transporte. Pero las estructuras
superficiales de estas arqueas requieren altas concentraciones de
cloruro sdico.
Dejando aparte las bacterias halfilas, hay algunas bacterias
halotolerantes (como por ejemplo, S. aureus), pero la inmensa

mayora de los procariotas viven a valores de actividad de agua de

0.98. Por ello, un mtodo que ya se conoca empricamente en la
antigedad para conservar ciertos alimentos era el desecarlos o
salarlos, o aadirles grandes cantidades de azcar (como en las
mermeladas).

5. EFECTO DEL pH
La mayora de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de
pH de su medio, manteniendo al mismo tiempo su pH interno ptimo
prcticamente constante.
Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH
6 y pH 8, pero su pH interno es siempre 7.6 o muy
cercano a ese valor.
Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias,
stas se pueden clasificar en:
Neutrfilas, si crecen de modo ptimo en torno a la neutralidad
(entre pH 5.5 y 8.
Acidfilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5.
Alcalfilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5.
La mayor parte de las bacterias son neutrfilas. Muchas bacterias
neutrfilas modifican el pH del medio, y resisten entornos
relativamente cidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias
fermentativas excretan cidos, mientras otras alcalinizan el medio,
p. ej., produciendo amonio a partir de desaminacin de aminocidos.
Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen ms o
menos amplio de pH (alrededor de un ptimo), los cambios bruscos
pueden ser lesivos (afectando a la membrana y al transporte de
solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplsmico cae
rpidamente hasta 5 o menos, la bacteria puede morir.
Uno de los mecanismos que, al menos en neutrfilos parece controlar
el pH interior es un sistema de antiporte H+/K+: a pH cidos, el

interior celular puede quedar en principio ms alcalino que el

exterior. Este sistema introduce protones en el interior y saca iones
potasio. De esta manera neutralizan el pH interior y siguen teniendo
un potencial de membrana para establecer una fuerza protn motriz
que les suministre energa.
Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S.
typhimurium inducen una respuesta de tolerancia a cidos,
consistente en ATPasas translocadoras de protones (expulsan protones
al exterior) y chaperonas (protenas celadoras) para corregir las
protenas desnaturalizadas.
Existen algunos notables procariotas cuyo pH ptimo es muy bajo
(acidfilos extremos u obligados): Algunas eubacterias del
gnero Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans)y las arqueas del
gnero Sulfolobus tienen su ptimo a pH 2, y generan ellas mismas
estos bajos pH al oxidar sulfuros hasta cido sulfrico. (Sulfolobus es
un notable ejemplo de procariota extremfilo: su hbitat son fuentes
termales cidas y solfataras: es un termoacidfilo). De hecho, estas
bacterias necesitan esas altas concentraciones de H +para mantener la
integridad de sus membranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas
se desintegran.
Las especies alcalfilas obligadas tienen ptimos de pH en torno a
10-11. Por ejemplo,Bacillus alcalophilus , cuyo pH interno es de 9.
Sus hbitats tpicos son suelos carbonatados y lagunas alcalinas
(algunos son tambin halfilos, como Natronobacterim gregoryi).