Bioqumica Clnica 2015

Trabajo Prctico N 1: Verificacin de calibracin de

micropipetas.
A) Objetivo:
En esta actividad el estudiante deber verificar el estado de calibracin de
las micropipetas que usar en los trabajos prcticos posteriores mediante el
mtodo gravimtrico. Deber determinar la exactitud y la precisin en la
dispensacin de volmenes de lquidos con dos modelos de micropipetas:
P200 y P1000. En un informe tcnico deber documentar los resultados
obtenidos y evaluar el error
sistemtico y aleatorio durante el uso de estos instrumentos y el efecto
de ellos sobre la confiabilidad de los resultados en pruebas de laboratorio
clnico.
B) Informacin Tcnica:
Las micropipetas o pipetas de precisin son instrumentos que permiten la
transferencia de pequeos volmenes de lquidos.
Existen de diferentes tipos (manuales y automticas) y que usan diferente
tecnologa (desplazamiento de aire o desplazamiento positivo) de volumen
fijo o volumen ajustable, de un canal o multicanal.
La informacin que se presenta a continuacin ha sido extrada del
documento Gilson Guide to Pipetting: Second Edition.
Pipetman: air-displacement pipette
displacement pipette

Microman: positive-

Tenga en cuenta las propiedades fsicas de la muestra

Muestras acuosas: operados y mantenidos correctamente, pipetas
Pipetman darn resultados precisos con la mayora de los lquidos que se
encuentran comnmente en el laboratorio. Si usted tiene un gran nmero
de fracciones para dispensar, utilice una pipeta repetitiva Distriman .
Muestras viscosas: Puede que le resulte ms fcil utilizar una pipeta
Gilson Microman. Microman da resultados reproducibles con muestras
altamente viscosas como el glicerol, el detergente y la miel. Microman
tambin se recomienda para alta volatilidad (cloroformo) o lquidos densos
(mercurio) que a menudo son difciles de aspirar.
Radiactivas y corrosivos muestras: pipetas Microman estn
especialmente diseados para manejar lquidos agresivos y sin peligro para
el usuario o daos al instrumento.
ADN, ARN, las muestras biolgicas: La eleccin es suya. Puede utilizar
un Pipetman con Diamond puntas con filtro autoclave (0,1 l - 1 ml) o un

Microman autoclavable (Modelo M10 y M100) con capilares y pistones

esterilizados. Si se usa adecuadamente, estos instrumentos asegurarn,
resultados precisos libres de contaminacin.
Para la dispensacin mltiple, optar por una pipeta repetitiva Distriman con
una jeringa esterilizada micro-gamma DistriTip .
cules son las pipetas por desplazamiento de aire?
1. Recomendado para muestras acuosas y para el trabajo general de
laboratorio.
2. Siempre tienen un cojn de aire (volumen muerto) entre el pistn de la
pipeta y la muestra de lquido.
3. El pistn es una parte permanente de la pipeta.
cules son las pipetas de desplazamiento positivo?
1. Recomendado para muestras problema (viscoso, denso, voltil,
radiactivo, corrosivo)
2. El contacto directo del pistn con la muestra (sin cojn de aire).
3. pistn desechable (no es una parte permanente de la pipeta)
IMPORTANTE:
Pistn perfecta: Cuando se establece el volumen en una pipeta por
desplazamiento de aire, el pistn regula el volumen del colchn de aire, lo
que, a su vez, determina el volumen de lquido que ha de ser aspirado. El
pistn tiene que ser perfecto si el volumen de muestra es para que se
corresponda exactamente con el volumen seleccionado. Desde el pistn es
una parte permanente de pipetas Pipetman, un pistn perfecto significa
medicin perfecto todas las veces.
Cmo funcionan las pipetas por desplazamiento de aire?
Cuando se presiona el pulsador situado en una pipeta por desplazamiento
de aire, el pistn en el interior del instrumento se mueve hacia abajo para
que el aire quede fuera. El aire es desplazado por el pistn. El volumen de
aire desplazado es equivalente al volumen de lquido aspirado.
1. Ajuste el volumen
El volumen requerido se establece. El pistn se mueve a la posicin
apropiada.
2. Preprese para la aspiracin
Se presiona el pulsador antes de la aspiracin de la muestra. El pistn
desciende y expulsa un volumen de aire igual al volumen de lquido que
seleccionada
3. Aspirar la muestra
Al soltar el pulsador, se crea un vaco parcial dentro de la punta. La presin
atmosfrica ambiente obliga al volumen deseado de lquido a travs del
orificio en la punta.
4. Vierta la muestra
Se vuelve a pulsar el pulsador. Aumenta la presin de aire dentro del eje y la
punta. El aire comprimido empuja el lquido fuera de la punta.
Cmo funcionan las pipetas de desplazamiento positivo?
Pipetas de desplazamiento positivo funcionan como una jeringa. No hay
cojn de aire entre el pistn desechable y la muestra. Sin colchn de aire
elstica para expandirse o contraerse, la fuerza de aspiracin se mantiene
constante, no afectado por las propiedades fsicas de la muestra.
Esto permite al operador Microman para pipetear muestras de densidad
muy viscosos o altas, como el mercurio o pasta de dientes.

1. Coloque el volumen
El volumen requerido se establece. El pistn se mueve hacia abajo a la
posicin de inicio adecuada.
2. Preprese para la aspiracin
Se presiona el pulsador antes de la aspiracin de la muestra. El pistn
desciende hasta el extremo del capilar.
3. Aspirar la muestra
El orificio se sumerge por debajo de la superficie del lquido. Como se suelta
el pulsador, el pistn se mueve hacia arriba y la presin ambiente obliga al
volumen deseado de lquido a travs del orificio en el capilar.
4. Vierta la muestra
Se vuelve a pulsar el pulsador. El pistn se mueve hacia abajo y expulsa el
lquido fuera de los capilares.
Considere el volumen de lquido que desea transferir
Los ocho modelos de la Gilson Pipetman y Pipetman Ultra estn diseados
para transferir volmenes precisos de 0,1 l a 10 ml. Pipetman tambin est
disponible en volmenes fijos de 2 l de 1 ml.

* Con una P2 tcnica de pipeteado preciso y U2 puede ser utilizado para

volmenes de aspirado de hasta 0,1l, P10 y U10 en 0,5 l, y p200 en 30 l.
Ejemplos de ajustes de volumen para el Pipetman
El volumen se muestra como tres dgitos que se leen de arriba a abajo. La
figura de la izquierda muestra el mnimo (MIN) y mximo (MAX) ajustes de
volumen. Tambin se muestran ejemplos de configuraciones de volumen
intermedio (INT.). Los nmeros en rojo representan dcimas de microlitros (l)
en el P20 y mililitros (ml) en el P1000. Para la correspondencia correcta en
los otros modelos, consulte el manual de instrucciones.

Organice su puesto de trabajo

Se debe prestar especial atencin a suavizar pipeteo
Favorecer el tiempo uniforme y el movimiento, tiene todos los objetos
necesarios al alcance fcil de la mano
Coloque los objetos de uso ms frecuente en frente de usted. Los artculos
ms raramente utilizado se pueden colocar un poco ms lejos de ti
La apertura del receptor para las extremidades usadas deben estar a la
misma altura que el extremo de la pipeta.

Coloque una punta de pipeta desechable

Para montar una punta desechable en un Pipetman, mantenga la
micropipeta en una mano y usar un ligero movimiento de torsin para
asentar firmemente la punta en el eje de la micropipeta y asegurar un
sellado hermtico.
El montaje de una punta desechable en Pipetman

1.Presione hacia abajo con el movimiento de

rotacin
2.
un

Evite apualar la punta como si la pipeta fuera

cuchillo

Ajustar la configuracin de volumen

Para ajustar el volumen: Sujete el cuerpo
de la micropipeta en una mano y con la otra
mano para girar la rueda selectora - o el
pulsador. Con el pulsador, el volumen se puede
ajustar fcilmente con una mano. Pulsador de
ajuste de volumen est disponible en todas las
pipetas Microman y en pipetas Pipetman
fabricados despus de abril de 1995.

Un consejo til para mejorar la

reproducibilidad

Rueda de
la
ajuste
vuelta por
Pulsad
girar
posicin deseada.

Siempre finalizar la configuracin de las agujas

del reloj. De esta manera, si ocurre cualquier
juego mecnico, que ser siempre en la misma
posicin. As es como para obtener un ajuste
de volumen en sentido horario:
al disminuir el nivel de volumen, gire la
rueda lentamente hasta que aparezca el ajuste
deseado. No rebasar la posicin deseada,
cuando se aumenta el nivel de volumen, gire
rueda selectora aproximadamente 1/3 de
encima de la configuracin deseada, y luego
lentamente a bajar el volumen hasta legar a la

Un consejo til para mejorar la precisin

Para evitar errores de paralaje,

asegrese de que el indicador
de volumen y el volumen
marcado seleccionados estn en
su lnea de visin directa. A
corta distancia, puede que le
resulte til para cerrar un ojo.

Importante
Para evitar daos en el interior
de la pipeta, nunca intente
forzar el ajuste de volumen ms
all de los lmites indicados
en las tablas de la pgina 14.
Siga las instrucciones para el avance o retroceso modo de pipeteo
La eleccin del modo de funcionamiento puede afectar
significativamente a los resultados de un anlisis.
Pipetas Gilson se calibran para pipetear modo de avance. Los fabricantes
deben enumerar todos los modos pertinentes de operacin y especificar
para qu modo se calibra el instrumento.
El modo de avanzar es la forma habitual de pipeteo con una pipeta por
desplazamiento de aire como Pipetman.
El modo de avance para pipetas de desplazamiento positivo como Microman
elimina el trazo de purga.
El modo de inversin slo es posible con pipetas por desplazamiento de
aire. Se utiliza para disolventes o lquidos poco viscosos.

Modo de desplazamiento de aire

En general, la precisin del modo de avance se basa en el drenaje precisa
por la presin de aire (pipetas de desplazamiento de aire) o de limpieza
interna del cilindro de la pipeta (pipetas de desplazamiento positivo).
1. Preparacin
Mantenga el instrumento en una posicin casi vertical. Presionar el mbolo
suavemente la primera posicin de parada.
2. Aspiracin
Sumergir la punta de la pipeta en el lquido *. Permitir que el mbolo se
mueva hacia arriba suavemente a la posicin de reposo. Espere un segundo,
hasta que todo el lquido tiene tiempo para moverse hacia arriba en la
punta.
*La profundidad de inmersin de la punta puede tener un efecto
significativo en los resultados. Si la punta se sumerge demasiado
profundamente, las gotas se forman en el exterior de la punta y sern
depositados junto con su muestra. Si la punta no est sumergido
profundamente suficiente, vrtex ocurrir y la pipeta no aspirar el volumen
seleccionado.

3. Distribucin
Coloque la punta de la pipeta en un ngulo (10 a 45 ) contra la pared
interior del recipiente de recepcin. Presionar el mbolo suavemente a la
primera posicin de parada.
4. purga
Espere un segundo, luego presione el mbolo hasta la segunda posicin de
parada. Este golpe "soplar (hacia afuera)" elimina cualquier resto de la
muestra de la punta. Retire el extremo de la punta de la pipeta deslizndola
por la pared.
5.Home
Deje que el mbolo se mueva hasta la posicin de reposo.
(3-4-5)

Desplazamiento de aire / modo inverso

En pipeteado en modo inverso, la carrera de purga se utiliza durante la
preparacin. Durante la aspiracin, se aade una cantidad de lquido igual a
la cantidad de aire purgado. Esta cantidad compensa el lquido que queda
en una pelcula dentro de la punta durante la dispensacin.
1. Preparacin
Mantenga el instrumento en una posicin casi vertical. Presionar el mbolo
suavemente hasta la segunda posicin de parada.
2. Aspiracin
Sumerja la punta de la pipeta en el lquido*. Permitir que el mbolo se
mueva hacia arriba suavemente a la posicin de reposo. Esperar un
segundo, hasta que todo el lquido tenga tiempo para desplazarse hacia
arriba en la punta.
(1-2)

3. Distribucin
Coloque la punta de la pipeta en un ngulo (10 a 45 ) contra la pared
interior del recipiente de recepcin. Presionar el mbolo suavemente a la
primera posicin de parada. Espere un segundo.
4.Re-aspiracin
Si la punta de la pipeta es para ser reutilizada para la misma muestra,
mantener el mbolo en la posicin intermedia para la posterior inmersin
para el siguiente ciclo de pipeteado y reiniciar la operacin 2.
5. Completar purga
Espere un segundo y purgue. Si es que no se puede volver a utilizar la punta
de la pipeta, presione el mbolo a la posicin para purgar sobre un
contenedor de residuos adecuado y luego expulsar la punta.
(3-4-5)

Limpiando
Si es necesario (lquidos viscosos tales como crema), limpie el exterior de la
punta o del capilar con un pauelo mdico limpio. No toque el orificio. Elegir
un pauelo que sea resistente, que no suelte pelusa, e inerte a los cidos y
disolventes.
Desechar el pauelo de una manera segura e higinica.
Importante
Cuando se trabaja con muestras de alto riesgo, no limpie la parte
desechable. Asegrese de que la profundidad de penetracin de lquido no
supere los 3 mm. A continuacin, toque fuera de la pared lateral del
recipiente.
Pre-enjuague:
Una mayor uniformidad y precisin de dispensacin se obtienen
generalmente proporcionando superficies de contacto idnticas para todas

las alcuotas. Esto se consigue mediante un pre-lavado con el mismo lquido

que se est dispensando.
Para el pre-enjuague, aspirado con la punta y luego regresar de vuelta al
depsito original o a los residuos.
Cundo debo realizar pre-enjuague a la punta?
El pre-enjuague debe realizarse:
Cada vez que cambie la punta
cada vez que aumente el volumen puesto (ajustado)
Expulsar la punta utilizada y almacenar la pipeta en posicin
vertical:
Para evitar tocar puntas contaminados, mantenga la pipeta sobre la
papelera y pulse el pulsador expulsor de puntas.
Evaluar las funciones de pipeteado
Ir a travs de todo el rango de volumen con el botn de la perilla de ajuste.
- La rueda debe moverse suavemente.
- El ajuste mnimo y mximo debe corresponder al rango de volumen normal
de pipetas como se indica en el manual de instrucciones.
- Comprobar la alineacin y el movimiento del visualizador del volmetro.
Ajuste el volmetro al valor mximo y oprima el pulsador
lentamente.
El movimiento debe ser suave. "Tirones" en el movimiento o variaciones en
la friccin pueden deberse a un rasguo o corrosin en el pistn (mbolo), o
a una varilla de operacin doblada.
Escuche un ruido del resorte lo que indicara la posicin incorrecta del
resorte dentro de la Pipetman.
Coloque una punta de Gilson y presione el eyector de la punta para
verificar su correcto funcionamiento.
Prueba de fugas
Para pipetas Pipetman P1000 a
P10ml
- Seleccione el volumen mximo de
ajuste y llene la punta con agua.
- Estabilizar durante 20 segundos.
Si aparece una gota en el extremo de
la punta, hay una fuga.

Para pipetas Pipetman P2 a P200

- Seleccione el volumen mximo de
ajuste y llenar la punta.
- Estabilizar durante 20 segundos.
Si aparece una gota en el extremo de
la punta, hay una fuga. Si no aparece

una gota, se vuelva a sumergir la

punta en el lquido de ensayo.
- Mientras est sumergido, el nivel del
lquido en la punta debe permanecer
constante.
Si el nivel de la punta cae, hay una
fuga.
Tipos de contaminacin y cmo prevenirlos
Pipeta para tomar muestras
Puntas contaminadas o una pipeta contaminada, a su vez, puede
contaminar las muestras.
Prevencin
-Utilice Puntas esterilizados y limpia o autoclave las partes de su pipeta que
estn en contacto con la muestra (ver pginas 36-37).
-Cambiar la punta despus de cada muestra.
Muestra para pipeta
La contaminacin puede ocurrir si la muestra o aerosoles de la muestra se
les permite entrar en el cuerpo de la pipeta.
Prevencin
-Para Evitar el derramamiento de lquidos en el cuerpo de la pipeta, evite
inclinar la pipeta en exceso y siempre guarde el instrumento en posicin
vertical.
-Soltar el pulsador lentamente.
-Para Evitar la contaminacin de aerosoles, utilizar Pipetman con puntas con
filtro o elegir un pipeta microman de desplazamiento positivo con una
funcin en la barrera de aerosol.

Riesgo de contaminacin de aerosoles

No hay riesgo de contaminacin por aerosol
Una muestra a otra (tambin conocido como traslado de muestra)
Una porcin de la muestra A se puede adherir a la pared interior de la punta
despus de la entrega de la muestra. La parte sobrante de la muestra A se
puede mezclar con la siguiente muestra (B) y puede causar un resultado
falso de la prueba.
Prevencin
Cambie la punta despus de cada muestra.

C) Esquema de Trabajo
1: ubique una balanza analtica y las micropipetas a usar
2: registre los datos de identificacin de la balanza y de las micropipetas
3: registre la temperatura ambiente
4: acerque al lugar de trabajo un vaso precipitado con suficiente agua
destilada y papel absorbente
5: coloque un vaso plstico liviano en la balanza analtica
6: reconozca las puntas apropiadas para cada micropipeta
7: tare la balanza
8: con la micropipeta P200 mida un volumen de 100 microlitros de agua
destilada, transfiera este
volumen hacia el vaso que est en la balanza, pese y registre el peso
9: repita los puntos 7 y 8 hasta tener 10 datos registrados
10: repita el procedimiento con la P1000, con un volumen de 500
microlitros.
11: entregue una copia del informe preliminar antes de abandonar el
laboratorio
D) Informe
Prepare un informe tcnico redactado en lenguaje apropiado respetando las
siguientes
especificaciones:
Fecha de entrega: viernes 20 de marzo antes de las 20:00 hrs
Presentacin: papel tamao carta escrita por una sola plana.
Extensin mxima: 1 hoja.

Tipografa: arial 11 interlineado simple

Estructura y ponderacin: