Konferencja Nowe metody w neurobiologii 15 grudnia 2004

2126

Zwierzta transgeniczne w neurobiologii

Witold Konopka
Zakad Neurobiologii Molekularnej i Komrkowej, Instytut Biologii Dowiadczalnej im. M. Nenckiego PAN
ul.Pasteura 3, 02-093 Warszawa
Streszczenie
Zwierzta transgeniczne w cigu ostatnich 20 lat stay si wanym narzdziem badawczym w wielu naukach biologicznych
w tym take w neurobiologii. Istniej cztery gwne sposoby otrzymywania zwierzt transgenicznych: 1 - mikroinjekcja
DNA do zygoty, 2 - transfer DNA przy pomocy wirusw, 3 - modykacja pierwotnych komrek zarodkowych ES (ang.
Embryonic Stem Cells), 4 - transplantacja jder komrkowych. Pierwsze dwie metody wykorzystywane s do otrzymywania
zwierzt gwnie z nadekspresj okrelonych konstrukcji genetycznych. Natomiast technologia ES pozwala na wyczenie
wybranego genu tzw. knock-out. Jak dotd technik delecji genw mona byo zastosowa jedynie u myszy. Alternatywn
metod tworzenia zwierzt typu knock-out dla innych gatunkw jest technika transplantacji jder komrkowych.
Obecnie intensywnie rozwijane s metody indukowalnej/warunkowej ekspresji genw. Spowodowane jest to potrzeb uzyskania zwierzt, w ktrych ekspresja lub knock-out wybranego genu obecne s tylko w okrelonych komrkach ciaa
lub w czasie zalenym od badacza. Gwnymi systemami tego typu s: system Cre/lox umoliwiajcy knock-out genu
ograniczony tylko do pewnego typu komrek oraz system tetracyklinowy umoliwiajcy wczanie i wyczanie ekspresji
wprowadzanego genu w dowolnym czasie.

Wstp
Pierwsze prby otrzymania transgenicznych myszy
pojawily si ju w na pocztku lat 80-sitych XX wieku
(Gordon i Ruddle 1980, 1981, Costantini i Lacy 1981).
Zwierzta transgeniczne powstay w wyniku poczenia
dwch dziedzin naukowych: embriologii dowiadczalnej oraz biologii molekularnej. Embriologowie opanowali umiejtno hodowania zarodkw poza ustrojem
oraz rozwinli techniki manipulacji nimi. Natomiast
w wyniku postpw biologii molekularnej stao si
moliwe niemal dowolne konstruowanie fragmentw
DNA, wprowadzanych nastpnie do genomu zwierzt
transgenicznych.
Terminem zwierz transgeniczne okrela si takie
zwierz, ktre w swoim genomie posiada egzogenny
DNA w postaci:
losowo zintegrowanego fragmentu liniowego
DNA
zmodykowanego wasnego genu w wyniku
wprowadzenia egzogennego DNA (technologia knock
out oraz knock-in)
wprowadzonej caej sztucznej jednostki genetycznej np. sztucznego chromosomu bakteryjnego BAC
(ang. Bacterial Articial Chromosome) lub sztucznego
chromosomu drodowego YAC (ang. Yeast Articial
Chromosome)

Sposoby otrzymywania zwierzt

transgenicznych
Mona wyrni kilka podstawowych metod wykorzystywanych do transgenizacji zwierzt laboratoryjnych oraz hodowlanych:
mikroinjekcja DNA do zygoty
transfer DNA przy pomocy wirusw
modykacja pierwotnych komrek zarodkowych
ES (ang. Embryonic Stem Cells)
transplantacja jder komrkowych
Mikroinjekcja DNA do zygoty
Pierwsza z metod polega na mikroinjekcji DNA
(liniowego lub w postaci sztucznych chromosomw)
do jednego z przedjdrzy jednokomrkowego zarodka zygoty przy pomocy mikrochirurgicznej szklanej pipety. Przedjdrza posiadaj materia genetyczny
pochodzcy od ojca i matki tu przed poczeniem si
w jedno jdro komrkowe, ktre pokieruje rozwojem
zarodka w pniejszym okresie. Roztwr DNA wstrzykiwany jest do dowolnie wybranego przedjdrza,
a nastpnie nastrzyknite zygoty hodowane s in vitro
do stadium dwukomrkowego. Brak jest moliwoci
dokadnego kontrolowania objtoci wstrzykiwanego
roztworu DNA. Mikroinjekcj DNA przeywa okoo
50% zarodkw, ktre nastpnie przeszczepiane s do

22 W. Konopka

jajowodu samic matek zastpczych. Po okresie ciy trwajcej u gryzoni okoo 3 tygodni rodzi si okoo
30% przetransferowanych zarodkw, wrd ktrych
okoo 15% posiada w swoim genomie zintegrowany
transgen (Ryc. 1). W metodzie mikroinjekcji integracja
wstrzyknitego transgenu do genomu jest losowa i nie
ma moliwoci wyboru miejsca wbudowania. Ponadto
nie mona kontrolowa liczby kopii transgenu wbudowanych w genom, ktre czsto ukadaj si tandemowo.
Otrzymany osobnik transgeniczny moe posiada
transgen we wszystkich komrkach swojego ciaa lub
moe by chimer. Chimer nazywamy taki organizm,
ktrego komrki ciaa nie s identyczne pod wzgldem
genetycznym. W przypadku zwierzt transgenicznych
oznacza to, e niektre komrki posiadaj transgen, natomiast inne nie. Taka sytuacja moe si zdarzy, gdy
integracja transgenu do genomu nastpia po pierwszym podziale komrkowym i tylko w jednej z komrek potomnych zwanych blastomerami. W przypadku
gdy transgen nie znajduje si w komrkach pciowych
zaoycielskiego osobnika transgenicznego, wtedy nie
bdzie on przekazywany nastpnym pokoleniom, co

Ryc. 1. Transgenizacja przy pomocy mikroinjekcji DNA do przedjdrza zygoty.

uniemoliwi wyprowadzenie linii transgenicznej oraz

przeprowadzenie bada.
Gwn zalet metody mikroinjekcji DNA jest
brak ograniczenia rozmiaru wstrzykiwanego DNA.
Dokonuje si injekcji DNA pochodzcego z plazmidw (ok. 10 kpz), kosmidw (ok. 45 kpz) a take DNA
sztucznych chromosomw BAC, YAC (dugo fragmentu DNA siegajca milionw par zasad).
Transfer DNA przy pomocy wirusw
Kolejn metod wykorzystywan do otrzymywania
zwierzt transgenicznych jest infekcja przy pomocy
retrowirusw i lentiwirusw. Gwn przewag tej metody nad innymi jest jej wyjtkowo dua wydajno,
sigajca nawet 80% transgenicznego potomstwa.
Ponadto retrowirusy i lentiwirusy posiadaj zdolno integracji do genomu po wnikniciu do komrki.
W przypadku retrowirusw gwnym ograniczeniem
stao si wyciszanie ekspresji genw (obecnych w
sekwencji wbudowanego do genomu retrowirusa)
podczas rozwoju zarodka. Prawdopodobnie wady tej
pozbawione s lentiwirusy, stanowice jedn z klas
retrowirusw. Lentiwirusy s zdolne do infekcji dzielcych si oraz nie dzielcych si komrek. Z tego powodu znalazy szerokie zastosowanie jako wektory w
terapiach genowych. Do otrzymania zwierzt transgenicznych z zastosowaniem lentiwirusw wykorzystano
dwie metody: infekcje jednokomrkowych zarodkw
(Lois i wsp. 2002) oraz infekcje pierwotnych komrek
zarodkowych ES (Pfeifer i wsp. 2002).
Modykacja pierwotnych komrek
zarodkowych ES
Metoda otrzymywania zwierzt transgenicznych z
wykorzystaniem pierwotnych komrek zarodkowych
ES (ang. embryo stem cells) pozwala na precyzyjn modykacj badanego genu lub miejsca w genomie (Ryc. 2). Komrki ES izolowane s z blastocysty
(wczesny etap rozwoju zarodka), dziki czemu otrzymuje si komrki niezrnicowane, ktre posiadaj
zdolno wbudowywania si do tkanek rozwijajcego
si zarodka po ponownym wprowadzeniu do blastocysty (Evans i Kaufman, 1981; Martin, 1981).
W metodzie tej komrki ES modykowane s in vitro w bardzo precyzyjny sposb. Podstawow technik
wprowadzania genw do komrek ES jest elektroporacja, ale take wykorzystuje si lipofekcj oraz metod
wapniow. Aby uzyska podane miejsce integracji
wprowadzany fragment DNA zawiera sekwencj genu

Zwierzta transgeniczne w neurobiologii 23

selekcyjnego otoczon przez sekwencje homologiczne

do modykowanego genu. W jdrze komrki nastpuje
rozpoznanie sekwencji otaczajcych i wymiana genomowej sekwencji na sekwencj wprowadzan przez
badacza. Wprowadzenie obcego DNA wycza prawidowe funkcjonowanie tego genu w komrce, dziki
czemu uzyskuje si komrk z wyczonym genem tzw.
knock-out. Ekspresja genu selekcyjnego (znajdujca si
na wprowadzonym DNA) pozwala wybra tylko te komrki-klony, w ktrych nastpia waciwa wymiana
(homologiczna rekombinacja).
Komrk, w ktrej nastpia wymiana i wyczenie
interesujcego nas genu namnaa si w odpowiednich
warunkach selekcyjnych. Komrki potomne nastpnie
transferuje si do blastocysty, w ktrej zmodykowane
komrki ES cz si z niezmodykowanymi komrkami zarodka tworzc jeden organizm. Otrzymana chimera posiada cz komrek ze zmienionym genotypem,
czyli z wyczonym genem knock-out. Jeeli komrki
ES-knock-out zasiedl tzw. sznury pciowe, czyli komrki z ktrych w yciu dorosym powstan komrki rozrodcze, to taki osobnik bdzie mg przekaza
now cech - knock-out genu nastpnemu pokoleniu.

Potomstwo osobnikw chimerowych jest heterozygotyczne i dopiero po skrzyowaniu dwch heterozygot

mona otrzyma osobnika homozygotycznego z cakowicie wyczonym genem (knock-out) na obu chromosomach homologicznych (Ryc. 2). Opisane wyczanie
genw stosuje si w celu zbadania funkcji danego genu,
poprzez analiz nieprawidowoci powstaych u homozygotycznych osobnikw typu knock-out.
Transplantacja jder komrkowych
Wczeniej opisana metoda moliwa jest do zastosowania jedynie u myszy, natomiast dla pozostaych gatunkw istnieje inna droga otrzymywania osobnikw z
wyczonym genem typu knock-out. Wykorzystuje ona
technik transplantacji jder komrkowych. Technika
taka okrelana jako klonowanie somatyczne zostaa
wykorzystana do otrzymania owcy Dolly (Wilmut i
wsp. 1997). W metodzie tej mona wykorzysta wiele rodzajw komrek somatycznych, ktre w hodowli
mog by modykowane w podobny sposb jak mysie
komrki ES. Po otrzymaniu komrek zmodykowanych np. typu knock-out, jedn z nich umieszcza si w
pobliu oocytu, z ktrego wczeniej mikrochirurgicz-

Ryc. 2. Transgenizacja przy pomocy pierwotnych komrek zarodkowych ES.

24 W. Konopka

nie usunito jdro komrkowe. Nastpnie czy si

obie komrki w procesie elektrofuzji, poddajc je dziaaniu pola elektrycznego. W ten sposb otrzymujemy
jednokomrkowy zarodek, ktrego rozwj kierowany
jest na pocztku przez skadniki zawarte w cytoplazmie oocytu, a nastpnie funkcj rozwoju przejmuje
jdro komrki somatycznej. Jeeli komrka ta zostaa
wczeniej zmodykowana np. poprzez knock-out genu,
zmiana ta obecna bdzie w kadej komrce powstaego
organizmu.

Systemy warunkowej/indukowalnej
ekspresji genw
W opisanych dotychczas metodach otrzymywania
zwierzt transgenicznych wprowadzone zmiany w genomie np. nadekspresja lub knock-out wybranego genu,
istniej od pocztku ycia organizmu i jak w przypadku
zwierzt knock-out we wszystkich komrkach ciaa.
Czasem moe to powodowa problemy z interpretacj
wynikw tj. u czci myszy typu knock-out wystpuj efekty kompensacji funkcji brakujcego genu przez
inne geny homologiczne lub pokrewne. Natomiast w
pewnych przypadkach, gdy badany gen odgrywa kluczow rol podczas rozwoju, jego usunicie powoduje
obumieranie zarodka, co uniemoliwia prowadzenie
bada. Z tego powodu naukowcy pracuj nad systemami warunkowej/indukowalnej ekspresji genw, ktre
pozwalaj na ekspresj bd zknockoutowanie wybranego genu tylko w pewnych typach komrek oraz
w czasie zalenym od badacza lub od specycznoci

Ryc. 3. System Cre/lox warunkowej ekspresji genw.

promotora. Przykady takich systemw oraz ich wykorzystania w neurobiologii podano poniej.
System Cre/lox
W systemie tym komrki ES modykuje si w celu
wprowadzenia do badanego genu pewnych sekwencji
bez uszkodzenia funkcjonowania tego genu (tzw. technologia knock-in). W tym przypadku sekwencja badanego genu jest zastpowana przez tak sam sekwencj
otoczon miejscami loxP. Sekwencje loxP to krtkie sekwencje rozpoznawane przez enzym rekombinaz Cre,
ktry usuwa sekwencj DNA zawart miedzy nimi. Tak
zmodykowane komrki ES wstrzykuje si do blastocysty w celu otrzymania myszy ze zmienionym genotypem. Nastpnie takie myszy (tzn. posiadajce gen, ktry chcemy usun, otoczony sekwencjami loxP) krzyuje si z myszami posiadajcymi gen rekombinazy
Cre. W zalenoci od wasnoci promotora kierujcego
ekspresj Cre, wycicie genu bdzie nastpowao tylko
w tych komrkach, w ktrych obecny bdzie ten enzym (Ryc. 3). Przykadem promotora, ktry wykazuje
specyczno do pewnego rodzaju komrek (neuronw
pobudzajcych przodomzgowia) jest promotor genu
podjednostki CaMKII. Fragment promotora CaMKII
(o dugoci 8,5 kpz) zastosowano do otrzymania myszy
CaMKII-Cre (Tsien i wsp. 1996a). Otrzymano 14 linii
myszy transgenicznych, ktre nastpnie skrzyowano z
myszami posiadajcymi gen -galaktozydazy pod promotorem -aktyny, przy czym promotor i gen byy rozdzielone sekwencj z kodonem stop dla transkrypcji.
Sekwencja stop bya ponadto otoczona miejscami

Zwierzta transgeniczne w neurobiologii 25

loxP, wskutek czego ekspresja -galaktozydazy moliwa bya tylko po usuniciu tej sekwencji rozdzielajcej przez rekombinaz Cre. W jednej z linii myszy
obserwowano ekspresj -galaktozydazy (wiadczcej
o zaistniaej rekombinacji Cre-loxP) tylko w komrkach pola CA1 hipokampa w mzgu. Opisan lini myszy CaMKII-Cre skrzyowano ponadto z myszami
posiadajcymi gen dla receptora NMDAR1 otoczony
sekwencjami loxP. Uzyskano w ten sposb myszy z
knock-outem receptora NMDA ograniczonym tylko
do niewielkiego regionu mzgu i tylko do pewnych komrek pole CA1 hipokampa (Tsien i wsp. 1996b).
System tetracyklinowy
Kolejnym systemem pozwalajcym na indukowaln
ekspresj genw jest system tetracyklinowy (Gossen i
Bujard, 1992). W systemie tym gen, ktry chcemy regulowa znajduje si pod kontrol promotora tetracyklinowego (PCMV*-1) zoonego z minimalnego promotora CMV oraz z sekwencji operatora tetracyklinowego
(TetO). W ulepszonej wersji tego systemu (Rossi i wsp.
1998) wykorzystano represor oraz odwrotny aktywator
tetracyklinowy. Oba biaka wi si z promotorem tetracyklinowym i reguluj jego dziaanie w sposb zaleny od doksycykliny. W stanie podstawowym (gdy

brak jest antybiotyku w komrce) zwizany z promotorem represor blokuje ekspresj regulowanego przez nas
genu. Natomiast po dodaniu doksycykliny zastpowany jest on przez odwrotny aktywator, ktry z antybiotykiem zyskuje powinowactwo do promotora PCMV*-1
i wcza ekspresj (Ryc. 4). Za pomoc doksycykliny
moemy dokonywa wyboru czasu wczenia i wyczenia ekspresji genu. Natomiast od wyboru promotora kierujcego ekspresj represora i aktywatora zaley
to w jakich komrkach lub tkankach system bdzie
dziaa. Przykadem zastosowania systemu tetracyklinowego do badania procesw uczenia si i pamici w
zwierztach transgenicznych jest praca, w ktrej dziki indukowalnej nadekspresji inhibitora calcyneuryny
wykazano jej rol w regulacji tych procesw (Malleret
i wsp. 2001). Otrzymano podwjnie transgeniczne myszy, w ktrych gen inhibitora calcyneuryny znajdowa
si pod kontrol promotora tetracyklinowego, natomiast odwrotny transaktywator pod kontrol promotora
CaMKII. Doksycyklin podawano w poywieniu miniumum tydzie przed wykonaniem eksperymentw.
Ekspresj inhibitora wywoan doksycyklin obserwowano w korze mzgowej, hipokampie, prkowiu,
opuszkach wchowych, a trake w mdku. Indukcja
ekspresji genu inhibitora bya odwracalna, a brak efektu

Ryc. 4. Tetracyklinowy system indukowalnej ekspresji genw. rtTA odwrotny transaktywator tetracyklinowy; tTR transrepresor tetracyklinowy; TetP promotor tetracyklinowy (PCMV*-1); X regulowany gen; DOX Doksycyklina.

26 W. Konopka

hamowania calcyneuryny (wiadczcym o wyczeniu

ekspresji inhibitora) obserwowano 12 dni po odstawieniu doksycykliny.
Na zakoczenie warto podkreli, e w najbliszym
czasie bdziemy prawdopodobnie obserwowa znaczcy
rozwj technik kontroli ekspresji genw w zwierztach
transgenicznych, dziki czemu moliwe bdzie dokonywanie coraz bardziej precyzyjnych zmian genomu.
Bibliograa
Costantini F i Lacy E (1981) Introduction of a rabbit beta-globin
gene into the mouse germ line. Nature. 294: 92-4
Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292:154-156.
Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH
(1980) Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of puried DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 77:7380-4.
Gordon JW, Ruddle FH (1981) Integration and stable germ line
transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science.
214: 1244-1246.
Gossen M., and Bujard H (1992) Tight control of gene expression
in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89, 55475551.

Lois C, Hong EJ, Pease S, Brown EJ, Baltimore D (2002) Germline

transmission and tissue-specic expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295:868-872.
Malleret G, Haditsch U, Genoux D, Jones MW, Bliss TV, Vanhoose
AM, Weitlauf C, Kandel ER, Winder DG, Mansuy IM (2001)
Inducible and reversible enhancement of learning, memory, and
long-term potentiation by genetic inhibition of calcineurin. Cell
104:675-686.
Martin GR (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early
mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78:7634-7638.
Pfeifer A, Ikawa M, Dayn Y, Verma IM (2002) Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic
stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U
S A. 99:2140-2145.
Rossi FM, Guicherit OM, Spicher A, Kringstein AM, Fatyol K,
Blakely BT, Blau HM (1998) Tetracycline-regulatable factors
with distinct dimerization domains allow reversible growth inhibition by p16. Nat. Genet. 20:389-393.
Tsien JZ, Chen DF, Gerber D, Tom C, Mercer EH, Anderson DJ,
Mayford M, Kandel ER, Tonegawa S (1996a) Subregion- and cell
type-restricted gene knockout in mouse brain. Cell. 87:1317-26.
Tsien JZ, Huerta PT, Tonegawa S (1996b) The essential role of hippocampal CA1 NMDA receptor-dependent synaptic plasticity in
spatial memory. Cell. 87:1327-38.
Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH (1997)
Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.
Nature. 385:810-813.