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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA

DE
MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
QUMICA FARMACUTICO BIOLGICA
Laboratorio de Microbiologa General I

R E P O RTE E X P E R I M E N TAL P R C T I C A S : 8 .
A I S L A M I E N TO Y C U A N T I F I C A C I N D E
M I C R O O R G A N I S M O S Y 9 . PATOG E N I C I D A D Y V I R U L E N C I A .
Resumen.
Se llev a cabo la siembra de una muestra
con agua de betabel para realizar la cuantificacin
de los microorganismos presentes mediante las
tcnicas de dilucin y vaciado en placa con asa
calibrada. Para ello, se utiliz agar EMB (para
enterobacterias y/o gram negativas), AN y ASC al
5%. Posteriormente, se realizaron las pruebas de
patogenicidad, de Coagulasa (libre y ligada) con
Sthapylococcus
aureus,
Hemolisina
con
Streptococcus pyogenes y Staphylococcus
aureus, Catalasa con todas las bacterias del
cepario (Pseudomona aeruginosa, Salmonella
thypi, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris,
Micrococcus
lysodeikticus,
Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis, Corynobacterium equi y
Eschericia coli); asimismo, se analiz en la mesa
redonda la presencia de cpsulas como factor de
virulencia y, que la manera ms adecuada de
llevar a cabo la presencia de esta con las bacterias
es mediante una tincin de capsula (desarrollada
la clase pasada) con rojo Congo o tinta china.
Introduccin.
Para trabajar con un microorganismo
especfico, se necesita aislar de una muestra, ya
sea de algn fluido corporal, alimento o materia
orgnica. El aislamiento implica la obtencin de un
cultivo puro (axnico), donde slo existe un tipo de
microorganismo.
La
separacin
de
microorganismos presentes en una poblacin
mixta puede lograrse de varias maneras:
separando a los microorganismos fsicamente
mediante diluciones seriadas y vaciado en placa,
por agotamiento de un pequeo inculo en un
medio de cultivo slido o utilizando medios de
cultivo selectivos para inhibir a los microrganismos
no deseados.
Existen
mtodos
para
cuantificar
microorganismos de una determinada muestra.
Estos mtodos pueden cuantificar masa total de la
poblacin y otros el nmero de UFC. Su
clasificacin de acuerdo a la manera de cuantificar
puede ser directa o indirecta y segn los
microorganismos que consideren pueden se
clasifican en mtodos viables y mtodos totales. El
vaciado y cuantificacin en placa es un mtodo
indirecto que cuantifica clulas viables, al igual que
el mtodo de asa calibrada.

La cuantificacin para productos alimenticios est


autorizada segn la NOM- 113-SSA1-1994 y la
NOM-110-SSA1-1994 con placas que contienen
25 250UFC o bien, la literatura avala su conteo
con placas en un rango de 30-300UFC. En tanto,
el procedimiento se realiza segn esta imagen:

Generalmente los microorganismos se pueden


clasificar como saprofitos si no producen
enfermedad o patgenos si producen una
enfermedad
en
el
hospedero.
Los
microorganismos patgenos tienen una virulencia
que implica la infecciosidad del microorganismo y
la severidad de la infeccin producida (virulencia
lata, moderada y baja). Los factores de virulencia
que desarrolla el microorganismo patgeno para
sobrevivir y multiplicarse en el husped son la
cpsula propia de la bacteria, toxinas, enzimas,
etc.
Las toxinas pueden ser endotoxinas, presentes en
microorganismos Gram (-) y que se encuentran
dentro de la bacteria en su pared celular
compuestas por LPS; o exotoxinas, secretadas por
bacterias Gram (+) y Gram (-), compuestas de
polipptidos y tienen alta toxicidad.
Tambin las bacterias cuentan con algunas
enzimas para establecer una infeccin o
simplemente para su propio metabolismo. La
catalasa es una enzima que cataliza la
degradacin del H2O2 en hidrogeno y agua, la
prueba de laboratorio, permite diferenciar
organismos Gram (+) de Gram (-). La coagulasa
es una enzima que transforma el fibringeno en

fibrina. La hemolisina, es una enzima que


transforma la hemoglobina en biliverdina.
Materiales y Metodologa.
Instrumentos y material
Asa calibrada
Asa
bacteriolgica
Portaobjetos
Mechero
bunsen

Microorganismos
(bacterias de cepario)
-Pseudomona aeruginosa
- Salmonella thypi
- Klebsiella pneumoniae
- Proteus vulgaris
- Micrococcus lysodeikticus,
- Staphylococcus aureus
- Bacillus subtilis
- Corynobacterium equi
- Escherichia coli
- Streptococcus pyogenes
Muestra agua de betabel

Prctica 8 Aislamiento y cuantificacin de


Microorganismos

Mtodo de dilucin y vaciado en placa


- Se tom 1 mL (en condiciones esteriles) de agua de
betabel y se adicion a un tubo que contenia solucin
salina, se etiquet con 10-1.
- Despues 1mL de esta dilucin, se vaci dentro del
siguiente tubo ( 10 -2) y asi sucesivamente hasta llegar al
tubo de 10-6
-Finalmente se realiz una descarga de 1mL de los
tubos
10-4 , 10-5 , y 10-6 en placas estriles.
agregandoseles agar nutritivo. Se mezcl el agar dentro
de las placas con movimientos en forma de 8.

Tambien se realiz el mtodo de asa calibrada en agar


nutritivo y en EMB por estria cruzada. Para
posteriormente hacer el conteo de UFC en las 2
pruebas.

Reactivos

Prctica
Prctica 9
9 Patogenicidad
Patogenicidad y
y virulencia
virulencia
H2 O 2

Prueba de coagulasa
-Se
una muestra
muestra de
-Se tom
tom una
de Salmonella
Salmonella aureus,
aureus,
inoculandose
inoculandose en
en un
un tubo
tubo con
con plasma
plasma (de
(de conejo)
conejo) yy se
se
incubo
incubo a
a 37C
37C por
por 4
4 horas.
horas.

Prueba
Prueba de
de Hemolisinas
Hemolisinas
Se
incubo a
Se inoculo
inoculo e
e incubo
a 37
37 C
C por
por 24
24 o
o 48
48 hrs.
hrs.
Staphylococcus
Staphylococcus aureus
aureus yy Steptococcus
Steptococcus pyogenes
pyogenes en
en
un
un medio
medio de
de agar
agar sangre,
sangre, este
este ltimo
ltimo sellandose
sellandose con
con
masking.
masking.

Resultados.
Tabla I. Aislamiento y cuantificacin.
Mtodo

Cuantificacin y vaciado en placa.

Imagen

Resultad
o

Mtodo
Imagen

Asa calibrada (1L)

Agar Nutritivo

Resultado

EMB

Tabla II Prueba de Coagulasa.


Esta prueba se realiz para los 3 equipos ya que solo se tena un tubo de plasma por profesor. En el
tubo de realizo la inoculacin de Salmonella aureus, posteriormente se Incubo a 37C, la tcnica nos
dice que debe ser por 4 horas pero el tiempo no era suficiente, mientras se daba la incubacin se le hizo
observaciones cada 15 minutos para determinar si haba formacin de algn coagulo sin embargo el
tiempo que se estuvo en revisin no dio formacin de dicho coagulo por lo tanto la reaccin se determin
como negativa.

Tabla IV Prueba de Catalasa


Bacteria

Reaccin con H2O2


+++

Pseudomona auriginosa

Salmonella typhi

Streptococcus pyogenes

Klebsiella pneumoniae

++

Proteus vulgaris

+++

Micrococcus lysodeikticus

+++

Staphylococcus aureus

++

Bacillus subtilis

++

Corynebacterium equi

Escherichia coli.

*Algunas reacciones no se aprecian debido a que la foto fue tomada


una vez que se terminaron las pruebas.

Tabla III Prueba de Hemolisina (AS5%)


Bacteria
Streptococcus
pyogenes

Imagen

Staphylococcu
s
Resultado
aureus
Negativo

Negativo