Procesos Biotecnolgicos II

2014

Trabajo Prctico N3- Primera Parte

COMPROBACIN EXPERIMENTAL DE UN MODELO TERICO APLICADO A
UN BIORREACTOR CONTINUO CON ENZIMAS INMOVILIZADAS

En los ltimos aos la Biotecnologa ha experimentado grandes avances y sus

aplicaciones industriales en la obtencin de productos qumicos, en la industria alimentaria
y farmacutica se han acrecentado considerablemente. En la industria, los procesos
catalizados por enzimas son cada da ms numerosos, ya que presentan una serie de
ventajas frente a los catalizadores convencionales no biolgicos:
-

presentan una gran actividad cataltica,

muestran una gran especificidad hacia el sustrato,

son muy activos a temperatura ambiente y presin atmosfrica normal [1].

Sin embargo, el uso de enzimas ha sido limitado debido a su alto costo, pequeas
cantidades disponibles, inestabilidad y posibilidades limitadas de recuperacin econmica
de la enzima a partir de la mezcla de reaccin. Los recientes desarrollos biotecnolgicos en
el campo de la inmovilizacin enzimtica permiten la superacin de esta problemtica [2].
Esta tcnica consiste en confinar la enzima en una regin definida del espacio por unin a
un soporte, dando lugar a formas insolubles que retienen su actividad cataltica y pueden
ser reutilizadas repetidamente [3].
Como ventajas del uso de las enzimas inmovilizadas podemos destacar [4]:
-

el aumento de la estabilidad de la enzima,

la posible reutilizacin disminuyendo los costos del proceso,

la posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a

la aplicacin de la enzima inmovilizada, permitiendo el empleo de cargas elevadas de

enzimas, la cual mantendr su actividad durante ms tiempo.

Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin enzimtica son [5]:

-

la alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo,

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la gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte coexistiendo distintas fracciones

de protenas inmovilizadas con un diferente nmero de uniones al soporte,

-

suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la inmovilizacin,

el biocatalizador es ms caro que la enzima nativa,

la catlisis heterognea se ve fuertemente afectada por el fenmeno de difusin [6].

El transporte de masa est limitado tanto por la difusin externa (debido a la capa de Nernst
que rodea al soporte de la enzima) como por la interna (depende de la interaccin entre el
sustrato y el material de la matriz y la porosidad de la matriz) [7].

En general, los mtodos de inmovilizacin enzimtica [8] se suelen clasificar en dos

grandes categoras:
1) retencin fsica y
2) unin qumica.

El atrapamiento enzimtico consiste en la retencin fsica de la enzima en las

cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros
fotoentrecruzados o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carragenano o
resinas de poliuretano. Con el objetivo de mantener la mayor actividad cataltica, la
inmovilizacin debe realizarse en condiciones suaves.

En el presente trabajo prctico se estudiarn las caractersticas cinticas de un

biorreactor continuo consistente en enzimas utilizadas para la determinacin bioqumica de
glucosa (kit comercial para anlisis clnico) atrapadas en una matriz de alginato.

ALGINATO
El alginato es un polmero extrado de algas marinas que consiste en monmeros de
cido-D-manurnico (M) y cido-D-glucurnico (G) unidos por enlaces glucosdicos
14 formando un copolmero lineal. Las regiones ricas en unidades G forman cavidades
dentro de las cuales interaccionan cationes polivalentes tales como Al3+, Ca2+, Cu2+.
Este polmero soluble en agua puede transformarse en un gel insoluble, resistente al
calor a travs de un proceso denominado gelificacin ionotrfica [9]; gracias a los puentes

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salinos formados entre bloques G adyacentes de diferentes cadenas y tomos polivalentes

como el Ca2+.
+

( ) + 2+ 2+ + 2+ ( )

ENZIMAS (kit para la determinacin clnica de glucosa)

Este kit comercial consta de dos enzimas: la glucosa oxidasa (GOD) y la peroxidasa
(POD), las cuales catalizan la siguiente reaccin:

+ 2 + 2
22 2 + 4 +

+ 2 2
+ 42

GOD y POD son las enzimas a inmovilizar, y 4-AF corresponde a la 4aminofenazona. La quinona coloreada puede ser cuantificada realizando medidas de
absorbancia a 505 nm.

Procedimiento
El procedimiento para llevar a cabo este TP consta de 4 etapas. Las etapas A) y B)
ya fueron realizadas por los auxiliares a cargo de la preparacin del TP y la etapa D) ser
realizada la prxima semana en la segunda parte del TP.

A) Curva de calibracin de glucosa

1.- Preparar 50 mL de solucin de glucosa 1 g/L
2.- Preparar en un vaso de precipitado Reactivo de trabajo conteniendo:

50 ml de H2O

3,5 mL de reactivo 4-AF

3,5 mL de Reactivo Fenol

210 L de GOD/POD

H2O c.s.p. 70 mL.

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Es importante respetar el orden de agregado de cada uno de los reactivos y

homogeneizar bien antes de agregar el reactivo siguiente.

3.- Preparar la siguiente batera de tubos de Kahn con diferente concentracin de glucosa,
cada uno por triplicado:

Tubo
[Glu] (g/L)
React.
Trabajo

1
0

2
0.0005

3
0.0010

4
0.0015

5
6
0.0020 0.0025

2,0 mL en cada tubo

4.- Incubar los tubos a 37C por 10 minutos.

5.- Medir absorbancia ( = 505 nm) de cada sistema por triplicado, promediar los valores
y graficar Absorbancia vs [Glu] en g/L.

B) Calibracin de la bomba peristltica (con el fin de determinar el caudal obtenido a las

diferentes velocidades indicadas en la perilla de la bomba peristltica)
1.- Conectar 2 capilares a la bomba, sumergiendo el extremo de uno de ellos en un vaso
de precipitado con agua y el otro dentro de una probeta.
2.- Encender la bomba, llevar a la velocidad a utilizar y, al mismo tiempo, largar el
cronmetro. Realizar medidas del volumen emitido dentro de la probeta cada dos minutos.
3.- Repetir los pasos 1 y 2 para cada velocidad incluyendo los puntos intermedios 1,5 y
2,5.
4.- Graficar Volumen emitido (mL) vs tiempo (min) y obtener para cada velocidad el
caudal Q de la bomba (pendiente de la grfica en mL/min).

C) Determinacin de los parmetros cinticos de la reaccin de glicemia con las

enzimas inmovilizadas en un Reactor en Batch.
1.- Agregar 105 L de la solucin de enzimas GOD/POD a 35 mL de alginato 2% P/V.
Trabajar con agitacin constante y homogeneizar durante 10 minutos.
2.- Colocar aproximadamente 40 ml de CaCl2 0,25 M en el vaso de plstico.
3.- Cargar la solucin de alginato-GOD/POD en la jeringa procurando que no se formen
burbujas de aire.

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4.- Gotear la solucin de alginato-GOD/POD sobre el CaCl2 hasta fabricar 100 esferas;
colarlas y escurrirlas con papel absorbente para secarlas, apoyando el papel por debajo del
colador.
5.- Colocar las esferas en el reactor y agregar, con agitacin constante, primero 5,00 mL
de CaCl2 0,25 M y luego 2,50 mL del reactivo 4-AF.
6.- Colocar en la probeta 40 mL de la solucin de glucosa (concentracin S0
correspondiente a cada grupo) y 2,50 mL del reactivo Fenol. Homogeneizar bien la
solucin.
7.- Setear la longitud de onda del espectrofotmetro en 505 nm y realizar el blanco agua.
8.- Verter el contenido de la probeta dentro del frasco, constituyendo as el reactor.
Comenzar el conteo con el cronmetro. Siempre trabajar con agitacin. Calcular la
concentracin inicial efectiva.
9.- Cada 5 minutos tomar 1 mL del reactor con pipeta pasteur, colocar en la cubeta y
medir la absorbancia de la muestra. Devolver la alcuota al reactor. Siempre limpiar las
paredes de la cubeta.
10.- Repetir este procedimiento hasta alcanzar los 60 minutos de trabajo
11.- Calcular la S0 en el reactor y la [quinona coloreada]; graficar [quinona coloreada] vs.
tiempo y determinar las velocidades de reaccin inicial para cada S0.
12.- Realizar una grfica del tipo Lineweaver-Burk y obtener los parmetros de Vmx y Km
aparentes:

= +

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1.- Arroyo M. (1998) Inmovilizacin de enzimas. Fundamentos, mtodos y aplicaciones.
Ars Pharmaceutica, 39, 23-29.
2.- Kayastha AM, Das N. (1999) A simple laboratory experiment for teaching enzyme
immobilization with urease and its application in blood urea estimation. Biochem Educ,
27, 114-117.
3.- Wingard LB. (1972) Enzyme Engineering, Interscience Publishers, New York.

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4.- Hartmeier W. (1985) Immobilized biocatalysts: from simple to complex systems.

Trends Biotechnol, 3, 149-153.
5.- Martinek K, Mozhaev VV. (1987) Immobilization of enzymes: an approach to
fundamental studies in biochemistry. Adv Enzymol, 57, 179-249.
6.- Grunwald P. (2000) Experimental treatment of the laws of heterogeneous catalysis
with immobilized yeast cells (Saccharomyces cerevisiae). Biochem Educ, 28, 96-99.
7.- Grunwald P. Determination of effective diffusion coefficients an important parameter
for the efficiency of immobilized biocatalyst. Biochem Educ, 17, 99-102.
8.- Kennedy JF, Cabral JMS. (1983) Solid Phase Biochemistry. Schouten, WH. (ed)
Wiley Pub., New York.
9.- Klein J, Stock J, Vorlop KD. (1983) Pore size and properties of spherical Ca-alginate
biocatalysts. Europ J Appl Microbiol Biotechnol, 18, 86-91.