UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE
INGENIERA AGROINDUSTRIAL

DETERMINACIN DE BIOMASA DE Saccharomyces cerevisiae

AUTORES: CABANILLAS PURIHUAMAN, JHONATAN DAVID

ESTRADA OSCO, ADEMAR JUNIOR
SANTACRUZ VASQUEZ, MIGUEL

CURSO:

BIOTECNOLOGIA DE LOS PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

PROFESOR: Mg. LINARES LUJAN, GUILLERMO ALBERTO

TRUJILLO - PER
2014

CONTENIDO
INTRODUCCI
N

MARCO
TERICO

2
MATERIALES Y
MTODOS

RESULTADOS

Plan HACCP

2
DIAGRAMA DE
FLUJO

2
COMENTARIO

I.

INTRODUCCIN

En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el nmero de

microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en:
estudio de curvas de crecimiento, anlisis de alimentos, preparaciones inculos para
fermentacin, control de fermentaciones a escala de laboratorio e industrial,
comparaciones crecimiento celular en varias condicin es, etc. (Aquiahuati M., 2004).
Segn La UNAM (1986). Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero de
microorganismos o peso (biomasa) de clulas microbianas en un cultivo. Una suspensin
celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas microscpicas dispersas en un
fluido. Habitualmente ser necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la
suspensin como el porcentaje de stas que son viables.
Los mtodos utilizados para la determinacin de microorganismos son aplicados para
numerosos microorganismos unicelulares tales como bacterias, levaduras y en el caso de
hongos, particularmente para esporas fngicas. La determinacin de la masa celular es
empleada para todos los tipos de microorganismos incluyendo los que forman micelio
como los hongos.
Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la
relativamente simple cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes,
entre ellas la que empleamos (cmara de Neubauer), hasta equipos automticos de contaje
celular.
Es posible determinar la densidad celular empleando mtodos ms sencillos. Como una
cmara de contaje celular de Neubauer, y un microscopio. Una cmara de contaje celular
es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensin a medir. El dispositivo
presenta unas seales que determinan un volumen conocido (microlitros). Al contar bajo el
microscopio el nmero de partculas presentes en ese volumen se puede determinar la
densidad de partculas en la suspensin de origen. (UNAM, 1986).

El conocimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el nmero de clulas a

lo largo del tiempo. La turbidimetra, se basa en la medicin de la turbidez de una muestra
de clulas, como medida indirecta de la concentracin celular El conocimiento de
poblaciones se mide estimando los cambios en el nmero de clulas a lo largo del tiempo y
espacio. El recuento de clulas que se hace en el microscopio permite medir el nmero
total de clulas de la poblacin que se est analizando. Es as como procedemos a
plantearnos los siguientes objetivos de estudio para la presente prctica de laboratorio.
La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una
suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han
mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del
tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso
seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente
proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin
embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad
Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por
esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de
microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva de
calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar
Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales o con UFC.
II.

OBJETIVOS

Reconocer la tcnica del contaje en cmara Neubauer y por Turbidimetra.

Determinacin de la biomasa celular, utilizando biomasa de levadura, siguiendo los
procedimientos de recuento microscpico en cmara Neubauer y turbidimetra.
III. FUNDAMENTO TORICO
3.1

Crecimiento microbiano

Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos

comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de
cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. Este proceso contina hasta que algn

nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene.

Tambin puede detenerse el crecimiento por acumulacin de alguna substancia inhibidora
formada por los mismos microorganismos. (Ingraham y Ingraham, 1998)
El crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el nmero de clulas, en
la cantidad de algn componente de las mismas (por ejemplo, protenas) o en el peso total
seco de las clulas. Existen varios mtodos de contar el nmero de clulas o de determinar
la masa celular, adecuados para diferentes organismos o diferentes situaciones. (Brock y
Madigan, 1991)
3.2

Recuento celular

El recuento directo por microscopa es un mtodo rpido para conocer el nmero de

clulas. Sin embargo, Brock y Madigan (1991) sealan que este mtodo presenta ciertas
limitaciones como:
No distingue las clulas vivas de las muertas.
Las clulas pequeas son difciles de ver con el microscopio y algunas posiblemente se
pierden en el recuento.
En ocasiones la precisin es difcil.
Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando las muestras no se tien.
El mtodo no suele ser adecuado para suspensiones con baja densidad celular. Las
suspensiones diluidas se pueden contar con ms fiabilidad estadstica si la muestra se
concentra primero y se re-suspende luego en un pequeo volumen
Las clulas mviles se deben inmovilizar antes del recuento.
El crecimiento se puede determinar en trminos del nmero de clulas por mililitro. El
nmero total de clulas se puede medir colocando muestras de cultivo adecuadamente
diluidas sobre portaobjetos de microscopios graduados como los de Helber o los
Hematocitmetros y contando el nmero de clulas con la ayuda de un microscopio.
Aunque este mtodo es relativamente rpido y exacto, no distingue entre clulas viables y
no viables, tambin muy agotador, sin embargo se cuenta con contadores de clulas
automticos, aunque sumamente caros. (Scragg, 1996).

3.3

Levaduras

Levadura es un nombre genrico que agrupa a una variedad de hongos, incluyendo tanto
especies patgenas para plantas y animales, como especies no solamente inocuas sino de
gran utilidad. De hecho, las levaduras constituyen el grupo de microorganismos ms
ntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad. Algunas especies de
levaduras del gnero Saccharomyces son capaces de llevar a cabo el proceso de
fermentacin, propiedad que se ha explotado desde hace muchos aos en la produccin de
pan y de bebidas alcohlicas.
Desde el punto de vista cientfico, el estudio de las levaduras como modelo biolgico ha
contribuido de manera muy importante a elucidar los procesos bsicos de la fisiologa
celular. Dentro del gnero Saccharomyces, la especie cerevisiae constituye la levadura y el
microorganismo eucarionte ms estudiado. Este organismo se conoce tambin como la
levadura de panadera, ya que es necesario agregarla a la masa que se utiliza para preparar
el pan para que este esponje o levante; de hecho el trmino levadura proviene del latn
levare, que significa levantar. (Gonzlez y Valenzuela, 2004).
3.3.1 Caractersticas principales de las levaduras de panadera
La principal caracterstica en produccin es una velocidad de crecimiento lo ms elevada
posible y un buen rendimiento sobre el medio utilizado, la melaza en la gran mayora de las
producciones actuales, pero se podra pensar en cepas mejoradas genticamente para poder
desarrollarse en pentosa, lactosa o celulosa. (Leveux y Bouix, 2000).
Las otras caractersticas importantes son:
La resistencia a la desecacin para las levaduras que deben ser producidas en
forma de levaduras activas;
La resistencia a la congelacin.
El color blanco.
La conservacin: las levaduras muestran un descenso de su actividad
fermentativa durante el almacenamiento. La temperatura y el oxgeno tienen una
gran importancia en la conservacin.

 Un buen poder de fermentacin.

3.4 Cmara de Neubauer
Es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de
fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se
ha marcado una cuadricula. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos
lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1
milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a
la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie
marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es
de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.
Si contamos las cuatro reas sombreadas (L) observando un total de x clulas entre las
cuatro reas, la concentracin en la suspensin celular ser: concentracin en la suspensin
(Clulas/ml) = 10000 (x/4).
3.4.1 Conteo en cmara de Neubauer:
Esta cmara se utiliza para conteo celular.
Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, este debe quedar
centrada.
Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la
distribucin de las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequea o con
una jeringa ya que la cmara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en
un solo intento.

 La cmara no puede quedar seca, esto se detecta porque en las esquinas del recuadro
llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la

de

cmara es

de lquido abundante en las terminaciones del recuadro.

Figura 1. Conteo por cmara neubauer. Representacin de la cuadricula 10X.

En la figura 1, si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras, bacterias,
etc., debemos ubicarnos en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. En esta
cuadricula se visualizan 25 cuadrados, de los cuales se cuentan las clulas presentes en 5
campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza
un conteo aleatorio.
3.5 Determinacin de la densidad celular
La densidad celular de la suspensin de algas se calcula de la siguiente forma:
En caso de haber empleado los cuadrantes de 0,04 mm2. El Nmero de clulas en 0,1 mm3
= (nm. total clulas contadas/nm. cuadros 0,04 mm2.
Esto dar el nmero total de clulas por 0,1 mm3 (volumen obtenido de multiplicar el rea
de 1 mm2 x 0,1 mm de profundidad de la cmara).

El nmero de clulas por mL se obtendr de multiplicar el valor obtenido anteriormente por

10000. Entonces el nmero de clulas por mL = Nmero de clulas en 0,1 mm3 x 10 000.

3.6 Medidas indirectas del crecimiento microbiano: Turbidez

Un mtodo que se utiliza debido a que es muy rpido y til que permite obtener estimaciones
del nmero de clulas son las medidas de turbidez. Una suspensin celular aparece turbia a la
vista porque las clulas dispersan la luz que atraviesa la suspensin. Cuntas ms clulas estn
presentes mayor ser la luz dispersada y, por tanto, mayor la turbidez. La turbidez puede
medirse con aparatos como el fotmetro o espectrofotmetro que hacen pasa la luz a travs de
suspensiones celulares y detectan la cantidad de luz emergente no dispersada.
Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones dilucidas de diferentes tipos de
bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad
de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es
directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del
microorganismo.
Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partculas o por UFC (unidades
formadoras de colonias). Cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes, por ello
se estima el nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de
una suspensin bacteriana para realizarse una curva de calibracin con cada tipo de
microorganismo, solo de esta forma es posible relacionar la absorbancia (densidad ptica) con
el nmero de microorganismos totales o con UFC.
La principal diferencia entre estos dos instrumentos es que un fotmetro emplea un filtro
simple para generar la luz incidente de longitud de onda relativamente corta, mientras que un
espectrofotmetro emplea un prisma o red de difraccin para generar luz incidente en una
banda muy estrecha de longitudes de onda. Las longitudes de onda ms comnmente usadas
para medir la turbidez bacteriana son 540 nm. (verde), 600 nm. (naranja) y 660 nm. (rojo). Sin
embargo, tanto los fotmetros (nefelmetros) como los espectrofotmetros miden solamente

luz no dispersada y las lecturas se expresan en unidades fotomtricas (por ejemplo, unidades
Klett para el fotmetro Klett-Sumerson) o en unidades de densidad ptica (DO) en un
espectrofotmetro. (Brock y Madigan, 1991).
La espectrofotometra se refiere a los mtodos cuantitativos, de anlisis qumicos que utilizan
la luz para medir la concentracin de las sustancias qumicas. Se conocen como mtodos
espectrofotomtricos y segn sea la radiacin utilizada como espectrofotometra de absorcin
visible (colorimetra), ultravioleta, infrarroja.

Figura 2. Espectrofotmetro UV-visible.

3.6.1. Obtencin de una curva estndar

Para el caso de organismos unicelulares, las unidades fotomtricas o de densidad ptica son
proporcionales (dentro de ciertos lmites) al nmero de clulas; por consiguiente, las lecturas de
turbidez pueden usarse como un sustituto de los mtodos de recuento directo.
Se recomienda que antes de utilizar la turbidez como sistema para estimar el nmero de clulas,
se debe tener en cuenta que se debe preparar primero para cada microorganismo a estudiar una
curva estndar relacionando alguna medida directa del nmero de clulas (microscpica o
recuento de viables) o de la masa (peso seco) con la medida indirecta obtenida por turbidez. Tal
curva de calibracin puede contener datos tanto del nmero de clulas como de la masa celular,
permitiendo una estimacin de ambos parmetros a partir de una simple lectura de la turbidez.
(Brock y Madigan, 1991)

A altas concentraciones celulares, la luz dispersada por una clula, que normalmente no
alcanzara el detector, puede ser redispersada por otra de tal modo que para la clula
fotoelctrica es como si no hubiese sido dispersada nunca. Cuando esto ocurre, la
correspondencia entre el nmero de clulas y la turbidez pierde linealidad. Sin embargo, en
unos lmites, las medidas de turbidez pueden ser razonablemente precisas y tienen la virtud de
ser rpidas y fciles de realizar. Adems estas determinaciones se pueden hacer normalmente
sin destruir o modificar significativamente la muestra. Por estos motivos, las medidas de la
turbidez se usan con frecuencia para seguir la velocidad de crecimiento en los cultivos
microbianos; la misma muestra puede medirse repetidamente, los resultados se pueden
representar semilogartmicamente frente al tiempo y usarse para calcular el tiempo de
generacin de un cultivo en crecimiento.
IV.

MATERIALES Y MTODOS

4.1. Materiales
-

Cmara Neubauer con portaobjeto.

Microscopio.

Pipeta Pasteur.

Material biolgico: suspensin de levaduras en crecimiento exponencial.

Pipetas.

Tubos de ensayo.

Espectofotmetro.

Cubetas para lectura en espectofotmetro.

4.1. Metodologa
La parte experimental de esta investigacin se realiz en el Laboratorio Biotecnologa de la
Universidad Nacional de Trujillo.
4.1.1 Recuento con cmara de Neubauer:

Lavar cuidadosamente la cmara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el
portaobjetos. Secar con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central

limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecian una zona cuadriculada a
simple vista.

Homogenizar perfectamente la muestra, tomar inmediatamente una muestra con una

pipeta de punta fina y depositar una gota entre la cmara y el cubreobjetos por el borde
de la cmara. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que
dificultar la evaluacin precisa de la poblacin microbiana.

Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cmara en la platina del microscopio y

localizar con el objetivo seco dbil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la
Figura 3.

Localizar el cuadro central grande (C1) que mide 1 mm por lado, que se encuentra
dividido en 5x5 cuadros pequeos (C2) limitados por triple lnea que mide 0.2 mm por
lado. Estos cuadros pequeos a su vez se encuentran divididos en 16 cuadros ms
pequeos (C3) de 0.05 mm de lado.

Hacer la cuantificacin de clulas con el objetivo seco fuerte (40X), contando el nmero
de clulas que se localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamao C2 sirven de
gua para el cmputo. Se empieza a contar desde la parte superior de los cuadros C2 y se
contina hasta la base. Si las clulas tocan los lmites de los cuadros C2; debern
contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado izquierdo del cuadro.
Si las clulas tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este mtodo reduce
las posibilidades de contar la misma clula dos veces.

Cuente hasta cerca de 200 a 250 clulas antes de determinar el nmero de clulas por
mL. En el proceso de contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a
continuacin se explican:
Si hay de 200 a 250 clulas por cuadro grande (C1), multiplica directamente por 10 3
para reportar el nmero de clulas por mL.
Con menos de 200 clulas por cuadro grande (C1), ser necesario contar algunos de
los cuadros de las esquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4x4). De esta

manera se cuantificarn ms de 200 clulas. Despus dividir el nmero total de

clulas entre el nmero de cuadros empleados y sacar el valor promedio por cuatro
grandes. Despus multiplicar este valor por 10 3 para reportar el nmero de clulas
por mL.
En el caso de que se observen ms de 200 clulas por cuadro grande (C1), se
debern contar las clulas de los cuadros de menor tamao (C2) hasta contar cerca
de 200 clulas. Dividir este valor entre el nmero de cuadros usados para la cuenta
para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio por 25
para obtener el nmero de clulas aproximada en un cuadro grande (C1) y despus
multiplicar por 103 para reportar el nmero de clulas por mL.

El factor de 103 por el cul se debe multiplicar el nmero de clulas por cuadro grande
(C1) es porque este cuadro contiene un volumen de 0.1 mm 3 (mide 1 mm por lado y la
cmara tiene una profundidad de 0.1 mm).
# Clulas/cuadro C1 (25 cuadros C2) = # clulas/0.1 mm3 x 103 = # clulas/mL

4.1.2 Recuento por Turbidimetra:

Se prepar una suspensin de levadura (suspensin madre), luego se pipeteo 1 ml a partir
de la suspensin madre, en tubos de ensayo y se agreg 9 ml de agua destilada para obtener
la dilucin que represente a una dilucin 10-1; luego se pipeteo 1 ml a partir del tubo antes
preparado y se agreg 9 ml de agua destilada para obtener la dilucin que represente a la
dilucin 10-2. Se repiti el procedimiento para la dilucin de 10 -3. Luego se procedi a
medir las absorbancias a 550 nm. de todas las muestras preparadas en un espectrofotmetro
UV-visible.
RESULTADOS Y DISCUSIN
En la tabla 1 podemos ver los resultados obtenidos en el conteo de levaduras de
Saccharomyces cerevisiae de la suspensin preparada en el laboratorio (0.2g/100ml). El conteo fue
realizado en el cuadrante central de la cmara de Neubauer en 9 de los 25 cuadros (Anexo 1), los
cuales fueron escogidos aleatoriamente siguiendo un orden de izquierda a derecha, y de arriba hacia
abajo, todo esto para tener un muestreo ms eficaz.

Tabla #. Nmero de levaduras de Saccharomyces cerevisiae por cuadro

Cuadro
1
3
5
11
13
15
21
23
25

Nmero de
levaduras
270
249
330
223
253
234
246
236
261

El promedio de los 9 cuadros contados es de 255.78 levaduras/cuadro, con lo cual podemos

decir que a la hora de realizado el conteo la solucin muestreada tena un total de 2.6x10 5
levaduras/ml, este resultado se considera aceptable basndonos en el coeficiente de
variacin de los datos (12.3%). Anexo 2
Si bien el mtodo de recuento de levaduras por cmara de Neubauer ha sido utilizado y
referenciado en diversas investigaciones (Gualtieri et al., 2007; Sabino et al., 2011; Wang
et al,. 2014) es un mtodo en el que la velocidad y exactitud con la que se obtienen los
resultados dependen en parte, de la experiencia del realizador del examen, ya que es un
mtodo en el que se incurre en errores muy grandes. Habiendo dicho esto analizamos
nuestra medicin y vemos que la metodologa seguida no nos asegura una confiabilidad
aceptable, ya que Segn Caedo y Ames (2004) para asegurar una mayor una exactitud
para el caso del conteo de biomasa se recomienda realizar al menos 4 repeticiones por
aislamiento. Sumado a todo esto Willen (1976) detalla el impacto de los principales errores
surgidos durante la prueba, como la carga ligeramente inferior o superior a 10l, lo cual
induce a un error de aproximacin de entre 3 y 5%. Adems habla de los errores
estadsticos que se cometen al utilizar solo 4 o 5 recuadros de la cmara de recuento y dice
que estos errores alcanzan frecuentemente el 20 a 30% del valor real, en nuestra
investigacin se respet esto separando ese error de nuestra medicin al contar 9 recuadros

con lo cual se obtuvo una muestras mucho mas representativa. Sin embargo segn Willen

Figura #. Fotografa tomada a una porcin de la cmara de neubauer, utilizada en el recuento final de bioma

una condicin generadora de error tambin es la inadecuada distribucin de las clulas en la

cmaras, error en el que incidimos como se puede ver en la Figura #. Por otro lado los
errores humanos tanto directos como indirectos como la mala visualizacin de la muestra,
confusin en la cuenta, error de recuento en los bordes, error en el conteo de las frmulas,
etc, son tambin consideraciones a tomar en este tipo de anlisis. (Fuentes et al., 1998).

Referencia
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Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Departamento de Biotecnologa,
1era Edicin, Pg. 63-68.
Brock T, M. Madigan. 1991. Microbiologa. Editorial Prentice Hall Hispanoamrica.
Mxico D.F.

Caedo, V y Ames, T. Manual de Laboratorio para el Manejo de Hongos Entomopatgenos.

Centro Internacional de la Papa. Lima, Per.
Fuentes, V., Castieiras, M., Queralt, J. 1998. Bioqumica Clnica y Patologa Molecular.
Vol. 1. Ed. 2. Editorial Revert S.A. Barcelona, Espaa.
Gonzlez, A. y Valenzuela, L. (2004). Saccharomycescerevisiae.Departamento De Gentica
Molecular, Instituto De Fisiologa Celular. Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
Apartado Postal 70-242. Mxico D.F. C.P. 04510.
Gualtieri, M., Villalta, C., Daz, L., Medina, G., Lapenna, E., Rondn, M. Produccin de
biomasa de Saccharomyces cerevisiae y Candida utilis usando residuos de pulpa de Coffea
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Ingraham, J. y Ingraham, C. 1998. Introduccin a la Microbiologa.2 Vol. Ed. Revert.
Barcelona.
Leveux, J y M. Bouix. 2000. Microbiologa Industrial. Los Microorganismos de inters
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Sabino, B., Mrquez, J., Campos, J., Segmentacin de Clulas de la Levadura
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Scragg. 1996. Biotecnologa para Ingenieros. Sistemas Biolgicos en procesos
tecnolgicos. Editorial Limusa Editores. Mexico D.F.
UNAM .1986. Biologa Celular, Manual de Prcticas. Departamento de Biologa,
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Wang, C., Esteve-Zarzoso, B., Mas, A. Monitoring of Saccharomyces cerevisiae,
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