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Extraction
Cette mthode consiste liminer toute sorte de contaminants pouvant tre prsent dans
lchantillon dADN.
Extraction au phnol- chloroforme : agiter lchantillon, centrifuger basse vitesse,
rcuprer la phase aqueuse qui contient les acides nucliques.
Extraction lisobutanol : limine les contaminants organiques, se fait aprs les tapes
prables enzymatique ou de sparation.
Prcipitations
Cette mthode permet de rcuprer les acides nucliques sous forme solide, et concentrs.
Prcipitation lthanol et sel : en ajoutant de lthanol, un prcipit dADN y est rcupr.
Pour ce faire, lthanol doit tre glac (-20), contenir un sel (haute force ionique). Le
rendement final est lev.
Prcipitation lisopropanol : lADN peut aussi tre prcipit lisopropanol pour de petits
volumes. Il ny a pas besoin de sel, retire les fragments de faible PM, rinage lthanol.
- Exclusion molculaire sur gel : utilise pour une sparation en fonction du PM, retiens les
nuclotides libres, les sondes non hybrides.
- Echangeuse dion : retiens les acides nucliques en raison de leur charge, retiens des petites
quantits dADN aprs modification.
- Chromatographie daffinit : utilise pour reconnaitre une squence prcise. (+/_)
- HPLC : utilise lorsque il faut une forte rsolution en fonction de la taille, prpare les
oligonuclotides de synthse, les plasmides, les fragments,
Electrophorse
Technique de sparation analytique et prparative.
Llectrophorse nest pas utilise uniquement en mthode analytique, elle est aussi utilise
pour purifier les fragments dADN.
La migration de lADN se fait travers un gel rticul dans un champ lectrique.
les acides nucliques anioniques migrent vers lanode
- la migration se fait en fonction de la masse molculaire de lADN et le type de gel
Types dlectrophorse :
- Gel dagarose : convient pour la sparation de fragments dADN de tailles comprises entre
quelques centaines de paires de bases et +- 20 Kb trs utilis, la migration se fait
lhorizontal, le tampon utilis pour cette migration est basique ( tris- Borate-EDTA).
- Gel dacrylamide : utilis pour sparer des fragments dADN plus petits ; infrieur 1Kb
la migration se fait verticale entre 2 plaques de verre, trs rsolutif car purifie les
oligonuclotides, dtermine des squences.
- Electrophorse en champs pulss : permet de sparer des molcules de tailles allant jusqu
10 Mb dans des gels dagarose.
Analyse des gels :
- Le tampon de charge utilis pour la migration lectrophortique permet un suivi des
migrations en temps rel.
(Role ?)
Coloration pendant et aprs la migration :
* bromure dthidium, ractif mlang de lADN. Il sintercale entre les brins dADN.
* Dtection ralise par exposition aux U.V, fluorescence orange aprs raction avec le BET
- La migration est inversement propre au log du nombre de Pb obtenues ltalonnage se
fait avec des marqueurs de poids molculaires connues.