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Segunda revisin

Nota:
Fecha:
Firma del docente:

IMAGING DE pH EN DOS DIMENSIONES Y

APLICACION
A MONITOREO DE SISTEMAS EN FLUJO
Autores: Noelia Bracamonte, Luciana Karothy, Glenda Kozakiewicz, Andrea Monroy
Fecha de realizacin del TP: 21 de Agosto de 2012
Fecha de entrega del informe: 3 de Septiembre de 2012
1. Objetivos

Mapeo de pH en un sistema con flujo continuo, mediante la utilizacin de un

indicador cido-base y el registro de datos con una cmara digital.

2. Materiales y mtodos
2.1 Materiales y equipamiento

Solucin de un complejo de Rutenio y Calcn como indicador acido-base.

Cmara fotogrfica digital con un sensor de semiconductor (matriz de CCD).
Programa de acceso libre ImageJ.

2.2 Mtodos y desarrollo experimental

2.2.1 Descripcin del sistema con flujo continuo
En este trabajo, se utiliz Calcn como indicador cido-base cuyo valor de
pKa es de 7,4. Su forma cida posee un mximo de absorcin a 515 nm (verde) y
en su forma bsica, la absorcin mxima se presenta a 610-640 nm (rojo). En la
Figura 1, se pueden apreciar los espectros de absorcin de las especies cida y
bsica.

Figura 1. Espectro de absorcin de Calcn a pH 3 y 10 (izquierda) y estructura de

Calcn (derecha).

El dispositivo montado consisti en un delgado tubo capilar por el cual se

hizo circular, en flujo continuo, una solucin de un complejo de Rutenio y Calcn.
El mismo fue excitado mediante un pulso lser en un punto del capilar,
provocando la ruptura fotoqumica del complejo liberando, as, butilamina. La
presencia de dicha base en el medio, alcaliniz el sistema y caus el viraje de
color del indicador en solucin. En la Figura 2, se presenta un esquema del
dispositivo empleado.

Figura 2. Esquema del sistema utilizado. A) representa la entrada de la solucin ,

B) la direccin del flujo, C) el descarte, D) el objetivo del microscopio y E) el lser de
405nm enfocado sobre el capilar.

2.2.2 Sensor empleado

Para obtener las imgenes del flujo, se utiliz una cmara fotogrfica digital
con un sensor de semiconductor (matriz de CCD) capaz de captar la cantidad de
luz en forma independiente, en cada uno de los puntos que forman la imagen.
Para ello, la matriz de CCD se encuentra dividida en los tres colores primarios
(RGB, por las siglas en ingls de rojo, verde y azul). Las respuestas de los filtros
del dispositivo no son lo suficientemente angostos como para considerar que la
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luz que llega a cada pxel es monocromtica y, por lo tanto, no sera correcto
aplicar la Ley de Lambert-Beer (cuya expresin se puede ver en la Ecuacin (1.A)
del Apndice) de manera directa. Para resolver este inconveniente, se utiliz
como fuente de iluminacin, un dispositivo LED rojo (635 nm) y otro LED verde
(535 nm) con un ancho de banda de unos 20 nm, Su implementacin redujo
apreciablemente el intervalo de longitudes de onda de la luz que llegaba a cada
filtro.

2.2.3 Obtencin de datos y procesamiento

La manipulacin de imgenes recolectadas se realiz con el software Image
J. Se dividi el video en los tres canales que representan cada filtro (rojo, verde y
azul) y se trabaj nicamente con el correspondiente al rojo (635 nm). Esto
ltimo result til por mltiples razones. Una de ellas es que, a esa longitud de
onda, la absorbancia correspondiente a la especie cida del Calcn es
despreciable frente a la de la especie bsica, lo cual, puede corroborarse en la
Figura 1. Otra ventaja es que el espectro de la especie bsica presenta su
mximo de absorcin y, por lo tanto, es posible aplicar la Ley de Lambert-Beer
con mayor sensibilidad que en otras regiones del espectro.
Teniendo en cuenta que a 635 nm nicamente absorbe la especie bsica,
se tom como I0 un promedio de imgenes en las que la solucin tena un pH tal
que el indicador se encontraba mayoritariamente como especie cida. A su vez,
se utiliz un promedio de imgenes con la finalidad de reducir el ruido asociado a
tomar un nico valor para cada punto de la imagen. Posteriormente, se realiz
una serie de operaciones sobre las imgenes del video para obtener informacin
del pH en cada punto del flujo.
La primera operacin consisti en convertir la seal de cada pxel de
intensidad I de luz a transmitancia (T). Esto se logr dividiendo la seal de cada
pxel de cada frame del video (I) por la seal del I 0 correspondiente a cada pxel.
Luego, se obtuvo la recproca de T, se aplic logaritmo natural y se multiplic por
2,303. As, se obtuvo un video de absorbancia de la especie bsica.
Posteriormente, se convirti este video en fraccin molar de la especie bsica (X B)
al dividir la absorbancia de cada pxel por el valor de absorbancia mximo
correspondiente a las zonas fuertemente bsicas, generadas por el pulso del
lser. De este modo, se gener un video de X B y uno de (1- XB). Finalmente,
teniendo en cuenta la expresin de la Ecuacin (1), se realizaron los clculos
correspondientes utilizando el valor de pKa 7,4 y obtener un video que brindara
informacin del pH del flujo en cada punto.

CB
XB
pKa log

CA
1 X B

pH pKa log

(1)

En distintos pasos se fijaron valores mximos y mnimos, utilizando como

criterio el conocimiento previo acerca de los parmetros y de la muestra.
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3. Resultados
3.1 Obtencin de la I0
Para obtener la absorbancia correspondientes a I0, se promedi distintas
imgenes en las que la especie bsica del indicador se encontraba ausente del
flujo. Para ello, el video contaba con una seccin final, en la cual, se dej de incidir
con el lser y, por lo tanto, el flujo contena nicamente a la especie cida. Las
imgenes correspondientes a dicha seccin fueron las seleccionadas para llevar a
cabo esta operacin.
El grfico de la Figura 3, representa la variacin de intensidad media
de luz en funcin del frame para una regin rectangular en particular. Como se
puede observar, aproximadamente, a partir del frame 149 la seal se estabiliza
por lo que se tom dicho frame como el primero de la zona para la obtencin de
I0. As, las imgenes promediadas para obtener el parmetro mencionado fueron
las comprendidas entre el frame 149 y el ltimo del video (el 173).

Figura 3. Grfico de intensidad media de luz (I) para una regin particular en
funcin del tiempo (frame).

3.2 Fotos de cuadros importantes del video y anlisis de la forma del perfil de pH
Las figuras que se presentan a continuacin, reflejan el avance de la pluma de
pH a lo largo del capilar. Desde la Figura 4.a) hasta la 4.d) se puede ver la
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pluma en las distintas posiciones del cuadro. Las cuatro figuras se encuentran
ordenadas y corresponden a los frames 28, 31, 35 y 38, respectivamente.

a)

b)

c)

d)
Figura 4. Avance de la pluma de pH a lo largo del capilar. A su vez, se presenta la recta que se
utiliz para calcular el pH vs distancia en pixeles en cada frame. En a) se puede ver la aparicin de
zonas bsicas ocasionadas por la incidencia del lser, y en b), c) y d) se observa cmo avanza la
pluma de pH.

A partir de las imgenes representadas arriba, se apreciar cmo se

desarrolla el flujo continuo dentro del capilar. La especie coloreada formada en
el punto de excitacin del lser se mueve a lo largo del capilar con una mayor
velocidad en el centro y velocidad nula en los bordes del mismo dando lugar a
un perfil de velocidades parablico. Esta caracterstica es propia de un fluido en
flujo o corriente laminar, y explica el aspecto de pluma que se observa
alrededor de la zona bsica a medida que circula por el capilar.
3.3 Variacin del pH con la longitud
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Para las cuatro imgenes mostradas en la Figura 4, se traz una lnea

horizontal (de color amarilla) para estudiar cmo vara el pH a lo largo del capilar
en cada una de ellas. Con una misma recta se realizaron todas las medidas. En
las Figuras 5.a) a 5.d) se exponen los grficos obtenidos en cada caso.

a)

b)

c)

d)

Figura 5. Grficos de pH en funcin de la distancia (en pxeles). a) Corresponde al frame

28, b) al 31, c) al 35 y d) al 38.

Se puede observar cmo, a medida que se desplaza la pluma, se

desplazan los mximos en los perfiles de los grficos de pH en funcin de la
distancia. Esta tendencia concuerda con los colores del perfil pluma que se
observa en la Figura 4. Por otro lado, se esperara ver que el perfil de pH de la
Figura 5.b) tuviera valores menores que el de la Figura 5.a) pero, se observa
lo contrario. Una causa de lo observado podra ser que la butilamina no se
libera instantneamente y, por lo tanto, el pH no aumenta de forma abrupta. En
las Figuras 5.c) y 5.d) se puede observar que los grficos se ensanchan y el
valor mximo disminuye lo cual, se debe a que se diluye la zona bsica
determinada por la pluma como consecuencia del mezclado y la difusin de los
OH- que son generados por la butilamina liberada en el fluido.

3.4 Variacin del pH con el tiempo

A continuacin, en la Figura 6, se presenta el grfico de pH en funcin

del tiempo registrado para una pequea regin rectangular ubicada en el centro
del capilar:

Figura 6. Variacin del pH con el tiempo (frame) para una pequea

regin rectangular.

Aqu, se pueden distinguir distintos picos correspondientes a valores de

pH cercanos a 8. Analizando el aspecto de los picos, se observa que aparecen
dando un aumento brusco de pH y luego, desciende con una menor pendiente
hasta la aparicin del siguiente pico. La aparicin del pico se puede adjudicar a
la llegada del punto de inters de la pluma de pH. Al tratarse de un punto que
se encuentra en el centro de la imagen, se deduce que la pluma ya atraves la
mitad de la seccin fotografiada del capilar y, por lo tanto, ya se encuentra a un
pH menos bsico que el que posea al formarse. Esto ltimo concuerda con la
observacin de mximos de pH cercanos a 8 en la Figura 6, que son menores
que los valores de pH superiores a 10 que se observan en la Figura 5.b). El
descenso suave de pH que sigue a la aparicin del pico se debe al pasaje del
resto de la pluma y a su posterior desaparicin de la imagen.
Finalmente, puede apreciarse claramente que a partir del frame 140, el
grfico se vuelve irregular como consecuencia del ruido de fondo. Este efecto
est relacionado con la toma de imgenes y es propio del mtodo, aunque se
sepa que el sistema no posee fluctuaciones tan violentas de pH y que el valor
del mismo se mantiene estable.

3.5 Anlisis del error en pH en distintas zonas

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Se debe destacar que, las mediciones de pH realizadas a travs de este

mtodo, poseen un ruido apreciable. Esto, se puede observar claramente en
todos los grficos presentados hasta el momento. Las fuentes de ruido pueden
estar asociadas a distintos factores. Por un lado, se debe tener en cuenta que
se est tomando imgenes de un fluido cuyo movimiento es de una velocidad
apreciable. Esto, puede generar variaciones en las mediciones de intensidad de
luz registradas por la cmara, si la misma no es de calidad suficiente. Adems,
si las paredes del capilar son imperfectas, se generan turbulencias en los
bordes que generan mezclados aleatorios y alteran las concentraciones locales,
por lo cual, las seales registradas por la cmara se ven afectadas,
contribuyendo a un incremento del ruido.
Por otra parte, es esperable que ciertas zonas presenten mayor ruido que
otras. Por ejemplo, en zonas cercanas al pKa del indicador, las concentraciones
relativas de la especie cida y bsica son muy parecidas, y pequeas
variaciones de pH generan cambios importantes en la coloracin, que es lo que
se utiliza indirectamente para cuantificar el pH. Por lo tanto, en las regiones de
pH cercanas al pKa se puede esperar una mayor variabilidad en la
determinacin de pH.
Como una aproximacin de las limitaciones del mtodo empleado, se
estudi el ruido a travs del desvo estndar del I 0 (SB). Para ello, se tom un
cuadro correspondiente al blanco (frame 165) y se realiz un histograma de pH
en un recuadro representativo del frame seleccionado. De esta manera, se pudo
asignar un valor promedio del pH en el blanco y estimar la varianza del mismo.
En la Figura 7, se presenta el frame utilizado y el histograma correspondiente.

a)

b)
Figura 7. Blanco de pH. a) Fotografa del frame utilizado para calcular el valor
promedio de pH del blanco. b) Histograma de los valores que toma el pH dentro de
ese sector.

En el histograma de la Figura 7, se puede observar el valor promedio de pH de

fondo y su desvo estndar. En la tabla de la Figura 8, se presenta el desvo estndar
(SB), el promedio (XB) y se asign un rango de pH segn la ecuacin 3.A del Apndice. No
se utiliz un intervalo de confianza ya que, al dividir la desviacin estndar por la
cantidad de puntos tomados, se obtiene un valor sumamente pequeo resultando el
intervalo de confianza extremadamente acotado, lo cual, no refleja la variabilidad
observada. Por otro lado, si se toma el valor promedio y un corrimiento de dos veces el
desvo estndar, el intervalo obtenido sera sumamente grande, lo que se sabe que no es
correcto ya que el sistema se encuentra con el pH estabilizado en esa seccin del video.
Los valores mencionados, se pueden apreciar a continuacin:
SB

XB

Rango asignado

1,375

3,566

41

Figura 8. Valores de XB, SB y Rango de valores

obtenidos para el pH del blanco (cido).

Finalmente, dado que el programa no puede discernir entre el error que se comete
por fluctuaciones o ruido y el cambio del pH por la ruptura del complejo, el criterio
escogido para determinar los errores fue dividir una imagen en zonas y estudiar la
distribucin de valores de pH en cada una de ellas. El software utilizado permite
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visualizar distintas zonas que contienen pxeles con valores de pH dentro de intervalos
determinados. Como consecuencia del ruido instrumental, las zonas presentan lmites
muy bruscos, por lo tanto, se suaviz gaussianamente a cada pxel con 2 pxeles vecinos,
a travs de la funcin Gaussian Blur. Esto permiti tener zonas mejor definidas para
estudiar, disminuyendo el ruido. Sin embargo, esta herramienta tiene la desventaja de
que aumenta el nmero de pxeles NaN (Not at Number).
Para asignar un pH a la escala de colores, se trabaj sobre la imagen que se
presenta en la Figura 9. Los valores de pH que figuran en la misma se obtuvieron a
partir de tomar un frame (31) y seleccionar rectngulos en distintas zonas (colores),
obteniendo la media y el desvo estndar en los mismos (manteniendo el mismo rea de
estudio seleccionado). De esta forma se realiz un anlisis estadstico con los datos de
cada regin, asignando un valor medio a cada color y su error asociado.

Figura 9. Grafico del calibrado de colores para la asignacin de valores medios con sus
respectivos errores.

Conclusiones
A lo largo de este trabajo prctico, fue posible realizar la medicin del pH de un
sistema en movimiento aproximado a dos dimensiones. El conjunto de datos obtenidos
se bas en la medicin de la intensidad de la radiacin electromagntica transmitida por
un compuesto coloreado utilizando una cmara digital como sensor.
La utilizacin del software ImageJ, permiti la manipulacin de las imgenes
recogidas por la cmara fotogrfica y, mediante operaciones matemticas, fue posible
obtener los resultados en unidades de pH a partir de datos de intensidades relativas de
colores en cada frame o fotografa del video capturado. Es importante mencionar que,
luego de las operaciones realizadas, surgieron una gran cantidad de pixeles sin valores
asignados que quedaron excluidos del anlisis crtico.
En cuanto al especto general de las imgenes, se pudo apreciar una figura de
pluma en el perfil de pH en las zonas cercanas al punto de incidencia del lser, lo cual,
permite concluir que el flujo se desplazaba como un flujo laminar dentro del capilar.
Por otra parte, se pudo observar que existe un importante ruido asociado a la
medicin, trayendo aparejado unos lmites de deteccin y cuantificacin que acotan el
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alcance de la tcnica. An as, al trabajar estadsticamente con una cantidad de datos

suficientemente grande fue posible obtener valores medios de pH con errores pequeos
para cada zona determinada en la pluma.

Bibliografa
Anlisis Instrumental, D. Skoog y J. Leary, 4 Edicin, 1994. Ed McGraw-Hill.

Apndice
Segn laLey de Lambert-Beer se tiene que:
A ( )bc

(1.A)

donde () es el coeficiente de absortividad molar de la especie considerada, b

la longitud de la cubeta y c la concentracin. Adems, A se relaciona con la
intensidad de luz que llega al detector (en este caso, a cada pxel de la matriz
de CCD de la cmara digital) del siguiente modo:
I
I0

A log

log T

(2.A)
donde I0 es la intensidad de luz que atraviesa el flujo y llega al detector cuando
no hay analito presente (en este caso, cuando no se encuentra la especie
bsica) e I es la intensidad que llega al detector cuando el flujo contiene al
analito.
Por otro lado, para calcular los valores medios en cada color con su respectivo error, se
utiliz la siguiente expresin:
xs

(3.A)

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