UNIVERSIDAD NACIONAL

PEDRO RUIZ GALLO

MICROBIOLOGIA DE LOS
ALIMENTOS I
DOCENTE: ALBINO CORNEJO, GRACIELA
ALUMNA: ORTIZ BACA, RUBI SUGGEY

Determinacin Indirecta de Microorganismos Viables: Prueba de

Reduccin de Colorantes

PRCTICA N3
DETERMINACION INDIRECTA DE MICROORGANISMOS VIABLES: PRUEBA
DE REDUCCION DE COLORANTES

I.

INTRODUCCION
La complejidad bioqumica de la leche en su composicin y su elevada
actividad de agua la convierte en una de los alimentos naturales donde
proliferan fcilmente la mayor parte de los microorganismos y se podra
catalogar como un medio universal de cultivo.
Los microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos son
beneficiosos

por

las

transformaciones

que

producen

otros

perjudiciales y su control presenta aspectos sanitarios y comerciales, el

primero se refiere al riesgo que el alimento puede suponer para la salud
del consumidor cuando es portador de microorganismos patgenos o de
sus toxinas y el segundo a las caractersticas de conservacin de la
misma que viene determinada por la presencia de un mayor o menor
nmero de flora saproftica, est en elevadas concentraciones puede
producir defectos y disminucin de las propiedades nutritivas y
organolpticas del producto.
El desarrollo de mtodos rpidos y/o automatizados en el diagnstico
de la calidad higinico sanitaria de la leche y sus productos constituye
en los ltimos aos una necesidad enfocada en lo fundamental en la
obtencin de la respuesta en el menor tiempo posible para tomar las
medidas correctivas sobre las posibles brechas en la higiene de algunas
de las fases de la cadena productiva antes de que el producto sea
liberado en el mercado.
Estos mtodos rpidos de diagnstico bacteriolgico en leche se han
clasificado atendiendo a diferentes puntos de vista, no obstante, en lo

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Reduccin de Colorantes
fundamental han tomado como base los aspectos siguientes: Rapidez
con que se obtienen las respuestas, la actividad metablica de los
microorganismos, posibilidades de automatizacin y principios de
medicin en que se basan las lecturas. Teniendo en cuenta la diversidad
de estas clasificaciones y para una mayor inclusin de mtodos rpidos
empleados en el diagnstico microbiolgico de la leche, estn agrupados
en tres grupos: mtodos directos, indirectos y en mtodos para
diagnstico de microorganismos especficos. El mtodo usado en esta
prctica es un mtodo indirecto, el mtodo de reduccin de colorantes
(Reductasa), usando azul de metileno.
Mtodo de reduccin de colorante Azul de metileno: mide en in intervalo
de tiempo requerido, la decoloracin de la mezcla colorante-alimento
(leche) de un color caracterstico azul, hasta incoloro (blanco en caso de
la leche). Se tiene en cuenta el factor tiempo y la temperatura de
incubacin.
El principio de la prueba de reduccin con azul de metileno se basa en
que el potencial de xido reduccin (Eh) de la leche fresca aireada es de
+0.35 a +0.40 voltios, el cual se debe principalmente al contenido de O 2
disuelto en el producto. Si por cualquier causa ese O 2 es separado, el
Eh disminuye. Esto ocurre cuando los microorganismos crecen en la
leche y consumen el O2. Si el nmero de microorganismos es muy
elevado, el consumo de O2 ser mayor y por consiguiente el Eh caer
rpidamente; si por el contrario, el nmero de microorganismos es
pequeo, el Eh disminuir lentamente.
El principio anterior encuentra aplicacin en la determinacin de la
calidad sanitaria de la leche, utilizando como indicador de xidoreduccin al azul de metileno, este se presenta de color azul en su
forma oxidada y es incoloro en su forma reducida. En solucin acuosa
de pH 7,0 su oxidacin es completa a Eh +0.075 voltios y su reduccin
es completa a Eh -0.015 voltios.

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En la leche, por existir un pH menor de 7 (6.5 6.7), la reduccin

completa del azul de metileno ocurre a un Eh ms positivo, habindose
demostrado que esto tiene lugar a u Eh entre 0.075 a +0.225. El tiempo
en horas que tarda en pasar el azul de metileno de su forma oxidada
(azul) a la reducida

(incolora) bajo condiciones controladas es

proporcional a la calidad sanitaria de la leche y aunque no es posible

establecer con exactitud el nmero de microorganismos, es factible
clasificar

el

producto

dentro

de

ciertos

grados

aceptables

inaceptables.
Debe tenerse en cuenta que existen factores que pueden afectar el
teimpo de reduccin, entre ellos el tipo de microorganismo, el nmero
de leucocitos, el periodo de exposicin a la luz, la cantidad de O 2
disuelto y la tendencia de la leche a elevar los microorganismos hacia la
superficie a medida que se va separando la crema en el tubo de prueba.
Es as como ciertos microorganismos (Lactococcus lactis) son ms
activos en su capacidad reductora que otros, mientras que existen
algunas

especies

(Streptococcus

que

son

agalactiae,

muy

poco

Bacillus

activas
subtilis,

en

este

sentido

microorganismos

termodricos). Por otra parte, a medida que aumenta el nmero de

leucocitos en la leche y su exposicin a la luz natural o artificial, el
tiempo de reduccin tiende a reducirse, mientras que la agitacin y la
tendencia de la crema a ascender (arrastrando los microorganismos)
son factores que tienden a retardar el tiempo de reduccin.

II.

OBJETIVOS
Determinar de manera directa el nmero de microorganismos.
Determinar las clulas viables presentes en la muestra de leche a
partir de la prueba de la reductasa.
Determinar a calidad de la muestra de leche.

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III.

MATERIALES

Material biologico: Leche fresca

Material no biolgico:
o Tubos con tapa rosca estriles (150mL x 1.5mm de dimetro)
o Pipetas de 1 y 10 mL.
o Bao Mara de preferencia con tapa (regulado 37C 0.1)
o Termmetro
o Agua destilada estril
o Botella de vidrio estril
o Gradillas
o Cronometro
o Solucin de Azul de Metileno (Prueba de Reductasa)

IV.

PROCEDIMIENTO

1. Preparacin de Azul de Metileno: se tena

a disposicin una

solucin madre saturada de azul de metileno. Se procede a diluir

la solucin de la siguiente manera.
o Pipetear 60 mL de agua destilada estril en una botella.
o Agregar 3 mL de la solucin madre de azul de metileno (AM).
En este procedimiento se obtiene una dilucin 1/10 del reactivo
para la prueba de reductasa.

60mlDE
de H
3ml sol.
2O
MICROBIOLOGIA
LOS
ALIMENTOS
I madre
destilada

AM

Dilucin 1/10 de
AM

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Reactivopipetear
Azul de 1 mL de reactivo azul de
2. Luego de preparado el reactivo,
Metileno

metileno en el tubo estril tapa rosca.

Luego, con una pipeta de 10 mL tomamos esa misma cantidad de
muestra de leche previamente homogenizada (20 veces)

y la

pasamos al tubo tapa rosca que contiene el reactivo (cada

muestra de leche en su propio tubo).
3. Se preparan dos tubos control de la siguiente manera:
Leche hervida (10mL) ms 1mL de reactivo azul de metileno, este
ser el tubo control negativo (CN).
Leche cruda sin colorante, que ser el control positivo (CP).

Tubo tapa rosca

Tubo tapa rosca
Tubo tapa rosca
control negativo
control positivo
con 1ml de AM
(CN)
(CP)
ms 10 ml de
muestra
de
4. Tapamos
los tubos y homogenizamos suavemente tratando de
leche.

cuidar la esterilidad del contenido. Previamente debemos tener ya

al bao Mara calentado a 37C ( 0.1), verificar bien la
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temperatura de la mejor manera, si el bao mara incluye el

termmetro lo ms recomendable es verificar con un termmetro
aparte.
5. Luego, rotulamos los tubos, los ponemos en su gradilla y lo
sumergimos en el bao Mara.

6. Revisar los tubos cada 30 min, observar la reaccin que se

produce en las muestras y compararlas con los tubos control.
7. Si pasados los primeros 30 min y no cambia de coloracin, es
decir no se vuelve blanco,

sacamos e invertimos el tubo

suavemente 3 veces y lo volvemos a poner en el bao Mara por

otros 30 min. Este procedimiento se realiza durante 4horas en
total, hasta que el contenido se vuelva blanco. Si el contenido
decolora antes de las 4 horas retirar el tubo y anotar el tiempo.
8. Anotar el tiempo que demore en virar de color de la muestra,
segn los resultados se interpreta de la siguiente manera:

Tiempo
> 4 horas

V.

Calificacin de la muestra
Muy buena, clase A

Entre 3 a 4 horas

Buena, clase B

> 30 min y < 3 horas

Aceptable

< 30 minutos

Inaceptable

RESULTADOS

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Reduccin de Colorantes

Resultados de la prueba de
reduccin:
observacin
a
30
minutos, aun se muestra la
coloracin azul en la muestra. Se
compara con los tubos CN y CP.

C
CN

Resultados de la prueba de
reduccin: observacin a 1 hora,
aun se muestra la coloracin azul
en la muestra.

Resultados
de
la
prueba
de
reduccin: observacin a 1:30 hora,
empieza
a
decolorarse
en
la
superficie del tubo.

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Resultados de la prueba de
reduccin: observacin a 2 horas,
se muestra una coloracin ms
clara que el control negativo.

CN

Resultados de la prueba de
reduccin: observacin a 2:30
horas, al comparar la muestra con
los tubos control,
se va
decolorando ms y se asemeja al

Resultados de la prueba de
reduccin: observacin a 3 horas.

CN

Resultados de la prueba de
reduccin: observacin a 3:30
horas, la muestra se decoloro
completamente.
Se
muestra
blanca al igual que el CP.

CN
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VI.

CONCLUSIONES
De la prueba de reduccin del azul de metileno, se puede concluir
que la muestra analizada califica como una leche Buena, lo que
nos indica que haba suficiente cantidad de O2 en la muestra para
que se realice una oxido reduccin completa a las 3 horas y media
desde el inicio de la Prueba.

VII.

CUESTIONARIO

1. Describir la frmula de azul de metileno en estado oxidado

El azul de metileno (C16H18ClN3S .3H2O), es un colorante que tiene
un PM = 373, 9. Viene en cristales o polvo cristalino de color verde
oscuro, con brillo bronceado. Es inodoro o prcticamente inodoro. Es
estable al aire. Sus soluciones en agua o en alcohol, son de color azul
profundo. Soluble en agua y en cloroformo; moderadamente soluble en
alcohol. Para su preparacin (100 mL) primero pesamos 0.31g de azul
de metileno (como es slido se tritura en un matraz), luego agregamos
30 mL de alcohol etlico, mezclamos y agregamos los 100 mL de agua
destilada (para evitar precipitados lo pasamos por papel filtro). El azul
de metileno de Loeffler tiene en vez de agua destilada una solucin de
KOH al 0.01%.
2. Para qu otros alimentos se utiliza el mtodo de reduccin del azul de
metileno?
Adems del uso de este mtodo para productos lcteos (lquidos),
tambin puede ser usado para otros alimentos como por ejemplo jugos
de frutas y variedades, en los que se encuentran los jugos de soya, pia

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y otros, sobre todo alimentos lquidos en los que tambin se podra

observar el viraje de color del azul de metileno u otro colorante a usar.

3. Qu otros mtodos indirectos existen para hacer un diagnstico

microbiolgico indirecto en leche?
Entre los distintos mtodos de diagnstico microbiolgico indirecto en
leche que existen tenemos: por su actividad metablica tenemos al
mtodo de tensin de oxgeno, el de la catalasa, citocromo E oxidasa,
microcalorimetra, flujo citomtrico, el mtodo de la Impedancia y el de
turbidimetra adems del mtodo de la reductasa que pertenece a este
grupo. Hay pruebas indirectas relacionadas con las mediciones de las
concentraciones de constituyentes especficos de las clulas, entre ellas
tenemos el mtodo de Bioluminiscencia y el Limulus TEST.
Por ltimo, hay pruebas indirectas que se fundamentan en la
determinacin de compuestos metablicos que aparecen en la muestra
como consecuencia de la transformacin de los componentes del
sustrato; entre ellos tenemos la prueba del Piruvato. Adems del azul de
metileno se puede utilizar la Resazurina (que cambia de azul apizarrado
a rosa o blanco), este indicador fue introducido en Alemania (1929)
como un sustituto del azul de metileno, desde entonces esta prueba se
ha venido utilizando cada vez ms por requerir menos tiempo y al ser
ms electropositiva es ms sensible que el azul de metileno para
detectar ligeros cambios en el potencial de xido-reduccin que permite
obtener resultados en 1 o 3 horas; y la Trifenilfetrazolium.

I.

BIBLIOGRAFIA

Gua prctica: Introduccin al control de calidad de la leche cruda.

2003. Universidad de Zulia. Facultad de Ciencias Veterinarias. Ctedra
de ciencia y tecnologa de la leche. Maracaibo. Disponible en:
MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS I

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http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/materialdeapoyoparapru
ebasdeplataforma_1693.pdf

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