Universidad Nacional Agraria la Molina

Laboratorio de Enzimologa

PROCEDIMIENTOS:

0,20 ml de
buffer
citrato
+
0,25 ml de pnitrofenil
fosfato

0,20 ml de
buffer
citrato
+
0,25 ml de pnitrofenil
fosfato

T/D

Vanadat
o

0,20 ml de
buffer citrato
+
0,25 ml de pnitrofenil
fosfato

0,20 ml de
buffer citrato
+
0,25 ml de pnitrofenil
fosfato

Fluorur
o

0,05
ml de
H2O

0,05
ml de
H2O

Incubar por 35

37C

2,5 ml de
NaOH 0,1
M

Incubar por 5
37C

0,1 ml
de
suero

Incubar por 5
37C

0,05 ml
de
vanadato

0,05 ml
de
fluoruro

Incubar por
30

0,1 ml
de
suero

Incubar por 5
37C

0,1 ml
de
suero

Incubar por
30

Incubar por
30

0,1 ml
de
suero

2,5 ml de
NaOH0,1
M

2,5 ml de
NaOH 0,1
M

2,5 ml de
NaOH 0,1
M

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0,20 ml de
buffer citrato
+
0,25 ml de pnitrofenil
fosfato

Tartrato

Incubar por 5
37C

0,05 ml
de
tartrato

0,1 ml
de
suero

Incubar por
30

2,5 ml de
NaOH 0,1
M

RESULTADOS
Tabla1: Absorbancia de actividad de fosfatasa en suero
M1
M2
M3
Bl
0,17
0,137
0,148
t/c ( buffer
citrato)
0,286
0,129
0,143
Vanadato
0,227
0,122
0,147
Tartrato
0,266
0,136
0,149
Fluoruro
0,188
0,120
0,138
Lectura a 402 nm
Muestra
S2
S1
S3

M4
0,139
0,155
0,139
0,154
0,137
S4

Fuente: Elaboracin propia

Actividad fosfatasa cida (buffer citrato) en suero
1M..18400 de absorbancia
2,7174x 10-7M0,143 (absorbancia de la muestra) -0,148 (absorbancia
de reactivo en blanco)
2,7174x 10-7M..0,005 de absorbancia del p-nitrofenxido de
sodio

2,7174x 10-7 moles1000ml de solucin de muestra

p-nitrofenxido de sodio
2

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8,424x 10-10 moles3,1ml de la solucin total de la muestra
8,424x 10-10 moles30 minutos de reaccin
2,808x 10-5umolesp-nitrofenxido de sodio1minuto de reaccin

0,1ml de suero
nitrofenxido de sodio

2,808 x10-5 umoles p0,2808

1000ml de suero

umoles. Min/L

Actividad fosfatasa cida (vanadato) en suero

1M..18400 de absorbancia
5,4348x 10-8M0,147 (absorbancia de la muestra) -0,148 (absorbancia
de reactivo en blanco)
5,4348 x 10-8M..0,001 de absorbancia del p-nitrofenxido de
sodio

5,4348x 10-8 moles1000ml de solucin de muestra

p-nitrofenxido de sodio
1,685x 10-10 moles3,1ml de la solucin total de la muestra
1,685x 10-10 moles30 minutos de reaccin
5,6167x 10-6umoles p-nitrofenxido de sodio1minuto de reaccin

0,1ml de suero
nitrofenxido de sodio
3

5,6167x10-6umoles p-

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0,05617umoles.

1000ml de suero

Min/L

Actividad fosfatasa cida (tartrato) en suero

1M..18400 de absorbancia
5,4348x 10-8M0,149 (absorbancia de la muestra) -0,148 (absorbancia
de reactivo en blanco)
5,4348 x 10-8M..0,001 de absorbancia del p-nitrofenxido de
sodio

5,4348x 10-8 moles1000ml de solucin de muestra

p-nitrofenxido de sodio
1,685x 10-10 moles3,1ml de la solucin total de la muestra
1,685 x 10-10 moles30 minutos de reaccin
5,6167x 10-6umoles p-nitrofenxido de sodio1minuto de reaccin

0,1ml de suero
nitrofenxido de sodio

5,6167x10-6 umoles p-

1000ml de suero

0,05617

umoles. Min/L

Actividad fosfatasa cida (fluoruro) en suero

1M..18400 de absorbancia
5,4348x 10-8M0,138 (absorbancia de la muestra) -0,148 (absorbancia
de reactivo en blanco)
5,4348 x 10-7M..0,01 de absorbancia del p-nitrofenxido de
sodio

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5,4348x 10-7 moles1000ml de solucin de muestra
p-nitrofenxido de sodio
1,685x 10-9 moles3,1ml de la solucin total de la muestra
1,685 x 10-9 moles30 minutos de reaccin
5,6167x 10-5umoles p-nitrofenxido de sodio1minuto de reaccin

0,1ml de suero
nitrofenxido de sodio
1000ml de suero

5,6167x10-5umoles p0,5617

Actividad
fosfatasa
cida
en
suero:
0,05617+0,5617 = 0,9548umoles.Min/L

umoles. Min/L

0,2808

0,05617+

DISCUSIONES:
Los siguientes resultados de las distintas mesas, pero se realizarn el
respectivo anlisis de la mesas dos y tres. Ya que los tubos a analizar
fueron al azar y mediante los resultados tenamos que identificar si es de
hombre o de mujer, pero resulto incongruencias que se explicarn ms
adelante.
La siguiente prctica se realizo para identificar fosfatasas cidas en la
sangre coagulada de hombre, sin saber si es de varn o de mujer. Para
poder observar las diferentes reacciones debemos ver como se
manifiesta el inhibidor.
Casi todas las clulas sanguneas contienen siete isoenzimas no
eritroides de la fosfatasa cida 0, 1, 2, 3, 3b, 4 y 5. Las clulas pilosas
liberan abundante isoenzimas 5. Esto provoca que la tincin de fosfatasa
se transforme en un herramienta para diagnostico til para la
confirmacin de clulas pilosas. La clula hematopoyticas presenta
actividad de fosfatasa cida. Los granulocitos, linfocitos y monocitos
son positivos en cierto punto, hasta el agregado del cido tartrico. La
5

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actividad se inhibe debido a la falta de isoenzimas 5 (Bernadette,

2005).
Por otro lado en la prueba de nuestra prctica con el suero se
muestran diferentes resultados porque los estudios bioqumicos de
suero, en particular la fosfatasa alcalina y fosfatasa cida prosttica son
tiles para detectar la diseminacin metastsica. La concentracin de
fosfatasa cida en suero est elevada a un 70% de los pacientes con
metastsis y en algunos con enfermedad avanzada (Kelley, 1995).
En el plasma tambin existen enzimas, que provienen de la destruccin
normal de las clulas sanguneas y de otros tejidos. La mayora de las
enzimas del plasma no tienen funciones metablicas en el plasma, a
excepcin de aquellas que participan en la coagulacin sangunea. As,
la actividad de determinadas enzimas en plasma puede indicar alguna
disfuncin, tal es el caso de la pancreatitis aguda que origina niveles
elevados de amilasas srica, el cncer de prstata cursa con elevacin
de fosfatasa cida (Garrido, 2006).
Por lo tanto, es ventajoso saber con qu compuesto trabajar para poder
realizar los diagnsticos y llegar a la especulacin de que si es cncer de
prstata. As mismo, en la prctica que se llevo a cabo hemos recibido
dos muestras de varn y de mujer, pero como se dijo se llego a una
incongruencia al analizar las muestras S1 y S3 porque result ser
evidente que el nivel de fosfatasa cida era semejante al blanco y se
poda inferir que la muestra era del sexo femenino, pero al finalizar la
prctica le perteneca las muestras a un varn.

Grafica de adsorbancia
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.5

1.5

2
M1

2.5
M2

3.5
M3

4.5
M4

5.5

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Figura1: funciones de las cuatro adsorbancia para

identificar la presencia de
fosfatasas cida en la
sangre.

Como podemos observar la actividad de la fosfatasa en la siguiente

grafica. La actividad se puede definir mejor por los factores que inhiben
su actividad enzimtica. Por ejemplo: la fosfatasa cida de los eritrocitos
muestra particularidad sensibilidad a la inhibicin por formaldehido al
0.5% o iones cobre (0.2mM), mientras que la actividad de la fosfatasa
cida prosttica es mucho ms sensible a la inhibicin por iones flor
(1mM) o L-tartrato (1mM).

CONCLUSIONES:
La fosfatasa cida es una enzima lisosomal, encontrada en los lisosomas
del epitelio de la prstata y es una glicoprotena y por lo tanto la mayor
actividad por gramo de tejido de la PAP es encontrada en la glndula
prosttica, pero en nuestra muestra los niveles estar parecidos al
blanco; es decir, la fosfatasa cida en los hombres consiste de
aproximadamente una parte prosttica y el resto del hgado y se
desintegra en las plaquetas y eritrocitos. En cambio en mujeres, la
actividad srica es presumiblemente a partir del hgado, eritrocitos y
plaquetas. Adems, no debe a ver tanta variacin con la fosfatasa cida,
ya que no pueden tener problemas prostticos.
Por lo tanto la muestra del varn que estamos haciendo el anlisis no
viene de las glndulas prosttico, sino del hgado o que estos niveles
bajos significa que nuestro donante tiene cncer prosttico.

BIBLIOGRAFIA:
7

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GUTIERREZ, J., 1998, El CANCER DE LA PROSTATA, Edit: San Jose
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