Gua prctica d e l a b o r a t o r i o

MODIFICACIN D E L A A C T I V I D A D ENZIMTICA D E L A T I R O S I N A S A A P A R T I R D E
U N A M U E S T R A D E CHAMPION
p
Procedimiento
Materiales y reactivos

Espectrofotmetro - colormetro. '

Bao termosttico. /
1 0 g d e championes. /
1 g de arena de mar lavada
T a m p o n e s f o s f a t o 1 0 0 m M d e p H 6 , 7, 7 . 5 y 8 . /.
Tampn a c e t a t o 1 0 m M d e p H 3 . 6 , 4 y 5.
Ccjietol 5 m M e n tampn a c e t a t o 1 0 m M p H 5 .
C^tc9l1 m M e n tampn a c e t a t o 1 0 m M p H 5 .
^Gfecol 5 m M e n a g u a d e s t i l a d a . /
cido cinmico 1 m M e n tampn a c e t a t o 1 0 m M p H 5

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Mtodos

A i s l a m i e n t o d e la e n z i m a

F r a g m e n t a r e l m a t e r i a l biolgico y c e n t r i f u g a r p o s t e r i o r m e n t e . E n u n m o r t e r o c o n 1 g
a p r o x i m a d a m e n t e d e a r e n a d e m a r l a v a d a t r i t u r a r 1 0 g d e champin d u r a n t e 1 0
m i n u t o s . A continuacin s e aaden 3 0 m i d e tampn d e f o s f a t o 1 0 0 m M p H 7 y s e
h o m o g e n i z a d u r a n t e 1 0 m i n u t o s . C e n t r i f u g a r la m e z c l a a 1 0 0 0 0 x g d u r a n t e 3 0 . m i n u t o s .
E l s o b r e n a d a n t e e s l a f u e n t e d e e n z i m a , a l m a c e n a r a 4 C. S i n o s e d i s p o n e d e
c e n t r i f u g a f i l t r a r a l vaco c o n e m b u d o B u c h n e r , e l f i l t r a d o e s l a f u e n t e d e e n z i m a , s e
a l m a c e n a a 4 C.

Medicin d e l a a c t i v i d a d d i f e n o l a s a

M e z c l a r e n u n a c u b e t a d e 1 c m d e p e s o ptico, 1 m i d e c a t e c o l 5 m M c o n 1 m i d e
tampn d e a c e t a t o 1 0 m M d e p H 5 . Aadir 0 . 1 m i d e e x t r a c t o enzimtico y m e d i r l a
variacin d e a b s o r b a n c i a a 3 9 0 n m d e l o n g i t u d d e o n d a e n e l i n t e r v a l o d e 3 0 a 9 0
s e g u n d o s (formacin d e o - b e n z o q u i n o n a ) .
P a r a e l clculo d e l a A c t i v i d a d enzimtica s e u t i l i z a u n 8 = 1 0 5 0 M " x c m " p a r a o benzoquinona a 390 nm.
1

Clculo d e

KM

VMAX

M e d i r l a a c t i v i d a d enzimtica v a r i a n d o l a concentracin d e c a t e c o l e n l a c e l d a d e
medicin: 5 0 p M , 6 6 M M , 1 0 0 p M , 2 0 0 M M , 5 0 0 M M , 1 m M y 3 m M . H a c e r l a
representacin d e L i n e w e a v e r - B u r k c o r r e s p o n d i e n t e y e v a l u a r l a s m a g n i t u d e s d e K M y
VMAX.

Inhibicin enzimtica

S e r e a l i z a n d o s s e r i e s d e m e d i d a s d e la a c t i v i d a d , u n a c o n concentracin d e c a t e c o l d e
2 m M y o t r a c o n 0 . 5 m M y concentracin v a r i a b l e d e cido cinmico d e s d e 0 h a s t a 0 . 4
m M . R e p r e s e n t a r c o n e l mtodo d e D i x o n .

E f e c t o d e la t e m p e r a t u r a

M e d i r l a a c t i v i d a d enzimtica e n m e d i o s d e reaccin p r e v i a m e n t e a t e m p e r a d o s e n u n
bao termosttico a t e m p e r a t u r a s e n t e 2 5 C y 7 0 C d u r a n t e 1 0 m i n u t o s , aadiendo l a
e n z i m a e n e l m o m e n t o d e medir. Representar l a actividad frente a la t e m p e r a t u r a
u t i l i z a d a e n c a d a c a s o y e v a l u a r l a t e m p e r a t u r a ptima.

Efecto del pH

M e d i r l a a c t i v i d a d enzimtica u t i l i z a n d o d i s o l u c i o n e s t a m p o n e s 1 0 m M e n a c e t a t o d e
p H 3 . 6 , 4 , 5 y d e t a m p o n e s 1 0 m M e n f o s f a t o d e p H 6 , 7 y 8 ( u t i l i z a r el s u s t r a t o d i s u e l t o
e n a g u a a u n a concentracin 5 m M ) . R e p r e s e n t a r l a a c t i v i d a d m e d i a f r e n t e a l p H d e l
tampn u t i l i z a d o y e v a l u a r el p H ptimo p a r a e s t a e n z i m a .

50

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