IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

GENERALIDADES:
Este test se realiza en un suero problema (entre las que se encuentran, muestras de pacientes, donantes,
mujeres embarazadas) que presenten alo o isoanticuerpos (test de screening de AI +) a fin de conocer la
especificidad del Ac detectado, por lo que una vez detectado un Ac, el paso siguiente ser, si es necesario, la
identificacin de este.
El procedimiento consiste en examinar el suero en estudio con un panel de clulas rojas que se adquiere
comercialmente: IDENTIGEN, RESOLVE, PANOCELL.
Estos paneles traen 10 a 18 frascos con suspensiones globulares de composicin antignica conocida para lo
cual se acompaan de un listado del perfil antignico del total de las clulas que lo integran.
Esta tcnica, bsicamente es similar a la deteccin y seleccin de anticuerpos irregulares, con la diferencia de
que en este caso se enfrenta el suero en estudio a una batera de varias clulas de grupo O ampliamente
fenotipadas, y cuya reactividad nos indicar la especificidad del anticuerpo en estudio.
PRINCIPIO DEL TEST:
Usando las condiciones bajo las cuales el anticuerpo fue originalmente detectado, se mezcla el suero en estudio
con cada tipo celular del panel de identificacin, observando la presencia o ausencia de lisis o aglutinacin y
comparando el pattern de reactividad con el perfil antignico de las clulas.
Generalmente se usa para el estudio:
Salino inmediato a temperatura ambiente
Incubacin a 37 grados C
Antiglobulina
Recordar que siempre deben seguirse las instrucciones del fabricante.
Existen varios tipos de paneles (fros, calientes, tratados con enzimas, etc.) por lo que el procedimientos para
realizar este test vara de acuerdo a las caractersticas de cada tipo de panel.
Puede usarse LISS como medio de suspensin de cada clula del panel, y de esa forma puede disminuirse el
tiempo de incubacin.
Este test debe permitir identificar los Acs clnicamente significativos que mas frecuentemente se encuentran (anti
D, anti E, anti K, anti c). La temperatura de incubacin se puede variar de acuerdo al Ac que se cree estar
estudiando (T ambiente, agregar aditivo e incubar a 37 y seguido de Coombs). Recordar que es importante
ensayar en las mismas fases en que el Ac fue detectado (test de screening).
LECTURA E INTERPRETACION:
Una vez anotados adecuadamente los resultados se debe verificar primero ver si existen reacciones claramente
negativas y otras claramente positivas y de una intensidad similar.
A continuacin ver si ese resultado se corresponde a algn patrn, entre los ms frecuentes est Anti-D que se
observa en pacientes D (-), mujeres multparas Rh negativas, embarazadas que acaban de recibir la
inmunoglobulina anti-D (inmunizacin pasiva).
El modelo de reaccin se interpreta de acuerdo a las tablas de Ags del panel usado.
Para la interpretacin de los resultados se utiliza generalmente la eliminacin sistemtica de los anticuerpos
correspondientes a antgenos de todas las clulas del panel que reaccionan negativamente, ya que todas las
clulas que son aglutinadas son aquellas que poseen el Ag correspondiente.
Una reaccin negativa indica:
a) Que el panel de GR no contiene el antgeno para el anticuerpo del suero en estudio
b) Que el mtodo utilizado no es el ms sensible.

c) Que hay un error tcnico.

Se deben revisar las reacciones obtenidas con el panel y si todas las reacciones positivas se registran en
clulas que presentan el antgeno y todas las reacciones negativas se registran con clulas que carecen del Ag,
el anticuerpo ha sido identificado.
Despus de una identificacin tentativa se puede confirmar este resultado fenotipificando las clulas del paciente
o embarazada en busca del correspondiente Ag, el cual debe estar ausente.
Es usualmente fcil reconocer la especificidad de un nico Ac observando las reacciones positivas y negativas.
Ejemplo: En un set lote RA 547; se estar en presencia de un anti Fya, ya que el suero reacciona solo en la fase
de antiglobulina con las clulas 2, 3, 8, 9, 10 y 11. Los 6 tipos de clulas son Fya positivas.

Lote RA 547
G
R

Fya

Fyb

J ka

J Kb

Le
a

Le
b

sali
no

AG
T

Enzi
ma

3+

3+

3+

3+

10

3+

3+

11

Cuando el suero contiene dos o ms Acs la identificacin puede ser difcil.

En las personas Rh (-) anti D a menudo se acompaa por anti C, anti E, anti K, anti Fya, o anti P1.
El anti C raramente esta solo y comnmente se encuentra junto a anti D.
A veces existe mezcla: anti-Ce, anti-DC
En personas Rh .+ las combinaciones ms comunes son: anti E + anti K, anti K + anti Fya, anti c + anti K, anti E
+ anti c.
LA MEZCLA DE ANTICUERPOS SE SOSPECHA POR:
1. Modelo de reaccin no se ajusta a aquellos de un solo Ac.
2. Se pueden observar reacciones de fuerza variable con el pannel de clulas.
3. El suero reacciona con distintas clulas por diferentes medios y/o tcnicas.
4. Se observan aglutinaciones inexplicables cuando la especificidad de un solo Ac es confirmado
enfrentando el suero contra clulas conocidas que carecen del Ag. Ej.: Cuando se sospecha de anti e y
aglutina clulas e negativas.
En tales casos es importante:
1. Determinar Ags a las clulas autlogas para as eliminar Acs dirigidos a Ags presentes en ellas.
2. Examinar el fenotipo de las clulas que reaccionan no tratadas y no son reactivas en test de enzimas
(efecto de enzimas).

3. Examinar el patrn de reaccin de cada fase: verificar si hay variacin en la fuerza de reaccin
(intensidad).
4. Ver si influy la cigocidad: observar si la reaccin con GR homocigotos es ms intensa. Efecto de dosis:
Rh, Duffy, Kidd, MNS
5. Resultado de la prueba autloga y test de Coombs directo.
6. Recurrir a absorcin y elucin para separar mezclas de anticuerpos.
7. Descartar un error tcnico.
ANTICUERPOS CONTRA ANTIGENOS DE ALTA FRECUENCIA
Es de importancia tener en cuenta que pueden existir en el suero en estudio aloacs ocultos por Acs contra Ags
de alta incidencia, situacin que debe ser aclarada. A continuacin una lista de algunos Ags de alta frecuencia,
destacados con color rojo.
Incluidos en sistemas de grupos sanguneos :
MNS: U, Ena, ENKT, N, ENEP, ENEH, ENAV, ENDA, ENEV
Rh: Hro, Hr, hrs, Rh29, hrB, HrB, Rh39, Nou, Sec, Dav, MAR
Lutheran (LU): Lub, Lu3, Lu4, Lu5, Lu6, Lu7, Lu8; Lu11, Lu12, Lu13, Lu16, Lu17, Lu20, Lu21
Kell (KEL): k, Kpb, Ku, Jsb, K11, K12, K13, K14, K16, K18, K19, Km, K22, Tou, RAZ, KALT, KTIM, KYO
Duffy (FY): Fy3, Fy4, Fy5, Fy6
Kidd (JK):Jk3
Diego (DI): Dib, Wrb
Yt (YT): Yta
Xg (XG) :CD99
Scianna (SC):Sc1, Sc3, STAR, SCER, SCAN
Dombrock (DO):Gya, Hy, Joa
Colton (CO): Coa, Co3
Landsteiner-Wiener (LW):LWa, LWab
Chido-Rodgers (CH/RG): Ch1,Ch2, Ch3, Ch4, Ch5, Ch6
H: H
Kx (XK): Kx
Gerbich (GE): Ge2, Ge3, Ge4
Cromer (CROM): Cra, Tca, Dra, Esa, IFC, CROV, CRAM
Knops (KN): Kna, McCa, Sla, Yka, Sl3
Indian (IN):Inb, INFI, INJA
Ok (OK): Oka
John Milton Hagen (JMH): JMH,JMHK, JMHL, JMHG, JMHM
I(I): I
P1/Pk : P
Gill (GIL): GIL
Incluidos en Colecciones:
Cost: Csa
Er :Era
Vel: Vel, ABTI
Incluidos en la serie 901:
Lan, Ata, Jra, Emm, AnWj, Sda, Duclos, PEL, MAM
Identificacin final del Ac de alta incidencia

Prueba negativa frente a 2 clulas carentes del Ag de alta incidencia

El fenotipo del paciente para el correspondiente Ag debe ser negativo

PRUEBA AUTOLOGA
Es muy til en estudios de identificacin, ser negativa cuando se encuentra presente solo un aloAc.
En los pacientes con AHA toda la batera del panel resulta positiva, debindose recurrir a tcnicas que permitan
estudiar el aloAc en presencia de autoAcs.
Se debe tener cuidado en interpretarla en casos de pacientes recin transfundidos, pueden presentar un aloAc
que reaccione con las clulas circulantes del donante, causando una aglutinacin falsa positiva, pudiendo ser
interpretado el aloAc por autoanticuerpo.
MEDIOS UTILIZADOS:
Existen varios medios que pueden ser agregados a la mezcla suero-clulas.
La albmina de bovino al 22% - 30% es un medio utilizado como potenciador para pruebas de screening e
identificacin. Algunos Acs IgG (especialmente anti Rhesus) aglutinan mejor en presencia de este potenciador.
Las soluciones de bajo poder inico (Liss) pueden son empleadas rutinariamente en pruebas de identificacin de
Acs. Liss permite acortar los tiempos de incubacin de 60 a 10 - 15 minutos, al facilitar la asociacin Ag-Ac.
EFECTO DE LAS ENZIMAS:
El uso de enzimas puede dar los siguientes efectos principales:

Puede perderse totalmente la actividad del Ag

Aumentar la reactividad del Ac
Puede aumentarse la potencia de la reaccin Ag-Ac
Puede mantenerse inalterada.

Algunos Antgenos que se destruyen en presencia de enzimas son: Fya, Fy b, M-N-S-s y Xga, a veces K.
Algunos Anti cuerpos que aumentan su reactividad despus del tratamiento enzimtico son: Rhesus, Kidd,
Lewis, I, P.
Los Acs fros aumentan su reactividad con el empleo de enzimas y muchos individuos tienen anticuerpos
reactivos solo en tcnicas enzimticas y sin importancia clnica, por lo que no se recomienda efectuar paneles con
tcnicas enzimticas.
IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS EN LA TT
Tras la identificacin del Ac deber elegirse para el paciente: hemates negativos para el antgeno
correspondiente al anticuerpo inesperado o irregular, para lo cual es importante realizar:
FENOTIPIFICACION DEL DONANTE
PROBABILIDAD:
Para que la especificidad de un Ac sea concluyente, se requiere que el suero en estudio sea probado frente a
una cantidad suficiente de GR (al menos tres) que carezcan y tambin frente a una cantidad adecuada de
hemates que presenten Ags relevantes o Ags de importancia clnica.
Este nmero mnimo de reacciones (3 con GR con el Ag y 3 sin el Ag) aseguran una probabilidad (p) de 1/20 de
que la identidad del Ac sea la indicada.
La tabla siguiente muestra las probabilidades de identificacin de varias combinaciones de test reactivos y no
reactivos calculados por el mtodo exacto de Fisher de estimacin de probabilidades.

PROBABILIDAD DE IDENTIFICACION DE COMBINACIONES DE TEST REACTIVOS Y NO REACTIVOS.

MUESTRAS PROCESADAS

REACTIVOS

NO REACTIVOS

1/15

1/20

1/21

1/35

1/8

1/28

1/56

1/70

1/9

1/36

1/84

10

1/10

10

1/45

10

1/120

10

1/210

10

1/252

Un valor de p de 1/20 (0.05) en un set idntico de resultado puede ser obtenido por 1 posibilidad en 20 estudios
similares, esto indica que la interpretacin de datos es correcta.
Por ejemplo: Si un suero aglutina 3 muestras de GR que son D + y no aglutinan 3 que son D(-), el p es 1/20,
hay una probabilidad de 19 en 20 de que el Ac sea un anti D y 1 en 20 de que las reacciones se hayan dado
por azar.
Un p de 1/20 (0.05) es el mnimo valor con el cual una interpretacin es considerada estadsticamente valida,
se debe tener presente que muchos de los paneles de GR son limitados en su habilidad de dar resultados
estadsticamente concluyentes en algunos Acs de grupo sanguneo, es importante recordar estas inevitables
limitaciones cuando solo un panel de GR este disponible para usar; un valor de p menor de 1/20 se considera
como con mayores probabilidades de que las reacciones obtenidas se deban al azar.
p de 1/20 o mayores se consideran satisfactorios para confirmar la identidad del anticuerpo
CALCULO:
Los niveles de probabilidad para la identificacin de anticuerpos se calculan construyendo tablas de 2x2 en las que la presencia
y ausencia de reactividad srica se relaciona con la presencia o ausencia de un antgeno concreto en las muestras de hemates
analizadas. Una tabla 2x2 se construye como sigue:

CALCULO DE LAS PROBABILIDADES (p de la tabla)

Reacciones del Suero

Ag presente

Ag ausente

Total

POSITIVO

A+ B

NEGATIVO

C+D

A+ C

TOTAL

B+ D

A: N de reacciones positivas observadas con el Ag + en los GR.

B: N de reacciones positivas observadas con el Ag (-) en los GR.
C: N de reacciones negativas observadas con el Ag + en los GR.
D: N de reacciones negativas observadas con el Ag (-) en los GR.
N: N total de muestras de GR procesadas.
La frmula para calcular la probabilidad (p) a partir de una tabla 2x2 es la siguiente:
FORMULA
(A+B)! x (C+D)! x (A+C) ! x (B+D)!
p=
N! x A! x B! x C! x D!
NOTA:
!: Smbolo de nmero factorial, que es el producto de todos los nmeros enteros desde 1 hasta el nmero en
cuestin.
Ej.: De nmero factorial (!)
6! = 6x5x4x3x2x1 = 720
3! = 3x2x1 = 6
1! = 1
0! = 1
EJEMPLO DE CLCULO:
Para un suero reactivo con 3 muestras de clulas E+ y no reactivo con 3 muestras
E(-), la tabla 2x2 es:

REACCIONES
SERICAS

HEMATIES
Ag PRESENTE
Ag AUSENTE
E+
E(- )

TOTAL

POSITIVO

NEGATIVO

TOTAL

p=

3! x 3! x 3! x 3!
____________________
6! x 3! x 0! x 0! x 3!

36 = 1 = 0.05
720 20

El ejemplo indica que hay una probabilidad de 1 en 20 de que un anticuerpo distinto de anti-E pudiera, haber
ocasionado las reacciones observadas, debido al azar. Este nivel de probabilidad es el mnimo aceptable para la
significacin estadstica.
La prueba del suero frente a 10 muestras de hemates, 6 E (-) y 4 E+, mejora drsticamente el nivel de
probabilidad para anti-E.
CONSIDERACIONES A TOMAR EN CUENTA EN LA IDENTIFICACION DE ACS
1. Es de utilidad, como parte de la identificacin de un Ac, confirmar que los GR del paciente no presenten
el Ag, al cual esta dirigido el Ac. Ejemplo: Si se sospecha de la presencia de un anti JK a en el suero de un
paciente, sus GR debern ser tipificados y resultar JK a (-) (normalmente un individuo no forma Acs
contra Ag presentes en sus propios glbulos rojos).
2. Se debe tener mximo cuidado al interpretar los resultados de las tipificaciones del fenotipo de pacientes
con Test de Coombs positivos o de individuos recientemente transfundidos. En el primer caso solamente
debe efectuarse la tipificacin del fenotipo despus de eluir las Igs que sensibilizan sus eritrocitos. En
individuos recientemente transfundidos, las clulas del donante pueden tipificarse positivamente, a pesar
de que el paciente carece del Ag respectivo. Puede mal interpretarse el resultado y dar un fenotipo errado al
paciente.
3. Los Acs de tipo fro, a bajas temperaturas fijan Co a los GR. El Ac IgM aglutina y sensibiliza los eritrocitos
con Co. Al incubar a 37, el Ac se disocia quedando los GR sensibilizados solamente con Co, el cual
es visualizado en la fase de antiglobulina con antisuero poliespecfico. La intensidad de la reaccin
generalmente es dbil y depender de la reactividad del Ag en los eritrocitos estudiados.
4. En algunas ocasiones el Ac fro se detecta solo en la fase antiglobulina, sin haber reaccionado en la fase
de centrifugacin inmediata, pudindose en esta ocasin confundir con un Alo Ac de tipo caliente.
Para definir cul es el Ac que est reaccionando es de utilidad emplear un suero
antiglobulina que
carezca de anti-complemento. La reaccin con este reactivo ser positiva en el caso de que sea IgG la
que esta sensibilizando los GR.
5. Debe recordarse que algunos AloAcs de tipo caliente que fijan Co y que tienen importancia clnica
generalmente son de especificidad anti Kidd y otros anti Lewis que reaccionan a 37 C, pero son de
escasa ocurrencia.

6. Antes de proceder a la identificacin de Acs inesperados debe conocerse del paciente:

Grupo ABO
Tipificacin RhD
Resultados del test de AI
Sexo y edad
Antecedentes previos de test de identificacin realizados
Diagnstico
Historia transfusional y gestacional

PROBLEMAS E N L A IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS

Casos complejos se presentan cuando existen:
Sueros conteniendo Acs mltiples
Anticuerpos contra antgenos de alta frecuencia
Transfusin en AHAI

GR raros son definidos como la unidad de componente sanguneo negativo para los antgenos de alta
frecuencia y mezcla de antgenos mas comunes (AABB).
PARA LA SELECCIN DEL MEJOR METODO
Uso de metodologas sensibles:

Deben ser tan buenas como el test de AGH con LISS (LISS-IAT) en el uso de rutina. (Gold Standard)
Entregar resultados reproducibles
Costo efectivas
No detectar Acs sin importancia clnica (crioaglutininas)
Para ser empleadas en tubo, Gel, Microplacas, molecular, etc.

Automatizacin de procesos permite:

Mejor utilizacin del tiempo, recursos humanos y econmicos

Lectura objetivada

Cuando se sospecha la presencia de un Ac, pero no puede ser demostrada, son tiles los siguientes
procedimientos:
1)

Tcnicas Enzimticas: Se recomienda realizarlas cuando no se usan

detectar algunos anticuerpos (Rh, Kidd).

rutinariamente; son tiles para

2)

Reduccin de la Temperatura: muchos aloanticuerpos que reaccionan a T ambiente, reaccionan mejor a

bajas temperaturas. Otros se hacen evidentes solo a 4 C.

3)

Aumentar la relacin suero-clulas : A menudo aumenta la reactividad de Acs presentes en baja

concentracin (5 a 10 volmenes de suero por 1 de glbulos rojos); se debe tener la precaucin de
remover muy bien el suero antes de lavar para Coombs.

4)

Aumentar el Tiempo de Incubacin : para algunos Acs en salino o albmina una incubacin de 15-30
minutos puede ser insuficiente y necesitarse una hora, lo que puede aumentar la reactividad y ayudar a
clarificar el modelo de reaccin observado.

5)

Alteracin del pH: La reactividad de algunos Acs como el anti H puede realzarse al disminuir el pH del medio
a 6.5. Cuando se sospecha su presencia, un test con suero acidificado (1 vol de HC1 0,2 N a 9 volmenes de
suero disminuye el pH a 6.5) puede mostrar un pattern de reactividad definitivo.

CONCLUSIONES (ISP 2014)

NO EXISTE UN MTODO UNICO QUE SEA CAPAZ DE DETECTAR TODOS LOS ACS DE
IMPORTANCIA.
o
o

ELEGIRLO EN BASE A UN ANLISIS DE CALIDAD Y COSTO-BENEFICIO EN

CADA INSTITUCION.
MUCHA DEDICACION Y TRABAJO

EDUCACION Y CAPACITACION DEL PERSONAL DEL SS Y DEL HOSPITAL

Indicacin de la Transfusin
Pesquisa, manejo y estudio de RPT
Comit Hospitalario de Transfusiones

LECTURA DE LOS RESULTADOS