Preparacin de muestra de PCR.

La muestra de PCR mix debe de contener (general):

A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.

Nucleotidos. (dNTPps)
DNA
Pirmers
Taq. Polimerasas
Buffer de reaccin
MgCl2
Agua destilada.

Cantidades: (tubo de 50uL)

dNTPs

Concentracin
Inicial
(comunes en el
mercado)
10mM

Concentracin
final en la
reaccin

Cantidad para un
tubo

MgCl
Taq.

25mM
5U/uL

200M vara de
acuerdo al
magnesio
1.5mM
1U

1 uL

3 uL
0.2 uL

Buffer
Agua
DNA

10X
-0.1mg/ml

1X
-0.1mg

5 uL
29.8 uL
11 uL

Obtencin de ADN.
Consideremos una muestra de ADN ya est aislada. Pero si no es el caso,
pongamos el ejemplo de querer aislar ADN de un bacteria "x". Se debe de
colocar la cepa de la bacteria x en una micro centrifugadora. En s consiste
en disolver la pared bacteriana con una "mezcla digestiva" buferada. Esta
mezcla es comercial y contiene diversas enzimas ya predeterminadas que
posteriormente se tendrn que destruir a 100C para poder usar otras
enzimas en el PCR y que no haya problema con las enzimas de la mezcla
digestiva.

Materiales para el proceso:

Campana de flujo.
Hielo.
Tubos de PCR.
Termociclador.
Autoclave.

Procedimiento:
1. Colocar en la cabina de flujo laminar, en el hielo, los reactivos necesarios para la realizar la
PCR: agua destilada, Buffer (Taq. Polimerasas) 10X, MgCl 2, iniciadores y las soluciones de
nucletidos; as como los tubos de PCR autoclavados, de manera que haya un tubo por muestra,
otro para el control positivo y otro para el negativo
2. Preparar una master mix (mezcla de componentes) que se aaden de forma comn a todas
las muestras, y en el siguiente orden: agua destilada, Buffer (Taq. Polimerasas) 10X, MgCl2,
iniciadores y el ADN reverse del gen que se quiere detectar, la solucin de nucletidos y Taq
polimerasa. Repartir en tantos tubos como muestras a amplificar. El volumen final habitual de la
reaccin suele ser 25 a 50 uL
3. Colocar los tubos en el termociclador y programar los ciclos adecuados para el gen que se
quiere detectar.

PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ELECTROFORESIS.

Electroforesis de ADN.
*Para muestra de ADN genmico* (ADN Extrado directamente de tejido celular)
Se necesita de una muestra y un marcador.
Componentes de Muestra.
Agua
Tampn de carga
Muestra (ADN)

Muestra (10 uL)

3 uL
2 uL
5uL

Componentes de Marcador.
Agua
Tampn de Carga
ADN marcador conocido

Marcador (10 uL)

6 uL
2 uL
2 uL

*Para muestra de ADN producto de PCR*

Componentes de Muestra:
Muestra (10 uL)

Tampn de Carga
Muestra

2 uL
8 uL

Componentes de Marcador:
Marcador (15 uL )
Escalera de DNA de 100 pb
15 uL
COMPONENTES DEL TAMPN DE CARGA (o buffer 6x):
Este tampn aumenta la densidad de la muestras para tener ms facilidad de aplicacin en el
pocillo, pone color a las muestras, facilitando el proceso de carga, y facilita ver el avance de la
muestra

Sacarosa 4g
Cianol de Xileno (Colorante) 0,025g
Azul de bromofenol 25mg
Preparacin del tampn de carga:
Aadir sacarosa y cianol de xileno al agua des ionizada para obtener 10 ml de
solucin.
Mezclar la solucin, pasar por autoclave y conservar a 4C

GELES
II.- Gel de agarosa: No es para nuestra muestra pero es necesario para el proceso, la agarosa,
para la construccin de gel de resolucin. La agarosa es un polisacrido de galactosas alfa,
proveniente de algas ( Gellidium y Gracillaria). Los fragmentos de ADN determinados viajan a
diferentes velocidades a travs de los geles segn la concentracin de agarosa. En funcin de la
concentracin de agarosa o tampn, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20
a 50 000 pb (pares de bases). El gel de resolucin es para electroforesis de ADN es diferente al
que se usa para electroforesis de protenas.
Estos geles de preferencia se usan cuando se cuenta con ADN mayores a 100 pb.

Concentracin recomendada de gel de agarosa para separar molculas de ADN lineales:

% de agarosa
0.75
1.0
1.25
1.5
2.0
2.5
Preparacin de agarosa 2.0%

Gamas de tamaos de ADN (pb)

10 000 15 000
500 10 000
300 5 000
200 4 000
100 2 500
50 1 000

1.-Disolver 0,8 g, 1,5 g 2 g de agarosa en 98 mL de agua bidestilada.

2.-Adicionar a la solucin 2 mL de TAE 50X ( regularizar el pH ), homogeneizar y disolver la
agarosa en horno microondas o en bao Mara.

Componentes de Buffer TAE 50X (en un L de agua destilada:

Reactivo.
Tris base.
cido actico glacial
EDTA 0.5M pH 8

Cantidad
242g
571 MI
100 MI

Preparacin del gel de agarosa:

Licuar la agarosa y posteriormente enfriarla en bao mara hasta que alcance una
temperatura entre 50C y 60C.
Aadir agarosa en un volumen dependiente del tamao de la cmara (20mL-25 mL son
suficientes para dimensiones de L x A x H del gel: 8 x 6 x 0,5 cm) asegurando tener los
peines debidamente insertados.
Luego dejar enfriar por espacio de 20 minutos.
Despus que la agarosa haya quedado completamente solidificada, aadir el buffer de
electroforesis TAE 1X entre 0,5 y 1 cm por encima del gel. Posteriormente empezar a
colocar las muestras.

III.- Geles de poliacrilamida.

Preparacin del gel Poliacrilamida:
Mililitros de reactivo para la preparacin de geles a varias concentraciones
(Volumen final 100 mL)
Reactivos
Acrilamida/bisacrila
mida al 30%
Agua destilada
TBE 5X
APS

3,5%
11,6

5,0%
16,6

8,0%
26,6

10%
33,3

12,0%
40,0

20%
66'6

67,7
20,0
0,7

62,7
20,0
0,7

52,7
20,0
0,7

46,0
20,0
0,70

39,3
20,0
0,7

13,7
20,0
0,7

BUFFER DE RESOLUCIN STOCK TRIS-BORATO (TBE) 5X:

Reactivo
Tris base
cido brico
EDTA 0,5 Ph 8,0
Preparacin:

Cantidad
54 g
27, 5 g
20 MI

Aproximadamente 5 mL de la solucin debern ser preparado en caso de trabajar con

geles pequeos (aproximadamente 8 - 10 cm de ancho x 5 - 7 cm de largo y un espesor de
0,7 - 0,8 mm). La concentracin de poliacrilamida para ADN depender de los objetivos de
trabajo del operador.
Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas
a fin de asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el
volumen.
Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta el
tope. Inmediatamente despus, colocar el peine de tefln entre ambos vidrios secando
con papel toalla los restos de poliacrilamida que se lleguen a derramar.
Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 - 30 minutos, usando
como control la solucin de poliacrilamida que qued remanente en el tubo.
Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya
formados con chorro suave de agua destilada.
APS: Persulfato amonico, genera radicales libres, indicador de reaccin de polimerizacin,
para formar el gel.
TEMED: N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina, (propagador) La tasa de polimerizacin y las
propiedades del gel resultante dependen de la concentracin de APS y TEMED.
Aumentando su contenido se disminuye la longitud media de la cadena de polmero y se
incrementa la turbidez del gel, al tiempo que disminuye su elasticidad.

Electroforesis de Protenas.
Como se prepara la muestra de protenas:

Mezclar la protena con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x) en
proporcin (tres partes de la muestra y una de buffer).
Asegurar la tapa de los tubos con lmina extensible de parafina y someter la muestra a
una temperatura de 100 C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar los viales en una
gradilla para microtubos dentro de un recipiente o vaso de precipitacin con agua
hirviendo
Controlar la temperatura con un termmetro adecuado.
Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitacin y centrifugarlos por
diez segundos a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un
recipiente con hielo hasta el proceso de electroforesis.

GELES.
Gel de poliacrilamida: Continuo a discontinuo denaturante, se llama discontinuo por estar
conformado por dos geles, uno de resolucin y otro de empacamiento, con diferente
concentracin, composicin y pH. Estos geles parecen estar unidos, pero tienen una fase de
separacin visible a trasluz. Se preparan por separado.

Gel
de
Cuerpo del
migraran y
protenas.

resolucin:
gel por donde
se separaran las

Preparacin de Gel de resolucin:

Marcar el lmite hasta donde la matriz de acrilamida ser vertida, trazando una lnea
horizontal en el vidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicacin exacta de la
lnea, colocar el peine entre ambos vidrios y medir entre uno y cinco centmetros
(dependiendo del tamao de la cmara) por debajo de los dientes del peine.
Realizar la preparacin del gel de resolucin a una concentracin de acuerdo a las
necesidades, mezclando los componentes en el orden que se indica en el Anexo A.
Aproximadamente 5 mL de solucin debern ser preparados en caso de trabajar con geles
pequeos de aproximadamente 8 - 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de
0,7 - 0,8 mm. La concentracin de poliacrilamida a usar depender de las necesidades del
operador.
Una vez finalizada la preparacin de la solucin, aadir los catalizadores APS y TEMED uno
por uno, tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el volumen.
Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la
lnea trazada. Posteriormente, aadir una capa de butanol-agua (aproximadamente 100
L) sobre la solucin de poliacrilamida para evitar el ingreso de molculas de oxgeno que
retarden la polimerizacin.
Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control
polimerizacin la solucin de poliacrilamida remanente.

Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel
varias veces con agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no
polimerizada y butanol.

Gel de empacamiento: Se localiza en la parte superior del sistema formando los pocillos donde
se depositarn las muestras
Componentes de preparacin de empacamiento al 5% de acuerdo a su volumen.

Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas
a fin de asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen
de la solucin.
Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cmara y sobre el gel de resolucin ya
polimerizado. Inmediatamente despus, colocar el peine entre ambos vidrios secando con
papel toalla los restos de poliacrilamida que lleguen a derramarse.
Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos usando
como control de la polimerizacin la solucin de poliacrilamida que qued remanente en el
tubo.
Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya
formados con chorro suave de agua destilada.

El punto de interseccin de una curva de amplificacin con el umbral se denomina Ct (Threshold

Cycle). Este punto indica el ciclo en el que la fluorescencia alcanza el valor umbral. Cuanto ms
ADN inicial tenga la muestra antes se alcanza este valor, pues ser menor el nmero de ciclos
necesarios (Ct menor) para ello