FCD 542 e

Profesor Patrocinante
Dra. Marcia Costa L.

Instituto de Ciencia y Tecnologa de los
Alimentos
Facultad de Ciencias Agrarias.
Extraccin, caracterizacin parcial y determinacin de propiedades

fisiolgicas in vitro de fucoidina y laminarina a partir de Macrocystis
pyrifera y Durvillaea antarctica.
Tesis de Grado presentada como parte de

los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioqumica y Ttulo
Profesional de Bioqumico.
OSCAR OLIVER DAZ ROLDN

VALDIVIA CHILE
2014
Solo en las condiciones de mi vida diaria,

puedo estudiar donde yacen mi fuerza y mi debilidad.
Gurdjieff
AGRADECIMIENTOS
A mis padres y abuelos, que con su esfuerzo, crianza, valores, paciencia, amor y cario, han
concebido en mi, parte de sus anhelos, pero por sobre todo, me han regalado unas grandes alas e
imaginacin, para llegar lo ms lejos que Dios y el destino me permitan en esta vida (humanamente
hablando).
A mis hermosos cachorros, Johny, Toms y Gaspar, que ms que simples animales, son
unos incondicionales y fieles amigos, que fecundan mi casa con alegra y son considerados como
miembros de mi familia.
A mis machos alfa (algunos no tanto) por los vacilones vividos, historias indignas e
irreproducibles, pero por sobre todo, hermandad incondicional; Pablosky, Jano, Gonzalo Ivn,
MatuSaint, Adolfo, abuelin y Andrs.
No puedo dejar de mencionar adems a, Lisette Yaez, Paulina Figueroa, Daniela Ampuero,
Leo Castro, Seba Gonzlez, Javito Aguinaga, Pamela Burdiles, Polin Lobos, Andrea Foitzich,
Silvia Snchez, Claudia Fuentealba, Eduardo Maureira, Claudia Roa y los cabros del baby.
Gracias a todos ustedes, por los agradables momentos vividos y las buenas vibras de siempre.
A mis compaeros de laboratorio, Alexandra Gonzlez, Toa Seplveda, Yoli Garca y
Francisco Palma. A tesistas como, Vicky Lpez, Karin Milling, Marta Muoz, Gabriela, Fernando
Quezada y Olga Garca. A personal del Instituto, como Don Otto, Don Tito, Paula Pozo, Susana
Agero y Erwin Ojeda. Gracias a todos, por su disposicin, risas, sugerencias o facilitando material
de trabajo () gracias de corazn.
A mis compaeros de la carrera de Bioqumica, Jorge Torres, Cristin Marchant, Rodrigo
Sandoval, Agustn Barra, Rodrigo Carrasco, Paulina Ferrada, Magdalena Esparza, Javiera
Campos, Consuelo Geoffroy, y Vanesa Muoz. Gracias por todo el transcurso y por esas horas de
estudio en los primeros aos. Donde quiera que estn, mucha suerte a todos en sus futuros
proyectos.
A Andrea, por su apoyo y consejos incondicionales, sin duda, un pilar fundamental en los
ltimos aos de mi vida. Con cario y agradecido eternamente por todo lo vivido junto a ti.
Al Profesor Dr. Patricio Godoy e Instituto de Microbiologa Clnica, por su ayuda en el
desarrollo de la seccin antifngica de esta tesis, la paciencia y disposicin a ensear; muchas
gracias. No puedo dejar de lado a mis compaeras en este pasaje, Vanesa y Yoli.
A la Sra. Gloria Muoz, QF del Hospital Base Valdivia, por su ayuda en la seccin
antimicrobiana de esta tesis.
A la Profesora QF Claudia Orstegui, por su apoyo y disposicin a formar parte de este
trabajo de tesis, muchas gracias.
A mis profesoras de internado hospitalario, QF Ximena Lagos, QF Ingrid Navarrete, y QF
Eliana Snchez, por facilitarme tiempo para dedicar al proceso terminal de titulacin. A su vez, a
mis compaeros de internado perteneciente a la carrera de Qumica y Farmacia, Mackarena A,
Francisco A y Andy A, muchas gracias.
A los profesores, Dra. Marcia Costa, Dr. Ociel Muoz y Prof. Mariela Horzella, por su
disposicin a ayudar y corregir mis errores. Atentamente muchas gracias.
Finalmente a Francisca, por toda la ayuda brindada en la ltima parte de este trabajo de
tesis, por ser la mujer que eres, y por ser sinnimo de una nueva etapa en mi vida. Miles de gracias.
Este trabajo fue realizado en la Universidad Austral de Chile y fue financiado por el
proyecto FONDEF DOi 1095.
i
INDICE GENERAL
1. RESUMEN
1.1SUMMARY
2. INTRODUCCIN.
2.1 Algas marinas.
2.2 Algas pardas. (Reino Protista, Filum Heterokontophyta, Clase Phaeophyceae)
2.3 Estructura celular en algas pardas.
13
2.4 Algas Kelp
17
2.5 Macrocystis pyrifera.
17
2.6 Durvillaea antarctica.
30
2.7 Polisacridos de reserva en algas pardas: Laminarina.
32
2.8 Polisacridos extracelulares y de la pared celular en algas marinas.
34
2.9 Polisacrido extracelular en algas pardas: Fucoidina.
36
2.10 Importancia mdica y Propiedades fisiolgicas en algas marinas.
36
2.10.1 Protothecosis.
36
2.10.2 Silicosis.
43
2.10.3 Bocio.
43
2.10.4 Arseniosis.
43
2.10.5 Alergias.
43
2.10.6 Actividad Anticancergena.
43
ii
2.10.7 Actividad Antihelmntica.
44
2.10.8 Actividad anticoagulante.
44
2.10.9 Actividad Laxante.
44
2.10.10 Actividad antifngica.
44
2.10.11 Actividad antiviral.
45
2.10.12 Actividad inmunolgica e inflamacin.
46
2.10.13 Actividad Hipolipemiante e Hipotensora.
47
2.10.14 Actividad antibacteriana.
48
2.10.15 Actividad Antioxidante
52
2.11 Digestin enzimtica y mtodo de deteccin de productos de hidrlisis.

2.11.1 Enzimas.
57
57
2.11.2 glucanos y distribucin en levaduras, hongos y algas segn el tipo de

enlace glucosdico que presentan.
58
2.11.3 Tcnicas de deteccin, Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
58
2.12 Hiptesis
61
2.13 Objetivo General
61
2.14 Objetivos Especficos
61
3. MATERIALES Y MTODOS.
62
3.1 Extraccin de polisacridos.
62
3.2 Deteccin de polisacridos.
65
iii
3.3 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
65
3.4 Recoleccin de fracciones de polisacridos (pick cromatogrficos) desde HPLC. 66

3.5 Hidrlisis enzimtica de polisacridos.
66
3.6 Test de glucosa.
67
3.7 Ensayo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS).
67
3.8 Determinacin cualitativa de Sulfatos.
68
3.9 Determinacin de la Actividad Antioxidante.
69
3.9.1 Estndares y Reactivos.
69
3.9.2 Mtodo DPPH.
69
3.9.3 Mtodo de Fenoles Totales.
71
3.10 Determinacin de la Actividad Antibacteriana.
72
3.10.1 Cepas bacterianas.
72
3.10.1.1 Bacillus subtilis ATCC 33608.
72
3.10.1.2 Escherichia coli ATCC 25922.
72
3.10.1.3 Klebsiella pneumoniae ATCC 23357.
73
3.10.1.4 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
73
3.10.1.5 Shigella sonnei OSP 2047 01.
73
3.10.1.6 Staphylococcus aureus ATCC 25923.
74
3.10.1.7 Staphylocccus epidermidis ATCC 12228.
74
3.10.1.8 Streptococcus pyogenes OSP 344 10.
74
iv
3.10.2 Conservacin de cepas de referencia.
74
3.10.3 Activacin de las cepas.
75
3.10.4 Recuento de colonias bacterianas.
75
3.10.5 Estndar de medicamentos Unasyn, Inem y Sulperazon.
76
3.10.5.1 Unasyn
76
3.10.5.2 Inem
76
3.10.5.3 Sulperazon
76
3.10.6 Ensayo de Sensibilidad de las cepas de referencia frente a los extractos de

Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica.
77
3.10.7 Diseo experimental para la inhibicin bacteriana por medio de pocillos o

discos filtro.
81
3.10.8 Anlisis estadsticos.
82
3.11 Determinacin de la actividad antifngica.
82
3.11.1 Cepas fngicas.
82
3.11.2 Cultivo de cepas fngicas.
83
3.11.3 Ensayo de Sensibilidad de las cepas fngicas frente a los extractos de

83
3.11.4 Diseo experimental para la inhibicin bacteriana por medio de pocillos

o discos filtro.
85
4. RESULTADOS.
85
v
4.1 Extraccin y deteccin mediante HPLC, de los polisacridos Laminarina y
Fucoidina desde las algas Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica.
85
4.2 Deteccin mediante HPLC, de los polisacridos Laminarina y Fucoidina,

obtenidos por la metodologa de extraccin segn Nakamura Black.
90
4.3 Contenido de Laminarina y Fucoidina en los extractos algales.
92
4.4. Hidrlisis enzimtica de polisacridos.
95
4.4.1 Estandarizacin del mtodo DNS (ANEXO 3.1).
95
4.5 Deteccin de los productos de hidrlisis de Laminarina y Fucoidina

mediante HPLC
101
4.6 Determinacin cualitativa de sulfatos.
105
4.7 Determinacin de la actividad antioxidante.
105
4.7.1 Estudio de Estabilidad del mtodo DPPH Brand Williams.
105
4.7.2 Estabilidad del ensayo DPPH en condiciones de Luz Oscuridad.
107
4.7.3 Estabilidad del ensayo DPPH a distintas temperaturas.
107
4.7.4 Estado estacionario del ensayo DPPH a 517 nm.
111
4.7.5 Determinacin de la concentracin ptima a utilizar para extractos

liofilizados de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica.
111
4.7.6 % de Inhibicin del radical libre DPPH (%IRL).
114
4.7.7 % DPPH remanente, EC50, TEC50 y AE.
114
4.7.8 Actividad antioxidante equivalente al cido ascrbico (VCEAC) y Actividad

antioxidante equivalente a TROLOX (TEAC).
119
vi
4.7.9 Mtodo de Fenoles Totales (FT) o Mtodo de Folin Ciocalteu.
121
123
132
5. DISCUSIN.
135
6. CONCLUSIONES.
142
7. BIBLIOGRAFA.
144
ANEXOS.
160
ANEXO 1
161
ANEXO 1.1. PROTOCOLO BLACK DE EXTRACCIN DE LAMINARINA

Y FUCOIDINA.
161
ANEXO 1.2. PROTOCOLO BLACK VARIANTE DE EXTRACCIN DE

LAMINARINA Y FUCOIDINA.
162
ANEXO 1.3. PROTOCOLO IVIN DE EXTRACCIN DE LAMINARINA Y

FUCOIDINA.
163
ANEXO 1.4. PROTOCOLO NUEVO DE EXTRACCIN DE LAMINARINA

Y FUCOIDINA.
164
ANEXO 1.5. PROTOCOLO NAKAMURA DE EXTRACCIN DE

165
ANEXO 1.6 PROTOCOLO NAKAMURA BLACK DE EXTRACCIN DE

ANEXO 2
ANEXO 2.1 ESQUEMA DE RECUENTO DE COLONIAS BACTERIANAS.
166
167
167
vii
ANEXO 2.2 ENSAYO DE SENSIBILDIAD DE LAS CEPAS DE REFERENCIA
FRENTE A LOS EXTRACTOS DE MACROCYSTIS PYRIFERA Y
DURVILLAEA ANTARCTICA.
168
ANEXO 2.3 PREPARACIN DE DILUCIONES DE MUESTRAS DE

ESTNDARES DE FUCOIDINA - LAMINARINA Y MUESTRAS DE
ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIBITICA.
ANEXO 3
169
170
ANEXO 3.1 PROTOCOLO SELECCIONADO DE LA ESTANDARIZACIN

DEL MTODO DE DNS.
ANEXO 4
170
171
ANEXO 4.1. CURVA DE CALIBRACIN DE FUCOIDINA.
171
ANEXO 4.2. CURVA DE CALIBRACIN DE LAMINARINA.
172
ANEXO 5
173
ANEXO 5.1 EC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA
173
ANEXO 5.2 TEC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA.
174
ANEXO 6
175
ANEXO 6.1 CURVA DE CALIBRACIN TROLOX (TEAC)
175
ANEXO 6.2 CURVA DE CALIBRACIN CIDO ASCRBICO (VCEAC)
176
ANEXO 7
178
ANEXO 7.1 CURVA DE CALIBRACIN DE CIDO GLICO A 765 nm

(MTODO DE FENOLES TOTALES).
177
viii
NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de clasificacin del filum Phaeophyta y sus rdenes Laminariales y
Fucales.
Figura 2. Estructura de la pared celular en Algas pardas.
14
Figura 3. Diagrama esquemtico de una clula de alga parda..
15
Figura 4. Ciclo de vida de Macrocystis pyrifera.
21
Figura 5. Conformacin anatmica general de Macrocystis pyrifera
22
Figura 6. Conformacin anatmica general de Durvillaea antarctica.
31
Figura 7. Estructura del polisacrido de reserva Laminarina.
33
Figura 8. Molculas fibrilares de la pared celular algal.
34
Figura 9. Estructura de fucoidina .
39
Figura 10: Espectro de absorcin del DPPH.
70
Figura 11. Esquema representativo de las placas de antibiograma .
80
Figura 12. Cromatograma de molculas estndar de Maltosa, Fucosa, Glucosa y

cido algnico.
87
Figura 13. Cromatograma de estndares.
88
Figura 14. Cromatograma de extractos algales de Macrocystis pyrifera, obtenidos

por las distintas metodologas de extraccin segn Deville et al.
89
Figura 15. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antarctica, obtenidos

por las distintas metodologas de extraccin segn Deville et al.
91
ix
Figura 16. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antarctica, obtenidos
por la metodologa de extraccin segn Nakamura Black.
93
Figura 17. Cromatograma extractos de protocolos Nakamura Black del alga

Durvillaea antarctica.
94
Figura 18. Hidrlisis enzimtica de estndares.
96
Figura 19. Hidrlisis enzimtica de extractos algales.
97
Figura 20. Test de DNS de muestras estndar de laminarina y fucoidina.
98
Figura 21. Test de DNS de extractos algales.
99
Figura 22. Cromatograma de estndares de polisacridos y estndares de productos

de hidrlisis.
102
Figura 23. Cromatograma de productos de hidrlisis de ensayo enzimtico con la

enzima -glucanasa.
103
Figura 24. Cromatograma de productos de hidrlisis de ensayo enzimtico con la

enzima laminarinasa.
104
Figura 25. Determinacin cualitativa de sulfatos.
106
Figura 26. Estabilidad ante la exposicin de luz oscuridad en el ensayo DPPH.
108
Figura 27. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variacin de temperatura.
109
Figura 28. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variacin de temperatura.
110
Figura 29. Estado estacionario del ensayo DPPH a 37C y 517 nm.
112
Figura 30. Concentracin ptima a utilizar para extractos liofilizados de

113
Figura 31. Antibiogramas de Extractos de protocolo nuevo de Macrocystis

pyrifera.
126
Figura 32. Antibiogramas de estndares antibiticos Inem, Unasyn, Sulperazon. 127

Figura 33. Inhibcin de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis por efecto de las distintas diluciones de extracto de
Macrocystis pyrifera.
130
Figura 34. Actividad antifngica de Estndar comercial de Laminarina 25 mg/ml y

Fucoidina 25 mg/ml
133
Figura 35. Actividad antifngica para el gnero Aspergillus.
134
xi
INDICE DE TABLAS
Tabla I. Tres filum algales y sus caractersticas principales.
11-12
Tabla II. Principales especies de algas pardas, distribucin geogrfica y

principales usos.
14
Tabla III. Composicin proximal en algas Phaeophyta, porcentaje expresado en

base seca.
24
Tabla IV. Composicin aminoacdica en algas Phaeophyta.
25
Tabla V. Contenido de cidos grasos en algas Phaeophyta. (%).
26
Tabla VI. Contenido de tocoferoles (mg/kg de lpido).
27
Tabla VII. Contenido de compuestos carotenoides en algas Phaeophyta

expresado en g/g en peso seco.
28
Tabla VIII. Concentracin de polifenoles totales presentes en las algas Phaeophyta.
29
Tabla IX. Composicin qumica de algunos fucoidanos segn la especie algal.
37
Tabla X. Variacin del Peso Molecular de la Fucoidina segn la especie algal.
38
Tabla XI. Propiedades fisiolgicas de polisacridos de algas o de extractos algales,

reportados en humanos y otros organismos.
Tabla XII. Molculas con actividad biolgica en algas marinas.
40
41 - 42
Tabla XIII. Lista de algunas algas marinas reportadas con actividad

antibacteriana.
51- 52
Tabla XIV. Categorizacin de grupos antioxidantes, ejemplos de ellos y fuente

algal de la cual proceden.
54
Tabla XV. Compuesto antioxidante algal con actividad fisiolgica o efecto

beneficioso para la salud.
56
Tabla XVI. Distribucin de 1,3 glucanos en levaduras, hongos y algas.
59
xii
Tabla XVII. Modificaciones realizadas a protocolos Nakamura Black (NB)
64
Tabla XVIII. Muestras estudiadas en ensayo de antibiograma.
79
Tabla XIX. % Inhibicin del radical libre DPPH
115
Tabla XX. % DPPH remanente segn concentracin de extracto algal utilizada.
117
Tabla XXI. % DPPH remanente segn tiempo de ensayo DPPH.
118
Tabla XXII. EC50, TEC50 y AE de extractos de alga Macrocytis pyrifera.
120
Tabla XXIII. VCEAC y TEAC para extractos de Macrocystis pyrifera y

Durvillaea antarctica.
122
Tabla XXIV. Fenoles Totales en extractos de Macrocytis pyrifera y Durvillaea

antarctica.
124
xiii
LISTADO DE ABREVIATURAS.
AE
Eficiencia antiradical
CST
Caldo Soya Tripticasa
Dictiosoma
DA
Durvillaea antarctica
DNS
cido 3,5 Dinitrosalcilico.
DPPH
2,2 Difenil 1 picrilhidrazilo
EPOC
Enfermedad pulmonar obstructiva crnica
EROS/ROS
Especies reactivas de oxgeno
Plasmodesmo
Fib
Microfibrillas de DNA
GLUT4
Transportador de glucosa tipo 4
GSH
Glutatin reducido
HDL
Lipoprotena de alta densidad
IR
ndice de refraccin
% IRL
% Inhibicin del radical libre
ITU
Infeccin tracto urinaria
LCAT
Lecitina colesterol acil transferasa
LDL
Lipoprotena de baja densidad
LH
Lipasa Heptica
LPL
Lipoprotena lipasa
xiv
M
Mitocondrias
MP
Macrocystis pyrifera
Ncleo
Nu
Nuclolo
Prenoide
Ps
Saco prenoideal
PVDF
Membrana de transferencia fluoruro de polivinilideno
TCA
cido tricloroactico
TEAC
Actividad equivalente al TROLOX
TROLOX
cido 6 hidroxi 2, 5, 7, 8 tetrametilcromano 2 carboxlico
Vacuolas
VCEAC
Actividad equivalente al cido ascrbico
VIH
Virus de la inmunodeficiencia adquirida
VMT
Virus del mosaico del tabaco
1. RESUMEN
Los polisacridos son molculas biolgicas que cumplen diversas funciones en los organismos
vivos. Algunas de estas molculas poseen actividad antiglicmica, antioxidante, anticoagulante,
antibacteriana y antifngica, entre otras.
El objetivo de este trabajo de tesis fue extraer y detectar polisacridos con capacidad
antibacteriana, antifngica y antioxidante desde las algas pardas Macrocystis pyrifera y Durvillaea
antarctica. La extraccin de los polisacridos laminarina y fucoidina, fue realizada a base de los
protocolos propuestos por Deville et al., la deteccin de estos fue llevada a cabo por la tcnica de
HPLC IR.
Para determinar la capacidad antibacteriana de ambos polisacridos, se aplic la tcnica de
antibiograma en ciertas cepas bacterianas, tales como Bacillus subtilis ATCC 33608, Escherichia
coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 23357, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Shigella sonnei OSP 2047-01, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 y Streptococcus pyogenes OSP 344-10, siendo sta positiva utilizando extractos de
Macrocystis pyrifera, en cuanto a la aparicin de halos de inhibicin, para Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Bacillus subtilis.
Para la determinacin de la capacidad antifngica, se trabaj con cepas clnicas del gnero
Candida y Aspergillus, resultando esta prueba negativa en cuanto a la aparicin de halos de
inhibicin, en todos sus casos.
La determinacin de la capacidad antioxidante fue positiva para los extractos de laminarina
y fucoidina, efectundose sta por medio de la tcnica de DPPH (Mtodo de Brand-Williams) y
Fenoles totales (Mtodo Folin-Ciocalteu).
1.1 SUMMARY
Polysaccharides are biological molecules that fulfill different functions in living
organisms. Some of these molecules have antiglycemic, antioxidant, anticoagulant, antibacterial
and antifungical activities.
The objective of this thesis, was to extract and detect polysaccharides with antimicrobial
and antioxidant capacity from brown algae Macrocystis pyrifera and Durvillaea antarctica. The
extraction of this polysaccharides was done from the basis of the extraction method proposed by
Deville et al., the detection of this molecules was realized by HPLC IR technique and the
application of molecular exclusion columns.
To determine the antibacterial capacity from both polysaccharides, it was applied the
antibiogram technique on certain bacterial strains, such as Bacillus subtilis ATCC 33608,
Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 23357, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853, Shigella sonnei OSP 2047-01, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus
epidermidis ATCC 12228 and Streptococcus pyogenes OSP 344-10, being positive (in matters of
inhibition halos) to Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Saphylococcus epidermidis and
Bacillus subtilis.
For the determination of antifungic activity, clinical strains of the gender Candida and
Aspergillus were used, being this negative (in matters of inhibition halos) in all the cases.
The determination of the antioxidante capacity, was positive for the laminarin and fucoidan
extracts, being this realized by the DPPH technique (Brand-Williams method) and Total phenols
(Folin-Ciocalteu method).
2. INTRODUCCIN.
2.1 Algas marinas.
Las algas marinas son un grupo grande y heterogneo de organismos vegetales, unas 50000
especies, entre los que se cuentan desde especies unicelulares hasta plantas enormes que pueden
medir sobre 50 metros (Ortiz, 2011). Adems, estos organismos se clasifican como protistas
fottrofos, donde se incluyen todos los eucariontes sin verdaderos tejidos ni rganos. 1
Desde el punto de vista morfolgico, las algas marinas son organismos estructuralmente
simples, sin embargo, para compensar tal limitacin han desarrollado eficientes mecanismos
fisiolgicos de respuesta, cuyas modificaciones a menudo presentan valor adaptativo. En este
sentido, los valores calricos y constituyentes energticos presentan variaciones ligadas con las
estrategias de desarrollo y consiguiente adecuacin biolgica de las especies (Lewin, 1981).
Adicionalmente, se considera a las algas marinas, como vegetales acuticos y productores
primarios, responsables de alrededor del 80% de la produccin del oxgeno atmosfrico. Su
organizacin biolgica es sencilla, pudiendo ser protofitos o talfitos; pueden presentar una
diversidad pigmentaria que ha sido aprovechada como parmetro para su clasificacin. De acuerdo
a su hbitat, se las puede encontrar tanto en el plancton, neuston, como en el bentos (Wratten y
Faulkner, 1977).
Las algas marinas viven en dos tipos de condiciones muy distintas: unas lo hacen flotando en
las capas ms superficiales del agua, son unicelulares y se las conoce con el nombre de algas
plantnicas; las otras viven adheridas a rocas u otros sustratos, y se las conoce con el nombre de
1
Brown Algae 3G. Coastal and Marine Life.
Algas bentnicas (Santelices, 1991). La distribucin, el asentamiento, el crecimiento y la

propagacin de las algas dependen directamente de las corrientes oceanogrficas, al igual que su
estructura fisiolgica.
Las algas bentnicas por su parte, crecen fijas a un sustrato. Hoy da, ese sustrato puede ser
artificial, permitiendo el desarrollo de una tecnologa con vistas al mximo aprovechamiento de
los recursos algolgicos. En la naturaleza, en tanto, el sustrato se localiza preferentemente en la
regin litoral (Neushul y Luning, 1978).
Las algas del bentos (bentnicas) son macroscpicas y presentan una gran variedad de formas
y colores. En consideracin a la mayoritaria sntesis de un determinado pigmento, se pueden
distinguir a grandes rasgos en tres grandes filum, a saber: algas verdes (Chlorophyta), algas pardas
(Phaeophyta) y algas rojas (Rhodophyta) (Hay et al., 1986).
Es relevante mencionar que, no todas las especies de algas presentan el color tpico del grupo
al cual pertenecen, as por ejemplo, Gymnogongrus furcellatus es un alga roja de color pardo.
Hay diversos factores que pueden enmascarar o alterar el color de una misma especie, como
por ejemplo, la presencia simultnea de otros pigmentos, la intensidad de la radiacin solar, el
momento del ciclo de vida del alga, la presencia de rganos reproductores, etc. (Wheeler, 1980).
En el litoral, las algas marinas bentnicas pueden ubicarse en diferentes zonas, tales como:
supramareal, inframareal e intermareal, que es la zona ms afectada por los cambios de
temperatura, humedad y salinidad, debido al efecto de las mareas.
En Chile central, se han descrito para la zona intermareal tres cinturones permanentes de algas
y varios cinturones estacionales (Santelices, 1981). Los tres cinturones permanentes incluyen una
franja de algas calcreas crustosas (Lithophyllum lithothamnion), un cinturn de algas pardas
formado por poblaciones de Lessonia nigrescens y Durvillaea antarctica y un cinturn de algas

crustosas (Codium dimorphum, Gelidium spp), con talos rastreros y coalescentes que forman una
cubierta vegetal continua.
El anlisis de los factores causales de la organizacin de estos cinturones, indica que su lmite
superior est regulado por factores abiticos, su lmite inferior por presin de pastoreo, mientras
que su estructura interna (importancia relativa de las especies con morfologa semejante), est
regulada por la competencia inter e intraespecfica (Wylie y Paul, 1988).
Las algas marinas bentnicas, slo usan el sustrato como lugar de fijacin. Tanto los nutrientes,
como el oxgeno se encuentran disueltos o en suspensin en el agua, la cual con su constante
agitacin, ayudada por el flujo y reflujo, los pone a disposicin de la planta. Este intercambio entre
el alga y el agua que la circunda, se ve facilitado si la planta est adherida a un sustrato y si su talo
opone resistencia, en caso contrario, este proceso se interrumpe y el alga muere.
En lo que respecta a su actividad fotosinttica, las algas bentnicas producen una variada gama
de compuestos orgnicos, los cuales se acumulan principalmente en sus paredes celulares. Se ha
demostrado que la composicin qumica de las algas sufre variaciones, las que pueden estar
relacionadas con los cambios estacionales, estado de desarrollo, ubicacin geogrfica, etc. (Ramus,
1990, Reed et al., 1985, Steinberg, 1989).
Por otra parte y respecto a la importancia industrial de las algas, podemos mencionar que; la
industria mundial se abastece de cantidades considerables de algas de distintos tipos, con miras a
la confeccin de una variedad de productos que ayudan al hombre a vivir mejor. Entre las algas de
mayor utilizacin se debe nombrar a especies de los gneros Gracilaria y Gelidium, ocupadas en
la obtencin de agar agar; Iridae, para la obtencin de carragenanos y Macrocystis, Lessonia y
Gymnogongrum para la produccin de alginatos (Abbott, 1979). En el caso especfico de

Macrocystis pyrifera, el producto extrado ms importante, tanto por su volumen como por su uso
es el cido algnico, un polmero coloidal de cido manurnico y gulurnico. Las aplicaciones del
cido algnico son mltiples, como por ejemplo, como espesante, emulsionante, estabilizante de
alimentos, frmacos, bebidas, textiles y muchos otros productos (Iturriaga y Hope, 1977, Kajiwara
et al., 1990).
En el plano ecolgico, las poblaciones de algas bentnicas en general y de Macrocytis pyrifera
en particular, forman un ambiente de gran analoga con el bosque y con ello proveen de alimento,
proteccin y sustrato de asentamiento a numerosas otras plantas y animales marinos; a su vez,
muchos de los peces y moluscos asociados a este bosque, son comestibles por los humanos. An
ms, la produccin orgnica de Macrocystis, fuera de la consumida por erizos y peces herbvoros,
eventualmente se transforma en material arrastrado, que a su vez sirve de alimento a los otros
organismos que viven fuera de la pradera de Macrocystis. Despus que un alga adulta de este tipo
desaparece como consecuencia del pastoreo, desgarro u otro accidente, la iluminacin del fondo
generalmente aumenta, lo que facilita el poblamiento de la zona del disco con otros ejemplares
juveniles de la misma especie preferentemente, antes que por otras especies (Parker, 1966. Gerard
et al., 1976. Kobayashi, 1989).
En Chile existen aproximadamente 550 especies de algas bentnicas, aunque las conocidas
ampliamente por la poblacin representan menos del 1 % de ellas. Las especies ms comunes son
exportadas como materia prima , usadas internamente en las industrias de alginatos y agar, y en
menor grado consumidas como alimentos (Chapman y Chapman, 1980); pero durante los ltimos
aos ha aumentado significativamente la importancia econmica y social de este recurso natural
renovable.
Las algas en general constituyen un alimento sano y completo, perfecto para nuestra poca;
en la cual, el psimo hbito alimenticio, el consumo de alimentos altamente procesados, y el exceso
en la utilizacin de sustancias qumicas en la agricultura, se desvirtan el sentido de la nutricin,
adems de debilitar el organismo.
Investigaciones realizadas en el extranjero sealan que la ingesta de algas de manera habitual,
provocan efectos favorables en la salud, relacionando los componentes qumicos derivados de la
biosntesis de las clulas vegetales marinas con dichos efectos; por lo tanto, molculas como
polifenoles, cidos grasos esenciales, pigmentos, fitoestrgenos, protenas, vitaminas y minerales;
son objeto de acuciosos estudios y son buscados incesantemente para ser utilizados como base de
alimentos funcionales y saludables (Chan , 1997). Es decir, la gran variedad de componentes
nutricionales que conforman las algas propician la formulacin y desarrollo de nuevos alimentos,
los cuales por sus propiedades fsicas, qumicas y biolgicas pueden ayudar a una nutricin
adaptada a cada caso o situacin fisiolgica individual, contribuyendo a mejorar la salud y
bienestar, junto con prevenir o hacer ms tolerable muchas enfermedades como cncer de colon,
arteriosclerosis, obesidad y problemas cardiovasculares entre otras (Sanz, 2000).
No obstante, la explotacin de las algas a nivel nacional ha sido mnima perdiendo con esto la
optimizacin de procesos, productos industriales y agrcolas (Chapman y Chapman, 1980). En
menor grado se les ha considerado como una importante fuente de nutrientes esenciales para una
alimentacin sana; atendiendo a su aporte energtico, fibra dietara (Lahaye, 1991) y los bajos
contenidos de lpidos, principalmente ricos en cidos grasos poliinsaturados 3 (Khotimchenko,
2002), lo que permite incluirlas en dietas especiales. Son muy pocos los productos en nuestro
mercado que cumplen con las caractersticas de ser beneficiosos para los consumidores con
carencias fisiolgicas y nutricionales especiales, y los existentes lo son gracias a que se le ha
aadido una sustancia especfica, cuyos efectos favorables han sido cientficamente probados. Pero
en el caso particular de las algas, stas podran llegar a constituir un alimento funcional por s
mismo; es decir, no sera necesario enriquecerlas.
2.2 Algas pardas. (Reino Protista, Filum Heterokontophyta, Clase Phaeophyceae)
Las algas pardas son un importante grupo de plantas que estn clasificadas en
aproximadamente 265 gneros, con ms de 1500 especies (Bold et al., 1985). Ellas derivan su
coloracin caracterstica de una gran cantidad de carotenoides de fucoxantina (que otorga la
coloracin parda), contenidos en cloroplastos y de la presencia de varios taninos propios de la
especie. Las algas pardas se desarrollan en regiones temperadas a subpolares, donde exhiben la
mayor diversidad en especies y expresin morfolgica (Lee, 1989).
La clase Phaeophyceae est dividida en ordenes, que subsecuentemente est dividida en
familias y luego stas en gneros (13 en esta divisin) y especies (Bold et al., 1985). Desde el punto
de vista de la bioabsorcin, slo los rdenes Laminariales y Fucales son de importancia (Figura 1)
(Davis et al., 2003).
Ambos rdenes son abundantes en la naturaleza e incluyen las algas estructuralmente ms
complejas. Laminariales son colectivamente y comnmente denominadas como kelp y son
cultivadas a gran escala para fines comerciales (propiedades gelificantes, emulsificantes para
polvos, propiedades estabilizantes en cermica, entre otros.) (Chapman, 1980). El orden Fucales,
es un amplio y diverso orden, con una gran variacin morfolgica. Por ejemplo, la familia
Sargassaceae contenida en l, es bien conocida por el gnero algal Sargassum, que se encuentra
en aguas tropicales del Mar de Sargasso.
Figura 1. Esquema de clasificacin del filum Phaeophyta y sus rdenes Laminariales y

Fucales. De estos ltimos se desprenden las familias respectivas que lo componen. Extrado de
Bold et al., 1985.
10
La Figura 1 contiene alguno de los gneros y especies objeto de mayor estudio cientfico y por su
especial capacidad de absorber metales pesados. (Davis et al., 2003).
Es importante sealar que las algas, son distintas del filum Cyanophyta, clase
Cyanophyceae, o algas verde azuladas, que tambin son organismos oxgenicos fottrofos, pero
corresponden a eubacterias y evolutivamente se diferencian de las algas (Davis et al., 2003).
Si comparamos las algas pardas, con otras clases de algas, nos encontramos con que muchas
de ellas son microscpicas en tamao y son por lo tanto, consideradas como microorganismos,
muchas formas de algas son macroscpicas en trminos de morfologa. Estas formas coloniales de
algas funcionan como agregados celulares, donde ellas comparten funciones y propiedades
comunes, incluyendo los productos de almacenamiento que ellas utilizan, as como las propiedades
estructurales de sus paredes celulares. (Stumm et al., 1996).
Existen variadas caractersticas para clasificar un alga, incluyendo la naturaleza de la
clorofila, la composicin qumica de la pared celular y flagelacin. Una caracterstica comn es
que todos los tipos de alga contienen clorofila; sin embargo, la presencia de fitopigmentos distintos
a la clorofila, es particular de cada filum/divisin algal. La naturaleza del polmero de reserva
sintetizado por fotosntesis, es tambin clave a la hora de clasificar un alga. Segn lo anterior, es
factible clasificar a los organismos algales, en los filum; Cyanophyta, Prochlorophyta,
Phaeophyta, Chlorophyta, Charophyta, Euglenophyta, Chrysophyta, Pyrrhophyta, Cryptophyta y
Rhodophyta, los cuales se contienen en la Tabla I, segn presenten o no pared celular, resaltando
sus caractersticas ms particulares. (Bouck, 1965).
11
Tabla I. Tres filum algales y sus caractersticas principales.

Filum
Nombre
Pigmentos
comn
Chlorophyta
Producto de
Pared
almacenamiento
Celular
Almidn
Celulosa,
Algas
Clorofila
verdes
a,b,, y
Glucosidos de
carotenos y
hidroxiprolina,
xantofilas.
xilanos y
Flagelos
Presente
manosa; o
pared celular
ausente,
calcificada en
algunos casos.
Phaeophyta
Algas
Clorofila a,
Laminarina,
Celulosa,
pardas
c,
manitol.
cido algnico
caroteno y
y muco
fucoxatina,
polisacridos
ms otras
sulfatados
xantofilas.
(fucoidina)
Extrado y adaptado de Bold et al., 1985.
Presente
12
Tabla I. (Cont.) Tres filum algales y sus caractersticas principales.
Rhodophyta
Algas rojas
Clorofila a;
Almidn
Celulosa,
RyC
floridiano.
xilanos,
ficocianinas;
polisacridos
RyB
sulfatados
ficoeritrina,
(galactanos).
xantofilas y
carotenos.
Extrado y adaptado de Bold et al, 1985.
Ausente.
13
En el filum Phaeophyta (algas pardas), el polisacrido laminarina es el principal producto

biosinttico de almacenamiento, mientras que en Rhodophyta (algas rojas) el almidn floridiano es
el principal producto. Los flagelos estn ausentes en Rhodophyta, pero si se encuentran presentes
en Chlorophyta y Phaeophyta. (Kylin, 1915).
Una pared celular algal tpica de Phaeophyta, Rhodophyta y muchas Chlorophyta, est
compuesta de un esqueleto fibrilar y una matriz amorfa. El esqueleto fibrilar de mayor
preponderancia dentro de estos filum, es el de celulosa. sta puede ser reemplazada por xilano en
Chlorophyta y Rhodophyta, en adicin de manosa en Chlorophyta.
El filum Phaeophyta se caracteriza por una matriz predominante en cido algnico o alginato,
con una menor proporcin de polisacridos sulfatados (fucoidina) (Figura 2), mientras que
Rhodophyta contiene una cierta cantidad de galactanos sulfatados (carrageninas). Ambas
Phaeophyta y Rhodophyta contienen las matrices de polisacridos amorfas ms grandes dentro de
los filum mencionados (Haug et al., 1967).
2.3 Estructura celular en algas pardas.
Una clula de alga parda tpica, corresponde a lo comprendido en la Figura 3. La envoltura
del cloroplasto (Ce) contiene los cloroplastos que poseen tres tilacoides por banda. Esta estructura
(conocida como plastidio) almacena material de reserva y contiene clorofila a, c1, y c2.
Adicionalmente a la envoltura del cloroplasto, los cloroplastos se encuentran rodeados por las dos
membranas de retculo endoplasmtico (Cer). La membrana externa, que contiene a su vez una
membrana interna, es descontinuada o interrumpida por la envoltura nuclear (Ne) en los rdenes
Fucales y Laminaria; sin embargo sta es continua (Figura 3) en el caso de las algas pardas, orden
Ectocarples (Brook y Madigan, 1991).
14
Figura 2. Estructura de la pared celular en Algas pardas. Extrado de Shiewer et al., 2000.
15
Figura 3. Diagrama esquemtico de una clula de alga parda. Envoltura del cloroplasto (Ce),
retculo endoplasmtico cloroplstico (Cer), retculo endoplasmtico (Er), envoltura nuclear (Ne),
DNA fibrilar (Fib), Nuclolo (Un), Ncleo (N), prenoide (P), saco del prenoide (Ps), dictiosoma
(D) (tambin conocido como aparato de Golgi o dictiosoma de golgi), mitocondria (M), vacuola
(V), plasmodesmo (F), pared celular (Cw), centriolos (Cen). Extrado de Bouck, 1965.
16
Aunque gran parte de las funciones celulares algales, son codificadas por el DNA, algunas
protenas organelares son codificadas dentro del cloroplasto. Dentro del cloroplasto, encontramos
microfibrillas de DNA (Fib) relacionadas directamente con los plastidios. La organizacin del
DNA en este caso, puede ser lineal o circular y se encuentra unido a las membranas del tilacoide.
Como en todos los eucariontes, el DNA es almacenado en el nuclolo, (Nu) y ste a su vez en el
ncleo (N) celular. El prenoide (P) es responsable de la fijacin de O2 y de la formacin de
productos de almacenamiento. ste es contenido por el saco prenoideal (Ps) y se extiende hacia
afuera del retculo endoplasmtico del cloroplasto (Dodge, 1973).
La produccin y secrecin de polisacridos acontece en el dictiosoma (D), tambin llamado
aparato de Golgi o dictiosoma de Golgi. Las mitocondrias (M) es el lugar donde ocurre la
respiracin celular, con subsecuente sntesis de ATP. (Dodge, 1973)
La principal funcin de las vacuolas (V) es el almacenamiento y transporte de variadas
macromolculas dentro o hacia el espacio extracelular.
Una proporcin significativa de estos organelos, contienen cido algnico, que adicionalmente
posee una funcin protectora (de la luz solar), al resituarse en la pared celular, mientras se
reabastece la sntesis de este cido. (Figueira et al., 2000).
Finalmente, las clulas se encuentran interconectadas por plasmodesmo (F), los cuales se
encuentran presentes en gran cantidad de clulas (Figueira et al., 2000).
17
2.4 Algas Kelp

El kelp es un nombre genrico utilizado para denominar a las algas pardas de los rdenes
Fucales (e.i Ascophyllum nodosum, Sargassum spp. y Pelvetia spp.) y Laminariales (e.i. Laminaria
hyperborea, Macrocytis pyrifera y Nereocystis luetkaena) (Vsquez, 1999), aunque existen
algunos autores que solamente consideran dentro de este trmino, especficamente a las
Laminariales (Vozzhinskaya y Kuzin, 1994, Kloareg et al., 1999). Estas algas generalmente se
localizan en zonas de sustratos rocosos cercanas a las costas a profundidades no mayores de 40
metros, en aguas templadas o fras, claras y ricas en nutrientes. Las principales reas en donde se
localiza Macrocystis pyrifera es en las costas de Amrica del Norte y del Sur, sur de frica, Nueva
Zelanda, Noruega, Escocia, Japn y Corea (Tabla II).
2.5 Macrocystis pyrifera.
Ubicacin taxonmica segn Silva et al., 1996.
Divisin: Phaeophyta
Clase: Phaeophyceae
Orden: Laminariales
Familia: Lessoniaceae
Gnero: Macrocystis
Especie: pyrifera
18
Tabla II. Principales especies de algas pardas, distribucin geogrfica y principales usos
Especie
Distribucin
Principal uso
Macrocystis
Costa oeste de Norteamrica, de
En california: Industria del
la pennsula de Monterrey a la
alginato, poca produccin en
mitad de la Baja California, costa
forma de harina o alga
oeste. Per, Chile y Argentina.
deshidratada para consumo

animal o humano farmacutico.
Laminaria
Escocia, Irlanda, Noruega,
En Asia: Consumo humano.
Francia, China y Japn.

Laminaria
Francia, Irlanda y Escocia.
Noruega produce alginatos.
Laminaria digitata
Francia, Noruega y Escocia.
Alginatos
Ascophyllum
Escocia e Irlanda, Noruega, Sur
Produccin de alginatos y de
nodosum
de Nueva Escocia y Cnada.
harina de kelp como forraje o
hyperborea
aditivo alimenticio.
Durvillaea
Chile
antarctica
Lessonia
Exportada para alginatos a

Inglaterra y Estados Unidos
Chile
Exportada a Japn, Estados

Unidos y Cnada
Undaria
Corea
Consumo humano, desechos

para alginato.
Extrado de Hernndez - Carmona, 1996
19
Macrocystis pyrifera es una alga de gran tamao, comnmente conocida como huiro, que en
ocasiones alcanza una longitud de 50 m o ms, en su base se encuentra sujeta a una sustrato rocoso
por medio de un rizoide, del cual se originan el estirpe primario de la planta, que tiene apariencia
de tallo y de ste a su vez, emanan los cauloides que tienen apariencia de ramas, y a lo largo de
estos, se encuentran las estructuras flotadoras llamadas neumatocistos o aerocistos de donde se
despliegan las lminas, constituyendo cada cauloide, sus aerocistos y lminas, una fronda (Guzmn
del Pro et al., 1986). Los aerocistos sostienen las frondas y permiten que crezcan hacia la
superficie, una vez que la fronda alcanza la superficie continua creciendo y expandindose,
formando un denso dosel flotante. Cada planta consta de un gran nmero de frondas, contando
siempre con una mezcla de frondas juveniles, adultas y senescentes.
El ciclo de vida de Macrocystis pyrifera, consiste de una alternancia de generaciones
heteromrfico y difsico entre un esporofito diploide y un gametofito microscpico haploide. Las
zoosporas biflageladas se liberan de lminas reproductivas especializadas o esporofilos, situados
cerca del sujetador del esporofito maduro. La produccin de esporas inicia cuando el esporofito
tiene de seis a doce meses de edad; las zoosporas germinan produciendo gametofitos dioicos. Los
gametofitos masculinos y femeninos se pueden diferenciar despus de aproximadamente una
semana (en cultivos de laboratorio); los masculinos producen clulas biflageladas mviles
(anterozoides), mientras que los femeninos producen el vulo, el cual se desarrolla en un embrin
despus de fertilizacin (Guzmn del Pro et al., 1986; North, 1987). En unas cuatro semanas, el
crecimiento produce lminas diminutas apenas visibles a simple vista (1 2 mm de largo), 30 das
despus el esporofito mide 5 a 10 cm. Las divisiones posteriores y la aparicin de frondas iniciales
conducen al desarrollo de la morfologa de una planta joven, con ms de ocho frondas y 20 cm de
20
longitud a los 12 meses y a los 18 meses aproximadamente la planta puede cosecharse (Figura 4)
(Neushul y Haxo, 1963).
Aunque la produccin de esporas es grande, slo una pequea fraccin se fija en un sustrato
adecuado y un nmero an menor sobrevive de la fase microscpica del ciclo de vida para producir
esporofitos (Dodge, 1973).
El perodo mximo de vida de las frondas es de aproximadamente seis meses, pero en muchas
ocasiones puede ser menor por el deterioro ocasionado por tormentas, ramoneo o condiciones
anmalas de temperatura. Una planta completa puede tener un perodo de vida de dos meses a
varios aos, dependiendo de los factores antes mencionados, que son las principales causas de la
mortalidad de las algas (North, 1987).
Macrocystis pyrifera, es una especie caracterstica de fondos rocosos, que forma mantos
densos en grandes extensiones (bosques), cuyo dosel (Figura 5), facilita el no tener competencia
con otras algas por la luz, pero incrementa su susceptibilidad al dao por tormentas, ya que al
entrelazarse las frondas en la superficie oponen una gran resistencia a las marejadas y entonces son
desprendidas las plantas completas. Se puede encontrar desde profundidades someras como es la
zona de mareas hasta profundidades de 40 m, cuando existe la suficiente penetracin de luz. Su
distribucin horizontal local frecuentemente est controlada por la disponibilidad de sustrato
rocoso (Guzmn del Bro et al., 1986).
21
Figura 4. Ciclo de vida de Macrocystis pyrifera. Extrado de North, 1971.
22
Figura 5. Conformacin anatmica general de Macrocystis pyrifera. A. Aspecto general de un

talo de Macrocystis pyrifera y partes principales que lo integran; B. Aspecto de una lmina.
Extrado de Guzmn del Bro et al., 1986.
23
Desde el punto de vista nutricional, las algas Macrocytis pyrifera son productos bajos en
caloras, con un alta concentracin de minerales (Mg, Ca, P, K y I), vitaminas, protenas,
carbohidratos poco digestibles, fibra y bajo contenido en lpidos (Mayer, et al, 1987). La calidad
de la protena y de los lpidos es aceptable en comparacin con otras fuentes vegetales
principalmente debido al alto contenido de aminocidos esenciales y altos valores relativos de
cidos grasos insaturados. El perfil de aminocidos destaca por contener elementos esenciales para
diversas especies, como alanina, leucina y lisina y no esenciales como cido glutmico, cido
asprtico, considerndose como una fuente de protenas complementaria, interesante por este
aspecto. Los carbohidratos se encuentran en esta alga en forma de carbohidratos complejos o
ficocoloides (40%), estos se presentan en forma de gomas, alginatos (18 26%), fucoidinas (0.5
2%), manitol (6 22%). Estos tienen la capacidad de retener agua (con sus minerales) en el alga
para evitar la deshidratacin (Ortiz, 2011).
En general la composicin proximal (Tabla III), aminoacdica (Tabla IV), lipdica (Tabla V),
de tocoferoles (Tabla VI), de compuestos carotenoides (Tabla VII) y concentracin de polifenoles
totales (Tabla VIII) en las algas M. pyrifera y D. antarctica, vara considerablemente de especie a
especie y en funcin de su localizacin geogrfica, estaciones del ao, exposicin al oleaje y a las
corrientes, concentracin de nutrientes presentes en el medio, profundidad a la que se localizan, la
temperatura, y estado de desarrollo de las algas.
24
Tabla III. Composicin proximal en algas Phaeophyta, porcentaje expresado en base seca.
Algas pardas
Macrocystis
Protenas
Lpidos
Cenizas
Caloras
(% D.E)
(% D.E)
(% D.E)
(kcal/100g)
13,2 0.0
0,7 0,1
10,8 0,2
360,3
10,4 0,6
0,8 0,0
17,9 0,1
332,4
11,6 0,1
4,3 0,1
25,7 0,1
318,7
pyrifera
Durvillaea
antarctica
(cochayuyo)
Durvillaea
antarctica
(Hulte)
Extrado de Ortiz, 2011.
25
Tabla IV. Composicin aminoacdica en algas Phaeophyta.

Aminocidos
(mg/100g base seca)
Durvillaea antarctica Durvillaea antarctica

(cochayuyo)
(Hulte)
cido asprtico
1338,8 22,8
936,4 10,2
2953,6 14,1
cido glutmico
1827,3 15,4
1642,7 29,9
1485,9 8,3
Serina
830,9 9,6
552,7 12,4
385,6 4,8
Histidina
161,9 6,1
867,1 9,9
1743,0 10,7
Glicina
664,9 8,7
715,3 14,1
441,7 6,3
Treonina
735,4 6,9
626,9 15,6
421,4 9,4
Arginina
944,7 10,1
225,6 8,1
229,8 7,5
Alanina
643,8 13,7
780,0 10,3
1252,9 9,0
Prolina
0,8 0,1
0,5 0,1
0,3 0,0
Tirosina
425,9 9,4
264,0 5,8
123,1 3,6
Valina
1140,2 12,5
274,4 11,2
281,4 5,1
Metionina
1111,6 10,8
170,4 9,7
631,7 7,7
Cistina
228,1 8,3
13,9 4,8
148,7 4,3
26
Tabla V. Contenido de cidos grasos en algas Phaeophyta. (%).

cidos grasos
Macrocytis pyrifera
Durvillaea antarctica Durvillaea antarctica

(cochayuyo)
(Hulte)
0,7
0,8
4,3
Total saturados
22,8 0,6
26,6 1,5
39,8 1,4
Total
25,2 0,2
38,9 2,2
33,9 2,8
51,4 0,6
35,5 3,4
28,3 1,3
43,9 0,4
22,5 1,9
15,7 1,1
5,9 0,01
11,0 1,4
3,8 0,05
Razn 6/ 3
7,42
2,05
4,13
ndice de
2.3
1,3
0,7
Porcentaje Materia
grasa
Monoinsaturados
Total
poliinsaturados
Total
poliinsaturados 6
Total
poliinsaturados 3
poliinsaturacin
27
Tabla VI. Contenido de tocoferoles (mg/kg de lpido)
tocoferol
tocoferol
tocoferol
tocotrienol
M. pyrifera
1327 4,4
91,3 4,7
88,9 4,0
25,2 1,4
7,7 1,1
1457,2 11,4
D. antarctica
179,4 7,3
7,7 0,5
19,4 1,0
615,7 8,1
245,9 3,7
1112,4 22,1
24,0 1,8
16,0 2,0
35,6 0,7
15,3 2,1
10,6 1,4
167,3 8,3
Algas pardas
- tocoferol
Tocoferoles
totales
(cochayuyo)
D. antarctica
(Hulte)
28
Tabla VII. Contenido de compuestos carotenoides en algas Phaeophyta expresado en g/g

en peso seco.
Algas pardas
Lutena
-Caroteno trans
-Caroteno cis
0,3 0,0
10,8 0,3
6,6 0,1
1,0 0,0
35,0 1,6
-----
4,2 0,4
58,0 3,4
43,0 1,0
cochayuyo
Hulte
29
Tabla VIII. Concentracin de polifenoles totales presentes en las algas Phaeophyta.

(Representado en equivaletes a ppm de Acido Glico)
Algas pardas
Obtenido desde
Obtenido desde alga
Obtenido desde alga
extracto etanlico
fresca
seca.
M. pyrifera
125
83,5
96,5
D.antarctica
130
55,0
198,6
127
48.7
273,7
cochayuyo
D. antrctica
Hulte
30
2.6 Durvillaea antarctica.

Ubicacin taxonmica segn Silva et al., 1996.
Divisin: Phaeophyta
Clase: Phaeophyceae
Orden: Durvillaeales
Familia: Durvillaeaceae
Gnero: Durvillaea
Especie: antarctica
D. antarctica, ms conocida como cochayuyo, corresponde al alga de mayor consumo en
nuestro pas, encontrndose en toda la costa chilena.
Las plantas pueden medir hasta 15 m de largo, son de color pardo verdoso oscuro o pardo
amarillento. Esta alga se divide en cochayuyo, que corresponde a las frondas de la planta, que
suelen medir entre 3 y 12 cm de ancho y Hulte, que representa al tallo; el cul, generalmente se
consume sin previa hidratacin. (Figura 6).
Crece adherida a rocas, mediante el rizoide, que es como una raz que se aferra al terreno;
especialmente, en lugares de oleaje intenso y cierta profundidad. Para que toda la planta pueda
recibir la energa del sol, las frondas estn formadas por cavidades llenas de aire, separadas por
tabiques, envueltas en una elstica y firme membrana; lo que les permite flotar (Buschmann et al.,
1984).
El cochayuyo como tal, destaca nutricionalmente por su equilibrada cantidad de yodo,
aproximadamente, 150 g/100g.
31
Figura 6. Conformacin anatmica general de Durvillaea antarctica, considerando frondas

laminares, estipe, disco adhesivo y frondas cilndricas. En el extremo superior derecho se
esquematiza un corta transversal de fronda y en el extremo inferior derecho, la apariencia de un
ejemplar juvenil de la especie. Extrado de Guzmn del Bro et al., 1986.
32
Es rico en minerales, fibra y protenas, adems, posee todos los aminocidos esenciales. Todo esto
convierte al cochayuyo en una fuente valiosa de nutrientes; por lo cual, es ideal que se le incorpore
en la dieta habitual.
Esta alga kelp, la cual produce esporas de corta vida (1 2 h) (Buschmann et al., 1984), habita
expuesta a las rocas intermareales y submareales superficiales subantrticas y en el hemisferio sur
en zonas temperadas de costas rocosas (Hay, 1977). En Chile, las especies se encuentran presente
desde la regin de Magallanes, extendindose hasta el sur. Las estipes y frondas secas de
Durvillaea antarctica han sido explotadas para el consumo humano en Chile, inicialmente por los
mapuches, anterior al establecimiento espaol (Masuda, 1986).
2.7 Polisacridos de reserva en algas pardas: Laminarina.
En algas marinas (como en algas Kelp), el carbono es almacenado en unidades monomricas
(como manitol) o en unidades polimricas. Almacenamientos en formas polimricas son mucho
ms ventajosas que formas monomricas, puesto que stas ltimas producen una mayor alteracin
osmtica en relacin a las polimricas. (Lobban, 1985). Generalmente el manitol no se encuentra
en algas pardas, aun cuando se puede llegar a presentar hasta en un 30% en relacin al peso seco
de sta.
La laminarina, el segundo mayor polisacrido de reserva en algas pardas (Figura 7), fue
inicialmente caracterizado por Schmiedeberg (1885), desde una mezcla de polisacridos. La
glucosa en esta molculas se encuentra en la forma (que significa que el grupo hidroxilo presente
en el C1, el carbono quiral, se encuentra presente por sobre el plano en una proyeccin de Haworth).
Los enlaces presentes en este polisacrido, corresponden a uniones (1 3) y (1 6) en menor
proporcin.
33
Figura 7. Estructura del polisacrido de reserva Laminarina (principalmente con uniones (1

3)), consistente en dos tipos de cadenas. En (a), el manitol se encuentra unido al extremo terminal
(cadenas M), mientras que en (b), la glucosa est unida al extremo terminal (cadenas G).
Extrado de Percival y McDowell, 1967.
34
Dos clases de cadenas de Laminarina puede existir, la cadena M, con manitol en el extremo
terminal y la cadena G, con presencia de glucosa en su extremo terminal (Percival y Mc dowell,
1967). La cantidad que puede llegar a almacenarse de este polisacrido depende de mltiples
factores en el alga, entre los cuales se consideran la etapa de crecimiento, tejido algal, condiciones
de reproduccin, condicin de luminosidad, perodo del ao y condiciones medioambientales en
general.
2.8 Polisacridos extracelulares y de la pared celular en algas marinas.
La pared celular algal est formada por al menos dos membranas diferentes. La ms interna
consiste de un esqueleto microfibrilar que otorga rigidez a la pared (Figura 2). La membrana
externa es una matriz amorfa (Kreger y Levin, 1962). Existe cierta evidencia que la matriz no
penetra las microfibrillas, pero s se encuentra unida a la membrana ms interna por uniones de
hidrogeno (Mackie y Preston, 1974). La membrana interna microfibrilar, se encuentra comprimida
con un polmero de celulosa (homopolmero de glucosa, con uniones (1 4)) (Figura 8a). Dos
otras molculas fibrilares, xilano (polisacrido constituido por uniones (1 3) de D xilosa y
diversas ramificaciones y sustituciones y manano (oligosacrido de D manosa con uniones (1
4)) son constituyentes principales en algas rojas y verdes (Figura 8b y 8c). Finalmente, el alginato
contribuye a la fuerza de la pared celular de algas pardas, en adicin a otorgarle flexibilidad
(Smidsrod y Draget, 1996). Incluso si el alginato est presente dentro de la membrana ms interna,
la celulosa se mantiene como el principal componente estructural. La fucoidina no slo se
encuentra presente en la matriz, sino que tambin en la pared celular interna. (Chapman, 1980).
35
Figura 8. Molculas fibrilares de la pared celular algal. (a) Celulosa, homopolisacrido de glucosa
con uniones (1 4), (b) uniones estructurales (1 3) y (1 4) presentes en xilano de algas
rojas, y (c) manano, oligosacrido de manosa con uniones (1 4) de algas verdes. Extrado de
Percival y McDowell et al., 1967.
36
2.9 Polisacrido extracelular en algas pardas: Fucoidina.

La molcula de laminarina fue inicialmente aislada por Kylin (1915), y de ah en adelante ha
sido encontrada en numerosas especies de la familia Laminariaceae (Figura 1), con porcentajes de
masa seca de entre 5 20 % (Black, 1953).
La fucoidina es un heteropolisacrido ramificado, con una composicin qumica (Tabla IX) y
peso molecular variable (Tabla X) segn la especie algal que se trate y al cual se le atribuyen
mltiples actividades fisiolgicas. Est constituido principalmente por L fucosa (Figura 9); una
hidrlisis cida de la fucoidina, puede liberar concentraciones considerables de D xilosa, D
galactosa y cido rico, entre otros (Mackie y Preston, 1974).
2.10 Importancia mdica y Propiedades fisiolgicas en algas marinas.
Las distintas especies de algas marinas poseen una serie de propiedades o cualidades,
atribuibles polisacridos (Tabla XI) u otras molculas con actividad biolgica (Tabla XII), que
resultan fisiolgicamente favorables para el hombre, sin embargo, no se debe olvidar que hay
algunas de ellas que le son patgenas. De las enfermedades y propiedades fisiolgicas producidas
por la accin de algas marinas, se pueden mencionar las siguientes:
2.10.1 Protothecosis. Enfermedad causada por un alga unicelular del Gnero Prototheca
(Chlorophyceae: Chlorococcales), que carece de clorofila, parecida a una levadura pero que se
reproduce por la formacin de endospora (Nosanchuk y Geenberg, 1973). Diferentes especies de
Prototheca han sido aisladas de lesiones humanas como bursitis, infecciones secundarias a
bacterias, infecciones de la piel, lesiones nodulares en la nariz y en inflamaciones del tracto
digestivo con diarrea crnica (Kaplan, 1978, Venezio et al., 1982).
37
Tabla IX. Composicin qumica de algunos fucoidanos segn la especie algal.

Alga parda
Composicin qumica (proporciones)
F. vesiculosus
Fucosa, sulfato
F. evanescens C. Ag.
Fucosa/sulfato/acetato (1/1.23/0.36)
F. distichus
Fucosa/sulfato/acetato (1/1.21/0.08)
F. serratus L.
Fucosa/sulfato/acetato (1/1/0.1)
Lessonia vadosa
Fucosa/sulfato (1/1.12)
Fucosa/galactosa (18/1), sulfato
Pelvetia wrightii
Undara pinnatifida (Mekabu)
Laminaria angustata
Fucosa/galactosa/sulfato (9/1/9)
Adenocystis utricularis
Fucosa/galactosa/manosa, sulfato
Spatoglossum schroederi
Fucosa/xilosa/galactosa/sulfato (1/0.5/2/2)
Hizikia fusiforme
Fucosa, galactosa, manosa, xilosa, sulfato
Sargassum stenophyllum
Fucosa, galactosa, manosa, glucosa, xilosa,

sulfato.
Extrado de Kaplan, 1978.
38
Tabla X. Variacin del Peso Molecular de la Fucoidina segn la especie algal.

Peso Molecular Fucoidina
Especie algal
13 KDa
Ascophyllum nodosum
16 KDa
Ascophyllum nodosum
25 KDa
Hizikia fusiforme
100 180 KDa
Fucus vesiculosus (Laboratorio Sigma)
160 KDa
Fucus vesiculosus (nativa)
189 KDa
Laminarina japonica
200 KDa
Cladosiphon okamuranus
950 KDa
Hizikia fusiforme.
Extrado de Kaplan, 1978.
39
Figura 9. Estructura de fucoidina, heteropolisacrido ramificado de L fucosa, ste ltimo como

el constituyente principal y con predominantes uniones (1 2). Extrado de Percival y McDowell
et al., 1967.
40
Tabla XI. Propiedades fisiolgicas de polisacridos de algas o de extractos algales,

reportados en humanos y otros organismos.
Actividad
Anticoagulante, Antitrombtica
Sustancia Activa
Polisacridos sulfatados, Fucoidanos de Ascophyllum y
otras algas pardas.
Anticoagulante
Derivados de dextranos, y fracciones de fucoidanos de

algas pardas.
Antitumoral y antiproliferativa en casos
Fucoidanos, polisacridos sulfatados de Ascophyllum.
de cncer.
Antioxidante
Pigmento fucoxantina de algas pardas asiticas: Undaria

saragassum, Hijikia.
Antioxidante
Funcin compartida con otros polisacridos solubles en

agua, como diversas sales de alginato sulfatado y
manuronato.
Disminucin de la absorcin intestinal
Polisacridos extrados o alginatos de algas Euchema
de glucosa e insulina en cerdos.
cottonni, Laminaria digitata, Palmaria palmata.
Actividades inmunomodulatorias
Polisacridos extrados con aguas calientes, de algas

pardas en Japn; Hijikia y Laminaria japonica.
Extrado de Cruz Surez et al., 2010.
41
Tabla XII. Molculas con actividad biolgica en algas marinas.

Molculas con actividad biolgica
Actividad especfica.
Protenas
Fuente de aminocidos esenciales.

Elementos de comunicacin intercelular.
Actividad antiviral
Actividad antimicrobiana
Actividad antiinflamatoria
Actividad antioxidante
cidos grasos poliinsaturados
Actividad antibitica
Actividad antifngica
Pigmentos
Actividad antiviral
Actividad Neuroprotectora
Actividad antiobesidad
Actividad antiangiognica
Actividad anticncer
Extrado desde Chojnacka et al., 2012.
42
Tabla XII (Cont.).

Polifenoles
Potente antioxidantes.
Actividad antimicrobiana.
Actividad antiviral.
Actividad antialrgica
Minerales
Promotor del crecimiento
Hormonas de crecimiento vegetal
Control sobre la divisin celular
Extrado desde Chojnacka et al., 2012.
43
2.10.2 Silicosis. Cuando es producida por algas, consiste en una irritacin pulmonar que causa la
descompensacin de las fibras del tejido conectivo; frecuentemente se presenta cuando el personal
que trabaja con tierra de diatomeas lo hace sin usar mascarilla, con lo cual se produce la aspiracin
de polvo de silicio (Beskow, 1978).
2.10.3 Bocio. Se han reportado algunos casos de bocio atribuibles a dieta por algas; en Japn se
produjeron casos de bocio por la ingestin de exceso de yodo contenido en tabletas de algas, casos
que fueron remediados simplemente disminuyendo la ingesta (Liewendahl y Torula, 1972).
2.10.4 Arseniosis. El alga Hizika (Phaeophyceae: Fucales), posee una alta concentracin de
arsnico y se ha observado que en ratas causa envenenamiento cuando se las consume en gran
cantidad; sin embargo, no se han observado casos clnicos en humanos (Watanabe et al., 1980).
2.10.5 Alergias. El alga verde azulada Lyngbya majuscula, causa una dermatitis en nadadores
cuando se produce un contacto severo, especialmente en climas templados. De esta especie se han
aislado dos toxinas que causan dermatitis; la debromoaplysiatoxina y la lyngbyatoxina A. Esta
causan inflamacin de las membranas mucosas de los ojos y nariz y reacciones en la piel, con
produccin de ampollas (Moore, 1977). La diatoma Fragilaria striatula (Fragilariales), tambin ha
sido implicada como productora de dermatitis alrgica (Hashimoto, 1979).
2.10.6 Actividad Anticancergena. Hay informes que muestran evidencias de actividad antitumoral
en especies de los Gneros Sargassum y Laminaria (Phaeophyceae). Se logr aislar algunos
compuestos que al ser probados contra el sarcoma de rata 180 y contra tumores leucmicos,
demostraron una moderada inhibicin del crecimiento (Yamamoto et al., 1982, Bhakuni et al.,
1976, Chenieux et al., 1980, Mayer y Panick, 1984, Chong y Parish 1985, Zea et al., 1986).
44
2.10.7 Actividad Antihelmntica. El alga roja del Gnero Digenea (Ceramiales), es conocida como
un vermfugo eficaz en contra de Ascaris lumbricoides. El principio activo es el cido Kainico que
a la dosis de 5 a 10 mg, fuerza al parsito a salir del husped sin producir efectos colaterales. La
actividad se produce porque el principio activo causa parlisis neuromuscular y el gusano pierde
la habilidad de mantenerse en posicin contra la accin del intestino delgado, siendo arrastrado
junto con las deposiciones del paciente (Hoope, 1979).
2.10.8 Actividad anticoagulante. Del alga marina Laminaria digitata, Macrocytis pyrifera y
Durvillaea antarctica, se aisl el polisacrido laminarina, que posee accin anticoagulante, tanto
in vivo como in vitro, y cuya potencia se estima equivalente a un tercio del de la heparina, que es
uno de los de mayor accin anticoagulante. (Nigrelli et al., 1967, Stein y Borden, 1984).
2.10.9 Actividad Laxante. Se sabe que los ficoloides tienen efectiva accin como laxantes y no
producen hbito (Gopal, 1979).
2.10.10 Actividad antifngica. Las investigaciones acerca de la actividad antifngica de extractos
de algas marinas, se inician con los trabajos de Pratt et al., (1951), quienes ensayaron sus
compuestos sobre Trichophyton metagrophytes y Trichophyton rubrum. En un acabado estudio,
Welch (1962) analiz las propiedades fugistticas de 35 especies de algas marinas, contra seis
especies de hongos patgenos y encontr que once de estos extractos presentaban amplias zonas
de inhibicin contra una o ms de los organismos de prueba. En forma anloga y algo ms tarde,
Pesando y Caramb (1984), muestrearon algas del Mar Mediterrneo y en los extractos obtenidos,
encontraron actividad contra dermatofitos, levaduras y mohos. Ma Jing Wen y Tan Wei Ci
(1984), por su parte, estudiaron la actividad antibitica de 60 especies de algas de tres Divisiones
45
de macroalgas de la costa de China, contra Sccharomyces cerevisiae y slo Laurencia spp y

Plocamium telefairiae presentaron baja accin contra esta levadura.
Reichelt y Borowitzka (1984), realizaron un intensivo estudio de la flora y fauna marina en
Australia y nueva Zelanda con el objetivo de encontrar nuevos compuestos de eventual uso en la
terapia humana y veterinaria; los extractos de algas fueron probados contra Candida albicans,
Cryptococcus neoformans, Trichophyton mentagrophytes y Microsporum audouini y obtuvieron
actividad significativa para los tres primeros con el extracto de Delisea elegans, en tanto
Microsporum audouni fue sensible a extractos de Gracilaria spp.
2.10.11 Actividad antiviral. En este mbito, destaca el trabajo pionero Kathan (1965), quien ensay
la proteccin de embriones de pollo contra el ataque del virus de la Influenza A, usando extractos
de Macrocytis pyrifera. Tambin fue este autor, quin report la accin inhibitoria de los extractos
de esta misma alga sobre la neuraminidasa viral.
En Sudamrica, recin en 1986, Mayer et al., (1987), estudiaron la actividad antiviral de
extractos de Macrocytis pyrifera, observando la proteccin de una capa de clulas de amnios
humanos, del efecto citoptico del virus de la estomatitis vesicular. Los mismos autores, tambin
estudiaron la actividad antiviral de la fucoidina, alginato de sodio y laminarina, contra el virus de
la estomatitis vesicular. Observaron que la fucoidina, presentaba una gran actividad antiviral.
Supusieron que la fucoidina se unira a receptores especficos (lectinas), que se encuentran
presentes en diferentes tipos celulares (Mayer et al., 1984). Otras hiptesis, respecto del mecanismo
de accin antiviral de la fucoidina, indican que stos podran interferir la adsorcin de los virus a
la clula susceptible o interactuar directamente con la partcula viral, formando un complejo
inhibidor virus, que disminua la tasa de partculas virales adheridas a la membrana celular y con
46
ello, la capacidad infecciosa del virin, o bien, gracias a la capacidad de las fucoidinas de unirse a
metales, podran funcionar como bloqueadores antivirales (Allen y Dawson 1960, Paskins
Hurjburt et al., 1978; Richard et al., 1978; Blunden et al., 1981; Bauer 1985; Hutchinson 1985;
Abrams et al., 1988).
El agar agar y las carrageninas, ambos extrados de Rhodophyta, han sido informados como
inhibidores de los virus de la Influenza A, Herpes simplex, polio y dengue, adems de la actividad
contra virus de plantas, tales como el virus del mosaico del tabaco. En Chlorophyta se ha
encontrado actividad antiviral contra Togaviridae, Influenza A y VMT (Takemoto y Spicer, 1965).
Los extractos acuosos de muchas algas rojas son activos contra ciertos retrovirus, y se supone
que la accin pueda deberse a las carrageninas, que son polisacridos comunes de las paredes
celulares de estas algas y son comunes de las paredes celulares de estas algas y son co
internalizados al interior de la clula con el virus infectante inhibindolo (Baba et al., 1988).
Neushul (1990) informa que los carragenanos interfieren en la fusin de clulas infectadas con el
virus del VIH e inhiben especficamente la transcriptasa reversa. Estudios clnicos en pacientes con
SIDA, internados en el Hospital General de San Francisco, fueron tratados con sulfato de dextrano,
va intravenosa y entrica, con resultados muy satisfactorios (Starr et al., 1962).
La literatura cientfica actual informa de actividad antiviral en las tres divisiones de macroalgas
y sta se manifiesta contra virus de clulas animales y clulas vegetales. Sin embargo, no se informa
an acerca de la actividad en contra de virus bacterianos o de cianfagos.
2.10.12 Actividad inmunolgica e inflamacin. La experiencias con estimulacin de la
multiplicacin de clulas T in vitro por extractos algales, procede de observaciones in vivo de otros
investigadores. (Cooper et al, 2002. Subramian et al, 2001).
47
Los desrdenes inflamatorios, como psoriasis y algunos tipos de colitis, son caracterizados
por una presencia excesiva de linfocitos que pueden ser aminorados por la ingestin de algas
marinas. Fucoidanos derivados de las algas, inhiben el pasaje de linfocitos hacia el tejido por el
bloqueo de receptores. Estos fucoidanos estn siendo investigados clnicamente por su potencial
de prevenir la destruccin postisqumica de tejido cardaco muscular, por una accin sobre
linfocitos. (Ritter, 1998).
2.10.13 Actividad Hipolipemiante e Hipotensora. Muchas comidas son conocidas por su
capacidad de reducir los niveles de colesterol y las algas pardas caen en esta categora. La ingestin
de Undaria, produce una disminucin del colesterol sanguneo en ratas (Iritani y Nogi, 1972). Este
efecto sobre el procesamiento lipdico, parece ser el resultado de la estimulacin de enzimas
hepticas (Murata et al., 1999).
Un extracto de F. vesiculosus, de forma dosis dependiente, redujo en forma efectiva la
elevacin de triglicridos sanguneos y los niveles totales de colesterol. En ratas, con una dieta alta
en colesterol por 21 das, la aplicacin de la suplementacin en la dieta de U. pertusa, produce una
disminucin en el colesterol y LDL, no as en los triglicridos sricos. (Pengzhan et al., 2003). Los
efectos de U. pertusa, fueron modificados una vez que sta fue sometida a degradacin a pequeas
fracciones moleculares. Estos derivados de bajo peso molecular y viscosidad intrnseca, no
redujeron el colesterol srico, pero s normalizaron la Hipertrigliceridemia de estos animales, as
como tambin el HDL. El mecanismo por el cual se consiguen estos efectos, es incierto, pero
aparentemente no involucra la accin sobre cidos biliares, puesto que U.pertusa y sus derivados
de bajo peso molecular, incrementan la excrecin biliar.
48
Recientemente, ha sido reportado que la fucoidina de L. japonica, reduce el contenido srico

de LDL y triglicridos y aumenta el HDL en modelos de ratas hiperlpidemicas (Huang et al.,
2010). El tratamiento tambin incremento la actividad de lipoprotena lipasa (LPL), lipasa heptica
(LH), y Lecitina colesterol acil transferasa (LCAT) en suero. Estos cambios en la actividad
enzimtica, pueden ser el resultado directo del tratamiento fucoidano o un efecto indirecto asociado
con la mejora del perfil lipdico. (Chopin et al., 1999).
Los polisacridos sulfatados algales, han demostrado efectos prometedores en el manejo de
la hiperlipidemia asociada con la toxicidad de ciertas drogas (efectos adversos). Fucanos, de S.
polycystum, demostraron tener un efecto preventivo en la elevacin de colesterol y triglicridos en
suero y tejido hepticos, derivado de la toxicidad heptica por acetaminofeno. (Raghavendran et
al., 2005). De forma similar, un polisacrido sulfatado de S. wightii, redujo hiperlipidemia y
normalizo la LPL y LCAT en plasma un caso de Nefrotoxicidad inducida por el uso de Ciclosporina
A. (Josephine et al., 2007).
Undaria contiene cantidades suficientes de laminina y tetrapptidos similares, que han
demostrado poseer una actividad inhibitoria sobre la enzima convertidora de angiotensina, en
ensayos in vivo e in vitro (Suetsana y Nakano, 2000). Una ingestin de 3.6 g/da de Undaria
(wakame) por cuatro semanas, resulta en una cada de 14 mmHg en la presin sistlica, en pacientes
asiticos que tenan hipertensin (Krothiewski, 1991).
2.10.14 Actividad antibacteriana. Fue estudiada por primera vez por Pratt et al., (1951), al observar
que diversas especies de algas tropicales presentaban una importante actividad antibacteriana. Los
avances significativos que se han continuado hasta el da de hoy, han sido numerosos y se
49
incorporan slo alguno de ellos en la Tabla XIII (Chester y Stott 1956, Fassina 1962, Olesse et al.,
1964; Blunden et al., 1981; Rossel y Srivastava 1987, Steinberg et al., 1991).
Rossel y Srivastava (1987), estudiaron la actividad antibacteriana de nueva algas pardas y las
probaron contra nueve especies bacterianas, encontrando que la actividad antimicrobiana est dada
principalmente por cidos grasos insaturados, los cuales pueden estar en el alga como cidos grasos
libres o formando parte de mono, di y triglicridos. Reichelt y Borowitzka (1984), en cambio,
atribuyeron la actividad antimicrobiana de algas pardas australianas, a la accin de fenoles, como
resorcinol y floroglucinol.
Entre los principios activos aislados de alga marinas, que tienen actividad antibitica, se
mencionan los siguientes; cido acrlico, cidos grasos insaturados, fenoles, sesquiterpenos
halogenados, carbonilos, hidroquinonas bromadas, etc. (Howard y Fenical 1978, Steinberg et al.,
1991)
Diversos autores, estiman que algunas de las sustancias con actividad antibitica y antiviral
producidas por algas marinas, tendran una funcin ecolgica de proteccin del organismo que la
produce, provocando la eliminacin de microorganismos epi o endofiticos y provocando respuestas
de repelencia en sus predadores (Krasilnikova 1961, Steinberg 1986, Santelices 1989).
Se ha observado que la actividad antibitica de las algas marinas presenta marcadas
variaciones estacionales en trminos cualitativos y cuantitativos, hasta el punto que Chester y Stott
(1956), sealan que cada especie de alga posee su propia periodicidad en la produccin del
antibitico. En cambio, otros autores encuentran cuatro patrones de produccin del antibitico, que
van desde uniforme todo el ao, hasta mxima produccin en Invierno, en Primavera o en Verano
(Hornsey y Hide 1985, Valdebenito 1981, Mora 1981).
50
Tabla XIII. Lista de algunas algas marinas reportadas con actividad antibacteriana.
Nombre del alga
Microorganismo
Ceramium indica, Enteromorpha intestinalis,
B. cereus ATCC 11778, M. flavus ATCC
Ulva lactuca, Gelidiella acerosa, Corallina
10249, K. pneumonia NCIM 2719, P.
officinalis, Gracilaria coticata, Sargassum
testosterone NCIM 5098, C. freundii ATCC
sp., Galaxaura oblongata, Grateloupia sp.,
10787.
Ceramium indica, Laurentia pedicullata,

Sargassum sp., Padina gymnospora,
Stoechospermum marginatum, Cystoseira sp.,
Caulerpa racemosa, Caulerpa
scalpelliforrmis, Spathoglossum variabile,
Halimda tuna, Gelidiopsis gracilis, Iyengaria
stellata, Gelidium sp., Udotea indica,
Corallina officinalis, Cystoseria barbata,
S.aureus, M. luteus, E. faecalis, E. coli, E.
Dictyota dichotoma, Halopteris filicina,
aerogenes, E. coli O157:H7
Cladostephus spongiosus, Ulva rigida.

Gracilaria tikvahiae, Ulva lactuca, Ulva
E. coli, S. aureus, S. enteritidis, S.
fasciata, Sargassum fluitans.
epidermidis, P. aeruginosa, S. faecalis, C.

albicans.
Ulva lactuca, Padina gymnospora, Sargassum S. aureus, V. cholerae, S. dysentriae, S. bodi,

wightii, Gracilaria edulis.
Extrado de Chanda et al., 2010.
S. paratyphi, P. aeruginosa, K. pneumoniae.
51
Tabla XIII. (cont.)

Caulerpa prolifera, Gracilaria domingensis,
E. coli, E. aerogenes, K. pneumoniae, M.
Gracilaria sp., Amansia smultifida.
morganii, P. aeruginosa, S. typhi, S.

typhimurium, S. enteritidis, S. cholerae.
S. marginatum, St. marginatum, P.
B. subtilis, E.coli, Pseudomonas sp., S.
tetrastromatica, P. gymnospora, C. implexa,
pyogenes, S. aureus, P. vulgaris, K.
D. australis, D. bartayresiana, S. aspermum,
pneumoniae, S. morgani, C. albicans.
Asparagopsis taxiformis, Amphiroa

fragilissima, Jania reubens, Caulerpa
racemosa, Caulerpa peltaa, Caulerpa
taxifolia, Codium fragile, Chlorodesmis
fastigiata.
Gacilaria corticata, Ulva fasciata,
V. alginolyticus, P. aeruginosa, A. hydrophilia
Enteromorpha compressa.
E, tarde, P. fluorescens, A. hydrophila.
Valonia aegrophila, Ulva pertusa, Halimeda
S. aureus, B, subtilis, E. coli, C. albicans.
opuntia, Halimeda tuna, Caulerpa racemosa,

Caulerpa mexicana.
Enteromorpha linza
S. aureus, S. epidermidis, S. faecalis, B,

subtilis, S. typhimorium, P. aeruginosa, E.
cloacae, E. coli, C. albicans.
52
Por otra parte, Hornsey y Hide (1985) analizaron la distribucin de la sustancia antibitica
dentro del talo de seis especies de algas y observaron que slo Ulva lactuca, presentaba un
contenido uniforme en toda su economa, en tanto que tres especies, Chondrus crispus, Dilsea
carnosa, Codium fragile, exhiban actividad antibitica aumentada en las regiones ms jvenes de
la planta.
En Laminaria sacharina, la menor actividad se present alrededor de las zonas
meristemticas, en tanto que en Laminaria digitata, la actividad antibitica se distribuy
irregularmente dentro del talo.
2.10.15 Actividad Antioxidante. Los procesos metablicos normales de todos los organismos que
utilizan oxgeno pueden producir especies reactivas del oxgeno (EROS o ROS), se estima que
cerca del 2 5% del oxgeno total consumido se convierte en EROS (O2- , OH-, H2O2, -O2, entre
otros). Probablemente, la fuente endgena ms importante generadora de EROS es la cadena
respiratoria mitocondrial, aunque tambin pueden incluirse algunas reacciones del metabolismo de
los prostanoides, la autoxidacin de las catecolaminas, la actividad de la Xantina oxidasa y la
activacin de fagocitos y clulas endoteliales (Ros de Molina 2003. Ferrari, 1994).
En situacin patolgica se incrementan sustancialmente estas especies qumicas, provocando
una alteracin orgnica conocida como estrs oxidativo caracterizado por el dao a biomolecular,
vindose implicadas en la gnesis o exacerbacin de numerosos procesos en el aparato
cardiovascular (arteriosclerosis, cardiopata alcohlica), sistema neurolgico (enfermedad de
Parkinson, Alzhemier traumatismo craneales), aparato ocular (Cataratas, fibroplasia), aparato
respiratorio (cncer de pulmn), rin (Nefrotoxicidad por metales) y artritis reumatoidea, entre
otros (Rodrguez et al., 2001. Elejalde, 2001).
53
Entre los desrdenes metablicos crnicos de mayor morbilidad y mortalidad esta la diabetes,
del 5 al 10% de la poblacin mundial la padece, y se estima que para el ao 2010 cerca de 239
millones de personas pueden ser afectadas (Hamdan y Afifi, 2004). La diabetes y el estrs oxidativo
parecen relacionarse (Sabu y Kuttan, 2002. Ugochukwu y Babady, 2002), existe evidencia que
demuestra que los niveles elevados de glucosa en la sangre conducen a la autooxidacin de esta
misma, tambin la glicosilacin no enzimtica de protenas y el aumento del metabolismo de la
glucosa por la ruta del poliol sorbitol son contribuyentes del proceso; en cualquier caso la
produccin de EROS se incrementa, y ms an en presencia de metales como el hierro (Failla y
kiser, 1981). Las EROS contribuyen a la resistencia a la insulina debido a que, interfieren con las
vas de sealizacin inducida por esta hormona, evitando as la traslocacin del transportador de
glucosa GLUT 4 a la membrana plasmtica, por otra parte una descarga de EROS es liberada por
los neutrfilos, exacerbando los procesos inflamatorios y elevando la concentracin de las EROS
ajo condiciones patolgicas persistentes (Micelii, 2005. Fernndez et al., 2004).
Si bien los organismos vivos soportan multitudinarios factores endgenos y exgenos de estrs
oxidativo, tambin poseen numerosos sistemas de defensa antioxidantes regulables, enzimticos
(superxido dismutasa, catalasa, GSH peroxidasa, quinonas reductasas y hemoxigenasa) y no
enzimticos (Se, Zn, vitaminas Cy E y carotenoides) que conforman la defensa antioxidante frente
a las EROS (Kim et al., 2003), pero que no siempre resultan ser una barrera efectiva.
Muchos estudios in vitro han demostrado que la fucoidina presenta una actividad antioxidante
muy significativa, as como tambin existen otros antioxidantes algales (Tabla XIV) con distintas
actividades fisiolgicas o efectos beneficiosos para la salud (Tabla XV). La fucoidina es un
excelente antioxidante natural, con gran potencial para prevenir la liberacin o sntesis de ROS,
producto de mltiples patologas.
54
Tabla XIV. Categorizacin de grupos antioxidantes, ejemplos de ellos y fuente algal de la

cual proceden.
Categora General
Carotenoides
Molcula
Fuente algal
Caroteno
Chondrus
crispus,
Mastocarpus stellatus.
Fucoxantina
Anteraxantina,
Algas pardas
lutena, Algas rojas
Violaxantina, zeaxantina.
Compuestos fenlicos.
Estipodiol,
Isoepitaondiol, Taonia atomaria
Taondiol.
Pigmentos ficobilinas
Terpenoides
Cystoseria sp.
Ficoeritrina
Algas pardas
Ficocianina
Polifenoles
Catequinas,
Epicatequina, Halimeda sp.
Galato
Flavonoides
Palmaria palmata
Florotaninos
Sargassum pallidum
Fucus vesiculosus
Extrado desde Cornish et al., 2010.
55
Tabla. XIV (Cont.).

Fucoidina, cido algnico,
Polisacridos Sulfatados
Turbinaria conoides
laminarina.
Laminarina, Fucoidina.
Laminaria japonica,
Durvillaea antarctica,
Vitaminas
Galactanos sulfatados
Algunas algas rojas
Ascorbato
Chondrus crispus
Mastrocarpus stellatus
Sargassum sp.
Vitamina A
Kappaphycus alvarezii
56
Tabla XV. Compuesto antioxidante algal con actividad fisiolgica o efecto beneficioso para
la salud.
Compuesto antioxidante
Actividad fisiolgica/Efecto beneficioso.
- Caroteno, Lutena
Antimutagnico
Protector ante el cncer de mama
Carragenanos, oligosacridos del Carragenano
Antitumoral, Anti HIV
Fucoxantinas
Antiangiognico
Efecto protector ante la
deficiencia de retinol
Galactanos sulfatados
Antiviral
Florotaninos
Antiinflamatorio
Bactericida
Inhibicin perxido de hidrogeno
Hipertensin
Polifenoles
Antimicrobiano
Proteccin vascular
57
La fucoidina de Laminaria japonica puede prevenir el incremento del perxido lipdico (LPO,
implicado en la liperoxidacin lipdica), en suero, hgado y bazo de ratones diabticos. Este
fucoidano tiene un potente efecto contra el radical superxido, pero uno menor en el radical
hidroxilo y en DPPH. (Micheline et al., 2007).
2.11 Digestin enzimtica y mtodo de deteccin de productos de hidrlisis.
2.11.1 Enzimas.
Las capacidades de los polisacridos algales sealadas anteriormente (fucoidina y
laminarina), se ven mejoradas cuando se trata de sus oligmeros con ramificaciones -1,6 que son
los que tendran un mayor efecto inmunoestimulador (Elyakova et al., 2006).
Laminarina puede ser hidrolizada por -glucanasas microbianas resultando fragmentos de
4 6 residuos de monosacridos ( glucanos, que segn su extensin de monmeros pueden
recibir nombres como laminaribiosa, laminaritreosa o laminariteraosa, en la caso de la hidrlisis
de la laminarina) que preservan la actividad biolgica del polisacrido, estas enzimas son
encontradas en las bacteria y hongos marinos que colonizan las algas y son capaces de degradar la
laminarina y otros carbohidratos presentes. Estas enzimas son clasificadas como exo--1,3glucanasa y endo--1,3-glucanasa.
Las glucanasas cumplen distintos roles fisiolgicos: en plantas terrestres, estn involucradas
en diferenciacin celular y defensa contra hongos patgenos. En hongos tienen diferentes funciones
en procesos morfogenticos, movilizacin de -glucanos e interaccin hongo-patgeno-planta. En
bacterias, cumplen funciones metablicas (Gueguen et al., 1997).
La enzima especfica que degrada laminarina es laminarinasa, una endo--1,3-glucanasa.
Se han identificado dos tipos de laminarinasas, endo--1,3(4)-glucanasa y endo--1,3-glucanasa;
58
endo--1,3(4)-glucanasa es capaz de hidrolizar ambos enlaces -1,3 y -1,4-glicosdicos, mientras

que endo--1,3-glucanasa hidroliza principalmente enlaces -1,3-glicosdicos (Allardyce et al.,
2008).
2.11.2 glucanos y distribucin en levaduras, hongos y algas segn el tipo de enlace
glucosdico que presentan.
Los glucanos, corresponden a oligmeros cortos resultantes de la hidrlisis de ciertos
polisacridos, pero tambin pueden ser encontrados de forma natural, en microorganismos y
plantas mayores, como estructuras conformantes de la pared celular, como material de reserva en
el espacio citoplasmtico o vacuolar o como substancias extracelulares de significancia o
importancia incierta. (Allardyce et al, 2008). La distribucin natural de algunos 1,3, 1,6
glucanos, se muestra en la Tabla XVI.
2.11.3 Tcnicas de deteccin, Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
La cromatografa lquida de alta eficiencia es la tcnica analtica de separacin ms usada
en la actualidad, por su alta sensibilidad, exactitud, una gran capacidad para la separacin de
sustancias no voltiles y termolbiles y principalmente por la aplicabilidad a sustancias de inters
como lo son aminocidos, protenas, cidos nucleicos, polisacridos, frmacos, hidrocarburos y
variadas sustancias inorgnicas. La diferencia de esta tcnica cromatogrfica con la cromatografa
liquida convencional, en la que la fase mvil es un lquido, es que en la cromatografa liquida de
alta eficiencia el dimetro de las partculas de relleno de la columna es del orden de 3 a 10 m.
adems de que se utilizan altas presiones para forzar a los componentes disueltos en la fase mvil
a pasar por la columna (Skoog et al., 2001).
59
Tabla XVI. Distribucin de 1,3 glucanos en levaduras, hongos y algas.

Fuente
Enlace glucosdico 1,3 (%)
Otro enlace
glucosdico/componente
Levaduras
Saccharomyces cerevisiae
80 90
1,6
Candida albicans
28
1,6
Cryptococcus laurentii
---
1,6, 1,4, 1,2.
Hongos
Penicilium luteum
---
1,6, 1,4
Microsporum quinckeanum
---
1,6
Plectania occidentalis
60 70
1,6, fructosa, manosa.
Algas
Laminaria digitata
90
1,6, manitol 2,7%.
95
1,6, manitol 1,7%.
100
----
(laminarina soluble)
Laminaria cloustoni
(laminarina insoluble)
Euglena gracilis
Extrado de Allardyce et al, 2008.
60
Bsicamente las partes de un equipo de HPLC son: depsito de solventes, bomba, inyector
y detector. El detector de ndice de Refraccin (IR), el cual mide la diferencia de ndice de
refraccin entre el solvente puro y el solvente que contiene la muestra, es el recomendado para usar
en la deteccin de carbohidratos en general (Quattrocchi et al., 1975).
Entre los mtodos clsicos de cromatografa liquida, la cromatografa de exclusin
molecular fue el ltimo en ser desarrollado, esta cromatografa se utiliza para el anlisis de
compuestos de elevado peso molecular, los rellenos estn constituidos por pequeas partculas
(aprox. 10 m.) polimricas o de slice que contienen una red de poros uniforme en los que puede
difundir las molculas del soluto y del disolvente. Las molculas son atrapadas por los poros y
eliminadas del flujo de la fase mvil. Las molculas de mayor tamao que el tamao medio de los
poros del relleno son excluidas, siendo las primeras en eluir, las molculas que tienen un tamao
inferior que el tamao del poro penetran al interior del laberinto de poros resultando atrapadas por
ms tiempo, siendo las ultimas en eluir. Las molculas de un tamao medio cuya penetracin en
los poros depende de su dimetro eluyen de forma intermedia (Skoog et al., 2001).
El resultado del ensayo cromatogrfico es, por un lado, la obtencin de fracciones separadas
de los componentes de la muestra, y por el otro, la de un grfico o cromatograma, de cuya
interpretacin puede extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas (Quattrocchi et al., 1975).
61
2.12 Hiptesis
H1. Usando diversos protocolos es posible obtener extractos de fucoidina y laminarina con
propiedades fisiolgicas (antioxidante, antibacteriana y antifngica) a partir del alga
Macrocytis pyrifera y Durvillaea antarctica.
H2. La hidrlisis enzimtica refuerza las propiedades fisiolgicas de los extractos de laminarina y
fucoidina obtenidos del alga Macrocytis pyrifera y Durvillaea antarctica.
2.13 Objetivo General
Efectuar la extraccin, deteccin y caracterizacin parcial de laminarina y fucoidina a partir
del alga parda Macrocytis pyrifera y obtener oligosacridos ( glucanos) con propiedades
fisiolgicas.
2.14 Objetivos Especficos
1.- Extraer laminarina y fucoidina desde Macrocystis pyrifera usando diversos protocolos de
extraccin (tcnicas, instrumentacin y reactivos).
2.- Determinar la actividad antioxidante, antibacteriana y antifngica, de los dos mejores extractos
de laminarina y fucoidina obtenidos.
3.- Determinar de actividad antioxidante, antibacteriana y antifngica de oligosacridos de
fucoidina y laminarina obtenidos mediante hidrlisis enzimtica con enzimas estndar (SIGMA).
62
3. MATERIALES Y MTODOS.
3.1 Extraccin de polisacridos.
Las algas utilizadas para la extraccin de polisacridos fueron colectadas en dos zonas y
fechas distintas del ao (estaciones del ao), a saber, M. pyrifera desde Calbuco en junio de 2009
y D. antarctica desde la localidad de Pucatrihue, costa de Osorno, en abril de 2010.
Para la extraccin de los polisacridos se procedi a aplicar las metodologas propuestas
por Deville y colaboradores (Deville et al., 2004), efectuando los ajustes necesarios que no estaban
especificados en el documento antes sealado1
Es as como se determin que para el protocolo Black et al., (Anexo 1.1) se realizara
posterior a la adicin del HCl 0,09 M una filtracin con muselina para separar la fraccin de mayor
tamao, adems se estableci que la primera centrifugacin se realizara a 5000 rpm durante 30
min. , se estipulo tambin que la coagulacin con etanol se efectuara en una proporcin 1:5 (v/v)
y que la segunda centrifugacin se realizara a 8000 rpm durante 30 min. Para el protocolo Black
et al., modificado (Anexo 1.2) se establecieron las mismas condiciones mencionadas en el
protocolo anterior.
En el protocolo Yvins (Anexo 1.3) la incubacin del alga con H2SO4 se realiza durante 150
min. a 70 C, para una posterior filtracin con muselina; la primera centrifugacin y la coagulacin
Los ajustes a la metodologa fueron desarrollados en el Lab. de Biotecnologa del ICYTAL por Oscar Daz R. (el
suscrito), Andrea Daz C., y Javier Aguinaga G, estudiantes tesistas de Bioqumica de la UACh, adscritos al proyecto
FONDEF D07I 1095
63
con etanol se realizan en las mismas condiciones que en los protocolos mencionados anteriormente,
mientras que la segunda filtracin se realiz a 5000 rpm por 30 min.
Para el protocolo Nuevo (Anexo 1.4) al igual que en los protocolos anteriores se realiza una
filtracin con muselina, una primera centrifugacin a 5000 rpm durante 30 min. , subsecuentemente
una coagulacin con etanol en una proporcin 1:5 (v/v) y una ltima centrifugacin a 5000 rpm
durante 30 min.
Los extractos obtenidos fueron secados por medio del uso de Centrivap refrigerated
concentrator Labconco (speed back), este instrumento utiliza la fuerza centrfuga y vaco para
condensar rpidamente solventes a partir de muestras biolgicas y analticas. Concentra el soluto
en la parte inferior del vial, permitiendo la recuperacin de stos en muestras de volmenes
pequeos, de esta forma, se obtienen muestras secas sin remanentes de alcohol.
La lnea central de protocolo de extraccin, se realiz a base de los protocolos elaborado
por Deville et al., (2004), y aunque finalmente estos fueron la base sobre la cual se efectu la
deteccin de polisacridos por HPLC, se confeccionaron protocolos alternativos, combinando los
protocolos de Deville y Nakamura (1985) (Anexo 1.5), o protocolos NB (NB01 a NB09, segn la
modificacin realizada, Tabla XVII) (Anexo 1.6). Nakamura, confeccion su protocolo de
extraccin en orden de conseguir la extraccin de manitol, cidos orgnicos, aminocidos libres y
cido algnico entre otros, desde el alga marina japonesa Laminaria religias. El protocolo de
Nakamura se diferencia del de Deville, bsicamente en las proporciones y concentraciones de cido
que se utilizan para la extraccin, as como tambin en los ajustes de pH y los volmenes de etanol
85% que se utilizaban. A su vez, la extraccin de Laminarina y Fucoidina por el protocolo de
Nakamura, implica que ambos polisacridos sean extrados de forma conjunta en el precipitado de
uno de los pasos finales del protocolo.
64
Tabla XVII. Modificaciones realizadas a protocolos Nakamura Black (NB)

Proto-
Modifi-
colo
NB01
Modificacin
Modificacin
cacion
3**
4**
1 **
( recirculaciones)
(recirculaciones)
1:8
Modificicacin 2**
Shaker 24h + proceso

congelamiento y descongelamiento.
NB02
1:6
Shaker 24h + proceso

NB03
1:7
Shaker 24h + proceso de

NB04
1:9
Shaker 24h + proceso de

NB05
1:5
Ultrasonido por 1-2 h
NB06
1:8
NB07
1:8
NB08
1:8
Ultrasonido 1-2 h + shaker
NB09
1:8
Ultrasonido 1-2 h + shaker
** Los puntos 1, 2, 3 y 4, corresponden a las modificaciones realizadas al protocolo NB, que en

definitiva resulta en la numeracin correspondiente a cada protocolo. En Anexos 1,6 se especfica
a que proceso del protocolo corresponde cada punto.
65
Por lo tanto, y en vista de las variaciones que presenta Nakamura en sus protocolos, se
realiz la combinacin antes mencionada, con el propsito de elaborar un nuevo protocolo que
resulte en un mtodo de extraccin alternativo de los polisacridos en estudio.
3.2 Deteccin de polisacridos.
Los extractos obtenidos de cada uno de los protocolos ensayados, se disuelven en agua
desionizada y se procesan por HPLC ConstaMetric 3200 solvent delivery system con columnas de
exclusin molecular Ultrahidrogel Waters 500 y 250 de 7,8*300 mm y detector IR Merck detector
diferential refractometer RI-71. La utilizacin de equipos de cromatografa, orienta a la utilizacin
de los mejores protocolos, en cunto a contenido de laminarina y fucoidina, descartando aquellos
con baja concentracin de polisacridos o simplemente en ausencia de estos.
3.3 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
Previo a este anlisis y para una mayor purificacin y facilitacin en la deteccin de los
polisacridos se realiza una filtracin de la muestra con filtros Millex con membrana de PVDF,
con tamao de poro de 0,22 m. Una vez realizada la filtracin de los extractos obtenidos por la
aplicacin de los distintos protocolos, stos se analizan por HPLC/IR, utilizando como fase mvil
agua desionizada y una columna cromatogrfica de exclusin molecular a 1000 psi a un flujo de
1,0 mL/min. A temperatura ambiente y con un tiempo de corrida de 25 min. Los componentes de
la mezcla eluyen de la columna en funcin de sus pesos moleculares, lo que constituye el
cromatograma. Por medio de ste ltimo, se puede realizar la identificacin cualitativa y
cuantitativa de los polisacridos.
66
3.4 Recoleccin de fracciones de polisacridos (pick cromatogrficos) desde HPLC.
La recoleccin de pick cromatogrficos, se refiere a la captura y acumulacin del eludo que
proviene del HPLC y que corresponde al inicio y fin de un pico en el cromatograma, perteneciente
a Fucoidina, o bien a Laminarina.
3.5 Hidrlisis enzimtica de polisacridos.
Una vez elegido el protocolo de mayor rendimiento y pureza basado en los resultados
mostrados en el HPLC, se procede a la degradacin enzimtica de los polisacridos utilizando dos
enzimas comerciales, para luego utilizar estos productos enzimticos en pruebas de actividad
fisiolgica.
La primera enzima que se utiliza es la -glucanasa GrainGain, con esta enzima se realizan
ensayos enzimticos de 6, 12, 24 y 48 h para conocer el tiempo que necesita esta -glucanasa para
la degradacin de los polisacridos. Cada ensayo enzimtico se realiz como se describe a
continuacin: Se incuba a 60C 500 L del polisacrido con 500 L de la enzima -glucanasa
(cada muestra en triplicado), incubndose la mezcla a distintos tiempos (0, 30, 60 min, etc.),
cumplido el tiempo determinado las muestras se trasladan rpidamente al congelador (para
inactivar la accin hidroltica de la enzima). Una vez terminado el ensayo las muestras son retiradas
del congelador y descongeladas en agua fra para anlisis.
Por otra parte, se utiliz tambin la enzima comercial Laminarinasa Sigma, la cual es
especfica para el polisacrido de laminarina. Se realizaron ensayos enzimticos de 6, 12, 24 y 48
h a 37 C para conocer el tiempo que requera la enzima para la degradacin completa de los
polisacridos en estudio, estos ensayos se realizan de la misma forma que con la enzima GrainGain.
Los productos de hidrlisis obtenidos de la degradacin enzimtica con ambas enzimas
fueron detectados por medio del test de glucosa, DNS y HPLC.
67
3.6 Test de glucosa.

Para este ensayo se utiliz el GOD PAP comercial (Spin React). Este mtodo se basa
en el principio que se especfica; la enzima glucosa-oxidasa (GOD) cataliza la oxidacin de glucosa
de acuerdo a la siguiente ecuacin:
C6H12O6 + O2 + H2O
GOD
C6H12O7 + H2O2
El H2O2 formado en esta reaccin, reacciona con 4-aminoantipireno y 4-cido

hidroxibenzoico en presencia de peroxidasa para formar N-(4-antipiril)-p-benzoquinona imino. La
cantidad de color formado es proporcional a la concentracin de glucosa.
El procedimiento consiste en mezclar 50 L de muestra (digerida enzimticamente) con 2
mL del reactivo que contiene las enzimas hidrolizantes de glucosa, luego se incuba a 37 C durante
10 min, para as medir la absorbancia contra el blanco a 505 nm en un espectrofotmetro Spectronic
Genesys 5 .
3.7 Ensayo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS).
Este mtodo detecta la presencia de un grupo carbonilo (C=O) libre presente en azcares
reductores, involucrando la oxidacin de grupos aldehdos funcionales presentes en los azcares,
reducindose simultneamente el cido 3,5-dinitrosaliclico a cido 3-amino, 5-nitrosaliclico bajo
condiciones alcalinas (Miller, 1959). Segn la siguiente ecuacin:
Grupo aldehdo
3,5-dinitrosaliclico
oxidacin
reduccin
Grupo carboxilo
cido 3-amino, 5-nitrosaliclico
Este mtodo fue estandarizado 2, de manera tal de optimizar el ensayo segn las variaciones
en la metodologa que se encontraron en las bases bibliogrficas.
68
Los primeros ensayos en estudio, coinciden en utilizar 1,5 mL de muestra con 2 mL de

cido tricloroactico (TCA) y 3,5 mL de DNS, luego la mezcla obtenida se lleva a hervor por bao
mara durante 5 min. , para posteriormente dejar enfriar a temperatura ambiente. La absorbancia
fue medida a 510 nm 540 nm. Por contraparte, otros protocolos coinciden en mezclar 3 mL de
muestra con 3 mL de DNS e incubar a 90C durante 15 min. , para luego dejar enfriar a temperatura
ambiente y as agregar 1 mL de tartrato de sodio y potasio al 40%; finalmente se mide la
absorbancia contra el blanco a 575 nm 610 nm. La estandarizacin se realiza utilizando las 4
mezclas propuestas y midiendo cada una de estas a las cuatro longitudes de ondas expresadas, as,
la muestra utilizada corresponde a glucosa a distintas concentraciones y el blanco a reactivo DNS.
3.8 Determinacin cualitativa de Sulfatos.
La presencia de sulfatacin en los polisacridos en estudio, es relevante por el hecho de que
en variadas investigaciones del campo algal, se atribuye a estos grupo sulfatos, gran parte de la
actividad fisiolgica que se intenta demostrar en este trabajo de investigacin, o en su defecto
explicara parte de la actividad biolgica que presentaran Fucoidina y Laminarina. Es por ello, que
ensayos tan slo cualitativos, son de gran ayuda para dilucidar la presencia de estos grupos. Para
esto, la muestra que posiblemente contiene grupos sulfatos es levemente acidificada agregando
gotas de HCl 2 M, para as adicionar BaCl2 0,2 M, producindose un precipitado blanco
correspondiente a sulfato de bario.
2
La Estandarizacin de la Metodologa, fue desarrollada en el Laboratorio de Biotecnologa del ICYTAL por Andrea
Daz C., estudiante tesista de Bioqumica UACh, adscrito al proyecto FONDEF D07I 1095.
Finalmente se agregan gotas de cido clorhdrico 2 M, el cual disuelve los sulfatos que no
correspondan a sulfato bario 3. Este ensayo se resume en la siguiente ecuacin:
69
SO42- + Ba2+
BaSO4
3.9 Determinacin de la Actividad Antioxidante.

3.9.1 Estndares y Reactivos.
Los siguientes estndares fueron utilizados; cido glico, cido ascrbico y TROLOX (cido
6-hidroxi 2, 5, 7,8 tetrametilcromo 2 cido carboxlico 97 %), todos ellos de Sigma Aldrich. El primero de ellos para la determinacin de Fenoles Totales y los dos ltimos, para la
metodologa por DPPH. Los reactivos utilizados fueron, reactivo de Folin Ciocalteu de Sigma Aldrich y la preparacin de Na2CO3 20 % p/v, para el caso del mtodo de Fenoles Totales.
3.9.2 Mtodo DPPH.
Este mtodo, desarrollado por Brand Williams, (Brand Williams et al., 1995), se basa en
la reduccin de la absorbancia medida del radical DPPH* (2,2 difenil 1 picrilhidrazilo), por
antioxidantes. Ya que una notoria banda de absorcin, se encuentra aproximadamente a los 520
nm, el DPPH posee una fuerte coloracin violeta (en su estado reducido, con un electrn
deslocalizado), ste al ser expuesto a una sustancia antioxidante, es llevado a su forma oxidada,
donde la caracterstica coloracin violeta, cambia a un amarillo plido, signo del que el radical
DPPH ha sido estabilizado o ha perdido su capacidad oxidante (Figura 10).
3
La Determinacin cualitativa de Sulfatos, fue desarrollada en el Laboratorio de Biotecnologa del ICYTAL por
Andrea Daz C., estudiante tesista de Bioqumica UACh, adscrito al proyecto FONDEF D07I 1095. En esta
oportunidad, ser utilizado como fundamentacin y soporte de la Actividad Antioxidante de las algas antes
mencionadas.
70
Figura 10. Espectro de absorcin del DPPH. Lnea morada indica el espectro, con pico de
absorcin a 520 nm, del estado reducido del radical DPPH. Lnea amarilla indica el espectro, del
estado oxidado del radical DPPH, as como tambin el descenso en la absorcin a los 520 nm.
Adems se incluye el cambio en la conformacin molecular, del DPPH en su estado radical
reducido (molcula izquierda) a su estado estable oxidado (molcula a la derecha), con la respectiva
accin del agente antioxidante (R*). Figura extrada de Snchez Moreno et al., 1997.
71
Con modificaciones el mtodo descrito por Kim (Kim et al., 2002), se basa en la medida de
la absorbancia del radical DPPH* 5,10 10 -5 M (1,5 mL), disuelto en Metanol 100 %, a la longitud
de onda de 517 nm. Se aade 0.75 mL de la muestra o patrn, sta se homogeniza cuidadosamente,
y se mantiene en la oscuridad durante 1 hora y a una temperatura de 37C (parmetros obtenidos
por estandarizacin del mtodo Brand Williams, a raz del bajo consenso que exista en las fuentes
bibliogrficas, en cuanto a parmetros utilizados). La inhibicin del radical libre (DPPH) o % IRLa,
fue efectuada midiendo el descenso de la absorbancia a 517 nm, para ello se realizaron mediciones
antes de aadir la muestra con supuesta actividad antioxidante (A0) y pasada 1 h de haber agregado
sta (Af). La concentracin de DPPH* en el medio de reaccin se calcula a partir de una curva de
calibracin obtenida por regresin lineal. Los resultados son expresados en TEAC y VCEAC, o en
otras palabras, actividad antioxidante equivalente a Trolox y actividad antioxidante equivalente al
cido ascrbico respectivamente. Los resultados de actividad antioxidante, tambin fueron
expresados como la cantidad de antioxidante que era necesaria para disminuir la concentracin
inicial de DPPH* a la mitad (EC50). El tiempo necesario para alcanzar EC50 (TEC50, determinado
grficamente), fue un parmetro necesario de determinar, ya que junto a EC50 (ambos afectan la
capacidad antiradical), se obtiene un nuevo parmetro para la medicin antioxidante,
AEb o
eficiencia antiradical, que se complementa al TEAC y VCEAC.

a
%IRL = A (t = 0min) A (t = tiempo en estado estacionario) / A (t = 0 min) 100

b
AE = 1/EC50 TEC50
3.9.3 Mtodo de Fenoles Totales.

El mtodo espectrofotomtrico desarrollado por Folin y Ciocalteu (Folin y Ciocalteu, 1924),
para la determinacin de fenoles totales, se fundamente en su carcter reductor y es el ms
72
empleado. Se utiliza como reactivo una mezcla de cido fosfowolfrmico y fosfomolibdco en

medio bsico, que se reducen al oxidar los compuestos fenlicos, originando xidos azules de
wolframio (W8023) y molibdeno (Mo8023). La metodologa empleada en el laboratorio, consisti en
mezclar 3,16 mL de H20 destilada, 400 L de estndar (cido glico) o de extracto, 200 L de
reactivo Folin Ciocalteu, esperar 5 min. , agregar 600 L de Na2CO3 al 20 % p/v, esperar 2 h y
finalmente medir la absorbancia a 765 nm. Los resultados se expresan en unidad de concentracin
para cido glico.
3.10.1 Cepas bacterianas.
La eleccin de las cepas utilizadas en este trabajo de investigacin, fue en base a los
antecedentes bibliogrficos encontrados y segn su incidencia en salud pblica, ya que todas las
bacterias en cuestin, causan alguna patologa en el ser humano. A continuacin, se detalla cada
cepa utilizada y las patologas o afecciones de salud que stas pueden causar.
3.10.1.1 Bacillus subtilis ATCC 33608. No es considerado un patgeno humano; sin embargo
puede contaminar alimentos, pero raramente causa intoxicacin alimenticia. Sus esporas pueden
sobrevivir las temperaturas extremas, que a menudo es usada en la preparacin de alimentos.
(Madigan et al., 2005).
3.10.1.2 Escherichia coli ATCC 25922. Esta bacteria puede causar infecciones intestinales y extra
intestinales generalmente graves, tales como infecciones del aparato excretor, vas urinarias,
cistitis, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemias y neumona. La ITU por E coli son ms
comunes en mujeres por la corta longitud de la uretra en comparacin con el hombre, y por la
73
proximidad a la zona anal. Entre los ancianos, las infecciones urinarias tienden a ser de la misma
proporcin entre hombres y mujeres. (Bae et al., 2006).
3.10.1.3 Klebsiella pneumoniae ATCC 23357. Dentro de este gnero estn involucradas
principalmente infecciones nosocomiales. Es el agente causal de infecciones del tracto urinario,
neumonas, sepsis, infecciones de tejidos blandos, e infecciones de herida quirrgica. Son
especialmente susceptibles los pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos, neonatos
y pacientes con EPOC, diabetes mellitus o alcohlicos. (Biering et al., 2001).
3.10.1.4 Pseudomnas aeruginosa ATCC 27853. Este patgeno oportunista de individuos
inmunocomprometidos, infecta el tracto pulmonar, el urinario, tejidos, heridas, y tambin causa
otras infecciones de sangre. La fibrosis qustica est tambin predispuesta a la infeccin con P
aeruginosa de los pulmones, esta bacteria es la causante de dermatitis, causada por la disminucin
del control de la calidad del agua de bebida. El ms comn causante de altas fiebres en infecciones
es P aeruginosa. (King et al., 1954).
3.10.1.5 Shigella sonnei OSP 2047 01. La mayora de las personas infectadas con Shigella
contraen diarrea, fiebre y calambres estomacales a partir de un da o dos despus de su exposicin
a la bacteria. La diarrea es a menudo sanguinolenta. La Shigelosis se resuelve de ordinario en 5 a
7 das. En algunas personas, especialmente en los nios de corta edad y los ancianos, la diarrea
puede ser tan grave que el paciente necesite ser hospitalizado.
Adems, Shigella alcanza la submucosa del colon y es capaz de ulcerar esos tejidos, pero
slo produce bacterieremia en casos absolutamente excepcionales. Sin embargo, al causar
afectacin colnica provoca una reaccin inflamatoria intensa con moco y pus, pudiendo formarse
lceras sangrantes, por lo que las deposiciones son de pequeo volumen y pueden ir acompaadas
74
de moco y sangre dando lugar, en conjunto, al cuadro denominado disentera bacilar. (Delpiano et
al., 2001).
3.10.1.6 Staphylococcus aureus ATCC 25923. Es el causante de diversos procesos infecciosos
que van desde infecciones cutneas hasta enfermedades sistmicas mortales. Entre ellas podemos
mencionar, Sndrome de la piel escaldada, intoxicacin alimentaria, Sndrome del shock txico,
abscesos cutneos, imptigo, foliculitis, ntrax, celulitis de cara y cuello, Mastitis, Endocarditis,
Neumona, Osteomielitis, Artritis sptica, peritonitis, pericarditis, entre otras. (Cheung et al.,
1994).
3.10.1.7 Staphylocccus epidermidis ATCC 12228. Este microorganismo es por lejos, el
recuperado con mayor frecuencia, ya que explica entre el 50% y ms del 80 % de los aislamientos.
Se ha aislado en vlvulas cardiacas protsicas, prtesis ortopdicas y catteres intravenosos.
(Cheung et al., 1994).
3.10.1.8 Streptococcus pyogenes OSP 344 10. Esta bacteria se asocia a muchas enfermedades,
algunas muy importantes; faringitis estreptoccica, infecciones de la piel por estreptococo
(celulitis, erisipelas, imptigos, fascitis necrotizante). La faringitis se puede complicar con la
aparicin de un exantema difuso (escarlatina), lo que ocurre con algunas cepas de estreptococo.
Otras enfermedades que puede causar son las bartolinitis, sndrome de shock txico, fiebre
reumtica y glomerulonefritis postestreptoccica. (Bisno et al., 2003).
3.10.2 Conservacin de cepas de referencia.
Para conservar las cepas de referencia se deben congelar usando criopreservantes como; leche
descremada al 20% o caldo glicerol al 20%, ste ltimo fue el utilizado normalmente en los
75
procedimientos y desde el cual se realizaban los repiques. El proceso de conservacin consisti

bsicamente en los siguientes pasos;
Sembrar la cepa en el agar adecuado e incubar por 18 24 h a 35C.
Cosechar con trula y hacer una suspensin espesa en leche o caldo glicerol.
Agitar en vortex y congelar a -70C (duracin indefinida) o -20C (dura alrededor de 1

ao).
Mientras ms baja sea la temperatura de congelacin, mayor es la viabilidad de la cepa. Para
recuperar la cepa del congelado, se rasp la superficie del hielo con un asa y se siembra en el medio
adecuado. Luego incubar 24 48h a 35C, siempre teniendo la precaucin de que el criopreservante
no se descongele, pues la cepa puede perder viabilidad.
3.10.3 Activacin de las cepas.
Cada una de las cepas de bacterias conservadas, fue sometida a un proceso de repique, que
consisti en tomar una alcuota de 100 L desde el agar de conservacin, para ser sta inoculada
en 10 mL de Caldo Soya Tripticasa (Triptic Soy Agar, Merck AG) a 30 1C por 24 h, para
posteriormente obtener una concentracin de trabajo de entre 105 106 ufc/mL.
3.10.4 Recuento de colonias bacterianas.
El recuento de bacterias fue realizado con el objeto de determinar una concentracin en
unidades formadoras de colonias/mL, cercana a la concentracin de la cual se debe disponer para
desencadenar un proceso infeccioso. Es por ello que, contar con concentraciones de entre 105 106
ufc/mL, fue preponderante para las posteriores pruebas antibiticas. Este proceso se detalla en
ANEXO 2.1.
76
3.10.5 Estndar de medicamentos Unasyn, Inem y Sulperazon.

3.10.5.1 Unasyn, antibitico inyectable, consistente de ampicilina sdica y sulbactam sdico. El
primero consistente en un antibitico semisinttico de la familia de las penicilinas y el segundo, un
inhibidor de las lactamasas. Su espectro de accin, se detalla a continuacin;
a. Bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Stapyloccus saprophyticus, Streptococcus faecalis (Enterococcus), Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans.
b. Bacterias
Gram
negativas:
Haemophilus
influenzae,
Moraxella
catarrhalis,
Escherichia coli, Klebsiella spp, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia

rettgeri, Providencia stuartii, Morganella morganii y Neisseria gonorrhoeae.
c. Anaerobios: Clostridium spp, Peptococcus spp, Peptostreptococcus spp, Bacteroides
spp.
3.10.5.2 Inem, antibitico lactmico del grupo de los carbapenems. Amplio espectro que
incluye bacterias Gram positivas y Gram negativas aerobias y anaerobias. Todos los estafilococos
resistentes a meticilina son resistentes a imipenem. Los microorganismos intrnsecamente
resistentes a Imipenem incluyen Enterococcus faecium, Legionella spp, Stenotrophomonas
maltophilia, Corynebacterium y algunas cepas de Burkholderia cepacia, Clostridium difficile
puede ser moderadamente sensible. No es activo contra Chlamydia spp, Chlamydophila spp y
Mycoplasma spp.
3.10.5.3 Sulperazon, consistente en Cefoperazona sdica, cefalosporina de tercera generacin,
antibitico semisinttico de amplio espectro, ms Sulbactam sdico.
77
3.10.6 Ensayo de Sensibilidad de las cepas de referencia frente a los extractos de Macrocystis
pyrifera y Durvillaea antarctica.
El proceso de activacin de cepas referenciales y posterior recuento de ellas, son los
procedimientos que preceden al ensayo de sensibilidad o antibiograma de las bacterias en cuestin
(este proceso se especfica de mejor manera en ANEXO 2.2).
Para la realizacin de las diluciones que fueron utilizadas para conseguir concentraciones
de entre 105 106 ufc/mL, y posterior inoculo en agar semislido Soya Tripticasa (Contenedor de
menor cantidad de agar en relacin al agar slido Soya Tripticasa), se requiri de buffer fosfato
salino (PBS) 0.01 M pH 7.20, el cual se elabor de la siguiente forma;
Preparar una solucin sales en 500 mL de H2O destilada, ajustando a pH 7.20.
Las sales consisten de; NaCl 4 g, KCl 0.1 g, Na2HPO4 anhidro 0.72 g, KH2PO4 0.12 g.
La placa Petri de ensayo de antibiograma, fue elaborada con un inculo de cada bacteria de
referencia, incluida en el agar semislido Soya Tripticasa, de manera tal, de evitar la siembra en
csped sobre agar slido y as conseguir un sembrado ms homogneo. Se tuvo especial cuidado
al momento de someter a temperatura al agar semislido (para fundir el agar y aplicar inculo),
dejando un tiempo pertinente para que sta descienda y as agregar el inculo bacteriano con
seguridad. Alcuotas (5 7 mL) de este agar semislido con inculo incluido a l, fueron vertidas
sobre una agar slido Soya Tripticasa previamente preparado. (Mayor detalle en ANEXO 2.2).
Posteriormente las placas fueron incubadas en un tiempo pertinente y a T ptima para el
crecimiento de cada bacteria, para luego determinar halos de inhibicin formados alrededor de los
discos. El tamao del halo de inhibicin, se midi mediante un pie de metro digital, midiendo en
78
milmetros la distancia correspondiente entre el borde del disco y el inicio del cultivo. Todas las
mediciones se realizaron en triplicado.
La manera en que se confeccion cada placa de ensayo de antibiograma y el contenido de
stas en cuanto a muestras ensayadas fue la siguiente;
A. Las placas que contenan extractos crudos (concentrado de 25 mg/mL en H2O estril, desde
el cual se realizaban las diluciones), extractos digeridos enzimticamente, estndares
comerciales de los polisacridos en estudio, estndar de antibiticos y pick cromatogrficos
recolectados por HPLC de fracciones de fucoidina y laminarina (Tabla XVIII), consistieron
de 6 perforaciones o 6 discos filtros. Cada perforacin o pocillo, previo a un proceso de
filtrado por filtros Millipore de 0,45 m, almacenaba (25 L) distintas diluciones de las
muestras mencionadas. Es as como, cada placa estaba constituida por: (Figura 11)
a. Pocillo 1, correspondiente a la muestra concentrada.
b. Pocillo 2, correspondiente a la muestra con una dilucin 1:1
c. Pocillo 3, correspondiente a la muestra con una dilucin 1:2
d. Pocillo 4, correspondiente a la muestra con una dilucin 1:4
e. Pocillo 5, correspondiente a la muestra con una dilucin 1:8
f. Pocillo 6, correspondiente a una muestra de H2O destilada estril, como blanco.
B. En el caso del trabajo por discos filtros, los discos Whatman estriles de 9 mm de dimetro,
eran impregnados en la respectiva muestra. Los discos, posteriormente fueron depositados
sobre la superficie de la placa que contiene el csped de cultivo bacteriano, para as ser
incubadas por 24 h a 30C indistintamente para cada bacteria de referencia.
79
Tabla XVIII. Muestras estudiadas en ensayo de antibiograma.

Estndar con
Estndar
Actividad
comercial
Antibitica
polisacridos en
recolectados
estudio
desde HPLC
Unasyn
Inem
Sulperazon
Extracto crudo
Extracto digerido
Pick
enzimticamente
cromatogrficos
Fucoidina 25
Macrocystis
Durvillaea
mg/mL
pyrifera 25 mg/
antrctica +
mL
laminarinasa
Laminarina 25
Durvillaea
Durvillaea
mg/ mL
antarctica 25
antrctica +
mg/mL
glucanasa
Laminarina
Fucoidina
Macrocystis
Laminarina +
pyrifera +
laminarinasa
glucanasa
Fucoidina +
Laminarina +
glucanasa
glucanasa
Fucoidina +
Fucoidina +
glucanasa
glucanasa
Laminarina +
laminarinasa
80
Figura 11. Esquema representativo de las placas de antibiograma realizadas en este trabajo de
investigacin. En azul el Agar slido Soya Tripticasa, sobre el cual se dispersa una alcuota de 25
L de agar semislido Soya Tripticasa, contenedor de inculos de las bacterias de referencia. De
mayor a menor, 1, indica un concentrado de la muestra estudiada, 2, dilucin 1:1 de la muestra, 3,
dilucin 1:2 de la muestra, 4, dilucin 1:4 de la muestra, 5, dilucin 1:8 de la muestra y 6, H2O
destilada estril.
81
A. Las muestras estndar de los medicamentos Unasyn, Inem y Sulperazon, de las cuales
slo se trabaj un preparado sin diluciones, fueron preparadas de la siguiente forma:
a. Inem: Solucin de 100 mL, dnde Inem era resuspendido en NaCl 0.9 % y 5
10 % de Dextrosa H2O. Si se mantiene refrigerado, la estabilidad se conserva por
24 h.
b. Unasyn: Resuspensin en NaCl0.9 % y 5 10 % Dextrosa en H2O. Si se mantiene
refrigerado, la estabilidad se conserva por 24 h.
c. Sulperazon: Resuspensin en solucin de 20 mL, constituida por; 5 % dextrosa y
NaCl 0.9 %. Si se mantiene refrigerado, la estabilidad se conserva por 24 h.
B. Las muestras concentradas de estndares comerciales de Fucoidina y Laminarina, de las
cuales se realizaron diluciones en la misma placa (pocillo 2, 3, 4 y 5), fueron de 25 mg/mL.
En lo que compete a las muestras ensayadas para actividad antibitica, tambin fueron
sometidas a las mismas diluciones que en el caso de los estndares. El modo por el cual se
realizaron las diluciones fue el esquematizado en ANEXO 2.3.
3.10.7 Diseo experimental para la inhibicin bacteriana por medio de pocillos o discos filtro.
El diseo experimental utilizado consisti en un diseo multifactorial 8 5 3 de dos
factores representantes o responsables de cada bacteria, cuyos parmetros corresponden a los
ocho microorganismos afectados por la inhibicin. El factor cinco corresponde a los
tratamientos efectuados con las concentraciones de extracto algal y el factor tres indica el
nmero de repeticiones.
82
3.10.8 Anlisis estadsticos.

La inhibicin bacteriana por efecto de los extractos crudos fue evaluada mediante
estadstica descriptiva y anlisis de varianza de una va (ANDEVA) utilizando el software
estadstico Statgraphics 5.1. En caso de reportarse evidencia significativa (p 0.05) entre
resultados se realiz una prueba de rango mltiple con el fin de determinar la magnitud de
diferencia.
3.11.1 Cepas fngicas.
La eleccin de las cepas utilizadas en este trabajo de investigacin, fue en base a los
antecedentes bibliogrficos que indican que los hongos testeados en esta oportunidad, son los
primeros que deben probarse para un ensayo de actividad antifngica, puesto presentan un grado
de sensibilidad mayor a ser inhibidos en crecimiento, en comparacin a otras especies de hongos.
Los hongos estudiados en esta oportunidad, fueron obtenidos y estudiados desde el
cepario fngico de las dependencias del Instituto de Microbiologa Clnica. Las especies de hongos
estudiadas fueron;
Candida albicans
Candida krusei
Candida glabrans
Candida Guillermondii
Aspergillus niger
83
Aspergillus terreus
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus.
3.11.2 Cultivo de cepas fngicas.

El cultivo fue realizado a base de un cepario o banco fngico del Instituto de
Microbiologa Clnica, desde l se realiz un repique por medio de asa de micrn a un Agar
Sabouraud inclinado, incubando las cepas por 48 h a 32C. Desde ste ltimo cultivo, y por medio
del asa de micrn se realiz un inoculo en H2O estril, para finalmente y por medio de una trula,
realizar un siembra en placa con Agar Sabouraud, para incubar por 48 h a 32C.
3.11.3 Ensayo de Sensibilidad de las cepas fngicas frente a los extractos de Macrocystis pyrifera
y Durvillaea antarctica.
Las muestras estudiadas en esta oportunidad fueron las siguientes:
A. Extracto de Macrocystis pyrifera concentrado 25 mg/mL en H2O estril.
B. Extracto de Durvillaea antarctica concentrado 25 mg/mL en H2O estril.
C. Preparado de Laminarina y Fucoidina estndar 25 mg/mL en H2O estril, a raz del cual se
realizaron las mismas diluciones descritas en la Figura 11.
D. Muestras de pick recolectados desde HPLC, correspondiente a las fracciones de Laminarina
y Fucoidina. Extractos digeridos enzimticamente con - glucanasa y laminarinasa.
La manera en que se confeccion cada placa de ensayo de antibiograma y el contenido de
stas en cuanto a muestras ensayadas fue la siguiente;
84
A. Los cultivos en placas consistieron de 6 perforaciones o 6 discos filtros. Cada perforacin

o pocillo, previo a un proceso de filtrado por filtros Millipore de 0,45m, almacenaba (25
L) distintas diluciones de las muestras mencionadas. Es as como, cada placa estaba
constituida por: (Figura 11)
a. Pocillo 1, correspondiente a la muestra concentrada.
b. Pocillo 2, correspondiente a la muestra con una dilucin 1:1
c. Pocillo 3, correspondiente a la muestra con una dilucin 1:2
d. Pocillo 4, correspondiente a la muestra con una dilucin 1:4
e. Pocillo 5, correspondiente a la muestra con una dilucin 1:8
f. Pocillo 6, correspondiente a una muestra de H2O destilada estril, como blanco.
B. En el caso del trabajo por discos filtros, los discos Whatman estriles de 9 mm de dimetro,
eran impregnados en una solucin de 25 mg/mL por aproximadamente 30 segundos. Los
discos, posteriormente fueron depositados sobre la superficie de la placa que contiene el
csped de cultivo fngico, para as ser incubadas por 48h a 32C indistintamente para cada
cepa fngica.
C. Las muestras concentradas de estndares comerciales de Fucoidina y Laminarina, de las
cuales se realizaron diluciones en la misma placa (pocillo 2, 3, 4 y 5), fueron de 25 mg/mL
para ambos casos. En lo que compete a las muestras ensayadas para actividad antibitica,
tambin fueron sometidas a las mismas diluciones que en el caso de los estndares. El modo
por el cual se realizaron las diluciones fue el esquematizado en ANEXO 2.3.
85
3.11.4 Diseo experimental para la inhibicin bacteriana por medio de pocillos o discos filtro.
El diseo experimental utilizado consisti en un diseo multifactorial 8 5 3 de dos
factores representantes o responsables de cada cepa fngica, cuyos parmetros corresponden a los
ocho microorganismos afectados por la inhibicin. El factor cinco corresponde a los tratamientos
efectuados con las concentraciones de extracto algal y el factor tres indica el nmero de
repeticiones.
4. RESULTADOS.
4.1 Extraccin y deteccin mediante HPLC, de los polisacridos Laminarina y Fucoidina desde
las algas Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica.
El proceso de secado, de los extractos hmedos obtenidos por las distintas metodologas de
extraccin, fue realizado por la metodologa Speed back mencionada en la seccin de Materiales y
Mtodos. Los extractos secos derivados de este procedimiento, fueron disueltos y resuspendidos
en agua desionizada para su posterior deteccin por HPLC. Se obviaron los resultados por el
protocolo Black modificado del mtodo elaborado por Deville et al., ya que la disolucin de ste
en agua desionizada, result muy dificultosa, sin mencionar que la presencia de los polisacridos
en estudio, fue mnima.
Es importante a la hora de la lectura o anlisis de un cromatograma, considerar todos los
elementos que han sido detectados por el HPLC, tanto los conocidos o esperados, como los no
conocidos; sobre todo estos ltimos, ya que pueden ser sinnimo de errores o interferentes a la hora
de detectar molculas en estudio.
86
Para disminuir este factor de error, es trascendental conocer en parte, las posibles molculas
o componentes qumicos que pueden poseer la muestras (y que pueden ser detectados por el
detector acoplado al HPLC), por ello realizar inyecciones y posteriores cromatogramas de
estndares que se pueden encontrar en la muestra problema que se analizar a futuro, puede
convertirse en una buena opcin, para optimizar el trabajo y disminuir errores. Para esto, se realiz
la deteccin de molculas estndar (Figura 12) como; manitol, glucosa, fucosa y cido algnico,
que en definitiva se convierten en picko tpicos distintos a los de Laminarina y Fucoidina, que
pudiesen encontrarse en posteriores cromatogramas.
De la Figura 12 se desprende adems que, de las molculas que pudiesen significar un
problema para el anlisis de extractos y posterior deteccin de laminarina y fucoidina, manitol,
fucosa y glucosa, no involucran un problema o posible fuente de error, puesto su tiempo de elucin,
es mucho despus que los polisacridos en estudio, es decir, mayor que 17 min. (alrededor de los
20 min.). Es de cuidado, no caer en confusiones con el pico correspondiente a fucoidina y cido
algnico, puesto ambos se encuentran muy cercanos a los 10 min, pero siempre, fucoidina eluye
ms rpido (segn las condiciones de flujo, detector y columna utilizados) y por ende es detectado
antes que cido algnico.
El cromatograma contenido en la Figura 13, comprende a los polisacridos en estudio, es
decir, los estndares de laminarina y fucoidina. La Figura 14 por tanto, corresponde al
cromatograma de los extractos logrados con los protocolos Black, Nuevo e Yvins a partir del alga
Del anlisis de los cromatogramas mencionados, se observa que laminarina y fucoidina
estndar, presentan un picocercano a los 15 y 10 min. respectivamente.
87
Figura 12. Cromatograma de molculas estndar de Maltosa, Fucosa, Glucosa y cido

algnico. Se inyectaron 20 L en todas las muestras analizadas en este cromatograma,
adicionalmente se realiz la inyeccin de; laminarina estndar, fucoidina estndar, laminaritriosa
y laminaritetraosa. El procedimiento cromatogrfico se efectu con un tiempo de retencin de 25
min. , a un flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente.
88
Figura 13. Cromatograma de estndares. Se inyectaron 20 L de las siguientes muestras:

laminarina estndar y fucoidina estndar. El procedimiento cromatogrfico, se efectu con un
tiempo de retencin de 25 min. a un flujo de 1 mL/min y temperatura ambiente.
89
Figura 14. Cromatograma de extractos algales de Macrocystis pyrifera, obtenidos por las
distintas metodologas de extraccin segn Deville et al. Se inyectaron 20 L de las siguientes
muestras; extracto protocolo Black, extracto protocolo Nuevo y extracto protocolo Yvins. Con un
tiempo de retencin de 25 min. a un flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente.
90
En lo que respecta a la deteccin de Laminarina, no es menor considerar que sta puede

variar su tiempo de elucin de entre 15 a 17 min. (observando la Figura 12 y Figura 13). Referente
de los extractos por la metodologa de Deville et al., los protocolos Black, Nuevo e Yvins
presentan un patrn comn en cuanto a que, todos presentan los pico de los 10 y 15 min, en mayor
o menor proporcin, pero que en definitiva apuntan a la presencia de los polisacridos en cuestin.
La Figura 15 representa el cromatograma de los extractos de Durvillaea antarctica, de los
protocolos Black, Nuevo e Yvins. Se observan picos cercanos a los 15 min. , sugerentes de la
presencia de Laminarina.
4.2 Deteccin mediante HPLC, de los polisacridos Laminarina y Fucoidina, obtenidos por la
metodologa de extraccin segn Nakamura Black.
La deteccin de fucoidina, fue relativamente simple y en cantidad aceptable en el caso del
protocolo Nuevo de Deville et al., a partir de Macrocytis pyrifera. No as para el caso del
polisacrido Laminarina, cuya deteccin fue compleja por mltiples factores, adems de que
cuando sta era detectada a partir del protocolo Black y del alga Durvillaea antarctica, se
encontraba en baja cantidad en el extracto o debido a factores ambientales, el alga analizada no
contena el polisacrido de Laminarina, por lo que desarrollar mtodos alternativos, ms eficientes
o con mayor rendimiento, fue una alternativa en este trabajo de investigacin. En vista de aquello,
se intent elaborar protocolos viables, en base al mtodo Black y el mtodo desarrollado por
Nakamura (protocolos NB); siendo los resultados positivos en cunto a presencia de Laminarina,
pero negativos en cantidad del polisacrido extrado.
91
Figura 15. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antarctica, obtenidos por las
distintas metodologas de extraccin segn Deville et al. Se inyectaron 100 L de extracto del
protocolo Black, Nuevo e Yvins. El procedimiento cromatogrfico se efectu con un tiempo de
retencin de 25 min. a un flujo de 1 mL/min y temperatura ambiente.
92
En vista de ello, se opt por mantener la metodologa de Deville et al., (protocolo Black),
como mtodo base para realizar la extraccin de este polisacrido. Aun as, los resultados obtenidos
por medio del protocolo NB, figuran en la Figura 16 para NB 01 a NB05 y Figura 17, del protocolo
NB 06 a NB09.
Para la determinacin de la concentracin de fucoidina se seleccion el extracto logrado por
medio del protocolo Nuevo segn Deville et al., y a partir del alga Macrocytis pyrifera. Por otra
parte, para determinar la concentracin de laminarina se seleccion el protocolo Black segn
Deville et al., a partir del alga Durvillaea antarctica.
4.3 Contenido de laminarina y fucoidina en los extractos algales.
Esta seleccin se bas en los cromatogramas que mostraban un peak cercano a los 10 min.
para fucoidina y otro a los 15 min. para laminarina, las reas de estos peaks se utilizaron para la
determinacin de la concentracin de los polisacridos, utilizando las curvas de calibracin de los
estndares de fucoidina (ANEXO 4.1) (y = 12,477 x 48,564) y laminarina (ANEXO 4.2) (y =
10,614 x 11,939).
93
Figura 16. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antrctica, obtenidos por la

metodologa de extraccin segn Nakamura Black. Se inyectaron 100 L de extracto del
protocolo NB01 a NB05, procedimiento cromatogrfico realizado con un tiempo de retencin de
25 min. a un flujo de 1 mL/min y a temperatura ambiente.
94
Figura 17. Cromatograma extractos de protocolos Nakamura Black del alga Durvillaea
antarctica. Se inyectaron 100 L de extracto del protocolo NB06 al NB09, procedimiento
cromatogrfico realizado con un tiempo de retencin de 25 min. a un flujo de 1 mL/min y a
temperatura ambiente.
95
4.4. Hidrlisis enzimtica de polisacridos. 4

4.4.1 Estandarizacin del mtodo DNS (ANEXO 3.1). Los ensayos realizados por Daz (2011),
apuntaron a la forma correcta y estandarizada en la que se deba realizar el mtodo DNS, a raz de
las diferencias que figuraban en las fuentes bibliogrficas. La metodologa, consisti en;
a. Mezclar 3 mL de muestra con 3 mL de reactivo de DNS.
b. Incubacin a 90C durante 15 min, y luego enfriar a temperatura ambiente.
c. Agregar 1 mL de Tartrato de Na y K al 40%.
d. Para finalizar, medicin de la absorbancia a 540 nm, que corresponde a la longitud de onda,
donde se obtiene la mejor linealidad con un R2 = 0,9861.
En la Figura 18 y 19, 20 y 21 se exponen los resultados del test de glucosa y DNS
respectivamente. Estos ensayos fueron realizados a los productos de hidrlisis de los estndares de
laminarina, fucoidina y a los extractos obtenidos por la aplicacin del protocolo Nuevo en el caso
del alga Macrocytis pyrifera y protocolo Black, para el alga Durvillaea. antarctica.
La Hidrolisis enzimtica de poliscaridos, fue desarrollada en el Laboratorio de Biotecnologa del ICYTAL por
Andrea Daz C., estudiante tesista de Bioqumica UACh, adscrito al proyecto FONDEF D07I 1095. En esta
oportunidad, los resultados sern utilizados como fundamentacin y soporte de las actividades fisiolgicas estudiadas
en este trabajo de investigacin.
96
Figura 18. Hidrlisis enzimtica de estndares. Las grficas muestran los resultados
obtenidos de los procesos de hidrlisis enzimtica a las 48 h, con -glucanasa y laminarinasa,
sobre: Laminarina (A), Fucoidina (B), siendo la respuesta la glucosa liberada detectada con test
de glucosa. La fucoidina no fue sometida a hidrolisis enzimtica con laminarinasa, ya que esta
enzima no tiene actividad hidroltica sobre este polisacrido. Figura extrada desde Daz, 2011.
97
Figura 19. Hidrlisis enzimtica de extractos algales. Las grficas muestran los resultados
obtenidos de los procesos de hidrlisis enzimtica a las 48 h, con -glucanasa y laminarinasa,
sobre: extracto de D. antarctica (A) y extracto de M. pyrifera (B), siendo la respuesta la glucosa
liberada detectada con test de glucosa. Figura extrada desde Daz, 2011.
98
Figura 20. Test de DNS de muestras estndar de laminarina y fucoidina. Se realiz una
hidrlisis enzimtica de 48 h, para luego aplicar el test de DNS a las muestras obtenidas. Estas
se analizaron como extracto crudo, digeridas enzimticamente con laminarinasa y -glucanasa.
A. Laminarina; B. Fucoidina. La fucoidina no fue sometida a hidrolisis enzimtica con
laminarinasa, ya que esta enzima no tiene actividad hidroltica sobre este polisacrido. Figura
extrada desde Daz, 2011.
99
Figura 21. Test de DNS de extractos algales. Se realiz una hidrlisis enzimtica de 48 h,
luego se realiz un test de DNS a las muestras obtenidas. Estas se analizaron como extracto
crudo, degradadas con laminarinasa e hidrolizadas con -glucanasa. A, D. antarctica; B. M.
pyrifera. Figura extrada desde Daz, 2011.
100
Si se comparan las metodologas del test de glucosa y DNS aplicados a los extractos de
Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica, tenemos que, por el mtodo del test de glucosa
(Figura 19A) si existe actividad sobre M. pyrifera, pero slo por parte de la enzima - glucanasa,
ya que esta es no especfica y acta hidrolizando enlaces glucosdicos indistintamente, no as
Laminarinasa que slo acta sobre el polisacrido de Laminarina, claramente reflejado en la Figura
19A, ya que el extracto de M.pyifera slo contiene Fucoidina o en su defecto, Laminarina en una
muy baja cantidad. Respecto a la Figura 19B, sta es relacionable al hecho de que el extracto de D.
antarctica contiene laminarina y por ende la accin enzimtica de laminarina, debiese arrojar
resultados positivos en cuanto a presencia de glucosa detectable por la metodologa del test de
glucosa. La enzima glucanasa, tambin es efectiva en este caso, pues es no especfica y genera
cortes hidrolticos de igual forma en este polisacrido, as como tambin en otro que estn presentes
en el extracto, lo que explica la mayor cantidad de residuos de glucosa detectables en el caso de la
- glucanasa comparada a laminarinasa. Referente a la Figura 21A y 21B, stas tambin son
concluyentes a la hora de ratificar la accin de ambas enzimas y que efectivamente hay presencia
de fucoidina y laminarina en los extractos. Si se comparan ambas metodologas en relacin a su
efectividad o utilidad en cuanto a deteccin de productos de hidrolisis tenemos que; el mtodo
DNS detecta azcares reductores, que normalmente son monosacridos, por lo tanto se deduce que
en el caso de la Figura 21, el hecho de que se haya detectado ms azcar reductor que glucosa
(como en el caso de la Figura 19), obedece a que la digestin enzimtica genera productos de
hidrlisis variados, y no exclusivamente glucosa, que es la que nicamente detecta el test de
glucosa. Por lo tanto, en trminos de sensibilidad la tcnica DNS es superior al test de glucosa,
pero inferior en especificidad por glucosa. Para efectos de corroborar la accin enzimtica sobre
los extractos estudiados, ambas tcnicas son igual de tiles y entregan informacin relevante.
101
4.5 Deteccin de los productos de hidrlisis de Laminarina y Fucoidina mediante HPLC

La Figura 22 comprende los estndares de los polisacridos y productos de hidrolizis
(laminaritriosa y laminaritetraosa). En esta ltima se reitera la patrn de elucin de acido algnico
y fucoidina, muy cercanos ambos a los 10 min. , pero aun ms impotante, se asevera que los
productos de hidrolizis de estos polisacridos, no eluyen o no son detectados por el detector IR
antes de los 17 min. (17-22 min.) . Los productos de hidrolizis especficos de laminarina en
conjunto con laminarinasa, eluyen entre los 17-19 min.
Por otra parte, la detecion de productos de hidrolizis de laminarina y fucoidina, por la
utilizacin de enzimas hidroliticas - glucanasa y laminarinasa, es presentada en las Figuras 23 y
24, respectivamente.
En la Figura 23 se exponen los cromatogramas de los productos de hidrlisis del ensayo
enzimtico realizado con la enzima -glucanasa durante 48 h a 60C a los estndares laminarina,
fucoidina y a los extractos obtenidos del protocolo Nuevo para el alga Macrocystis pyrifera y del
protocolo Black para Durvillaea antrctica. A raz de esta Figura, se observa que existen pick que
se condicen o relacionan directamente con aquellos de la Figura 22, aseverndose por lo tanto la
presencia efectiva de productos de hidrolisis de los polisacridos laminarina y fucoidina, as como
tambin productos de hidrlisis especficos de la accin de laminarinasa sobre laminarina (Figura
23, picks entre 17 y 20 min. ). Esto ltimo, se correlaciona adems con los resultados presentados
en las Figuras 19 y 21, que ratifican que la digestin enzimtica sobre extractos algales,
efectivamente resulta en la generacin de monosacridos (como fucosa, glucosa o manitol) u
oligosacridos como laminaritriosa y laminaritetraosa.
102
Figura 22. Cromatograma de estndares de polisacridos y estndares de productos de

hidrlisis. Los polisacridos analizados fueron laminarina, fucoidina y cido algnico y los
productos de hidrlisis corresponden a laminaritriosa (Laminarina3), laminaritetraosa
(Laminarina4), glucosa, fucosa y manitol. Para este procedimiento cromatogrfico, se
inyectaron 20 L de estndares con un tiempo de retencin de 25 min. a un flujo de 1 mL/min
y a temperatura ambiente.
103
Figura 23. Cromatograma de productos de hidrlisis de ensayo enzimtico con la enzima glucanasa. Los productos de hidrolisis de los estndares de laminarina (Lam + B), fucoidina (Fuc
+ B) y de los extractos algales Macrocystis pyrifera (Mp + B) y Durvillaea antarctica (Da + B)
muestran peaks a los 17 min al igual que los estndares de productos de hidrlisis laminaritriosa
(Lam3), laminaritetraosa (Lam4) y glucosa. Se inyectaron 20 L de muestras con un tiempo de
retencin de 25 min. a un flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente. Estos resultados confirman
la eficacia de las enzimas al efectuar cortes del polisacrido y generar Lam 3 y Lam 4.
104
Figura 24. Cromatograma de productos de hidrlisis de ensayo enzimtico con la enzima

laminarinasa. Los productos de hidrlisis de los estndares de laminarina, fucoidina y de los
extractos algales de M. pyrifera y D. antrctica muestran peaks a los 17 min al igual que los
estndares de productos de hidrlisis laminaritriosa (Lam3, verde)), laminaritetraosa (Lam4,
fucsia) y glucosa. Se inyectaron 20 L de muestras con un tiempo de retencin de 25 min. a un
flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente.
105
En la Figura 24 se exponen los cromatogramas de los productos de hidrlisis del ensayo

enzimtico realizado con la enzima laminarinasa durante 48 h a 37C a los estndares laminarina,
fucoidina y a los extractos del protocolo Nuevo para el alga M. pyrifera y extracto Black para el
caso de D. antarctica. En esta figura tambin es posible apreciar peaks cercanos a los 15 - 17 min
que coinciden con los peaks de los estndares de los productos de hidrlisis, sin embargo estos son
de un rea menor a la que presentan los estndares de productos de hidrlisis.
4.6 Determinacin cualitativa de sulfatos.
En la Figura 25 se observan los resultados del anlisis cualitativo de sulfatos los cuales se
presentan como un precipitado blanco que corresponde a BaSO4, el cual precipit luego de agregar
gotas de BaCl2 a una muestra acidificada previamente con HCl 2M. En todas las muestras
analizadas es posible observar precipitado blanco, siendo menor en el estndar de laminarina que
en el de fucoidina. Con respecto a los extractos, aquel obtenido por el protocolo Black utilizando
el alga D. antarctica present mayor contenido sulfatado que el extracto obtenido por el uso del
protocolo Nuevo, para el alga M.pyrifera.
4.7 Determinacin de la actividad antioxidante.
4.7.1 Estudio de Estabilidad del mtodo DPPH Brand Williams.
Ya que la metodologa presentaba muchas variaciones tras su revisin bibliogrfica, y sta
adems variada en relacin al tipo de antioxidante a estudiar, se opt por realizar un ensayo de
estabilidad previo al estudio final de la actividad antioxidante. Este ensayo tuvo como objeto,
determinar las condiciones ptimas a las cuales se debera realizar la prueba, es decir, en
condiciones de oscuridad luz, temperatura, por cuanto tiempo debera extenderse el ensayo
DPPH, concentracin ptima a la que se deberan trabajar los extractos, entre otros.
106
A.
B.
D.
C.
F.
Figura 25. Determinacin cualitativa de sulfatos. Los sulfatos se precipitaron como BaSO4,
desde una muestra levemente acidificada. Control positivo MgSO4 1% (A); Estndar de laminarina
1% (B); Estndar de fucoidina 1% (C); Extracto protocolo Black D. antrctica 1% (D); Extracto
protocolo Nuevo M. pyrifera 1% (F). Figura extrada desde Daz, 2011.
107
4.7.2 Estabilidad del ensayo DPPH en condiciones de Luz Oscuridad.

Esta prueba se realiz, utilizando una concentracin de DPPH (DPPH disuelto en metanol
100%) de 5.10 10-5 M, longitud de onda de 517 nm, temperatura ambiente y extendiendo el
ensayo por 24h en condiciones de luz u oscuridad. Se observ por lo tanto como estas
condicionantes, afectaron la estabilidad de la absorbancia propia del DPPH en el tiempo.
Observando la Figura 26, se determin que la condicin de oscuridad es ms apropiada para realizar
este tipo de ensayo, que por lo dems se correlaciona con la informacin bibliogrfica, que describe
claramente que el DPPH es altamente inestable si es expuesto a la luz.
4.7.3 Estabilidad del ensayo DPPH a distintas temperaturas.
Se realiz un ensayo de estabilidad del ensayo DPPH a distintas temperaturas (T ambiente,
37C, 27C y 20C), con el objeto de determinar la temperatura a la cual se consigue el mayor
descenso de la absorbancia para el tipo de extracto utilizado y para los efectos de este estudio
(Figura 27 28). Puesto que desde la hora de ensayo en adelante, se experiment un aumento de
la absorbancia probablemente debido a la inestabilidad de la solucin de DPPH (5.10 10-5 M),
en todas las temperaturas probadas, se tom como mximo de absorbancia al cumplirse una hora
de ensayo. Considerado aquello, los mejores resultados se obtuvieron con la aplicacin de 37C,
con lo cual sta se convirti en la temperatura de trabajo. Para este ensayo y considerando que en
esta instancia, si se debe visualizar el efecto antioxidante, se utilizaron las siguientes preparaciones:
a) Extracto de protocolo Nuevo Macrocytis pyrifera 5 mg/mL (en metanol 100%).
b) TROLOX 8,00 10-5 M (en metanol 100%).
c) cido glico 5,80 10-5 M (en metanol 100%).
d) cido ascrbico 5,00 10-5 M (en metanol 100%).
108
Absorbancia
Estabilidad del ensayo DPPH a la exposicin de Luz Oscuridad

1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Tiempo (minutos)
Absorbancia Luz
Absorbancia
Absorbancia Oscuridad
Estabilidad del ensayo DPPH a la exposicin Luz - Oscuridad

0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo (minutos)
Absorbancia Luz
Absorbancia Oscuridad
Figura 26. Estabilidad ante la exposicin de luz oscuridad en el ensayo DPPH. A,

representacin grfica de la variacin de la absorbancia ante la exposicin de luz y oscuridad, en
el tiempo (hasta 6 horas). B, representacin grfica de la variacin de la absorbancia ante la
exposicin de luz y oscuridad, hasta 1 hora (tiempo ptimo de realizacin del ensayo DPPH).
109
Absorbancia
Estabilidad ensayo DPPH a T ambiente.

0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Tiempo (minutos)
Extracto MP 5mg/mL
TROLOX
cido glico
cido ascrbico
Estabilidad ensayo DPPH a 37C

0,4
Absorbancia
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Tiempo (minutos)
Extracto MP 5 mg/mL
TROLOX
cido glico
cido ascrbico
Figura 27. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variacin de temperatura. Para las cuatro
soluciones probadas, se testeo el descenso de la absorbancia en el ensayo de DPPH como reflejo
de la actividad antioxidante, variando ste segn el antioxidante y temperatura utilizada. A,
estabilidad del ensayo DPPH a T ambiente, B, estabilidad del ensayo DPPH a 37C.
110

0,4
Absorbancia
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
50
100
150
200
Tiempo (minutos)
Extracto MP 5mg/mL
Absorbancia
TROLOX
cido glico
cido ascrbico

0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
50
100
150
200
Tiempo (minutos)
Extracto MP 5mg/mL
TROLOX
cido glico
cido ascrbico
Figura 28. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variacin de temperatura. Para las cuatro
soluciones probadas, se testeo el descenso de la absorbancia en el ensayo de DPPH como reflejo
de la actividad antioxidante, variando ste segn el antioxidante y temperatura utilizada. A,
estabilidad del ensayo DPPH a 27C, B, estabilidad del ensayo DPPH a 20C.
111
4.7.4 Estado estacionario del ensayo DPPH a 517 nm.

La determinacin del estado estacionario consisti en determinar a qu tiempo, la
disminucin de la absorbancia fue mxima y si la medicin era estable en cuanto a variacin de la
absorbancia en torno al tiempo establecido (Figura 29). Para este caso, se utilizaron slo extractos
de Macrocystis pyrifera (contenedores de fucoidina), ya que por referencia y los resultados de las
Figuras 27 y 28, se sabe que este extracto posee actividad antioxidante. Adicionalmente, se reiteran
los resultados obtenidos en la Figuras 27 y 28, puesto hasta una hora de ensayo, el descenso de la
absorbancia es mxima y estable para su medicin. Adems, este resultado fue previsualizado y
deducido de la Figura 26, puesto si se considera la condicin de oscuridad, slo hasta la hora de
ensayo, se observa estabilidad en los valores de absorbancia.
4.7.5 Determinacin de la concentracin ptima a utilizar para extractos liofilizados de
La determinacin de la concentracin ptima a la cual se deba trabajar los extractos
liofilizados, consisti en determinar la disminucin de la absorbancia en el ensayo DPPH segn la
concentracin utilizada. El ensayo fue realizado a 517 nm, 37C y a una hora de la reaccin
antioxidante. Los extractos probados, consistieron en los mejores liofilizados (Segn resultados
cromatogrficos por HPLC) de extracto segn protocolo Nuevo de Macrocystis pyrifera y
protocolo Black para Durvillaea antarctica, cada uno de ellos probados por triplicado. Segn la
Figura 30, todos los extractos probados, resultaron ser buenos antioxidantes (por la disminucin de
la absorbancia) a 5mg/mL, ya que aparentemente a concentraciones mayores, la solucin se satura
y arroja resultados de absorbancia no concordantes, as como tambin, concentraciones menores a
5 mg/mL, no equivalen a un mximo de actividad antioxidante.
112
Estado estacionario ensayo DPPH a 37C 517 nm.

0,3
Absorbancia
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
50
100
150
200
250
300
Tiempo (minutos)
Extracto MP 5 mg/mL (1)
Extracto MP 5mg/mL (2)
Figura 29. Estado estacionario del ensayo DPPH a 37C y 517 nm. Los extractos MP
corresponden a extractos de Macrocystis pyrifera, pero de orgenes geogrficos y estacionales
distintos. Cada extracto se conform de un triplicado.
113
Concentracin ptima a utilizar para extractos liofilizados de

0,7
Absorbancia
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
12
Concentracin Extracto algal (mg/mL)

Extracto MP (1)
Extracto MP (2)
Extracto MP (3)
Extracto MP (5)
Extracto MP (5)
Extracto MP (6)
Extracto MP (7)
Extracto MP (8)
Extracto MP (9)
Extracto MP (10)
Extracto DA(1)
Extracto DA2
Figura 30. Concentracin ptima a utilizar para extractos liofilizados de Macrocystis pyrifera
y Durvillaea antarctica. Cada extracto utilizado (MP o Macrocystis pyrifera 1 10, DA o
Durvillaea antarctica 1 - 2) fue realizado en triplicado, utilizando concentraciones de 1 a 10
mg/mL, se midi la actividad antioxidante de los extractos slo por la disminucin de la
absorbancia del ensayo DPPH. La prueba se realiz midiendo la absorbancia a 517 nm, 1 h de
ensayo, 37 C y en condiciones de oscuridad.
114
4.7.6 % de Inhibicin del radical libre DPPH (%IRL).

Segn Von Gadow et al., (1997), Snchez Moreno et al., (1997) y KushoSki et al., (2005),
una de las formas de representar la actividad antioxidante de un agente antioxidante, es determinar
el %IRL, representando cuanto radical libre, o en otras palabras, cuanto potencial oxidante ha sido
inhibido por el antioxidante. La determinacin del %IRL, se lleva a cabo por el clculo a travs de
la formula indicada en la seccin de materiales y mtodos.
Los extractos utilizados para probar la actividad antioxidante, consistieron en extracto por
protocolo Nuevo de Macrocytis pyrifera o MP (contenedor de fucoidina) y extracto de protocolo
Black de Durvillaea antarctica o DA (contenedor de laminarina). Se trabaj en base a los
resultados conseguidos en la Figura 30, dnde el extracto MP 3 y DA2, fueron los que consiguieron
un mayor descenso de la absorbancia en el ensayo DPPH a una concentracin ptima de 5mg/mL.
Estos extractos fueron probados considerando los resultados de todo el ensayo de estabilidad, es
decir, 517 nm, 37 C, 1 h de ensayo y condicin de oscuridad, adems de realizar triplicados para
ambos extractos MP y DA. Se midi el %IRL a distintas concentraciones de estndares
antioxidantes tales como; TROLOX, cido ascrbico y cido glico, para establecer una referencia
en cuanto a la potencia antioxidante. La absorbancia a 517 nm al minuto cero del ensayo fue de
0,383 y la absorbancia a la hora de ensayo, corresponde a cada valor de absorbancia promedio, que
figura en la Tabla XIX.
4.7.7 % DPPH remanente, EC50, TEC50 y AE.
Este parmetro fue determinado como consecuencia directa del % IRL, puesto denota el
porcentaje restante de DPPH que queda en la solucin sin reducir o en otras palabras, la cantidad
de DPPH que no ha sido sometida al efecto antioxidante.
115
Tabla XIX. % Inhibicin del radical libre DPPH

Agente antioxidante
Concentracin
%IRL
Abs 517 nm DE
TROLOX
1,60 10-4 M
89,56%
0,04 0,002
4,00 10-4 M
85,90%
0,054 0,002
8,00 10-5 M
81,20%
0,072 0,003
1,10 mM
93,47%
0,025 0,001
2,30 10-4 M
72,84%
0,104 0,002
2,80 10-4 M
69,20%
0,118 0,002
5,00 10-5 M
26,89%
0,280 0,005
1,40 mM
94,26%
0,022 0,002
5,80 10-4 M
95,82%
0,016 0,005
6,00 10-4 M
93,73%
0,024 0,003
5,80 10-5 M
85,12%
0,057 0,001
Extracto Macrocytis pyrifera
5,0 mg/mL
81,72%
0,070 0,002
Extracto Durvillaea antarctica
5,0 mg/mL
36,30%
0,244 0,020
cido Ascrbico
cido glico
116
El % DPPH remanente se calcula por medio de la siguiente frmula;

% DPPH remanente = Absorbancia 517 nm muestra / Absorbancia 517 nm control 100
Donde la absorbancia a 517 nm de la muestra, corresponde a la absorbancia conseguida por
un extracto en particular que posee actividad antioxidante y la absorbancia control, corresponde a
la absorbancia del DPPH sin ser sometido a algn agente antioxidante. Ya que l % DPPH
remanente, es til para determinar la cantidad de agente antioxidante necesario para disminuir en
un 50 % la absorbancia de DPPH (50 % de DPPH remanente) (EC50), se trabaj en esta oportunidad
con los extractos comprendidos en la tabla XIX, pero esta vez, abarcando un mayor espectro de
concentraciones (1 5 mg/mL). As mismo, se utiliz el % DPPH remanente de las distintas
concentraciones de los extractos antes mencionados, pero comparndolos con el tiempo
transcurrido (0 60 min), es decir, para concentraciones de extracto MP y DA de 5 mg/mL, se
determin como vara el % DPPH remanente en el tiempo (60 min). Con aquello, es posible
conseguir el tiempo necesario para alcanzar el valor de EC50 (TEC50).
En definitiva, la determinacin de las ecuaciones de la recta para calcular, tanto EC50 como
TEC50, fueron logradas en un principio por el clculo del % DPPH remanente segn la concentracin
utilizada de extracto (Tabla XX) y en segunda instancia o una vez que ya se conoca la
concentracin con la cual se consegua un mejor resultado de porcentaje de DPPH remanente, se
estableci sta (5 mg/mL) para realizar el estudio de cmo variaba el % DPPH remanente en el
tiempo (Tabla XXI). Las grficas desde donde se obtienen las ecuaciones de la recta necesarias
para determinar, EC50 y TEC50, se adjuntan en ANEXOS 5.0.
117
Tabla XX. % DPPH remanente segn concentracin de extracto algal utilizada.

% DPPH remanente + DE
Concentracin
Extracto Macrocystis
extracto algal
pyrifera.
Extracto Durvillaea antarctica.
(mg/mL)
1.00
97,17 0,002
87,21 0,007
2.00
76,33 0,008
78.07 0,017
3.00
55,22 0,010
73,89 0,020
4.00
34,22 0,007
69,71 0,009
5.00
19,84 0,003
66,31 0,008
118
Tabla XXI. % DPPH remanente segn tiempo de ensayo DPPH.

% DPPH remanente
Tiempo de ensayo (min)
Extracto
de
Macrocytis Extracto
pyrifera
de
Durvillaea
antarctica
94,78 0,023
98,96 0,006
91,55 0,017
96,87 0,024
10
85,11 0,012
94,52 0,015
15
81,22 0,010
92,17 0,016
20
75,02 0,019
89,30 0,022
25
66,84 0,020
86,42 0,006
30
59,53 0,008
82,11 0,005
35
53,00 0,019
77,35 0,013
40
48,30 0,027
72,06 0,029
45
42,04 0,011
68,93 0,032
50
38,38 0,006
64,22 0,041
55
31,44 0,009
61,11 0,008
60
26,23 0,003
58,77 0,007
119
Observando las Tablas XX y XXI, se concluye que los extractos del alga Durvillaea
antarctica, no poseen suficiente actividad antioxidante, para lograr disminuir a la mitad la
concentracin de radical libre DPPH, esto considerando que en todos los ensayos realizados en este
trabajo, la concentracin ptima de trabajo para los extractos, fue de 5 mg/mL, midiendo valores
de absorbancia a la hora de ensayo. Esto ltimo, no resta el hecho de que extractos de Durvillaea
antarctica, si presentan un %IRL considerable, aunque menor que los extractos provenientes del
alga Macrocystis pyrifera.
Finalmente, se calcul el AE o eficiencia antiradical, inversamente proporcional a EC50 y
TEC50, como parmetro extraordinario para valorar la actividad antioxidante de los extractos de
Macrocystis pyrifera, ya que estos si lograban disminuir al menos en un 50% la actividad oxidante
del DPPH. Los valores de EC50 se obtuvieron por medio de la ecuacin de la recta y = -19,677 x +
115,59 (ANEXO 5.1) y los de TEC50 por medio de la ecuacin de la recta y = -1,1908 x + 96,757
(ANEXO 5.2). AE por tanto fue determinado como una relacin inversamente proporcional entre
EC50 y TEC50. Estos valores son expuestos en la Tabla XXII adjunto a valores bibliogrficos para
acido glico y acido ascrbico, extrados desde el trabajo de Snchez Moreno et al., (1998).
4.7.8 Actividad antioxidante equivalente al cido ascrbico (VCEAC) y Actividad antioxidante

equivalente a TROLOX (TEAC).
Al igual que % IRL, % DPPH remanente, EC50, TEC50 y AE, VCEAC y TEAC, son parmetros
muy utilizados para valorar la actividad antioxidante de una muestra sometida a estas pruebas. La
particularidad en este caso, es que la actividad antioxidante se correlaciona con aquella que
presenta el cido ascrbico (VCEAC) y TROLOX (TEAC), estableciendo una relacin de
equivalencia para con estas molculas antioxidantes, comnmente utilizadas como estndares.
120
Tabla XXII. EC50, TEC50 y AE de extractos de alga Macrocytis pyrifera.

Parmetro
Extracto de
cido ascrbico
cido glico
antioxidante
Macrocystis
177 g/kg DPPH
171 g/Kg DPPH
76 7
26 1
g Antioxidante/kg DPPH
g Antioxidante/Kg DPPH
pyrifera
5mg/mL
EC50
3,33 mg/mL
TEC50 (min)
39,27
1,15 0,08
14,69 1,10
AE ( 10-3)
7,65
11,44
2,62
Clasificacin
Alto?
Muy alto
Medio
potencia
antioxidante segn
Snchez Moreno
et al., (1998)
121
Para el clculo de estos parmetros, se hizo uso de las ecuaciones de la recta obtenidas por
medio de las curvas de calibracin para el cido ascrbico y TROLOX (ANEXO 6). Para el caso
del VCEAC, se utiliz la ecuacin y = - 0,0021x + 0,2565 y para TEAC, la ecuacin y = - 0,0008x
+ 0,0774. Los resultados fueron expresados en M para TEAC y en mg/L o ppm para VCEAC
(Tabla XXIII). El TEAC no fue aplicable para el caso del extracto de Durvillaea antarctica, porque
el valor de absorbancia de ste, escapaba del rango de absorbancia de TROLOX por el ensayo
DPPH. En la Tabla XXIII adems, se agrega informacin recopilada de Kushoski et al., (2005), en
relacin al TEAC y VCEAC de agente antioxidantes naturales, como la acerola y el mango, para
as contar con valores comparativos para un mejor anlisis de estos parmetros.
4.7.9 Mtodo de Fenoles Totales (FT) o Mtodo de Folin Ciocalteu.

Ya que la metodologa por ensayo DPPH, permite determinar la capacidad antioxidante de
una muestra en particular, aplicar metodologas como la de los Fenoles Totales, permite especificar
un tanto ms, a que componente de la muestra analizada se atribuye dicha capacidad. Por lo tanto,
resultados positivos para el mtodo de fenoles totales, es decir, un resultado de absorbancia
apreciable en la medicin a 765 nm o el cambio de color de la solucin, de amarillo a azul, equivale
a que la muestra analizada, posee en su constitucin compuesto fenlicos con actividad
antioxidante.
Por lo tanto, en esta oportunidad y al igual como se ha llevado a cabo anteriormente, se trabaj
con el mejor extracto de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica (triplicados) y a base de la
ecuacin de la recta, obtenida de la curva de calibracin para el cido glico a 765 nm (ANEXO7),
potente antioxidante, comnmente utilizado en esta metodologa.
Las muestras analizadas en esta oportunidad (triplicados todas ellas) consistieron en;
a) Estndar de Laminarina y Fucoidina, a 5mg/mL y 1mg/mL cada uno de ellos.
122
Tabla XXIII. VCEAC y TEAC para extractos de Macrocystis pyrifera y Durvillaea

antarctica.
Parmetro de
Extracto de
Extracto de
actividad
Macrocystis
Durvillaea
antioxidante
pyrifera
antarctica
TEAC (M) + DE
0,370 0,021
VCEAC (ppm) +
88,81 0,018
DE
Acerola
Mango
----
68,0 2,2
13,7 0,4
5,95 0,012
959,1 19,0
174,0 0,5
123
b) Extracto de protocolo nuevo de Macrocystis pyrifera y extracto de protocolo Black de

Durvillaea antarctica. Ambos a 5mg/mL.
El cido glico fue disuelto en metanol 100%, al igual que los extractos. Los estndares por su
parte, fueron disueltos en agua destilada. Adems se realiz un blanco para el solvente metanol
100%, sin obtenerse absorbancia apreciable a 765 nm.
En la Tabla XXIV figuran los datos de la metodologa por Fenoles Totales, calculados por
medio de la ecuacin de la recta y = 0,0008x + 0,0239.
Segn la Tabla XVIII de la seccin de Materiales y Mtodos, se analiz una variedad de
muestras considerable para este estudio, contemplando estndares comerciales de Laminarina y
Fucoidina, Estndar antibiticos como Unasyn, Sulperazon e Inem extractos algales a una
concentracin de 5 mg/mL y extractos digeridos enzimticamente y pick cromatogrficos de
laminarina y fucoidina, recolectados desde el mismo HPLC. Para el caso, de los ltimos tipos de
muestras, no se observ ninguna clase de inhibicin en placa, siendo los resultados para pick
recolectados y extractos digeridos con laminarina y - glucanasa, completamente negativos a todas
las concentraciones probadas.
Se realizaron placas control con el mismo inculo y metodologa que se realizaron los
antibiogramas, para todas las bacterias en cuestin y con el fin de corroborar el correcto crecimiento
bacteriano, libre cualquier contaminacin que invalide las pruebas.
Las placas elaboradas para testear los estndares comerciales de Laminarina y Fucoidina, a
concentraciones de 25 mg/mL ambas, resultaron todas negativas en cuanto a inhibicin bacteriana,
lo que se contrarresta para los extractos de Macrocytis pyrifera, que si presentaron actividad
antibacteriana para algunas bacterias.
124
Tabla XXIV. Fenoles Totales en extractos de Macrocytis pyrifera y Durvillaea antarctica.

Concentracin Extracto algal o
Absorbancia 765 nm + DE
Estndar polisacrido
Fenoles Totales
(representado en
concentracin de fenoles
totales, equivalentes a
ppm de cido glico) +
DE
Laminarina 5 mg/mL
0,005 0,001
-----
Fucoidina 5 mg/mL
0,037 0,002
16,375 0,012
Laminarina 1 mg/mL
0,019 0,001
-----
Fucoidina 1 mg/mL
0,159 0,003
168,88 0,011
Extracto Macrocystis pyrifera
0,069 0,004
56,38 0,018
0,041 0,001
21,38 0,022
M. pyrifera (referencial)
-----
125 0,096
D.antarctica (referencial)
-----
130 0,135
5 mg/mL
Extracto Durvillaea antarctica
5 mg/mL
125
Las bacterias ATCC que presentaron inhibicin frente al uso de extractos de Macrocystis
pyrifera, fueron Bacillus subtilis ATCC 33608, Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 y Escherichia coli ATCC 25922. La actividad
antibacteriana fue evaluada en relacin al halo de inhibicin formado en torno al pocillo que
contena cada preparado de extracto. Adems, se estudi el halo de inhibicin formado para estas
bacterias, pero contra antibiticos comerciales (preparados comerciales inyectables va
endovenosa), tales como; Inem, Sulperazon y Unasyn, con el fin de establecer una
comparacin en la magnitud del halo de inhibicin de estos estndar y el extracto de Macrocystis
pyrifera. El extracto de Durvillaea antarctica no presento inhibicin alguna, para ninguna de las
bacterias estudiadas. Ya que este ensayo obedece a un diseo experimental, 8 5 3, se realizaron
las pruebas en triplicado, donde en cada placa se testeaban cinco diluciones distintas ms un control
de H2O estril, resultando efectiva la prueba solamente para cuatro bacterias y no las ocho
originales que fueron contempladas.
Por lo tanto, en la Figura 31, se incluyen cuatro fotografas que comprenden los cuatro
antibiogramas positivos para halos de inhibicin por la aplicacin de extractos de Macrocystis
pyrifera. En la Figura 32 por otra parte, se contemplan las fotografas para halos de inhibicin por
la aplicacin de estndares antibiticos; conjuntamente se realizaron placas control para cada
bacteria, resultando todas ellas correctas en crecimiento bacteriano y libre de contaminacin.
(Informacin no entregada)
En la Tabla XXV se muestran los halos de inhibicin en milmetros (promedio de tres
repeticiones ms desviacin estndar), que son el resultado de la aplicacin de preparados en los
pocillos o impregnacin de discos filtros.
126
Figura 31. Antibiogramas de Extractos de protocolo nuevo de Macrocystis pyrifera.

En el sentido contrario de las manecillas del reloj, comenzando desde la flecha roja, los pocillos
corresponden a; concentrado, dilucin 1:1, dilucin 1:2, dilucin 1:4, dilucin 1:8 y control de H2O
estril. La concentracin de extracto utilizado fue de 25 mg/mL. A, antibiograma para Bacillus
subtilis ATCC 33608, B, Escherichia coli ATCC 25922, C, Staphylococcus aureus ATCC 25923,
D, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
127
Figura 32. Antibiogramas de estndares antibiticos Inem, Unasyn, Sulperazon.

En el sentido contrario de las manecillas del reloj y comenzando desde la flecha roja, para A
(Bacillus subtilis), Unasyn, Sulperazon, Inem, para B (Escherichia coli), Unasyn,
Sulperazon, Inem, para C (Staphylococcus epidermidis), Sulperazon, Inem, Unasyn. Los
estndares antibiticos fueron preparados como se seala en la seccin de materiales y mtodos.
128
Tabla XXV. Halos de inhibicin bacteriana para Extracto de Macrocystis pyrifera y

estndares antibiticos.
Halos de inhibicin (mm) + DE
Concentraciones
Concentrado
Bacillus subtilis
Staphylococcus
Staphylococcus
aureus
epidermidis
1,30 0,064 A
2,26 0,09 A
3,57 0,06 A
5,39 0,03 A
1,16 0,04 A
2,11 0,025 A
2,77 0,02 B
3,82 0,05 B
ab
00 B
00 B
00 C
00 C
00 B
00 B
00 C
00 C
00 B
00 B
00 C
00 C
00 B
00 B
00 C
00 C
25mg/mL
1:1
Escherichia coli
1:2
1:4
1:8
H2O estril
(control)
Halos de inhibicin (nm) + DE para estndar antibitico.

Inem
11,74 0,22 a
12,94 0,39 ac
18,74 0,38 b
13,16 0,59 c
Unasyn
14,29 0,28 a
17,94 0,10 b
22,90 0,11 c
16,18 0,33 b
Sulperazon
16,59 0,46 a
18,92 0,78 b
20,67 0,49 c
17,58 0,64 ab
Letras maysculas diferentes en las columnas, indican diferencia significativa estadstica entre
concentraciones de acuerdo a la prueba de rango mltiple de Tukey al 95%. Letras minsculas diferentes
en las filas, indican diferencia significativa estadstica entre bacterias de acuerdo a la prueba de rango
mltiple de Tukey al 95 %.
129
En la Figura 33, se contemplan los resultados comprendidos en la Tabla XXV, para el

concentrado y diluido 1:1 del extracto de Macrocystis pyrifera. Los resultados para los diluidos
1:2, 1:4, 1:8 y H2O estril fueron todos negativos, sin ninguna formacin de halo de inhibicin,
siendo no incorporados en la Figura 33.
En cuanto a la Tabla XXV en particular, podemos inferir que; para extractos de protocolo nuevo
para el alga Macrocystis pyrifera, slo resultaron efectivas para impedir el crecimiento
bacteriolgico, los extractos concentrado y con una dilucin 1:1, siendo inefectivas las diluciones
1:2, 1:4 y 1:8, adems de no presentarse inhibicin alguna en el pocillo control. De forma adicional,
la bacteria ms fuertemente inhibida result ser S. epidermidis, con un halo de inhibicin de 5,39
0,03 mm para el concentrado y de 3,82 0,05 mm para la dilucin 1:1 del extracto probado
(demostrable tambin por Figura 33). La segunda bacteria ms fuertemente inhibida, fue S. aureus,
con un halo de inhibicin de 3,57 0,06 mm para el concentrado y otro de 2,77 0,02 mm para la
dilucin 1:1, le siguen a ste, E. coli, con un halo de inhibicin para el extracto concentrado de
2,26 0,09 mm y de 2,11 0,025 mm para el extracto con dilucin 1:1 y finalmente, con la menor
inhibicin de crecimiento, la bacteria B. subtilis, con halos de inhibicin de 1,30 0,064 mm y
1,16 0,04 mm, para el extracto concentrado y 1:1 respectivamente.
Al analizar estadsticamente la inhibicin bacterial mediante anlisis de varianza (ANDEVA),
fue posible comprobar para el caso del extracto concentrado sobre S. epidermidis, que ste presenta
diferencia significativa (p < 0,05) con respecto a las tres bacterias restantes, como se observa en
las letras minsculas de la fila del concentrado. Para el caso de la dilucin 1:1 sobre S. epidermidis,
no existe diferencia significativa si comparamos a sta con S. aureus por anlisis ANDEVA (p >
0,05) y por las letras minsculas de la fila dilucin 1:1 (letras minsculas iguales entre ambas
bacterias). Adems, para el caso de la fila
130
Halo de inhibicin (mm)
5,39
5
3,57
4
3
2,26
1,3
1
0
Concentrado
Extracto concenrado de Macrocystis pyrifera
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Stahphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Halo de inhibicin (mm)
4,5
3,82
4
3,5
2,77
3
2,5
2,11
2
1,5
1,16
1
0,5
0
Dilucion 1
Extracto diluido 1:1 de Macrocystis pyrifera
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Figura 33. Inhibicin de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y

Staphylococcus epidermidis por efecto de las distintas diluciones de extracto de Macrocystis
pyrifera. A, inhibicin del crecimiento bacteriano correspondiente al extracto concentrado de
Macrocystis pyrifera (25 mg/mL), B, inhibicin del crecimiento bacteriano correspondiente a una
dilucin 1:1 del extracto de Macrocystis pyrifera.
131
del extracto concentrado, podemos indicar que no existe diferencia significativa (p < 0,05) entre
Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus; por otra parte, y observando la fila
dilucin 1:1, tampoco existi diferencia significativa entre Bacillus subtilis, Escherichia coli y
Staphylococcus aureus.
Para el caso de los controles antibiticos, todos presentaron una inhibicin del crecimiento
bacteriano mucho ms fuerte y en todas las bacterias, que el extracto probado. Analizando la accin
de estos antibiticos sobre cada bacteria estudiada y no sobre distintas concentraciones (como el
caso del extracto), tenemos que; Inem inhibe ms fuertemente a Staphylococcus aureus, seguido
de S. epidermidis, luego E. coli y finalmente B. subtilis. Adems, existe diferencia significativa (p
< 0,05) de magnitud de la inhibicin entre B. subtilis, S. aureus y S. epidermidis, pero no existe
diferencia significativa (p > 0,05) entre E. coli y B. subtilis o S. epidermidis. Desde otra perspectiva,
Unasyn, inhibe fuertemente y en primer lugar a S. aureus, luego a E. coli, S. epidermidis y
finalmente a B.subtilis. En trminos de anlisis ANDEVA, existe diferencia significativa (p > 0,05)
entre B. subtilis, E. coli y S. aureus, pero no entre E. coli y S. epidermidis (letras minsculas iguales
en Tabla XXV). En ltima instancia, Sulperazon, inhibe de mejor forma a S. aureus, luego a E.
coli, para seguir con S. epidermidis y finalmente B. subtilis. En cuanto a diferencia significativa, si
existe entre B. subtilis, E. coli y S. aureus, pero no entre S. epidermidis y E. coli. (p < 0,05 y letras
minsculas iguales en la fila).
Comparando los resultados de la prueba del extracto de Macrocytus pyrifera y estndares
antibiticos, claramente observamos una superioridad notable de estos ltimos y el extracto, an
cuando se trate del concentrado o dilucin 1:1 del extracto. Slo para el caso del extracto probado,
se observ concordancia en cuanto a que, la inhibicin bacteriana debe disminuir a medida que el
agente a probar, se somete a dilucin. No se observa concordancia en relacin a que, para el caso
132
de Staphylococcus epidermidis, se observ diferencia significativa entre esta bacteria y

Staphylococcus aureus para el extracto concentrado, pero no as cuando se trataba del extracto con
dilucin 1:1, revelando que no existe diferencia en la inhibicin del crecimiento bacteriano para
estas bacterias, cuando se trata de la aplicacin de una dilucin 1:1.
Finalmente, se concreta el hecho que, los extractos de Macrocystis pyrifera contenedores de
fucoidina, si presentaron actividad antibacteriana, lo que no ocurri con las muestras estndar de
Fucoidina 25 mg/mL. Si corresponde que el extracto de Durvillaea antarctica no haya presentado
actividad alguna, puesto que el estndar de Laminarina 25 mg/mL tampoco fue efectivo en ningn
grado o magnitud para inhibir el crecimiento de algunas de las bacterias estudiadas.

La realizacin de la actividad antifngica fue desarrollada en las dependencias del Instituto
de Microbiologa Clnica de la Facultad de Medicina de la Universidad Austral de Chile. Segn lo
descrito en la seccin de Materiales y Mtodos, de todos los tipos de muestras ensayadas sobre las
cepas fngicas estudiadas, no se obtuvo ningn resultado positivo en cuanto a aparicin de halo de
inhibicin. Esto ltimo se corrobor al aplicar estndar comercial de Laminarina y Fucoidina y no
conseguirse ninguna clase de inhibicin del crecimiento fngico. En las Figuras 34 y 35, se
exponen algunos de los resultados negativos para el gnero Candida y Aspergillus respectivamente,
pero slo para algunas de las muestras ensayadas.
133
Figura 34.
Actividad antifngica de Estndar comercial de Laminarina 25 mg/mL y
Fucoidina 25 mg/mL. En el sentido contrario de las manecillas del reloj, desde la flecha roja,
concentrado, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 y control (H2O estril). A, Candida albicans, para estndar comercial
de Laminarina 25 mg/mL, B, Candida guillermondii, para estndar comercial de Fucoidina 25
mg/mL, C, Candida Krusei, para estndar comercial de Laminarina 25 mg/mL.
134
Figura 35. Actividad antifngica para el gnero Aspergillus. A, Extracto de Durvillaea

antarctica, arriba Aspergillus terreus, abajo Aspergillus fumigatus, B, Extracto de Durvillaea
antarctica, arriba A. flavus, abajo A. niger, C, Extracto de Macrocystis pyrifera, arriba A. terreus,
abajo A. fumigatus, D, Extracto de Macrocystis pyrifera, arriba A. flavus, abajo A. niger, E,
Fucoidina estndar, arriba A. terreus, abajo A. fumigatus, F, Laminarina estndar, arriba A. flavus,
abajo A. niger.
135
5. DISCUSIN
En lo que respecta el proceso de extraccin de las materias primas algales, tenemos que;
observando la Figura 12 (pgina 89), los monosacridos glucosa, fucosa y manitol no revierten un
posible interferente en cuanto a tiempo de elucin, comparado con los picos principales y objeto
central de este trabajo de tesis, es decir, los picos referentes a fucoidina y laminarina, que eluyen a
los 10 min y 15 17 min respectivamente. De igual forma, los productos de hidrlisis enzimtica
como laminaritriosa y laminaritetraosa y su tiempo de elucin de aproximado de 18 y 19 min
respectivamente, tampoco son sinnimo de conflicto a la hora de identificar los picos principales a
detectar en los cromatogramas. Segn el cromatograma de los estndares comerciales (Figura 13,
pgina 90), se obtiene una relacin directa con la Figura 12, ya que el estndar de fucoidina siempre
eluye en torno a los 10 min y antes que el picos de cido algnico. De igual forma, el pico de
laminarina comercial, eluye en esta oportunidad cercano a los 15 min, mantenindose el rango
aproximado de elucin, de 15 17 min. Segn Ortiz (2011), los extractos de Macrocystis pyrifera
debiesen contener mayor proporcin del polisacrido estructural fucoidina, que del polisacrido de
reserva, laminarina, lo cual es consistente con que en la Figura 14, todos los procesos extractivos
elaborados por Deville et al., entregan una proporcin aceptable de fucoidina, pero en menor grado
de laminarina (a excepcin de protocolo Yvins), siendo el protocolo Nuevo, el que resulta en una
mayor cantidad (Segn rea de pico) de fucoidina. Por otra parte, para el caso del proceso de
extraccin desde Durvillaea antarctica, el protocolo Black se convirti en el mejor proceso
extractivo para conseguir una mayor cantidad de laminarina, lo que tambin se condice con las
fuentes referenciales, que se refieran a que esta alga contiene un mayor grado de laminarina que
Macrocystis pyrifera, slo cuando, los factores ambientales as lo promueven. Esto ltimo, se
convierte en una limitante y factor determinante a la hora de intentar extraer en primera instancia
136
estos polisacridos y por otra parte, en efectivamente detectarlos por la metodologa HPLC IR,
ya que se encuentra perfectamente descrito que, la variacin del contenido, aminoacdico, de
tocoferoles, compuestos carotenoides y concentracin de polifenoles, entre otros, vara de especie
a especie segn la localizacin geogrfica, estaciones del ao, exposicin a oleaje y a las corrientes,
concentracin de nutrientes presentes en el medio, profundidad a la que se localizan, la temperatura
y estado de desarrollo del alga. Sintetizando lo predicho, las condiciones ambientales pueden
promover o restringir totalmente, la sntesis del polisacrido laminarina, ya que la presencia de
sta, est directamente limitada a la mayor o menor irradiacin de luz solar que se utiliza para el
proceso fotosinttico, directamente dependiente de la profundidad a la cual se encuentra el alga, a
las condiciones climatolgicas (menor luz solar en perodo de invierno, lo que fomenta la sntesis
de un polisacrido de almacenamiento como laminarina), y a la juventud del alga que ha sido
extrada (algas jvenes, segn condiciones ambientales, puede contener mayor cantidad de
laminarina y fucoidina). As tambin, no es de menor importancia mencionar que, la anatoma del
alga pudiese influir en encontrar mayor o menor contenido de estos polisacridos en las algas
estudiadas, siendo una alternativa para trabajos futuros, realizar un estudio ms acucioso sobre
estipes y frondas, as como tambin correlacionar los resultados, con la fuente de la materia prima,
es decir, la ubicacin geogrfica y el perodo estacional a la que corresponde el alga trabajada.
Aun cuando las metodologas elaboradas por Deville et al., fueron el principal foco de trabajo,
la elaboracin de protocolos alternativos como Nakamura Black se convirtieron por momentos
en opciones no menores para experimentar en torno a, cunta cantidad de laminarina se poda
conseguir, ya que sta revesta el principal problema de deteccin de este trabajo, debido a que
siempre se encuentra en mucho menor proporcin, independiente de la materia prima, que el
polisacrido de fucoidina. A raz de la Figura 16 (pgina 95), se tiene que para estos protocolos
137
NB, se consigue una menor de laminarina en relacin al protocolo Black elaborado de Deville y
aplicada al alga Durvillaea antarctica.
A pesar de que, el trabajo en torno a los productos de hidrlisis no fue productivo en ninguna
de las actividades ensayadas, se realiz el proceso de deteccin de estos segn si se aplicaba la
enzima - glucanasa o laminarinasa (Figura 23 y 24 respectivamente). En ambos casos, la
deteccin de laminaritriosa o laminaritetraosa fue positiva, siendo algo menor en el caso de la glucanasa, por ser sta una enzima de menor especificidad para la hidrlisis exclusiva de
laminarina.
Para determinar la concentracin de fucoidina entonces, se seleccion el extracto logrado con
el protocolo Nuevo a partir de M. pyrifera. Mientras que para determinar la concentracin de
laminarina se opt por el extracto del protocolo Black de D. antarctica. Esta eleccin se bas en
que el protocolo Nuevo de M. pyrifera extrae mayoritariamente fucoidina, mientras que el
protocolo Black de D. antarctica es ms especfico para conseguir buenas cantidades de
laminarina. Las reas de los respectivos picos se utilizaron para la determinacin de concentracin
de los polisacridos, utilizando las curvas de calibracin de los estndares fucoidina (y = 12,477 x
48,564) y laminarina (y = 10,614 x 11,939) (Anexo 4.1 y 4.2 respectivamente). Esto resultados
indican que el extracto de M. pyrifera corresponda en un 100% a fucoidina mientras que el extracto
de D. antarctica presenta un 79% de laminarina.
En otra instancia y respecto a la actividad enzimtica de las enzimas glucanasa y
laminarinasa sobre los extractos de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica, se realizaron
pruebas de deteccin de los productos de hidrlisis. Es este punto, el test de glucosa y el mtodo
estandarizado del DNS, son relevantes para determinar si las enzimas efectivamente fueron activas
enzimticamente frente a los extractos. Podemos decir por lo tanto, que aunque esta seccin era
138
primordial para desarrollar parte de la hiptesis de este trabajo, era an ms relevantes para
determinar si exista o no presencia de los polisacridos en estudio (sobre todo laminarina, por
especificidad hidroltica de una de las enzimas por este polisacrido). Se obtuvo entonces que, para
ambos casos si exista una hidrlisis enzimtica positiva, siendo sta ms sensible, pero ms
inespecfica para el caso del test del DNS y ms especfica, pero menos sensible para el test de
glucosa. Esto ltimo ya que, el test del DNS detecta azcares reductores, que comprende
mayoritariamente monosacridos como productos de hidrlisis probables, detectando por ende
mayor cantidad de posibles productos hidrolticos en relacin al test de glucosa, que slo se refiere
a la deteccin exclusiva de glucosa.
Referente a la medicin de la actividad antioxidante para extractos de Macrocystis pyrifera y
Durvillaea antarctica, podemos mencionar que, los mejores resultados se consiguieron en torno a
extractos de M. pyrifera, con un % IRL (Tabla XIX, pgina 117) en torno al 81,72 % siempre
cercano a los rangos de estndares antioxidantes, como TROLOX, cido glico y cido ascrbico.
Extractos de D. antarctica, siempre presentaron menor actividad antioxidante (% IRL del 36,30
%). Si consideramos la concentracin ptima de trabajo para extractos algales, 5 mg/mL, los
extractos de M. pyrifera vuelven a ser superiores que los de D. antarctica, esta vez en el % DPPH
remanente
(Tabla XX, pgina 119), 19,84 % y 66,31 % respectivamente, denotando que el extracto de
M. pyrifera ejerce una actividad antioxidante ms potente, al dejar menor cantidad de DPPH libre
o en estado reducido en el medio. En relacin a la Tabla XXII (pgina 122), los parmetros EC50,
TEC50 y AE, comprenden otra herramienta para establecer la actividad antioxidante de un agente
antioxidante en particular, as tenemos que, el extracto de M. pyrifera, posee un EC50 aceptable en
comparacin con el cido ascrbico y cido glico, pero un TEC50 un tanto alto, lo que equivale a
que el extracto es un buen antioxidante, pero lento en su accin en relacin a los estndares con los
139
que se compara en esta figura, y que segn la clasificacin de Snchez Moreno et al.,
correspondera aparentemente (por carecer de rangos de referencia) a un agente antioxidante de
alta potencia. La eficiencia antiradical para el extracto de M.pyrifera por tanto es excelente, pero
menor al cido ascrbico, que es considerado un agente con una altsima potencia antioxidante. De
forma adicional, EC50 demuestra que, slo se necesita de una concentracin de 3,3 mg/mL para
conseguir la mitad de la inhibicin del DPPH. Adems, la Tabla XXIII (pgina 124) demuestra que
el extracto de D. antarctica sigue siendo menor en cuanto a actividad antioxidante y que la Acerola
y Mango son agentes antioxidantes muy potentes, pues consiguen valores de TEAC y VCEAC
importantes, considerando que el TROLOX y cido ascrbico ya son fuertes antioxidantes. Ante
esto ltimo, podemos inferir que, a pesar que segn los parmetros EC50, TEC50 y AE son buenos
para el extracto de M. pyrifera, el TEAC y VCEAC son menores, ya que sta corresponde a una
comparacin directa de la capacidad antioxidante de dos conocidos antioxidantes y un agente
nuevo que se prueba. Por lo tanto, el extracto de M.pyrifera slo equivale a 0,370 0,021 M de
Trolox y a 88,81 0,018 ppm de cido ascrbico. La Tabla XXIV por tanto (pgina 126), se refiere
a la medicin de fenoles totales, por la metodologa de Folin-Ciocalteu que mide el aumento de la
absorbancia a 765 nm y es til para la determinacin de antioxidante fenlicos y polifenlicos. La
Tabla XXIV demuestra adems que, para el estndar de Laminarina si existe absorbancia a 765
nm, debido a una absorcin a esa longitud de onda propia de laminarina o de algn producto de
reaccin una vez sometida la muestra a los reactivos del mtodo de fenoles totales. Para el caso de
fucoidina 5 mg/mL y 1 mg/mL, tambin se present lectura de absorbancia,pero mayor que en el
caso de laminarina, posiblemente a las mismas razones anteriores, ya que el estndar comercial de
fucoidina proviene de Fucus vesiculosus, donde se conoce que este tipo de fucoidina no contiene
compuestos fenlicos en su estructura, sino que contiene fucosa y sulfato. Adicionalmente, la
140
actividad antioxidante que reporta fucoidina, y algunos polisacridos, se debe en gran parte a los
radicales hidroxilados de estos y no a la estructura resonante propia de los fenoles, o grupos fenil
en su defecto. A pesar de lo anterior, resulta ms razonable que los extractos de M. pyrifera y D.
antarctica hayan sido positivos para el ensayo de fenoles totales, puesto que en su calidad de
extractos, adems de fucoidina o laminarina, puedan contener otros compuestos, a los cuales se les
pueda atribuir la absorbancia resultante de este ensayo. Esto ltimo, se condice con lo sealado en
la Tabla XXIV, puesto que Macrocystis pyrifera presenta una concengtracion de fenoles totales
quivalentes a 125 ppm de cido glico y Durvillaea antarctica, una de 130 ppm de cido glico,
resaltando el hecho entonces, de que ambas especies algales poseen efectivamente compuestos
fenlicos a los que se les puede atribuir parte de la actividad antioxidante ya demostrada en el
ensayo del DPPH. Dentro de los posibles compuestos fenlicos que pudiesen contener las algas en
cuestin, se encuentran los florotaninos, que segn Koivikko (2008), son la nica clase de taninos
que se encuentran en algas pardas, consistentes en polmeros de floroglicenoles, que pueden llegar
a constituir aproximadamente el 15 % del peso seco del alga (1 1,3 % del peso seco de
Macrocystis pyrifera, segn Van Alystyne (1999)). Swanson y Druehl (2002), sealan adems que
la sntesis y liberacin al espacio marino de florotaninos, est estrechamente relacionada con el
stress UV A y la proteccin a radiacin UV B. Cruces et al., (2013) por tanto seala que, la
actividad antioxidante y contenido soluble de florataninos, es positivamente correlacionada con la
exposicin a radiacin UV y rpidamente inducible a T > 20 C para el caso de D. antarctica, la
especie ms sensible a la irradiacin de temperatura. Esto reafirma an ms, que las condiciones
ambientales, influye fuertemente en la capacidad antioxidante de estas algas.
En relacin a la determinacin de la actividad antibacteriana, slo se consiguieron positivos
para el extracto obtenido por protocolo nuevo de Macrocystis pyrifera, siendo ste efectivo en
141
cuanto a aparicin de halo de inhibicin para las bacterias, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis y Bacillus subtilis. Es altamente probable por antecedentes
bibliogrficos, que la actividad antibitica de este extracto se deba a fucoidina, aun cuando Reichelt
y Borowitzka (1984) sealan que, esta actividad podra deberse tambin a mltiples principios
activos presentes en este tipo de algas, entre los cuales tenemos, cidos grasos insaturados, fenoles,
sesquiterpenos halogenados e hidroquinonas bromadas. Howard y Fenical (1978) agregan a la lista
anterior, cidos grasos libres o formando parte de mono, di y triglicridos. Una vez ms, no se
puede menospreciar el hecho, y sealado por Valdebenito (1981), que cada especie algal posee su
propia periodicidad en la produccin del antibitico. En cambio, otros autores como Hornsey y
Hide (1985) encuentran cuatro patrones de produccin de antibitico, que van desde uniforme todo
el ao, hasta mximo produccin en invierno, primavera o verano.
Finalmente, en materia de medicin de actividad antifngica, sta prueba result negativa
para todos los tipo de muestra ensayada, no obtenindose ninguna clase de inhibicin de las cepas
fngicas utilizadas. Esto posiblemente debido a que escasos estudios indican que, el gnero
Undaria, u otras algas de costas tropicales u orientes, han presentado actividad sobre Trichophyton,
Candida y Saccharomyces, pero no sobre el gnero Aspergillus. La actividad antifngica de
fucoidina o laminarina tampoco se encuentra bien especificada en antecedentes bibliogrficos.
142
6. CONCLUSIONES.
Para finalizar y considerando los resultados de este trabajo de investigacin, es posible concluir
lo que sigue;
a.- A partir del alga Durvillaea antarctica, es posible extraer en mayor cantidad el polisacrido de
reserva, laminarina, mientras que, desde MP se obtiene de mejor forma fucoidina.
b.- El polisacrido laminarina no se encuentra sulfatado en forma natural en cambio fucoidina
presenta un importante contenido de sulfatos.
c.- Respecto a la medicin de actividad antioxidante para extractos de Durvillaea antarctica y
Macrocystis pyrifera, podemos mencionar que, los mejores resultados se consiguieron en torno a
extractos de Macrocystis pyrifera, cuyos resultados se asemejan a los obtenidos por medio de
estndares antioxidantes como, TROLOX, Acido Glico y Acido Ascorbico.
d.- Las especies algales, Durvillaea antarctica y Macrocystis pyrifera, contienen compuestos
fenlicos a los que se les puede atribuir parte de la actividad antioxidante registrada. Entre estos,
los florotaninos seran los taninos que contemplan mayor importancia.
e.- Extractos del alga Macrocystis pyrifera, presentan actividad antibacteriana contra las cepas
bacterianas de, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylocuccus epidermidis y Bacillus
subtilis. Existe una gran probabilidad, que esta actividad pueda deberse al polisacrido fucoidina,
pero no se descarta atribuir esta actividad a otros principios activos presentes en el alga (descrito
por varios autores).
f.- Extractos de las algas Durvillaea antarctica y Macrocystis pyrifera, no presentan actividad
antifngica alguna, ante las cepas fngicas estudiadas.
g.- No es de menor importancia mencionar que, la anatoma del alga puede influir en encontrar
mayor o menor contenido de estos polisacridos, siendo una alternativa para trabajos futuros.
143
Realizar un estudio acucioso sobre estipes y frondas, ubicacin geogrfica y perodo estacional,
son variantes importantes a considerar, en la variacin en el contenido de polisacridos que
contienen estas algas.
h.- Finalmente, puesto que tanto Durvillaea antarctica y Macrocystis pyrifera son recursos marinos
nacionales y aplicables a la dieta humana, sera importante considerar a stas como terapias no
farmacolgicas para aprovechar as, las actividades fisiolgicas probadas en este trabajo de
investigacin. Aun as, trabajos in vivo seran necesarios para avalar de mejor forma, los resultados
obtenidos en esta oportunidad.
144
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160
ANEXOS.
161
ANEXO 1
ANEXO 1.1. PROTOCOLO BLACK DE EXTRACCIN DE LAMINARINA Y
FUCOIDINA.
Alga + HCl (1:10 p:v)
120 min 4C
Centrifugacin
4x
Sobrenadante + Alga
Ajustar pH a 2,5
Centrifugacin
Sobrenadante + Etanol
Centrifugacin
Precipitado
La laminarina es extrada desde el alga seca de acuerdo a la tcnica descrita por Black et
al., el alga fue mezclada con HCl 0,09 M (1:10 p/v) a 4C durante 2 h. se realizan 4 sucesivas
extracciones y la laminarina contenida en el sobrenadante fue precipitada por adicin de etanol.
162
ANEXO 1.2. PROTOCOLO BLACK VARIANTE DE EXTRACCIN DE LAMINARINA

Y FUCOIDINA.
120 min 4C
4x
Centrifugacin
Sobrenadante + Alga
Ajustar pH a 2,5
Centrifugacin
Sobrenadante
Neutralizacin con NaOH
Muestra liquida
La laminarina es extrada desde el alga seca de acuerdo a la tcnica descrita por Black et
al., hasta la precipitacin con etanol. En este caso el sobrenadante no fue mezclado con etanol,
siendo que neutralizado con NaOH 1M, mantenindose la laminarina en solucin.
163
ANEXO 1.3. PROTOCOLO IVIN DE EXTRACCIN DE LAMINARINA Y FUCOIDINA.
Alga + H2SO4 (1:14 p: v)
150 min 70C
Centrifugacin
Centrifugacin
Precipitado
La laminarina es extrada desde el alga seca de acuerdo a la tcnica descrita por Ivin et
al., el alga fue mezclada con H2SO4 0,09 M (1:10 p/v) a 70C durante 2,5 h. la laminarina contenida
en el sobrenadante fue precipitada por adicin de etanol.
164
ANEXO 1.4. PROTOCOLO NUEVO DE EXTRACCIN DE LAMINARINA Y

FUCOIDINA.
150 min 70C
Centrifugacin
Centrifugacin
Precipitado
La laminarina es extrada desde el alga seca de acuerdo a la tcnica descrita por Ivin et
al., el alga fue mezclada con HCl 0,09 M (1:10 p/v) a 70C durante 2,5 h. la laminarina contenida
en el sobrenadante fue precipitada por adicin de etanol.
165
ANEXO 1.5. PROTOCOLO NAKAMURA DE EXTRACCIN DE LAMINARINA Y

FUCOIDINA.
Alga marina + HCl 0.1 M (1:2 p/v)
Adicin de 2L HCl 0.1 M
Homogeneizado
Agitacin por shaker a T ambiente, durante la noche.
Centrifugacin 5000 rpm 20 min.
Sobrenadante.
Ajuste a pH 7.00 con NaOH 5M
4x
Centrifugacin a 3000 rpm.
Sobrenadante.
Resuspender con EtOH 85%
Centrifugacin a 3000 rpm.
Precipitado (Laminarina + Fucoidina)
166
ANEXO 1.6 PROTOCOLO NAKAMURA BLACK DE EXTRACCIN DE

Alga marina + HCl 0.1 N
MODIFICACIN 1
(Diluciones reaizadas)
MODIFICACIN 2
(Procesos realizados)
Filtracin
MODIFICACIN 3
(Recirculaciones)
Centrifugar a 5000 rpm por 20 30 min.
Sobrenadante
Ajustar pH 7.00 con NaOH 5N + Alga
5000 rpm por 20 min.
Sobrenadante
Coagulacin con EtOH 85% (1:2)

MODIFICACIN 4
(Recirculaciones)
Centrifugacin 5000 rpm por 20 30 min.
Sobrenadante
Precipitado (Laminarina y Fucoidina)
167
ANEXO 2.
ANEXO 2.1 ESQUEMA DE RECUENTO DE COLONIAS BACTERIANAS.
Eppendorf + Bacteria ATCC
Caldo Soya Tripticasa (CST) (10ml)

Incubar por 24 h a 30C
1 mL
de
CST
1 mL
1 mL
9 ml PBS
9 ml PBS
9 ml PBS
9 ml PBS
9 ml PBS
9 ml PBS
9 ml PBS
9 ml PBS
9 ml PBS
1 mL
9 ml PBS
1 mL
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
Incubacin 24 h a 30C
1 mL
100 L de cada dilucin con PBS a placa AST
Agar Soya Tripticasa

( 20 30 mL)
Recuento de colonias en
Contador de colonias digital.
Ej:
Placa -6: 65 colonias = 6,5 10 -7
168
ANEXO 2.2 ENSAYO DE SENSIBILDIAD DE LAS CEPAS DE REFERENCIA FRENTE

A LOS EXTRACTOS DE MACROCYSTIS PYRIFERA Y DURVILLAEA ANTARCTICA.
Eppendorf + Bacteria ATCC
Caldo Soya Tripticasa (CST) (10ml)

Incubar por 24 h a 30C
1 mL
de
CST
9 ml PBS
9 ml PBS
9 ml PBS
9 ml PBS
1 mL
9 ml PBS
1 mL
-1
-2
-3
-4
-5
45 mL
Agar Soya
Tripticasa
semislido
106 ufc/mL
-6
5 mL
1 mL
Incubacin 24 h
a 30C
1 mL
25 L cada
muestra +
reposo 1 3 h.
Alicuotas de 5 7
mL 106 ufc/mL
Agar Soya Tripticasa (20 30mL)
169
ANEXO 2.3 PREPARACIN DE DILUCIONES DE MUESTRAS DE ESTNDARES DE

FUCOIDINA - LAMINARINA Y MUESTRAS DE ENSAYO DE ACTIVIDAD
ANTIBITICA.
0.75 mL
0.75 ml H2Odest estril
Conc
..
0.75 mL
1.5 ml concentrado
0.75 mL
1:1
1:2
1:4
1:8
0.75 mL
170
ANEXO 3
ANEXO 3.1 PROTOCOLO SELECCIONADO DE LA ESTANDARIZACIN DEL
MTODO DE DNS.
Estandarizacin DNS
Absorbancia (nm)
y = 0,863x - 0,0167
R = 0,9832
Concetracin glucosa (mg/mL)
Protocolo consistente en la mezcla de 3 mL del Reactivo DNS, ms 3 mL de muestra en

estudio. Incubacin a 90C durante 15 min, enfriar a temperatura ambiente, para luego agregar 1
mL de Tartrato de sodio y potasio al 40%, finalmente medir la absorbancia a 540 nm. Como
muestra se utiliz glucosa a distintas concentraciones. Figura extrada de Daz, AP (2011).
171
ANEXO 4.
ANEXO 4.1. CURVA DE CALIBRACIN DE FUCOIDINA.
Se realiz una curva de Calibracin con fucoidina estndar a las concentraciones: 0, 40, 80,
120, 160, 200 g , obtenindose la siguiente ecuacin de la recta: y= 12,477x 48,564 y un R2=
0,9975. Figura extrada de Daz, AP (2011).
172
ANEXO 4.2. CURVA DE CALIBRACIN DE LAMINARINA.
1200
Area (mVs)
1000
y = 10,614x - 11,939
R2 = 0,9943
800
600
400
200
0
0
20
40
60
80
100
120
Contenido de Laminarina (g)
Se realiz una curva de Calibracin con laminarina estndar a las concentraciones: 0, 20, 40,
60, 80, 100 g , obtenindose la siguiente ecuacin de la recta: y= 10,614x 11,939 y un R2=
0,9943. Figura extrada de Daz, AP (2011).
173
ANEXO 5
ANEXO 5.1 EC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA
EC50 Extracto Macrocystis pyrifera

120
%DPPH remanente
100
y = -19,677x + 115,59
R = 0,9955
80
60
40
20
0
0
Concentracin extracto Macrocystis pyrifera (MP) mg/ml
174
ANEXO 5.2 TEC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA.
TEC50 Extracto Macrocytis pyrifera

120
100
%DPPH remanente
y = -1,1908x + 96,757
R = 0,9961
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
Tiempo (min)
50
60
70
175
ANEXO 6
ANEXO 6.1 CURVA DE CALIBRACIN TROLOX (TEAC)
Curva de calibracin TROLOX

0,08
0,07
Absorbancia
0,06
y = -0,0008x + 0,0774
R = 0,9902
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
-0,01
20
40
60
Concentracin (ppm)
80
100
120
176
ANEXO 6.2 CURVA DE CALIBRACIN CIDO ASCRBICO (VCEAC)
Curva de calibracin cido ascrbico

0,3
Absorbancia
0,25
0,2
y = -0,0021x + 0,2565
R = 0,9835
0,15
0,1
0,05
0
0
20
40
60
Concentracin (ppm)
80
100
120
177
ANEXO 7
ANEXO 7.1 CURVA DE CALIBRACIN DE CIDO GLICO A 765 nm (MTODO DE
FENOLES TOTALES).
Curva de calibracin cido glico 765 nm

0,12
Absorbancia 765 nm
0,1
0,08
0,06
y = 0,0008x + 0,0239
R = 0,9866
0,04
0,02
0
0
20
40
60
80
Concentracin cido glico (ppm)
100
120

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Profesor Patrocinante

Dra. Marcia Costa L.

Extraccin, caracterizacin parcial y determinacin de propiedades

Tesis de Grado presentada como parte de

OSCAR OLIVER DAZ ROLDN

Solo en las condiciones de mi vida diaria,

2.1 Algas marinas.

2.2 Algas pardas. (Reino Protista, Filum Heterokontophyta, Clase Phaeophyceae)

2.3 Estructura celular en algas pardas.

2.4 Algas Kelp

2.5 Macrocystis pyrifera.

2.6 Durvillaea antarctica.

2.7 Polisacridos de reserva en algas pardas: Laminarina.

2.8 Polisacridos extracelulares y de la pared celular en algas marinas.

2.9 Polisacrido extracelular en algas pardas: Fucoidina.

2.10 Importancia mdica y Propiedades fisiolgicas en algas marinas.

2.10.6 Actividad Anticancergena.

2.10.7 Actividad Antihelmntica.

2.10.8 Actividad anticoagulante.

2.10.9 Actividad Laxante.

2.10.10 Actividad antifngica.

2.10.11 Actividad antiviral.

2.10.12 Actividad inmunolgica e inflamacin.

2.10.13 Actividad Hipolipemiante e Hipotensora.

2.10.14 Actividad antibacteriana.

2.10.15 Actividad Antioxidante

2.11 Digestin enzimtica y mtodo de deteccin de productos de hidrlisis.

2.11.2 glucanos y distribucin en levaduras, hongos y algas segn el tipo de

2.11.3 Tcnicas de deteccin, Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).

2.13 Objetivo General

2.14 Objetivos Especficos

3.1 Extraccin de polisacridos.

3.2 Deteccin de polisacridos.

3.3 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).

3.4 Recoleccin de fracciones de polisacridos (pick cromatogrficos) desde HPLC. 66

3.6 Test de glucosa.

3.7 Ensayo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS).

3.8 Determinacin cualitativa de Sulfatos.

3.9 Determinacin de la Actividad Antioxidante.

3.9.1 Estndares y Reactivos.

3.9.2 Mtodo DPPH.

3.9.3 Mtodo de Fenoles Totales.

3.10 Determinacin de la Actividad Antibacteriana.

3.10.1 Cepas bacterianas.

3.10.1.1 Bacillus subtilis ATCC 33608.

3.10.1.2 Escherichia coli ATCC 25922.

3.10.1.3 Klebsiella pneumoniae ATCC 23357.

3.10.1.4 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

3.10.1.5 Shigella sonnei OSP 2047 01.

3.10.1.6 Staphylococcus aureus ATCC 25923.

3.10.1.7 Staphylocccus epidermidis ATCC 12228.

3.10.1.8 Streptococcus pyogenes OSP 344 10.

3.10.2 Conservacin de cepas de referencia.

3.10.3 Activacin de las cepas.

3.10.4 Recuento de colonias bacterianas.

3.10.5 Estndar de medicamentos Unasyn, Inem y Sulperazon.

3.10.6 Ensayo de Sensibilidad de las cepas de referencia frente a los extractos de

3.10.7 Diseo experimental para la inhibicin bacteriana por medio de pocillos o

3.10.8 Anlisis estadsticos.

3.11 Determinacin de la actividad antifngica.

3.11.1 Cepas fngicas.

3.11.2 Cultivo de cepas fngicas.

3.11.3 Ensayo de Sensibilidad de las cepas fngicas frente a los extractos de