BOLSA DE INICIAO CIENTFICA COTAS

RELATRIO TCNICO FINAL

IDENTIFICAO
INSTITUIO: Universidade Federal da Bahia
NOME DO BOLSISTA: Hilan Ribeiro de Morais Lopes
CPF N: 05905858519

PEDIDO N

3359 /2013

ORIENTADOR (A): Patricia Belini Nishiyama

TTULO DO PROJETO DE PESQUISA: Estudo citogentico e molecular em espcies de peixes de
pequeno porte (Pisces, Characidae) pertencentes a bacia do Rio Pardo, regio de Itamb/BA
PERODO ABRANGIDO PELO RELATRIO: 17 /08 / 2014

19 /06 /2015

EXECUO DAS ATIVIDADES

DESCRIO DAS ATIVIDADES REALIZADAS CONFORME PLANO DE
TRABALHO

PERODO PREVISTO

PERODO DE EXECUO

17/08/2014

17/08/2014

20/08/14

20/08/14

Preparao e colorao de lminas para anlise

25/08/14
14/11/14

25/08/14 14/11/14

Anlise de lminas

11/11/14
18/12/14

11/11/14 18/12/14

Fotografar metfase

15/01/15
20/02/15

15/01/15 20/02/15

Montagem do caritipo

02/03/15
24/04/15

02/03/15 24/04/15

Realizao das tcnicas de bandeamento

11/05/15
19/06/15

11/05/15 19/06/15

Preparao de reagentes
Coletas Rio Pardo

DESCRIO DA(S) ATIVIDADE(S) NO PREVISTA(S) ORIGINALMENTE

NO PLANO DE TRABALHO (SE HOUVER)

PERODO DE EXECUO

DIFICULDADES ENCONTRADAS: Durante o perodo deste relatrio, houveram alguns problemas quanto a
locomoo at o local da coleta, devido s ms condies da estrada e devido a chuvas, o que dificultaram o
acesso ao Rio Pardo.

HOUVE ALTERAO NO PLANO DE TRABALHO: ( )SIM ( x)NO

JUSTIFIQUE A ALTERAO:
PROJETO (PLANO DE TRABALHO)
RESUMO: (aproximadamente 250 palavras)
Os Characiformes representam um grupo dominante entre os peixes de gua doce da Amrica do Sul. Dentro
desta ordem destaca-se a famlia Characidae, representando a maior e mais diversificada famlia de peixes de
gua doce. Os estudos citogenticos realizados em caracdeos tm evidenciado uma ampla variabilidade
cariotpica, observando-se grupos com caritipo bastante heterogneo, ao lado de outros bem mais
conservados na estrutura cariotpica. Estudos realizados em espcies de pequeno porte, tem demonstrado
uma ampla variabilidade cromossmica, evidenciando-se a presena de cromossomos sexuais, cromossomos
supranumerrios, polimorfismos cromossmicos, indicando que estes dados constituem uma ferramenta til,
que permite corroborar na identificao e no entendimento deste importante grupo, uma vez que muitos
gneros de pequeno porte esto includos como incertae sedis dentro da famlia Characidae. Assim, utilizando
alm da tcnica convencional com Giemsa, anlise por bandeamentos NOR e C, o presente estudo procurar
verificar diferenas cariotpicas inter e intraespecficas na macro e microestrutura cromossmica, alm da
anlise da variabilidade gentica deste grupo, buscando uma melhor compreenso e das relaes gentica e
evolutiva, alm de auxiliar a taxonomia deste importante grupo de vertebrados.

PALAVRAS-CHAVE (trs)
Peixes, citogentica, polimorfismo
INTRODUO (tema/objetivos/hipteses/justificativa)
A regio Neotropical engloba a Amrica do Sul, que possui a maior fauna de peixes de gua doce
conhecida (Graa e Pavanelli, 2007). Os Characiformes representam um grupo dominante entre os peixes de
gua doce da Amrica do Sul, com 18 famlias e cerca de 270 gneros (Nelson, 2006). Dentro desta ordem
destaca-se a famlia Characidade, com 1092 espcies validadas at o presente momento (Eschmemeyer e
Fong, 2015). Considerado um dos gneros mais especiosos em Characidae, Astyanax aloca aproximadamente
207 espcies vlidas de acordo com Froese & Pauly (2015). O fato de ocuparem uma posio bsica na
filogenia dos vertebrados, de constiturem um grande nmero de espcies dentro desse grupo e de estarem
distribudos por uma enorme diversidade de habitats, os torna um material bastante favorvel para a
abordagem de questes evolutivas (Nelson, 2006).
Uma reviso feita por Arai (2011) mostrou que, at esta data, eram conhecidos os nmeros haplides
e/ou diplides de 3.425 espcies, distribudas em 53 ordens e 269 famlias. Contudo, este nmero representa
apenas 12% de toda a diversidade de espcies de peixes. Estas anlises evidenciam uma grande variabilidade
cromossmica, com a presena de cromossomos supranumerrios, diferentes mecanismos de determinao
cromossmica sexual, diversidade cromossmica na localizao de regio (es) de organizadores nucleolares e
diversidade no padro de distribuio da heterocromatina constitutiva.

Segundo Artoni e Matiello (2003), os Characiformes (a maioria dos peixes de escamas sul-americanos)
exibem um padro de diversificao cromossmica, em especial ateno famlia Characidae (ex. Astyanax;
lambaris), mostrando uma grande variabilidade interpopulacional quanto ao nmero e estrutura
cromossmica, provavelmente em decorrncia de um estilo de vida mais sedentrio, propiciando tal
diversificao entre populaes isoladas. Segundo Artoni, Vicari e Bertollo (2000), observam-se grupos com
caritipo bastante heterogneo, ao lado de outros bem mais conservados na estrutura cariotpica.
Segundo Pacheco et al (2010), em um trabalho feito no lago Guaba (Brasil), a respeito da espcie
Astyanax jacuhiensis, da famlia Characidae, foi encontrado o nmero diploide de cromossomos igual a 50.
Resultado parecido com o encontrado por Santos e Morelli (2006), mas este observou caractersticas quanto a
organizao cariotpica e posies da Ag-NOR em espcies distintas. Martinez et al (2012), em um trabalho
encontrou resultados que diferiam quanto ao nmero diploide em duas espcies diferentes de Characidae,
2n=52 e 2n=50, Astyanax altiparanae e Hyphessobrycon eques respectivamente. No trabalho feito por Peres
(2005) foi usado uma maior gama de variedade e mais espcies e foi encontrado variaes desde 2n=50 at
2n=58 e ainda assim com mais de dez formas cariotpicas distintas.
Diante do exposto e a diversidade cariotpica encontrada em exemplares da famlia Characidae, o presente
trabalho tem como objetivo caracterizar citogeneticamente, espcies de peixes de pequeno porte da famlia
Characidae, quanto ao nmero e morfologia de cromossomos, atravs de colorao convencional pelo
Giemsa, bandeamento cromossmico e identificao dos cromossomos portadores da NOR e heterocromatina
constitutiva (banda C).

MTODO (sujeitos/instrumentos/procedimentos)
Para a realizao do presente estudo foram coletados 11 exemplares de Astyanax sp (7 fmeas e 4 machos)
no rio Pardo, regio sudoeste da Bahia (153634.49 S, 401212.92). Todos os exemplares coletados foram
fixados em formol 10% e conservados em lcool 700. Alguns exemplares foram encaminhados ao Museu de
Ictiologia do Nupelia da Universidade Estadual de Maring/Pr para identificao (Figura 1). Os demais foram
depositados na coleo do Museu de Zoologia do Instituto Multidisciplinar em Sade da Universidade Federal
da Bahia.

Figura 1: Exemplar de Astyanax sp.

Mtodo para obteno de cromossomos mitticos
Suspenso Celular
Para a obteno de um maior nmero de figuras mitticas nas preparaes foi utilizada a tcnica que
consistiu em injetar previamente nos animais uma soluo imunoestimulante (Molina et al., 2010)

As clulas mitticas foram obtidas a partir do rim, sendo utilizada, preferencialmente, a poro
posterior, devido ao fato dos resultados terem sido mais satisfatrios em relao ao nmero de metfases
obtidas nas preparaes.
O procedimento utilizado foi descrito por FORESTI et al. (1981), e consistiu em:
a) Injetou-se intraperitonialmente colchicina (0,05%) na proporo de 1 ml para cada 100 g de peso do
animal e deix-lo em aqurio por 50 minutos;
b) O animal foi sacrificado e o rim posterior foi coletado;
c)

Colocou-se o tecido retirado em uma placa de Petri contendo 4 a 6 ml de soluo hipotnica (KCL
0,075 M), dependendo da quantidade de tecido que possa ser retirado;

d) O material foi dissociado at a obteno de uma suspenso de clulas. Para que isso possa ser
possvel, o material foi separado com auxlio de pinas e depois homogeneizado com uma pipeta
Pasteur;
e) A suspenso da placa de Petri foi retirada e colocada em um tubo de centrfuga; este tubo foi deixado
no interior de uma estufa a 370 por 21 minutos;
f)

O tubo foi retirado da estufa, colocou-se 5 gotas de fixador gelado e previamente preparado (metanol
+ cido actico na proporo de 3:1, respectivamente). Agitou-se levemente com uma pipeta Pasteur
e deixado para repousar por 5 minutos em temperatura ambiente;

g) 6 ml de fixador foi adicionado e novamente agitado com pipeta Pasteur e ento centrifugado a 800900 rpm por 10 minutos;
h) Repetiu-se o item g por trs vezes, centrifugando por 7 minutos; e o sobrenadante foi descartado.
i)

Aps a ltima centrifugao eliminou-se o sobrenadante e 1 a 3 ml de fixador gelado foi adicionado;

j)

2 gotas desta suspenso foi pingada em uma lmina, e deixada para secar a temperatura ambiente;

k) A lmina foi corada com Giemsa, diludo a 5% em tampo Fosfato (pH 6.8) durante 10 minutos;
l)

E em seguida lavada em gua corrente e secada a temperatura ambiente.

Regies Organizadoras de Nuclolos (NOR)

Para deteco das regies organizadoras de nuclolos, utilizando nitrato de prata foi utilizada a metodologia
descrita por HOWELL e BLACK (1980), com algumas modificaes como segue:
a) Primeiramente, pingou-se sobre a lmina 2 gotas de soluo aquosa de gelatina em trs diferentes
pontos.
b) Em cada um desses pontos foi adicionada 1 gota de gua destilada. E em seguida mais 2 gotas de
Nitrato de Prata (AgNO3).
c)

A lmina, ento, foi levada para o banho-maria a 60C por aproximadamente 5 minutos, at adquirir
uma colorao caramelada.
Por fim, lavada com gua destilada, deixada para secar ao ar, e analisada em microscpio.
Montagem de Caritipo
Os cromossomos foram classificados em metacntricos (m), submetacntricos (sm), subtelocntricos
(st) e acrocntricos (a), de acordo com o mtodo de Levan, et al (1964) para montagem dos caritipos.

RESULTADOS PROPOSTOS/ALCANADOS
Foram realizadas contagens de 260 metfases, sendo encontrado um nmero diploide igual a 50
cromossomos, com a seguinte frmula cariotpica: 4m + 17sm + 1st + 3a. A colorao por AgNOR evidenciou
um sistema de NOR-simples, com marcaes em 2 cromossomos, na poro terminal do brao longo de um
par de cromossomos submetacntricos (figura 2).

Figura 2

- Cariotipo de Astyanax sp, em destaque o par da NOR

CONCLUSES
O nmero diploide encontrado para os exemplares de Astyanax sp analisados neste trabalho o mais
frequentemente encontrado para este gnero. PERES (2005) realizou um trabalho na bacia do Rio So
Francisco, caracterizando algumas espcies de Astyanax, dentre elas o A. lacustres, A. altiparane e A.
scabripinnis, e as 3 espcies compartilham o nmero diploide igual a 50. Kavalco e Toledo (2008) encontraram
resultados diferentes e mais variveis, com o nmero diploide variando de 46 a 50 cromossomos em Astyanax
aff. fasciatus. Pacheco (2010) fez um estudo citogentico em Astyanax jacuhienses no lago Guaba, Brasil, o
caritipo montado consistia em 2n=50. Yano (2011) estudou Astyanax aff. paranae, A. fasciatus, A.
altiparanae obtidos dos riachos Pindorama e Lopei, na bacia do alto rio Paran, os resultados foram diversos,
o A. fasciatus e A. altiparanae apresentaram nmero diploide de 50 cromossomos, enquanto o Astyanax aff.
paranae apresentou 48 cromossomos. Analisando esses dados da observa-se uma grande predominncia do
nmero diploide de indivduos pertencentes ao gnero Astyanax, no presente trabalho foi encontrado 2n=50,
convergindo com a maioria dos casos expostos, caracterizando um padro ligado ao gnero.
A anlise da estrutura cariotpica dos exemplares estudados neste trabalho difere daqueles observados
para outras espcies pertencentes ao gnero Astyanax. No trabalho de Peres (2005), a frmula cariotpica das
espcies estudas so distintas, A. lacuris com 8m+20sm+16st+6a, A. altiparanae apresenta
8m+20sm+12st+10a e o A. scabripinnis 6m+26sm+10st+8a. Santos e Morelli (2006) em uma comparao entre
duas populaes de Astyanax scrabipinnis obteve duas frmulas diferentes, uma com 8m+22sm+12st+8a, a

outra populao tem 6m+26sm+10st+8a. Silva (2014) ao analisar A. paranae, A. bockmanni, A. fasciatus e A.
altiparanae observou a mesma frmula cariotpica em (8m+12sm+14st+16a) em todas as amostras. O
resultado encontrado no presente trabalho, 8m+34sm+2st+6a, no se aproxima de nenhum resultado exposto
acima. Os dados evidenciam uma grande diversidade de frmulas de caritipos para um mesmo gnero, esse
fato pode ser explicado por rearranjos no-Robertsonianos durante o processo evolutivo do gnero, gerando
variaes inter e intraespecficas que se fixaram ao longo da histria evolutiva desse grupo.
A tcnica para deteco de regies organizadoras de nuclolos (NOR) com nitrato de prata, evidenciou
um padro de NOR simples. Na literatura pode-se verificar uma variedade nesse padro em espcies do
gnero Astyanax. Fernandes e Martins-Santos (2006) revelaram colorao por nitrato de prata em um ponto
terminal no brao longo do par 12, encontrado em todas as metfases, alm de outros pontos que apareciam
ao acaso em outros cromossomos de Astyanax fasciatus da bacia do alto rio Paran. PACHECO (2010)
encontrou um padro AgNOR de 2 a 5 cromossomos marcados por metfase. Giongo et al (2014) realizou
estudos com Astyanax asuncionensis na microbacia do rio Sepotuba (Alto Paraguai) e encontrou marcaes de
1 a 2 cromossomos por metfases, em regies do brao curto em submetacntricos. Quando se trata das
regies organizadoras de nuclolos os resultados na literatura so bem diversificados, neste trabalho foi
entrado um padro de 1 par por metfase, o que vai de encontro com alguns dos resultados expostos. Essas
variaes no padro de NOR em peixes podem ser oriundos de eventos de transposies, mas tambm h
processos de rearranjos cromossmicos e permutao de stios ribossomais que podem ser responsveis por
polimorfismos de regies organizadoras de nuclolos em peixes.
Os dados apresentados at o momento para os exemplares do gnero Astyanax tm sugerido um certo
conservadorismo quanto ao nmero diploide para as espcies. No entanto, tem sido evidenciada uma ampla
variabilidade quanto a frmula cariotpica, bem como nas marcaes de AgNOR. H necessidade de ampliao
em estudos citogenticos e moleculares que auxiliem na compreenso dos eventos cromossmicos que
estejam envolvidos na histria evolutiva deste grupo.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS E OUTRAS

ARTONI. R.F.; VICARI. M.R. e BERTOLLO, L.A.L. (2000). Citogenetica de peixes neotropicias: mtodos, resultados e
perspectivas. Biological and Health Sciences, 6(1): 43-60
ARTONI. R. F. e MATIELLO, M.C.A. Gentica de peixes neotropicais. I. Aspectos da conservao gentica dos
peixes no Parque Estadual de Vila Velha, Paran, Brasil. Publ. UEPG Ci. Biol. Sade, Ponta Grossa, 9 (2): 7-15, jun. 2003
FORESTI, F.; ALMEIDA TOLEDO, L.F & TOLEDO-FILHO, S.A. Polimorphic nature of nucleolus organizer regions in fishes.
Cytogenet. Cell. Genet., 31: 137-144, 1981
FROESE, R. & PAULY, D. (2015). FishBase. http://www.fishbase.org. Acessed in july 2015.
GIONGO, P.; SAMPAIO, W. M.S.; FERNANDES, A. DERGAM, J.A.; KAVALCO, F. K.; PAZZA, R. Diversidade cariotpica de
"Astyanax asuncionensis" (Teleostei, Characiformes) na microbacia do rio Sepotuba (Alto Paraguai). Tese de Doutorado.
Universidade Federal de Viosa. 3(2): 53-58. 2014.
HOWELL, W.M.; BLACK, D.A. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer:
a l-step method. Experientia, v.36, p.1014-1015, 1980.
KAVALCO, KF; ALMEIDA-TOLEDO LF. Molecular Cytogenetics of blind mexican tetra comments on the karyotypic
characteristics of genus Astyanax (Teleostei, Characidae). Zebrafish. v. 4, p 103 111. 2007
LEVAN, A.; FREDGA, K.; SANDBERG, A. A. Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas 52: 201-220.

1964
MARTINEZ, Emanuel RM et al. Cytogenetic analysis in the incertae sedis species Astyanax altiparanae Garutti and Britzki,
2000 and Hyphessobrycon eques Steindachner, 1882 (Characiformes, Characidae) from the upper Paran river basin.
Comparative cytogenetics, v. 6, n. 1, p. 41, 2012.
NELSON, J. S. (2006). Fishes of the world. 4th Edition. New York, John Willley & Sons, Inc. 601.
PACHECO, Rosiley B. et al. Cytogenetic data on Astyanax jacuhiensis (Characidae) in the lago Guaba and tributaries, Brazil.
Neotropical Ichthyology, v. 8, n. 3, p. 667-671, 2010.
PERES, W.A.M.; Evoluo, e. Anlise da diversidade cariotpica de characidae da bacia do so francisco. 2005
SANTOS, Ana Cristina dos; MORELLI, Sandra. Comparao citogentica de duas populaes de Astyanax scabripinnis
(Pisces, Characidae) da regio do Tringulo Mineiro. Biosci. j, v. 22, n. 1, p. 145-150, 2006.
SILVA, Dulio Mazzoni Zerbinato de Andrade. Estrutura molecular e citogentica de cromossomos B em Astyanax paranae
(Characiformes, Characidae). 2014.
YANO, C. F.; Citogentica em peixes de cabeceiras de dois riachos pertencentes bacia do Alto rio Paran, regio de
Toledo (PR). 2011. Dissertao (Mestrado em Recursos Pesqueiros e Engenharia de Pesca) Centro de Engenharia e
Cincias Exatas. Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE)

ANEXOS (se houver)

PARTICIPAO EM EVENTOS CIENTFICOS, TECNOLGICOS OU DE INOVAO
Durante o perodo de abrangncia deste relatrio parcial no houve a participao em reunies cientficas e
publicaes

ANLISE DE DESEMPENHO DO BOLSISTA

ASPECTOS
Qualidade do trabalho: considerar a
qualidade do trabalho, tendo em
vista as condies oferecidas
Dedicao: esforo revelado para
aprender, a partir de indagaes e
dvidas apresentadas
Assiduidade: cumprimento do plano
de trabalho com dedicao e zelo
Rendimento:
considerar
o
cumprimento do plano de trabalho
de acordo com os prazos

ADEQUADO

PARCIALMENTE
ADEQUADO

INADEQUADO

estabelecidos
OBSERVAES DO ORIENTADOR
Sem consideraes at o momento.

AVALIAO DO ALUNO EM RELAO AO PIBIC

Sugesto de estrutura: descrever de forma sucinta a viso analtica do bolsista em relao ao
Programa de Iniciao Cientfica, destacando dificuldades, pontos positivos, integrao no grupo de
pesquisa onde o trabalho estava inserido, relao com colegas e orientao, e qualquer outra
percepo tida em relao ao programa.
Atravs do presente programa fui inserido no grupo de Pesquisa em Gentica do IMS/CAT/UFBA. Durante o
perodo de abrangncia desta bolsa aprendi muitas tcnicas e desenvolvi a capacidade de trabalhar em
equipe, uma vez que todas as atividades no laboratrio exigem a participao de todos. Ainda tive a
oportunidade de ler muitos artigos cientficos, e participar de palestras do laboratrio, o que contriburam
significativamente para o meu crescimento acadmico.

PARECER FINAL DO ORIENTADOR

( X )APROVADO SEM MODIFICAES

( )APROVADO COM MODIFICAES

LOCAL: Vitria da Conquista

( )REPROVADO

DATA: 04/08/2015
Declaro estar ciente e concordar, para todos os
efeitos legais, com as informaes contidas neste
relatrio.

____________________________________
Assinatura do(a) Orientador(a)

__________________________________
Assinatura do(a) Bolsista

PARECER DA INSTITUIO COTISTA:

__________________________________________
Assinatura da Coordenao PIBIC