MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

INFORME N4
BIOSORCION DE Cu(II) POR Botryococcus
braunii.
Facundo Koss

1.

Introduccin

2.

En la Argentina las principales fientes

de contaminacin de los cursos de
aguas naturales estn constituidas por
los basurales a cielo abierto y po los
vertidos de efluentes industriales y
cloacales sin o con escaso tratamiento.

3.

Los metales pesados no se degradan

en el ambiente y suelen ser toxicos
para la mayora de los
microorganismos usados en
tratamientos convencionales de
efluentes, estando adems presentes
en grandes volmenes y pequeas
concentraciones, por lo cual su
remocin presenta dificultades
considerables.

4.

5.

La biosorcion utiliza la capacidad de la

biomasa de acumular metales pesados
y es considerado como un mtodo
competitivo, efectivo y de gran
atractivo econmico.
Botryococcus braunii es un alga
colonial planctnica del grupo de las
Chlorococcales que habita en aguas
dulces y es de distribucin mundial.
Esta alga posee la capacidad para
sintetizar hidrocarburos, revertir
condiciones acidas de un lecho o
efluente, y adems de remediar la
presencia de metales pesados.

6.

Objetivos

7.

Interiorizarse en la utilizacin de
microorganismos con fines
biotecnolgicos, realizando la
biosorcion de cobre por la utilizacin
del alga B. braunii.

8.

Materiales y Mtodos

9.

La experiencia consta de la
determinacin de cobre adsorbido por
el alga B. braunii. Se sembrara e
incubara el alga, y una vez alcanzada

una cantidad de biomasa considerable

se inoculara una solucin de cobre
para generar una concentracin de
5ppm. Se tomaran muestras a distintos
intervalos de tiempo, se separara por
centrifugado la biomasa del cobre en
solucin, y mediante
espectrofotometra y una curva de
calibracin se determinara la
concentracin de cobre sin adsorber.
10. Adems se tomaran muestras en cada
intervalo de tiempo para determinar el
crecimiento del alga. Esto tambin se
realizara por espectrofotometra,
relacionando la absorbancia medida
con el grafico de crecimiento aportado
por la ctedra, y as determinar la
cantidad de biomasa en mg.
11.
11.1.
cultivo

Preparacin del medio de

12. Para el crecimiento de B. braunii se

prepararon 400ml de medio de cultivo
sinttico Bold Basal Medium (BBM) a
partir de los macro nutrientes,
soluciones y metales correspondientes.
Luego se trasvasaron 150ml del
preparado a cada uno de dos
erlenmeyers. Luego de esto se los llevo
a esterilizacin en autoclave.
13.
13.1.
Preparacin de reactivo
colorimtrico
14.
15. Se utilizo el reactivo colorimtrico dietil
ditiocarbamato de sodio (DDTC-Na)
para determinar la concentracin de
cobre en solucin. El mismo se preparo
a partir de la sal del mismo nombre
diluida en etanol 50%. Este reactivo
toma una coloracin anaranjada, y su
intensidad es proporcional a la
cantidad de cobre en solucin.
16.
16.1.
Determinacin de la curva de
calibracin
17.

18. Para poder determinar la

concentracin de cobre en solucin por
colorimetra fue necesario a priori
realizar esta curva de calibracin que
nos permite asociar los valores de
absorbancia obtenidos con una
concentracin determinada.
19. Para construir esta curva, a partir de
una solucin madre de cobre de
concentracin conocida, se prepararon
por dilucin seriada con H2SO4 (10-3M)
soluciones de distintas
concentraciones de cobre. Se agrego
reactivo colorimtrico para relacionar
concentracin de cobre con
absorbancia. Los volmenes utilizados
se especifican a continuacin en la
Tabla 1.
20.
21.
22.
23.
24. Cu
25. H2SO
26. DDT
100
C-Na
4(10
3
ppm
M)
(ml)
(ml)
(ml)
28. 9
29. 1

27. 0

30.
33.
36.
39.
42.

0.05
0.2
0.3
0.5
0.7

31.
34.
37.
40.
43.

8.95
8.8
8.7
8.5
8.3

32.
35.
38.
41.
44.

1
1
1
1
1

45.

Tabla 1. Volmenes necesarios para realizar

soluciones a distintas concentraciones de
cobre.

46.
47. Una vez preparadas las soluciones con
concentraciones de cobre conocidas,
mediante la tcnica de
espectrofotometra a 440nm, se
determinaron las absorbancias para
cada concentracin de cobre. Los
valores obtenidos se expresan a
continuacin en la Tabla 2.
48.
49. Co final
50. Absorban
de Cu
cia (440
(ppm)
nm)
51. 0
52. 0
53. 0.5
54. 0.099
55. 2
56. 0.465
57. 3
58. 0.566
59. 5
60. 0.876
61. 7
62. 1.034
63.

Tabla 2. Absorbancias medidas para cada

concentracin de Cu.

64. A partir de estos datos se realizo el

Grafico 1 que representa la curva de
calibracin. A partir de la ecuacin
aproximada de esta curva se
determino la concentracin de cobre
en funcin a la absorbancia medida.
65.

66.

1.5
1

Absorbancia

f(x) = 0.15x + 0.07

0.5 R = 0.97
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8

C oncentracion de C u (ppm)

67.
68.
69.
70.

Grafico 1. Curva de calibracin de cobre

71.
71.1.
Determinacin de cobre en
solucin
72.
73. Se tomaron muestras de la solucin
que contiene el alga mas solucin de
cobre a distintos intervalos de tiempo.
Estas muestras se trasvasaron a dos
tubos Ependorf para su posterior
centrifugado. Una vez finalizado este
proceso, se separo el sobrenadante,
que contiene solo cobre en solucin,
para determinar la concentracin del
mismo. Esto se realizo realizando la
misma tcnica de diluciones seriadas
que para la curva de calibracin. Luego
de esto se determino la absorbancia
para cada solucin.
74. Para determinar la cantidad de cobre
adsorbido por el alga a cada tiempo se
utilizo la siguiente Ecuacin 1.

Ci Ceq *V
mb

75.
76.

77.

Ecuacin 1. Ecuacin para determinar la

cantidad de cobre adsorbido
78.

79.
80. Donde Ci es la concentracin inicial de
cobre, Ceq es la concentracin de
cobre en equilibrio, V el volumen de la
muestra inicial y mb es la masa seca
del biosorbente.
81.
82.
83.
84.
84.1.
Determinacin de biomasa
seca
85.
86. En los mismos intervalos de tiempo
que para la determinacin de cobre en
solucin, se tomaron muestras para
determinar el peso seco de la biomasa.
La muestra tomada fue trasvasada a
un Ependorf, para su posterior
determinacin de absorbancia. A partir
de
los
valores
de
absorbancia
obtenidos y utilizando la curva de
crecimiento aportada por la catedra,
Grafico 2, se determino el peso seco
de la biomasa.
87.

3
4

88.

D.O

117. Tabla 3. Masa de biomasa calculada a partir de

la absorbancia.
118.
119.

f(x) = 0.01x + 0.27

R = 0.98

0.5
0
0

10

20

30

40

Masa (mg)

89.
90.

Grafico 2. Curva de densidad ptica versus

masa, aportada por la ctedra.

91.
92. Resultados
92.1.
Determinacin de peso seco
de biomasa
93.
94. A partir de los valores obtenidos de
absorbancia para cada muestra en
cada intervalo de tiempo, utilizando la
curva de crecimiento Grafico 2, se
obtuvieron los valores de peso seco en
mg en cada intervalo de tiempo. Los
resultados se muestran en la Tabla 3.
95.
98. M
96. Ti
a
e
s
m
a
p
o
(
m
in
)

99. 0

102.1
5

105.2
5

108.6
0

111.9
0
114.1
2
5

97.
A

100.
0

103.
0

106.
0

109.
0

112.
0
115.
0

(
m
g
)
101.1
.
2
5
0
3
104.1
.
0
0
8
2
107.1
.
4
2
3
3
110.2
.
2
7
0
7
113.2
.
3
2
2
6
116.2
.
2
5

50

60

119.1.
Determinacin de cobre en
solucin
120.
121.
122.Se procedi de la misma manera que
70 para la determinacin de la biomasa
seca (seccin 4.1.), utilizando la
ecuacin de la curva de calibracin
para determinar la concentracin de
cobre remanente en solucin. A esta
concentracin se la multiplico por el
factor de dilucin para determinar la
concentracin real. Los resultados se
exponen en la siguiente Tabla 4.
123.
124.
125.Tiem
126.Abs
127.Co
po
de
(min
Cu
)
(pp
m)
128.0
129.0.33
130.5.97
8
37
131.15
132.0.25
133.4.19
8
47
134.25
135.0.19
136.4.32
9
42
137.60
138.0.24
139.5.85
5
85
140.90
141.0.26
142.4.43
9
94
143.125
144.0.27
145.4.57
5
28
146. Tabla 4. Concentraciones de Cu remanente en
solucin en cada intervalo de tiempo.
147.
148.

149.A partir de los concentraciones en

equilibrio obtenidas, y mediante la
aplicacin de la Ecuacin 1, se
obtuvieron los diferentes valores de q
en cada intervalo de tiempo. Los
resultados se expresan en la Tabla 5,
y se representan grficamente en el
Grafico 3.
150.
151.T
152.
i
q
e
m
p
o
(
m
i
n
)
153.0
154.
0
155.1
156.
5
259
157.2
5

158.
170

159.6
0

160.
7.4

161.9

162.

0
163.1
2
5

97.
164.
91.

165. Tabla 5. Cobre adsorbido (q) por el alga a cada

tiempo.
166.
167.
168.

300
200
q (Ecuacion 1)

100
0
0

50

100

150

Tiempo (min)

169.
170. Grafico 3. Cobre adsorbido (q) en funcin del
tiempo.
171.
172.

173.
Observaciones
174.
174.1.
Determinacin de peso seco
de biomasa
175.
176.Los valores obtenidos a partir de la
ecuacin de la recta del Grafico 2,
estn determinados por 1000ml de
solucin. Estos valores se ajustaron al
volumen de nuestra muestra original
que fue de 147ml.
177.
178.Debido a que el alga tiene una cintica
de crecimiento que demanda mucho
ms tiempo que el que le dimos
durante esta experiencia, podemos
observar que los valores de peso seco
de biomasa no varan demasiado.
179.
179.1.
Determinacin de cobre en
solucin
180.
181.Analizando los valores de la Tabla 4,
podemos ver que la concentracin

196.
197.
198.

inicial de cobre en solucin, tiempo 0,

es un valor cercano al esperado (5
ppm). Esto indica que la solucin
madre
de
cobre
estaba
a
la
concentracin
que
indicaba
su
preparado, y que las diluciones se
realizaron correctamente.
182.
183.Se observa adems fluctuaciones en
los valores de concentracin de cobre
en solucin, esto se debe a que la
adsorcin del alga ocurre en un
equilibrio. Por momento es alga
desprende algo del cobre ya adsorbido.
Es importante notar que en ningn
momento se supera el valor de cobre
inicial, lo que hace suponer que los
resultados obtenidos son correctos.
184.
185.Observando los valores de la Tabla 5 y
el Grafico 3, podemos observar que la
adsorcin de cobre tiene un pico muy
alto al tiempo de 15 minutos, y luego
baja estabilizndose. El descenso
observado en el tiempo 60 minutos se
explica por el gran desprendimiento de
cobre adsorbido que se produjo en ese
tiempo, que tambin se observa en la
Tabla 4.
186.
187.
188.
189.
190.
191.
Conclusiones
192.
193.El objetivo de esta experiencia se
alcanzo satisfactoriamente, haciendo
posible llevar a cabo una tcnica con
grandes aplicaciones a nivel ecolgico.
194.
195.Si bien los resultados obtenidos
esquematizan el comportamiento y las
propiedades del alga que se estudio
durante
la
experiencia,
resulta
evidente que para obtener aun
mejores resultados se necesita de ms
tiempo, ya sea para la incubacin del
microorganismo
como
para
los
intervalos de tiempo de toma de
muestras.

199.