130499

EXPLORACIN DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS DE EXTRACTOS
VEGETALES A PARTIR DE Calndula officinalis Y Tropaeolum majus Y SU USO

POTENCIAL EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS Y COSMTICA
LORENA MARIA ACOSTA ABRIL
TRABAJO DE GRADO
DIRECTOR: CLEMENTINA CUETO VIGIL

MICROBIOLOGA , MSc en Ciencias
UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERA
INGENIERA DE PRODUCCIN AGROINDUSTRIAL
LNEA DE INVESTIGACIN: FERMENTACIONES
BOGOT, D.C.
2006
Nota de aceptacin:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
__________________________________________
PRESIDENTE DEL JURADO
__________________________________________
JURADO
__________________________________________
JURADO
Bogot, D.C., Noviembre de 2006
La biodiversidad, aquella til biotecnolgicamente, necesita la existencia de la
especie, pero tambin quin sepa describirla y quien sepa transformarla en unas
necesidades especficas.
Carlos Eduardo ngel Villegas, 2004

Coordinador de proyectos e investigador del
Instituto de Estudios Ambientales
Universidad Nacional de Colombia
AGRADECIMIENTOS
A mis padres, Inirida y Oscar porque sin su amor, apoyo, dedicacin y respaldo no
podra alcanzar los objetivos propuestos en el transcurso de mi vida.
A Clementina Cueto, directora y consejera, por su gua y constancia en el desarrollo

de este trabajo, por compartir sus conocimientos y brindarme apoyo constante en
la elaboracin del mismo.
A mis hermanas, Gina y Juanita por su cario incondicional.
A Mateo, una inspiracin de mi vida.
A Diego, por su amor incondicional y su empeo por ayudarme a lograr lo que me

he propuesto.
A la Lnea de Investigacin de Fermentaciones de la Facultad de Ingeniera,

Universidad de La Sabana por patrocinar este trabajo, a la Universidad misma por
ser centro de desarrollo intelectual y personal, por sus maravillosas instalaciones, y
por promover y cultivar mi aprendizaje en los ltimos 6 aos; al equipo de trabajo
de laboratorios de Ingeniera por su colaboracin y participacin en el desarrollo
de la etapa experimental de este proyecto de grado.
CONTENIDO
Pg.
INTRODUCCIN .
19
1. OBJETIVO GENERAL ...
21
1.1. OBJETIVOS ESPECFICOS ....
21
1.1.1. Fase I
21
1.1.2. Fase II .
21
1.1.3. Fase III
21
2. MARCO TERICO
22
2.1. Colombia y su biodiversidad .
22
2.2. Investigacin en Colombia .
23
2.2.1. Especies vegetales silvestres .
24
2.2.1.1. Calndula officinalis L.
24
2.2.1.2. Tropaeolum majus
25
2.3. Antimicrobianos naturales .
25
2.3.1. Fito antimicrobianos
26
2.3.1.1 Fitofenoles ..
27
Mtodos de extraccin .....
27
Espectro antimicrobiano .
27
Mecanismos de accin ..
27
2.3.1.2. Saponinas ..
28
Mtodos de extraccin ..
28
Pg.
Espectro antimicrobiano y mecanismos de accin ...
29
2.3.1.3. Flavonoides .
29
Mtodos de extraccin .......
30
Espectro antimicrobiano y mecanismos de accin
31
2.3.1.4. Glucosinolatos ..
31
Mtodos de extraccin .....
32
Espectro antimicrobiano y mecanismos de accin ...
32
2.3.1.5. Carotenoides ..
32
2.4. Trabajos con extractos vegetales ....
34
2.5. Trabajos especficos con Calndula officinalis L. y Tropaeolum
majus ..
37
2.6. Regulacin, seguridad y estandarizacin de productos de origen

botnico .....
40
2.7. Microorganismos indicadores ............................................................................
43
3. MATERIALES Y MTODOS ...
45
3.1. Fase I: Obtencin de Extractos
45
3.1.1. Material vegetal
45
3.1.2. Mtodo de extraccin .
46
3.1.3. Diseo experimental Fase I
47
3.1.4. Cuantificacin de los extractos ..
48
3.1.4.1. Maceracin ..
48
Pg.
3.1.4.2. Rotoevaporacin
49
3.2. Fase II: Evaluacin de la actividad antimicrobiana y determinacin de

la capacidad bactericida o bacteriosttica y fungicida de los extractos .
50
3.2.1. Microorganismos indicadores .
50
3.2.2. Ensayo microbiolgico ..
50
3.2.3. Diseo experimental Fase II ..
56
3.2.4. Evaluacin de la actividad antibacteriana y antifngica ..
57
3.2.4.1. Mtodo de difusin por disco
57
3.2.5. Determinacin de la actividad bactericida o bacteriosttica y

fungicida o fungisttica
59
3.2.5.1. Mtodo del tubo pequeo ...
59
3.3. Fase III: Aplicacin de los extractos en sistemas In Vivo .
60
3.3.1. Material de ensayo .
60
3.3.2. Mtodos de aplicacin ..
61
3.3.2.1. Aplicacin de los extractos acuosos como conservantes naturales

en pulpa de frutas ..
61
3.3.2.2. Aplicacin de los extractos etanlicos en jabn gel antibacterial

para su uso sin enjuague ...
61
4. RESULTADOS Y ANLISIS .
63
4.1. Fase I: Obtencin de los extractos ...................................
63
4.2. Fase II: Evaluacin de la actividad antimicrobiana ..
64
Pg.
4.2.1. Evaluacin de la actividad antimicrobiana y antifngica .
64
4.2.1.1. Mtodo de difusin por disco
64
4.2.2. Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria, la actividad

bactericida o bacteriosttica y fungicida o fungisttica .
80
4.2.2.1 Determinacin de la actividad bactericida o bacteriosttica y

fungicida o fungisttica por medio del mtodo del tubo pequeo .....
80
4.2.2.2. Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) ..
84
4.3. Fase III: Aplicacin de los extractos ....
86
4.3.1. Aplicacin de los extractos acuosos como conservante natural en

pulpa de frutas ..
86
4.3.2. Aplicacin de los extractos etanlicos como jabn-gel antibacterial

para su uso sin enjuague
89
5. CONSIDERACIONES FINALES ..
93
6. CONCLUSIONES
95
RECOMENDACIONES
97
BIBLIOGRAFA
99
ANEXOS ..
106
LISTA DE TABLAS
Pg.
Tabla 1. Posicin mundial de Colombia en biodiversidad
22
Tabla 2. Resultados obtenidos despus de la evaluacin de actividad

antimicrobiana determinando la concentracin mnima inhibitoria (CMI)
de cuminaldehdo aislado .
34

antimicrobiana de los extractos etanlicos, etreos, acuosos y en acetato
de etilo de Drimys granadensis frente a indicadores Gram positivos,
Gram negativos, hongos y levaduras ..
35

antimicrobiana determinando la concentracin mnima inhibitoria (CMI)
de anetol aislado a partir de extractos alcohlicos de ans estrellado
(Illicium verum) y un patrn de acetol de Merck .
35

antimicrobiana de amplio espectro de los extractos combinados de
canela y cebollin chino con diversos tratamientos .
36
Tabla 6. Resultados obtenidos despus del estudio comparativo y

sinrgico entre varias especias y Bifidobacterium longum contra el
crecimiento de E. coli O157:H7 en la carne molida ..
36

antimicrobiana de aceites esenciales obtenidos a partir de canela, clavo
de olor, limonaria, mostaza, naranja, salvia, tomillo y romero contra los
hongos presentes en el pan de centeno: P. roqueforti, P. corilofilum, A.
flavus
37
Tabla 8. Determinaciones analticas del contenido del extracto acuoso de

Calndula officinalis .
Tabla 9. Tabla de muestras obtenidas. Frecuencia de agitacin: 200 rpm.
Tiempo de extraccin: 24 horas
Tabla 10. pH de extractos vegetales de Calndula officinalis y
Tropaeolum majus
Tabla 11. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso
de Calndula officinalis a diferentes concentraciones, obtenido a 25C,
por el mtodo de tubo pequeo .
9
38
48
64
81
Pg.
de Calndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50C por
el mtodo de tubo pequeo
81

de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 25C por
81

82
Tabla 15. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae del extracto

etanlico de Calndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido
a 25C, por el mtodo de tubo pequeo .
82
Tabla 16. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto

82

etanlico de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a
25C, por el mtodo de tubo pequeo ..
83

83
Tabla 19. Evaluacin preliminar de la Actividad Bactericida o

Bacteriosttica y Fungicida o Fungisttica de los Extractos acuoso y
etanlicos de Tropaeolum majus y Extractos etanlicos de Calndula
officinalis ......................
Tabla 20. Evaluacin preliminar de la Actividad Bactericida o
Bacteriosttica y Fungicida o Fungisttica del Extracto acuoso de
Calndula officinalis obtenido a 50C ....
Tabla 21. Intervalos de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) de los
extractos de Calndula officinalis y Tropaeolum majus .
Tabla 22. Caractersticas microbiolgicas de una pulpa de frutas
congelada ..
10
84
84
85
Pg.
Tabla 23. Conteo previo y conteo posterior de la carga microbiana
presente en las manos de dos individuos a los cuales se les aplicaron dos
soluciones desinfectantes
90
Tabla 24. Evaluacin preliminar de la capacidad antimicrobiana de los

extracto acuosos y etanlicos a partir de Calndula officinalis y
Tropaeolum majus contra E.coli, S. aureus y S. cerevisiae 106
Tabla 25. Resultados de las mediciones de los dimetros de los halos de
inhibicin formados por cada sendidisco impregnado con el extracto
correspondiente a cada tratamiento 108
por el mtodo de tubo pequeo . 133
el mtodo de tubo pequeo 134
11
Pg.
el mtodo de tubo pequeo .........
139

el mtodo de tubo pequeo ... 139
a 25C, por el mtodo de tubo pequeo . 140
142
12
Pg.
a 50C, por el mtodo de tubo pequeo .... 142
25C, por el mtodo de tubo pequeo .. 144
145

13
Pg.
147
Tabla 57. Clasificacin
y descripcin de los microorganismos
identificados en los frotis de manos .. 149
14
LISTA DE FIGURAS
Pg.
Figura 1. Calndula officinalis .
45
Figura 2. Tropaeolum majus ..
46
Figura 3. Obtencin de los extractos vegetales .
47
Figura 4. Diseo experimental de la Fase I: Obtencin de extractos
48
Figura 5. Curva de crecimiento de Escherichia coli
51
Figura 6. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus
52
Figura 7. Curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae
52
Figura 8. Curva estndar de Turbidez para Escherichia coli .
53
Figura 9. Curva estndar de turbidez para Staphylococcus aureus .
54
Figura 10. Curva estndar de turbidez para Saccharomyces cerevisiae ..
55
Figura 11. Preparacin del inculo
56
Figura 12. Diseo experimental de la Fase II: Evaluacin de la actividad

antimicrobiana y determinacin de la capacidad bactericida o
bacteriosttica y fungicida o fungisttica ...
57
Figura 13. Evaluacin antimicrobiana por el Mtodo de difusin por

disco
59
Figura 14. Evaluacin de la actividad antimicrobiana por el Mtodo del

tubo pequeo ...............
60
Figura 15. Comparacin de Promedios de dimetros de halos de

inhibicin por cada tratamiento aplicado a E. coli, S. aureus y
S. cerevisiae ..
66
Figura 16. Comparacin de promedios por solventes de extractos

aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae .
67
Figura 17. Comparacin de promedios por plantas de extractos aplicados

a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae ..
68
15
Pg.
Figura 18. Comparacin de promedios de la interaccin entre solvente y
planta de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae .
69
Figura 19. Comparacin de promedios de la interaccin entre

temperatura y planta de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S.
cerevisiae. ......................................
70
Figura 20. Comparacin de promedios de la interaccin entre

temperatura, planta y solvente de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y
S. cerevisiae .....................................................
71
Figura 21. Fotografa de los dimetros de inhibicin de crecimiento de E.

coli, obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en Agua a
una temperatura de 50C
72

coli, obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en Etanol
al 95% a una temperatura de 50C. ..
72
Figura 23. Fotografa de los dimetros de inhibicin de crecimiento de S.

aureus, obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en
Agua a una temperatura de 50C ..
73

aureus, obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en
Etanol al 95% a una temperatura de 50C .
73

cerevisiae, obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en
Agua una temperatura de 50C
74

cerevisiae, obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en
Etanol al 95 % a una temperatura de 50C ...
74

coli, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Agua a
una temperatura de 50C
coli, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Etanol al
95 % a una temperatura de 50C
16
75
75
Pg.
aureus, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Agua
a una temperatura de 50C ..
76

aureus, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en
Etanol al 95 % a una temperatura de 50C
76

cerevisiae, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en
Agua a una temperatura de 50C ..
77

aureus, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en
Etanol al 95 % a una temperatura de 50C
77
Figura 33. Comparacin del efecto bioconservante del extracto acuoso

de Calndula officinalis contra E.coli y un Blanco de crecimiento de
E.coli
87
Figura 34. Comparacin del efecto bioconservante del extracto acuoso

de Tropaeolum majus contra S. aureus y un Blanco de crecimiento de S.
aureus
88
Figura 35. Aplicacin del extracto etanlico de Calndula officinalis

obtenido a 50C, en la manos como locin antibacterial despus de un
frotis. Muestra 1
91
Figura 36. Aplicacin del extracto etanlico de Calndula officinalis

frotis. Muestra 2
91
Figura 37. Aplicacin del extracto etanlico de Tropaeolum majus

frotis. Muestra 1
92
Figura 38. Aplicacin del extracto etanlico de Tropaeolum majus

frotis. Muestra 2 .................................
17
92
LISTA DE ANEXOS
Pg.
Anexo 1. Evaluacin preliminar de la capacidad antimicrobiana de los
extracto acuosos y etanlicos a partir de Calndula officinalis y
Tropaeolum majus contra E.coli, S. aureus y S. cerevisiae
106
Anexo 2. Resultados de las mediciones de los dimetros de los halos de

inhibicin formados por cada sendidisco impregnado con el extracto
correspondiente a cada tratamiento 108
Anexo 3. Anlisis de Varianza. ANOVA ..
114
Anexo 4. Tablas de aplicacin de extractos por el mtodo del tubo

pequeo 133
Anexo 5. Clasificacin
y descripcin de los microorganismos
identificados en los frotis de manos .. 149
Anexo 6. Fotografas del conteo previo y post conteo de la aplicacin de
la locin antimicrobiana a partir de Calndula officinalis .... 150
Anexo 7. Fotografas del conteo previo y post conteo de la aplicacin de
152
la locin antimicrobiana a partir de Tropaeolum majus .....
18
INTRODUCCIN
Durante el curso de la historia, se han presentado diferentes avances y
descubrimientos que el ser humano ha puesto al servicio de sus semejantes. Bien
sea investigacin o azar, tales descubrimientos demuestran altruismo, adaptacin y
cuidado de las especies, lo que ha llevado al gnero humano a la cabeza de un
gigante ecosistema. Muestra de lo anterior, es la lucha contra las enfermedades
infecciosas por medio de uno de los ms importantes logros: los antibiticos.
En el siglo XX, como consecuencia del uso de agentes quimioteraputicos, se
produce la resistencia de los microorganismos hacia dichos frmacos, resultado de
procesos naturales mediante los cuales los microorganismos desarrollan tolerancia
a nuevas condiciones ambientales (Pelczar y Chan, 1984). En este contexto,
aquellas sustancias que se han convertido en inefectivas exponen la necesidad de
desarrollar nuevos agentes antimicrobianos que puedan complementarlas y/o
reemplazarlas.
En el siglo XXI, como resultado de experiencias con agentes qumicos, crece la
demanda de productos naturales tanto en el campo de la salud, como en el de la
industria alimenticia y cosmtica. Gracias a las tcnicas microbiolgicas modernas
se ha demostrado que gran variedad de especies vegetales silvestres manifiestan
atributos antimicrobianos.
Especias y hierbas usadas comnmente para reforzar sabor y aroma de los
alimentos, tambin fueron usadas por nuestros antepasados para preservar los
alimentos y con fines teraputicos. Ya en el siglo XIX experimentos cientficos
documentaban las propiedades antimicrobianas de algunas especias, hierbas y sus
componentes (Snyder, 1997).
Aunque actualmente los productos botnicos juegan un papel importante en el
mundo agrcola, cosmtico y de la salud, su participacin sigue siendo mnima y
con informacin limitada dentro de los campos mencionados. Sin embargo, los
productos vegetales presentan un enorme potencial y han contribuido a la
ampliacin de la investigacin agroqumica moderna.
Aparece entonces una nueva gama de productos: los alimentos funcionales. El
trmino de alimento funcional incluye sustancias botnicas que han sido usadas
como suplementos dietarios o como aditivos alimenticios. Estos ltimos llamados
conservantes biolgicos comprenden un amplio grupo de productos naturales a
partir de plantas o microorganismos, que pueden ser tiles para prolongar la vida
til de los alimentos, reduciendo o eliminando las bacterias patgenas e
incrementando la calidad de los productos alimenticios (Draughon, 2004).
19
Debido a la demanda actual de agentes antimicrobianos naturales, tanto

antifngicos como antibacterianos, a la interminable bsqueda de principios
naturales biolgicamente activos (Mukhopadhyay et al., 2001) y con el objeto de
aprovechar racionalmente los recursos naturales presentes en nuestro pas, se
plante el desarrollo de este proyecto.
Por el promisorio potencial antimicrobiano de Calndula officinalis y de
Tropaeolum majus, se propuso determinar la capacidad de inhibicin de sus
extractos etanlicos y acuosos contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Saccharomyces cerevisiae. Se plante para los extractos acuosos una aplicacin en
una matriz alimentaria como es la pulpa de fruta sin conservantes y para los
extractos etanlicos una aplicacin en jabn - gel antibacterial para uso sin
enjuague.
Los trabajos realizados con estas dos especies son muy escasos, por ello, adems de
llevar a cabo un estudio exploratorio y aplicaciones innovadoras con Calndula
officinalis y Tropaeolum majus, se pretendi aportar informacin de inters para
futuros investigadores interesados.
20
1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos y etanlicos de
Calndula officinalis y de Tropaeolum majus.

1.1.
OBJETIVOS ESPECFICOS
1.1.1. FASE I
-
Obtener extractos acuosos y etanlicos a partir de cada especie vegetal:

Calndula officinalis y Tropaeolum majus.
1.1.2. FASE II
Explorar la capacidad antimicrobiana de los extractos obtenidos en la Fase I

frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Saccharomyces cerevisiae.
Determinar la actividad bactericida o bacteriosttica para las bacterias y

fungicida o fungisttica para las levaduras, de los extractos etanlicos y
acuosos de Calndula officinalis y de Tropaeolum majus.
1.1.3. FASE III
-
Determinar la efectividad de la aplicacin de los extractos acuosos como

conservantes naturales en pulpa de frutas y de los extractos etanlicos en
jabn - gel antibacterial para uso sin enjuague.
21
2.
MARCO TERICO
2.1.
COLOMBIA Y SU BIODIVERSIDAD
Etimolgicamente, la palabra biodiversidad es una contraccin de la expresin

diversidad biolgica, la cual expresa la variedad del mundo biolgico (Pascual,
1997), variedad de vida que se manifiesta en la diversidad gentica de poblaciones,
especies, comunidades, ecosistemas y paisajes. En este campo, Colombia, puerta
de entrada a Amrica del Sur, ostenta el segundo lugar en biodiversidad del
planeta ya que posee entre el 10% y 14% de la diversidad mundial en una
superficie que corresponde al 0.8% de las tierras emergidas del mundo. Adems, en
diversidad vegetal tiene entre 35.000 y 45.000 especies de plantas vasculares y
cuenta con el mayor nmero de especies de palmas del mundo, 248 (FPAA, 2005).
En la tabla 1, se resume la posicin que Colombia ocupa dentro del contexto
mundial. Esta realidad confirma los anlisis realizados respecto al comportamiento
de la economa dependiente en buena medida de los recursos naturales del pas, o
por lo menos as lo demuestran los componentes del Producto Interno Bruto (PIB)
en las ltimas dos dcadas (FPAA, 2005).
Tabla 1. Posicin mundial de Colombia en biodiversidad.
Grupo
Estado
Plantas superiores
3er. Puesto mundial (despus de Brasil e Indonesia)

No. Especies: 35.000 - 45.000
No. Especies endmicas: 15.000 - 17.000
Participacin mundial: 6 - 6.8%
Mamferos
4to. Puesto mundial

No. Especies: 456
No. Especies endmicas: 28
No. Especies amenazadas: 35
Aves
1er. Puesto mundial

No. Especies: 1815
No. Especies endmicas: 28 (5to lugar)
No. Especies amenazadas: 35
Reptiles
3er. Puesto mundial (despus de Australia y Mxico)

No. Especies: 920
No. Especies endmicas: 97 (11vo. Puesto)
Anfibios
No. Especies: 583

No. Especies endmicas: 367
(1er lugar en ambos casos)
Fuente: Instituto de Investigacin en Recursos Biolgicos Alexander Von Humboldt, 2000.
22
Aunque esto ltimo demuestre que la economa nacional depende del

aprovechamiento agrcola, es necesario abarcar ms que la siembra y la cosecha.
Es de suma importancia generar procesos de utilizacin de sustancias funcionales
de las especies vegetales, promover una economa competitiva y sostenible, que
nos lleve a desmentir lo que actualmente se afirma respecto al aprovechamiento de
la biodiversidad, ya que se conoce menos del 1% de lo que tenemos (Daz, 2004).
La enorme riqueza natural del pas es una oportunidad y una responsabilidad con
generaciones futuras. El desarrollo de Colombia debe estar ntimamente ligado con
el aprovechamiento de la biodiversidad, buscando una distribucin ms justa y
equitativa de los costos y beneficios derivados de sta. Para lograr este objetivo se
formul una Poltica Nacional de Biodiversidad publicada en 1997, en la cual se
consignan las estrategias y acciones orientadas al conocimiento, conservacin y
utilizacin sostenible de la biodiversidad en Colombia (Samper et al., 1998).
2.2.
INVESTIGACIN EN COLOMBIA
Segn Colciencias para el ao 1999:

U El 57% de los investigadores se dedic al campo vegetal y agrcola, el 17%
al de la salud humana, el 14% a lo ambiental, el 7% al animal y el 5% a lo
industrial (ngel, 2004).
U El 35% del desarrollo de estas investigaciones lo hicieron las universidades,
el 33% el sector productivo, el 27% los centros de investigacin y el 5% otras
instituciones (ngel, 2004).
U El 57% de los investigadores era de nivel pregrado, el 26% tena algn tipo
de maestra y el 19% contaba con un nivel de doctorado en filosofa (ngel,
2004).
En el ltimo ao, en el taller del Programa Nacional de Biotecnologa, programa de
Colciencias, se afirm que en los ltimos 30 aos en investigacin de productos
naturales se han invertido US$7 millones y no hay ningn producto en el mercado
originado de esa investigacin (Snchez, 2004).
Estos planteamientos expuestos en el foro Biotecnologa en el agro, organizado
por la Escuela Colombiana de Ingeniera en el ao 2004, nos permiten ver el marco
de referencia que tienen grandes investigadores colombianos para promover la
educacin orientada hacia la investigacin; es de vital importancia generar
conocimiento, desarrollar nuevos procesos que involucren la biodiversidad y la
biotecnologa, nico camino para establecer una economa nacional competitiva y
23
dejar atrs el subdesarrollo que ha estancado a un pas lleno de naturaleza viva y

expectante a su utilizacin racional.
2.2.1. ESPECIES VEGETALES SILVESTRES
Se conocen alrededor de 35.000 especies vegetales en Colombia, algunas de estas
clasificadas por usos medicinales, otras usadas como condimentos, aditivos o
simplemente de uso ornamental; han sido ubicadas dentro del Convenio Andrs
Bello como especies promisorias por su potencial de explotacin en el campo de la
salud, la agricultura y la industria.
Dentro de este selecto grupo de especies promisorias hallamos a las dos
protagonistas de la presente investigacin:
2.2.1.1.
Calndula officinalis L.
FAMILIA
Compositae (Asteraceae)
TAMAO
Hierba anual, de 30 a 60 cm de altura.
GNERO
Calendula officinalis L.
NOMBRES COMUNES
Ingls:
Marigold,
Pot
marigold.
Espaol: Calndula, Maravilla de los jardines.
FOLLAJE
FLORES
Hojas color verde claro, simples, opuestas, Flores en forma de margarita, de color
gruesas y de textura suave.
amarillo plido hasta anaranjado fuerte,
tienen 5 cm de dimetro aprox..
SUSTANCIAS ACTIVAS
USOS
Aceites esenciales, principios amargos, Cicatrizante, desinflamante, tratamientos
muclagos, glucsidos, xantofila, fermentos, para
lcera
gstrica,
conjuntivitis,
saponinas.
antiespasmdica y bactericida.
Adaptado de Carreo (2000), Especies Vegetales Promisorias de los pases del Convenio
Andrs Bello, (1999), Acosta et al. (2004).
24
2.2.1.2. Tropaeolum majus

FAMILIA
GNERO
Tropaeolaceae
Tropaeolum majus L.
TAMAO
NOMBRES COMUNES
12 pulgadas de alto por 8 pulgadas de Ingls: Nasturtium, Indian Cress.
ancho.
Francs: Capucine.
Espaol: Capuchina.
FOLLAJE
FLORES
Hojas color verde claro, alternadas, Flores colores vistosos como rojo, rosado,
redondeadas, con bordes ondulados y venas anaranjado, amarillo, crema o pastel. Cada
fuertemente marcadas que radian del centro. flor tiene 5 spalos unidos a la base, 5
ptalos y 8 estambres.
SUSTANCIAS ACTIVAS
Sustancias antibiticas an no identificadas
USOS
Antiescorbtico, antisptico y calmante.
Adaptado de Carreo (2000), Especies Vegetales Promisorias de los pases del Convenio
Andrs Bello, (1999).
2.3.
ANTIMICROBIANOS NATURALES
Los conservantes son un grupo de antimicrobianos naturales que provienen de

cualquiera de los sistemas naturales presentes en el ecosistema incluyendo plantas
o microorganismos que pueden ser usados para alargar la vida til de los
alimentos, reduciendo o eliminando la carga bacteriana patgena ya que poseen
actividad antibacterial, antufngica o antiviral (Olaya y Mndez, 2003).
Los vegetales elaboran dos tipos de componentes qumicos: los principios
inmediatos y los principios activos. Los primeros, son sustancias que no tienen
actividad farmacolgica sobre el organismo animal, los elaboran las plantas
alimenticias y son fundamentales para la nutricin. Dentro de estos principios se
encuentran las protenas, lpidos, carbohidratos, entre otros; los segundos, son
sustancias que proveen beneficios o perjudican al organismo que los consume,
dependiendo de su composicin qumica. Por ejemplo, una infusin de hojas de
coca provee bienestar digestivo, mientras que de la extraccin con solventes
qumicos de estas mismas hojas de coca se obtiene el clorhidrato de cocana,
estimulante nervioso, que produce adiccin y estados de euforia (Olaya y Mndez,
2003).
La conservacin de alimentos data desde tiempos prehistricos y ha sido
perfeccionada con el arte de la culinaria y la industrializacin. Los beneficios
potenciales de las plantas comestibles, as como de los fitoqumicos que las
25
componen han ayudado a mejorar la calidad organolptica de algunos otros

alimentos.
Desde hace 5000 aos los chinos han utilizado las hierbas con fines medicinales y
el uso ms anticipado que se conoce de las hierbas y especias antimicrobianas y
conservantes se lo dieron los egipcios hacia el ao 1550 AC, cuando utilizaban la
canela, el comino y el tomillo para preservar alimentos y en la momificacin (Hirasa
y Takemasa, 1998).
Se tienen evidencias cientficas sobre el potencial antimicrobiano de las especias, en
el siglo XIX Webb y Tanner (1944) reportaron la actividad antimicrobiana del aceite
de canela contra esporas de ntrax. Luego, Grove (1918) observ la capacidad de
preservar la salsa de tomate con extractos acuosos y etanlicos de canela. Fabian
(1939) encontr que la canela inhiba el crecimiento microbiano en una dilucin de
1:50 y los clavos en dilucin 1:800 para inhibir Staphylococcus aureus (Naidu,
2000).
Segn Lindsay (1996) las hierbas son partes de plantas: arbustos y rboles, como
tallos u hojas suaves y aromticas; mientras que las especias son races, rizomas,
cortezas, flores, frutos y semillas. Comnmente, las hierbas provienen de plantas de
clima templado o subtropical y las especias de plantas de clima tropical.
Las especias son comercializadas frescas o secas, las secas se pueden extraer con
solventes como el etanol. Tambin pueden ser sometidas a destilacin, presin fra
o extradas con dixido de carbono supercrtico para obtener aceites esenciales
(Hirasa & Takemasa, 1998).
Las civilizaciones antiguas reconocieron el potencial antisptico y antimicrobiano
de varios extractos vegetales pero la caracterizacin fitoqumica se dio gracias a los
avances de las tcnicas de separacin molecular que permiten hoy en da aislar los
compuestos fitoantimicrobianos (Naidu, 2000).
2.3.1. FITO ANTIMICROBIANOS
.Los fito antimicrobianos son sustancias presentes en las plantas, ya sea en sus
tallos, hojas, flores y/o frutos que han demostrado tener capacidades
antimicrobianas. El creciente uso de especias, hierbas y de sus aceites esenciales
como aditivos alimentarios demuestra la gran capacidad antimicrobiana que estos
tienen. La gran limitante en muchos casos ha sido la concentracin de estos
componentes antimicrobianos que resultan muy bajas para ser usadas
efectivamente sin afectar las caractersticas sensoriales de los alimentos. (Naidu,
2000).
26
Entre los antimicrobianos ms estables que se han encontrado hasta el momento

en hierbas y especias se hallan en los componentes de la canela, clavos de olor,
semillas de mostaza, romero, salvia, tomillo y vainilla. Tambin, ciertos agentes fito
fenlicos tales como las oleoresinas del aceite de oliva que han demostrado aportar
beneficios fisiolgicos al consumidor y por lo tanto un atractivo favorable para la
industria de la comida saludable (Naidu, 2000).
Los fito antimicrobianos ms representativos conocidos hasta el momento son:
2.3.1.1. Fitofenoles
Los fitofenoles son los componentes principales de las especias, responsables de su
actividad antimicrobiana y ubicados en la fraccin de los aceites esenciales
(Beuchat, 1994). Por ejemplo, la actividad antimicrobiana de la canela, la pimienta y
los clavos se atribuye al eugenol (2 metoxi-4 alil fenol) y al aldehdo cinmico, los
cuales constituyen la mayor parte de los aceites voltiles de estas especias (Farrel,
1985).
Mtodos de extraccin
Para aislar cualquier sustancia antimicrobiana se debe elegir el solvente a usar,
teniendo en cuenta la habilidad de ste para arrastrar la mayor cantidad de
componentes antimicrobianos. Es necesario utilizar un solvente puro y llevar el
proceso de extraccin bajo condiciones de temperatura moderadas entre 30-60C,
utilizando cuando sea posible solventes de baja reactividad (Ghisalberti, 1993).
Espectro antimicrobiano
Innumerables factores influyen en la actividad antimicrobiana de los fitofenoles,
como la composicin qumica, influenciada por el origen geogrfico y la variedad
de cultivos. Tambin, el tipo de ensayo puede afectar la actividad antimicrobiana
de estos compuestos, ya que ciertos componentes antimicrobianos son hidrfobos,
por lo tanto los ensayos con discos pueden no ser apropiados para evaluar la
actividad (Hammer et al., 1999). La coexistencia con otros componentes del
alimento como las protenas, los lpidos, minerales, el pH, el tiempo y temperatura
de extraccin, pueden tambin controlar la actividad biolgica de los fenoles.
Mecanismos de accin
Los estudios se han centrado en el mecanismo por el cual las especias o sus aceites
esenciales inhiben crecimiento de microorganismos, llegando a concluir que los
terpenos, presentes en los aceites esenciales de las especias, son los principales
antimicrobianos.
27
La hiptesis planteada por Juven et al. (1994), afirma que la reaccin de los
compuestos fenlicos con las protenas en la membrana citoplasmtica del
microorganismo causa un cambio en la permeabilidad de la membrana
produciendo una fuga de solutos y afectando la fuerza motora de protones.
2.3.1.2. Saponinas
Son compuestos que protegen a las plantas del estrs bitico y adems promueven
actividades antibacteriales, antifngicas y antivirales. Esta actividad antimicrobiana
de amplio espectro puede ser til para la conservacin de alimentos (Naidu, 2000).
Las saponinas son un grupo que se presenta en los glicsidos, abundantes en el
reino vegetal, sin embargo, algunos animales marinos tambin contienen estos
compuestos. Las saponinas se pueden encontrar en diferentes partes de la planta,
como races, flores, vstagos y semillas. La caracterstica ms comn de las
saponinas es la formacin de espuma jabonosa cuando se agita en solucin
acuosa.
Dependiendo de la estructura de las saponinas, stas pueden mostrarse con
actividad hemoltica, antimicrobiana, despolarizante de membranas, capaz de
inmovilizar el colesterol. Desde el punto de vista nutricional, la actividad hemoltica
de las saponinas no representa amenaza para el consumidor, ya que se digieren y
no pasan a travs del torrente sanguneo (Naidu, 2000).
La actividad antimicrobiana es importante en la planta para protegerse contra
patgenos. La localizacin de saponinas con gran actividad antimicrobiana
depende de la funcin que quiera afectar el patgeno, por ejemplo, las partes
areas de algunas plantas acumulan un sabor amargo para protegerse de los
herbvoros (Oleszek et al., 1999).
Las saponinas se encuentran en plantas comestibles como soya, frjol, guisantes,
avena, tomate, esprragos, t, man, espinaca, remolacha, mora y ame; en plantas
usadas como alimento animal estn las legumbres, la alfalfa, el forraje, castaas y el
girasol; y en plantas usadas como saborizantes, alimentos saludables, tnicos, etc.,
incluyendo hierbas, semillas comestibles, ginseng y nuez moscada (Price et al.,
1987).
Mtodos de extraccin
En un extracto vegetal puede demostrarse su presencia simplemente con la
agitacin y la consecuente formacin de espuma, a pesar de ello, algunas
saponinas no forman espuma estable. Por otro lado, ciertos extractos vegetales
pueden no tener saponinas y podrn formar espuma.
28
Existen trabajos sobre saponinas que incluyen una extraccin con metanol, etanol
y agua, seguida de una evaporacin de alcohol y la extraccin de saponinas dentro
de n-butanol. En sta extraccin lquida-lquida los compuestos altamente polares
presentan una matriz de sacridos permanente en la solucin acuosa dando cierta
purificacin al extracto, sin embargo, la evaporacin del butanol produce un
oscurecimiento de la solucin rica en slidos con muchos compuestos que
interfieren y se sugiere por lo tanto la dilisis para remover pequeas molculas
solubles en agua (Massiot et al., 1996). No obstante, estos procedimientos tienen
como desventaja que las saponinas pueden degradarse debido a la utilizacin de
una solucin acuosa y metanol caliente (Massiot et al., 1996).
La accin principal de las saponinas sobre los microorganismos es su interaccin
con la membrana de esteroides, por lo tanto, las bacterias cuyas membranas sean
bajas en colesterol no sern sensibles a las saponinas. Tanto las saponinas
triterpenas como las esteroidales han mostrado actividad antibacterial (Takeya,
1997).
El grado de actividad depende de la estructura de la saponina y el microorganismo
objetivo (Masamitsu et al., 1998). La saponina ms comn es la de la hiedra que es
ms efectiva contra bacterias Gram positivas (Kim et al., 1998).
El mayor efecto producido por las saponinas sobre las bacterias es la liberacin de
protenas y ciertas enzimas de las clulas de las bacterias (Zablotowicz et al., 1996).
Las saponinas triterpenas y esteroidales son las que comnmente demuestran
actividades antifngicas. Al parecer el mecanismo principal de la predisposicin y
sensibilidad de un microorganismo a las saponinas son las interacciones con
esteroles, protenas y fosfolpidos de la membrana, pero su efecto todava no es
especfico (Gruiz, 1996).
2.3.1.3. Flavonoides
Han sido extensamente caracterizados por su actividad antimicrobiana de amplio
espectro y por la capacidad de inducir al organismo objetivo una baja resistencia a
su actividad antimicrobiana (Naidu, 2000). Los Isoflavonoides son potentes
inhibidores de crecimiento fngico y su uso potencial se destina al control de
enfermedades en las plantas, especficamente, se han sugerido como alternativa al
uso de fungicidas convencionales en el control de almacenamiento de granos en
pases subdesarrollados. Los flavonoides son reconocidos por aportar cualidades
nutricionales, sensoriales y antioxidantes a las frutas y a los productos derivados de
ellas, como los jugos y vinos. Estos compuestos se presentan hoy en da como
29
ingredientes nutracuticos de gran atractivo para la industria de alimentos (Naidu,

2000).
El trmino flavonoides (lat. Flavus=amarillo) fue usado por primer vez para la familia
de compuestos de color amarillo con el grupo 2-fenil-cromo (Swain, 1976). Luego,
se extendi a varios polifenoles para incluir a los compuestos menos coloreados. En
las plantas puede reconocerse su presencia en flores, frutas, races y cortezas de
color blanco o amarillo, esta caracterstica le permite a la planta protegerse de la
radiacin UV producida por el sol (Swain, 1979).
Una planta puede contener varios tipos de flavonoides, por ejemplo los que tienen
atractivos colores son blanco visual para los insectos polinizadores. Las catequinas y
otros flavonoides poseen caractersticas astringentes y actan como repelentes,
mientras que los isoflavonoides son importantes protectores de la planta. Estos
cidos fenlicos son de gran inters para el hombre desde diferentes aspectos, ya
que ellos contribuyen a la calidad sensorial y nutritiva de las frutas y de productos
derivados de ellas. Adems, son responsables de mejorar la estabilidad del color en
los productos derivados de las frutas (Mazza y Miniati, 1993).
De todas las sustancias identificadas de las plantas medicinales, los flavonoides
representan uno de los compuestos bioactivos ms interesantes. Actualmente,
alrededor de 40 plantas son usadas como fitomedicinas debido a su contenido en
flavonoides. En estas plantas, los flavonoides comnmente suceden como
glicsidos; las clases de flavonoides ms comunes son: los flavonoles, flavonas y sus
dihidroderivados, seguidos por las antocianinas e isoflavonas.
La distribucin de los flavonoides en las frutas es bastante amplia, por ejemplo, las
uvas son una fuente rica en compuestos fenlicos incluyendo flavonoides y no
flavonoides. Las clases de flavonoides ms comunes son las antocianinas (uvas
rojas) y flavonoles. Estos ltimos componen en su mayora a las uvas y se
identifican como todos los glicsidos presentes en ella (Cheynier y Rigaud, 1986),
como la mircetina, quercetina, kaempferol. La variacin en la composicin fenlica
depende del estado de madurez de la fruta as como de su variedad.
Mtodos de extraccin
Los flavonoides son inestables y pueden ser degradados por la accin de las
enzimas en la planta fresca, por lo tanto es necesario un cuidadoso procesamiento.
Se recomienda la liofilizacin de la planta, ya que se obtiene un polvo que puede
ser almacenado en recipientes sellados en un congelador, sin deterioro del
compuesto. Para cuantificar el contenido de flavonoides se recomienda un rpido
congelamiento en nitrgeno lquido inmediatamente despus de la cosecha. En la
prctica, si las antocianinas o taninos no estn involucrados, se puede optar por el
secado de la planta en una estufa a 100C. Luego de este procedimiento, el
material seco puede almacenarse en una bolsa plstica por varios meses bajo
30
refrigeracin para prevenir la prdida de flavonoides. El secado por aire a

temperatura ambiente no es recomendado, ya que podra causar degradacin
enzimtica. Una buena alternativa es realizar la extraccin del material fresco,
picando la muestra en un procesador con un solvente apropiado. La actividad
enzimtica puede evitarse si un alcohol es incluido como solvente de extraccin
(Naidu, 2000).
Los flavonoides son lipoflicos, caracterstica que les proporciona actividad
antimicrobiana, pues esta propiedad est asociada a la habilidad de traspasar
membranas biolgicas (Harborne, 1983).
La actividad antibacteriana de los flavonoides se observ por primera vez en 1977,
Wyman y Van Etten evaluaron seis isoflavonoides contra Pseudomonas,
Xantomonas y Acromobacter. Los resultados mostraron un efecto leve a moderado
contra Pseudomonas pero una fuerte actividad contra Acromobacter.
Extractos de diclorometano y metano de las hojas de Psiadia trinervia, especie del
gnero de las Compuestas, usada en Africa en medicina tradicional como
expectorante para el tratamiento de la bronquitis, fueron evaluados por Wang et
al. (1983), quienes midieron la actividad antibacterial contra Bacillus cereus dando
resultados positivos.
Los flavonoides como la quercetina, bioflavonoide ampliamente distribuido en
frutas, verduras y el t (Kuhnau, 1976) y la morina, se evaluaron y se encontr que
posean actividad virucida contra el Herpes simple (Beladi, 1977). Se cree que los
flavonoides que muestran actividad antiviral interactan sobre la cpsula de
protenas del virus (Ninomiya y Cols, 1984). Los efectos biolgicos de la quercetina
y de algunos de sus derivados han sido reportados: como el efecto inhibitorio
contra clulas malignas (Suolinna et al., 1975). Su mecanismo est bsicamente
ligado a interrumpir el ciclo de replicacin.
2.3.1.4. Glucosinolatos
Este componente bioactivo ha sido usado durante siglos en preparaciones herbales
y remedios para tratar desde el reumatismo hasta picaduras de serpientes
venenosas. Los presentes en el rbano y la mostaza han sido usados como
estimulantes, aplicndolos en las protenas grasas del pescado y la carne. Los
glucosinolatos voltiles tales como los isotiocianatos han mostrado un amplio
rango de efectos antibacteriales y antifngicos. Tambin, se ha sugerido la
aplicacin de alil isotiocianatos gaseosos como preservativos en alimentos
empacados. Por ltimo, se ha sugerido que la ingesta constante de brcoli, repollo
31
y col de Bruselas ayuda a prevenir el cncer mamario, sin embargo, ciertos estudios
con glucosinolatos purificados revelan toxicidad en algunos animales (Naidu,
2000).
Los glucosinolatos estn presentes en varias especies de la familia de las Cruciferae,
como en el coliflor, la mostaza, el rbano, repollo, brcoli, colinabo entre otros;
tambin se conoce su presencia en algunas variedades de la familia de las
Capparaceae y de las Tropaeolaceae, dentro de esta ltima se encuentra el
mastuerzo de indias (Tropaeolum majus) que adems contiene un tipo de aceite de
mostaza (Martin, 1999). La produccin de los glusinolatos dentro de la planta
ocurre cuando sta est amenazada por los insectos (Olsson y Jonasson, 1994).
Mecanismos de extraccin
Los mtodos de aislamiento para los glucosinolatos varan dependiendo de su
propiedad molecular. Existen varios tipos de glucosinolatos que pueden ser
extrados desde una simple lixiviacin con agua con solventes como: acetonas,
benceno, etanol al 95%, repasando lavados con estos mismos. El punto de
coincidencia en estas extracciones es el tipo de almacenamiento que debe darse al
extracto obtenido y es el mantenimiento a bajas temperaturas (Kyung et al., 1997)
(Shofran et al., 1998).
Shofran et al. (1998) report el efecto inhibidor de un glucosinolato: alilisotiocianato (AITC) contra E. coli, S. aureus, B. subtilis, A. hydrophilia, entre otras.
Delaquis y Sholberg (1997), probaron el AITC gaseoso contra Salmonella
typhimurium, Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7, Pseudomonas corrugada,
Penicillium expansun concluyendo la actividad inhibidora sobre los
microorganismos nombrados. Brabban y Edwards (1995) encontraron que la
sinigrina, un glucosinolato presente en el rbano, causaba la inhibicin de
crecimientos de E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, B. stearothermphilus y Streptomyces
thermoviolaceus.
2.3.1.5. Carotenoides
Son pigmentos sin nitrgeno que se presentan en las plantas atribuyndoles
caractersticas especiales de coloracin. Los carotenoides son los responsables de la
gran mayora de los colores amarillos, anaranjados o rojos presentes en los
alimentos vegetales, y tambin de los colores anaranjados de varios alimentos
animales. Desde el punto de vista qumico, pertenecen a la familia de los terpenos y
su biosntesis se produce a partir de isopentenil pirofosfato.
32
Se conocen alrededor de 600 compuestos de esta familia, que se dividen en dos

tipos bsicos : los carotenos, que son hidrocarburos, y las xantofilas, sus derivados
oxigenados. A estos tipos hay que unir los apocarotenoides, de tamao menor,
formados por ruptura de los carotenoides tpicos.
En los vegetales verdes se encuentran en los cloroplastos, formando parte del
sistema de biosntesis a partir de la energa solar, pero son mucho ms abundantes,
y visibles, coloreando algunas races, frutas y flores. Dada su ubicuidad en el reino
vegetal, la biosntesis total anual de carotenoides se ha estimado en unos 100
millones de toneladas. Los animales no pueden sintetizar sustancias de este tipo,
pero si pueden transformar una en otra, aunque con bastantes limitaciones (Calvo,
2006).
Segn Calvo, (2006), los carotenoides son un grupo muy importante de
flavonoides con funcin antioxidante y capaz de modular el sistema inmunolgico.
Entre estos se destacan:
1. Los carotenos, aquellos que poseen una coloracin rojiza y anaranjada:
-
Los beta carotenos: precursores de la vitamina A. Se trata de un

pigmento vegetal, que una vez ingerido, se transforma en el hgado y en
el intestino delgado en vitamina A. Es un componente antioxidante que
favorece la no aparicin del cncer, especialmente el de pulmn, boca y
estmago. Tambin se ha demostrado que previene las enfermedades
del corazn.
El alfa caroteno: con propiedades ms destacadas que el Beta caroteno,

aparece en los mismos alimentos que ste pero en menor proporcin.
El licopeno: componente al cual deben su coloracin roja los tomates.

Con propiedades similares a los beta carotenos de la zanahoria, tiene
propiedades anticancergenas. El licopeno parece reducir las
probabilidades de desarrollar cncer de prstata, pulmn estmago,
vejiga y cuello del tero, tiene adems las propiedades de disminuir el
colesterol en la sangre y prevenir las inflamaciones de la prstata.
La criptoxantina: tiene propiedades ms destacadas como antioxidante,

aparece en los mismos alimentos que el beta caroteno, principalmente
en las naranjas.
2. Las xantofilas, que confieren coloraciones amarillas y rojizas:
33
La lutena: pigmento liposoluble de color amarillento que aparece en

algas, bacterias y plantas superiores. Su funcin es la de proteger a la
planta contra la radiacin solar. La lutena se encuentra en muchos
vegetales, como las judas verdes, las espinacas o el brcoli, aunque su
color est enmascarado por el de la clorofila. Junto con la zeaxantina, es
el carotenoide responsable del color de la yema de huevo. Se utiliza
precisamente para aadirla al alimento de pollos y gallinas, para colorear
la piel, carne y huevos.
La zeaxantina: carotenoide tpico del maz.
La capsantina: es el principal carotenoide del pimiento comn.
2.4.
TRABAJOS CON EXTRACTOS VEGETALES
Los compuestos derivados de las plantas pueden tener aplicaciones para el control
de patgenos que afecten a los alimentos. Es as como la naturaleza ofrece la
solucin a los problemas que pueden generarse dentro de los frutos que ella da.
Estas sustancias abren el camino a la profundizacin de la investigacin en este
campo, el cual puede dar frutos econmicos rentables y una nueva perspectiva de
una produccin industrial ecolgica y sostenible.
Algunos resultados de las investigaciones muestran resultados promisorios:
antimicrobiana determinando la concentracin mnima inhibitoria (CMI) de
cuminaldehdo aislado.
EXTRACTO
VEGETAL DE
Extracto
alcohlico de
comino
(Cuminum
cyminum)
COMPONENTE
ACTIVO
Cuminaldehido (pisopropil
benzaldehido)
Microorganismo Indicador
Agrobacterium tumefaciens
B. subtilis
Micrococcus luteus,
Enterobacter aerogenes
Escherichia coli
Aspergillus niger
Fusarium oxysporum
Trichophyton rubrum
Helminthosporium oryzae
Saccharomyces cerevisiae
CMI
mg PEE (Peso de Especia
Equivalente)/ml
Cuminaldehido aislado
10
10
100
100
100
>100
>100
25
20
No se encontr
Adaptado de Mukhopadhyay et al., (2003). Actividad Antimicrobiana de Cuminum cyminum L.
34

antimicrobiana de los extractos etanlicos, etreos, acuosos y en acetato de etilo
de Drimys granadensis frente a indicadores Gram positivos, Gram negativos,
hongos y levaduras.
EXTRACTO
VEGETAL DE
COMPONENTE
ACTIVO
TIPO DE EXTRACTO
Microorganismo
Indicador
Etanlico
Etreo
Acuoso
En Acetato de
etilo
Gram positivos
Staphylococcus
aureus
Drimys
granadensis
Poligodial
+++
Salmonella typhi
Pseudomonas
aeruginosa
Aspergillus niger
Mucor sp.
Fusarium
oxysporum
++
++
Gram negativos
++
+
+
+
+
+
+
+
+
Hongos filamentosos
+
+
+
Levadura
Candida
albicans.
+++
Adaptado de Garzn y Quintero, (1996). identificacin de la sustancias Responsables de la

Actividad Antimicrobiana de Drimys granadensis.
+++: ptima efectividad.
++: Mediana efectividad.
+: Baja efectividad.

antimicrobiana determinando la concentracin mnima inhibitoria (CMI) de anetol
aislado a partir de extractos alcohlicos de ans estrellado (Illicium verum) y un
patrn de acetol de Merck.

EXTRACTO
VEGETAL DE
Extracto
alcohlico de
ans estrellado
(Illicium verum)
COMPONENTE
ACTIVO
Anetol
(1-metoxi-4-(1propenil)-benceno)
Microorganismo
Indicador
Staphylococcus
aureus
Escherichia coli
Saccharomyces
cerevisiae
CMI (g/ml)
Anetol aislado
Anetol patrn de
Merck
20
20
10
18
20
El patrn de Merck de anetol indic su pureza, demostrando gran actividad antimicrobiana comparable con el
anetol aislado directamente de la planta.
Adaptado de Mukhopadhyay et al., (2001). Actividad antimicrobiana de Illicium verum.
35

antimicrobiana de amplio espectro de los extractos combinados de canela y
cebollin chino con diversos tratamientos.
EXTRACTO
VEGETAL DE
Extracto
combinado de
canela y
cebollin chino
COMBINACIN
PTIMA
8:1 v/v
Microorganismo
Indicador
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Flavobacterium sp.
Listeria
monocytogenes
Pseudomonas
aeruginosa
Salmonella
typhimurium
Staphylococcus
aureus
Vibrio
parahaemoliticus,
Aspergillus flavus
Aspergilus niger.
TRATAMIENTOS QUE REFORZARON LA

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE AMPLIO
ESPECTRO
Tratamiento trmico
Modificacin de pH llevndolo a valores bajos,

cidos
Adicin de conservantes para alimentos, excepto

el cido ctrico que afect su desempeo
Se determin la capacidad antimicrobiana en pan dulce, jugo de guayaba y en t negro y verde, concluyendo que la
combinacin puede ser incorporada como conservante en productos alimenticios
Adaptado de Hsieh et al., (2001). Antimicrobial effect of various combinations of plant extracts.
Tabla 6. Resultados obtenidos despus del estudio comparativo y sinrgico entre

varias especias y Bifidobacterium longum contra el crecimiento de E. coli O157:H7
en la carne molida.
MATRIZ DE
PRUEBA
Microorganismo
Indicador
La dosis para cada muestra de carne fue de 2% (p/v).
Especias
Carne molida
E. coli O157:H7
Se inocularon 2 log
UFC/ml
Pimientos jalapeos
Jengibre
Ajo
Organo,
+++
Redujo hasta 2 Log
++
+
UFC
Especias y Bifidobacterium longum
La mejor combinacin resultante fue la de organo y Bifidobacterium
longum ya que en combinacin redujeron hasta 5 log.
Bifidobacterium longum
Redujo hasta 2 log UFC.
Adaptado de Ibrahim et al., (2004). Antimicrobial Activity of Bifidobacterium longum (NCFB 2259)
as Influenced by Spices.
-: No mostraron ninguna actividad.
36

antimicrobiana de aceites esenciales obtenidos a partir de canela, clavo de olor,
limonaria, mostaza, naranja, salvia, tomillo y romero contra los hongos presentes
en el pan de centeno: P. roqueforti, P. corilofilum, A. flavus.
MATRIZ DE
PRUEBA
Microorganismo
Indicador
METODOS DE EVALUACIN
Clavo de
olor
Limonaria
Mostaza
Naranja
Salvia
Tomillo
Romero
++
+++
Limonaria
Mostaza
Naranja
Salvia
Tomillo
Romero
MTODO 2. Pan de centeno contaminado por los hongos al

efecto directo de los aceites voltiles en cmara con aire
Clavo de
olor
P. roqueforti, P.
corilofilum, A.
flavus,
++
Canela
Pan de
centeno
Canela
MTODO 1: Agar de pan de centeno complementado con

aceite esencial de 250 ul y 100 ul
++
++
+++
+++
Adaptado de Suhr y Nielsen, (2003). Antifungal activity of essential oils evaluated by two different
application techniques against rye bread spoilage fungi.
-: No mostraron ninguna actividad.
2.5.
TRABAJOS ESPECFICOS CON Calndula officinalis Y Tropaeolum majus
Venikar y Jangle evaluaron en1992 extractos acuosos y etanlicos de las hojas y

flores de Calndula officinalis por el mtodo de difusin para ver su capacidad
antimicrobiana contra S. aureus y E. coli. Cuatro extractos obtenidos en total (hojas
en agua, hojas en etanol, flores en agua y flores en etanol) se probaron contra las
bacterias. Cada disco de papel fue impregnado con 60 g de extracto y puesto en
contacto con los microorganismos por 24 horas a 37 C. Se concluy que los
extractos acuosos y etanlicos obtenidos a partir de las hojas no tuvieron efecto
significativo contra S. aureus. Sin embargo, los extractos acuosos y etanlicos de las
37
flores tuvieron efectos significativos contra la misma cepa comparndolo con el

blanco (etanol). Por otro lado, todos los extractos tuvieron un efecto significativo
contra E. coli, se observ que las flores tienen mayor actividad que las hojas,
especficamente ms efectivas sobre bacterias Gram negativas. Se reporta el poder
antimicrobiano posiblemente a la presencia de saponinas, flavonoides y aceites
esenciales.
Tambin se evalu la actividad antifngica de cuatro extractos a partir de flores de
Calndula officinalis, a partir de ter de petrleo (60-80 %), cloroformo, acetona y
etanol de 95%. Los cuatro extractos mostraron efectos inhibitorios contra
Aspergillus niger, Rhizopus japonicu, Candida albicans, Candida tropicallis y
Rhodotorula glutinis, permitiendo comparar su efecto con las magnitudes
obtenidas por las sustancias inhibitorias patrn. No se conoce con seguridad la o
las sustancias implicadas en la actividad pero se presume por estudios preliminares
que su principio activo se deba a los glicsidos, los esteroles o los flavonoides
(Kasiram y Sakharkar, 2000).
En la evaluacin preliminar de un extracto acuoso de Calndula officinalis se
comprob analticamente el contenido de los compuestos que reporta la literatura,
obteniendo la siguiente tabla de determinaciones (Aguila et al., 2000).
Tabla 8. Determinaciones analticas del contenido del extracto acuoso de
Calndula officinalis.
Tipo de ensayo
Resultados
Descripcin
Liquido mbar oscuro de olor a flores
Slidos totales (%)
3,495
pH
5,4
Saponinas
Presenta
Polisacridos
Presenta
Flavonoides
Presenta
Aminocidos
Presenta
Taninos
Presenta
Adaptado de guila et al., (2000). Extracto acuoso de Calndula officinalis. Estudio preliminar de sus
propiedades.
Se ha analizado en la literatura que la Calndula officinalis se destaca en dos

aspectos: qumicos y farmacolgicos. Lastra y Piquet (1999) aseguraron que ni la
fecha de plantacin, ni el tipo de secado; ya sea solar o por aire; inciden en la
presencia de los metabolitos reportados para la especie. Sin embargo, Olaya y
Mndez (2003) insisten en que el tipo de secado es de gran importancia para
preservar los principios activos, adems que el almacenamiento debe ser en bolsas
de papel o polietileno. Es importante que en los procesos extractivos no se lleven a
cabo tratamientos a temperaturas mayores a 100C ya que tiende a reducirse la
cantidad de sustancias activas (Lastra y Piquet, 1999). Respecto a la farmacologa, el
uso de la Calndula officinalis en la medicina tradicional se ha planteado en
38
decocciones de las flores (Carreo, 2000) para el tratamiento de heridas, por sus
propiedades cicatrizantes, antiinflamatorias, antibacterianas y tranquilizantes, lo
cual hace de sta una materia prima natural de inters para la industria
farmacutica.
Algunos estudios experimentales plantean que los extractos etanlicos al 80%
muestran actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus y S. fecalis
(Dumenil, 1980). El primer reporte de su uso en cosmetologa ocurri en 1977,
cuando los extractos vegetales empezaron a aparecer en productos como cremas,
emulsiones, champes, lociones de bao, cremas dentales, entre otros (Lastra y
Piquet, 1999). Sin embargo, la informacin sobre la obtencin de extractos de
plantas para el uso en cosmetologa es muy escasa y la que se encuentra disponible
es muy pobre en su profundizacin. En relacin con esto Avramova (1988), plantea
la obtencin de extractos de Calendula con ter de petrleo, alcohol y
propilenglicol, dando ciertas condiciones de preparacin y afirmando que los
principios activos son los carotenoides y flavonoides. Adems, demostr que dichos
extractos no mostraron propiedades carcinognicas, ni toxicidad crnica en un
perodo de 18 meses. Coello (1999) plantea el uso de las flores de Calendula en el
tratamiento del acn y resalta las propiedades antispticas de su aceite esencial.
De la bibliografa consultada se concluye que las flores de Calndula officinalis
presentan un amplio espectro debido a los compuestos presentes en ellas; entre los
ms investigados dado su inters farmacolgico estn los carotenoides y los
flavonoides. Entre los carotenoides identificados se encuentran: caroteno,
violaxantina, rubixantina, citroxantina, flavocromo, flavoxantina, galenina, lutena,
licopeno, valentiaxantina, auroxantina, microxantina, epoxicaroteno, zeacaroteno,
mutatoxantina y lutena (Lastra y Piquet, 1999). En relacin con los flavonoides, los
compuestos identificados son: isorhamnetina, rutinsido, isorhamnetina
neohesperidsido, calendoflosido, calendoflavosido, calendoflavobiosido, narcisina,
isoquercetina, quercetina, rutsido y kaempferol (Lastra y Piquet, 1999).
Otros compuestos de inters en las flores de Calendula son las saponinas y los
triterpenos, de los cuales han sido identificados los siguientes: trihidroxi-ursaeno,
ursadiol, heliantriol, loliolido, calendulsido (Lastra y Piquet, 1999).
Tambin se reporta la presencia de cidos fenlicos de los cuales se pueden sealar
los siguientes: coumrico, gentsico, vainllico, cafico, sirngico, ohidroxifenilactico, protocatequnico, ferlico, p-hidroxibenzoico, saliclico,
clorgnico, vertrico. Tambin se encuentran presentes en la Calndula los taninos
(Aguila et al., 2000).
Por otro lado, Tropaeolum majus, no reporta ningn estudio profundo, algunos
estudios menores indican que contiene un glucotropaeolsido: isotiocinato de
benzilo que se manifiesta como vasodilatador coronario. Adems se ha usado
como expectorante y antibitico especfico para E. coli y S. aureus. Posee
39
carotenoides, cidos-fenoles y hetersidos flavonicos, quercetina en las hojas y

kaempferol en las flores (Perry, 2004)
2.6.
REGULACIN, SEGURIDAD Y ESTANDARIZACIN DE PRODUCTOS DE

ORIGEN BOTNICO
La administracin para drogas y alimentos, FDA, por sus siglas en ingls, Food and
Drug Administration, define qu factores hay que tener en cuenta para la
regulacin, estandarizacin y seguridad de este tipo de productos.
2.6.1. Regulacin
Los suplementos dietticos estn regulados bajo la Ley de educacin y Salud de
1994 (DSHEA: Dietary Supplement Health and Education Act); esta ley enmend el
estatuto federal para alimentos, medicamentos y productos cosmticos y cre un
marco regulador para la seguridad y rotulado de suplementos dietticos en donde
se incluyen vitaminas, minerales, productos botnicos, aminocidos, enzimas
especficas, concentrados, metabolitos, y extractos (Draughon, 2004).
Los productos que se consideran suplementos alimenticios deben ser Reconocidos
Generalmente como Seguros (GRAS: Generally Recognized as Safe). Bajo la DSHEA,
un producto de origen botnico no puede ser considerado categricamente como
aditivo alimentario, por lo cual debe someterse a la distincin de GRAS como
evidencia de seguridad, excepto s ese ingrediente estuvo en el mercado antes del
mes de octubre de 1994 (Draughon, 2004).
El 30 de enero de 2001, la FDA lanz un comunicado a los productores de
alimentos donde se pronunci que la adicin de nuevos ingredientes como
agregados o extractos botnicos, los cuales no se hubieran usado previamente
como ingredientes en alimentos, deben exponerlos a una aprobacin de
premarket; es decir, que el fabricante debe someterlos a prueba como categora
GRAS y as demostrar su seguridad para consumo ante la FDA (FDA, 1997).
Las sustancias exentas de la definicin como aditivo alimentario, y calificadas como
seguras por los expertos, estn exentas de la aprobacin de premarket (FDA,
2003).
Suelen presentarse problemas por la interpretacin que se da de las condiciones
para el uso de especias y productos botnicos. Es decir, cuando estos ltimos se
utilizan como saborizantes o condimentos en niveles bajos o en uso intencional
(Cantidad normalmente usada para el sabor), no se requiere de una preaprobacin de uso, pero, cuando se utilizan como conservantes naturales, ya que
se requieren niveles ms altos de concentracin que la normal, se activa el requisito
para la sumisin de un GRAS (FDA, 2003).
40
El axioma en toxicologa: - la dosis hace el veneno - (Draughon, 2004), define

bien que s una sustancia se consume seguramente en la dieta a bajos niveles
puede ser insegura s se consume a niveles ms altos. Por consiguiente, un
segundo requisito para la obtencin de la calificacin como GRAS de un producto
botnico, es que los datos deben proporcionarse de la literatura o de otras fuentes
que demuestren un consumo seguro de la sustancia a altos niveles en la dieta.
Las causas ms comunes para reprobar la calificacin GRAS en la aprobacin
premarket de productos botnicos incluyen los siguientes (FDA, 2003b):
1. La no estimacin de la exposicin diettica al producto.
2. El no cumplimiento de las Buenas Prcticas de Manufactura.
3. La no existencia de caractersticas tcnicas de calidad para describir al
alimento.
4. Los estudios clnicos citados sean para una preparacin y especificaciones
diferentes del producto.
5. La adicin del producto viola las normas de identidad del mismo.
6. Que los estudios presentados no estn publicados y disponibles para la
comunidad cientfica experta y por lo tanto no haya base para determinar la
calidad de GRAS.
7. Que el producto no proporcione una historia sustancial de consumo del
mismo como alimento.
8. Las referencias proporcionadas sealan que el consumo del producto debe
ser ocasional.
9. Los ingredientes activos en el producto mostraron ser mutagnicos y
carcinognicos al nivel de su concentracin en el producto.
La FDA ha tomado una firme posicin frente al uso de aditivos alimentarios a partir
de plantas y ha emitido varias reglamentaciones para ayudar a las industrias de
alimentos y cosmticas a producir apropiadamente sus productos. Por ello
cualquier alimento que contenga un ingrediente botnico que no sea GRAS
causar al producto adulteracin y el alimento no podr ser importado legalmente
o comercializado en los Estados Unidos.
El marcado inters del uso de ingredientes botnicos como bioconservantes ha ido
incrementndose en EE.UU., por ello las ventas de los productos botnicos como
suplementos nutricionales disminuy hasta el 13% en 2003 al igual que en algunos
pases europeos como Alemania (Blumenthal, 2003).
Las razones para tal disminucin en ventas son varias, pero la ms importante es
que el consumo de estos productos botnicos especficos muestra datos
contradictorios en su eficacia probada en ensayos clnicos.
41
Como EE.UU. ha venido tomando una posicin ms estricta frente al uso de

suplementos y aditivos alimentarios, la comunidad europea lo ha hecho bajo la
Direccin de Suplementos Alimentarios de la Unin Europea, entidad que traslad
su legislatura nacional de los 15 pases miembro a la de EE.UU. en el 2003; sta ley
afecta hoy en da aproximadamente a 5.000 productos presentes en los mercados
europeos (Verkerk, 2003).
2.6.2. Estandarizacin
La importancia de la estandarizacin radica en el uso de los nombres cientficos de
las plantas, ya que al etiquetar un producto con el nombre comn o el que
culturalmente se conoce no se da uniformidad en los productos presentes en el
mercado. El Cdigo Internacional Botnico Louis Code (Greuter et al., 2000) es
una gua til de la nomenclatura de productos a partir de especies botnicas, ste
cdigo establece las reglas internacionales aceptadas que gobiernan la
denominacin cientfica de las plantas.
La estandarizacin del nombre comn de cada planta se encuentra en Las hierbas
de Comercio Herbs of commerce (McGuffin et al., 2000). Esta referencia es
citada especficamente por la FDA para los alimentos y cosmticos que contienen
suplementos dietticos a partir de especies vegetales (FDA, 2003).
Los extractos botnicos normalmente contienen una cantidad definida de un
compuesto particular. Un aspecto importante de la estandarizacin de los
ingredientes botnicos es asegurar que la variacin de lote a lote del compuesto
est dentro de los lmites aceptables. Un extracto, en preparacin seca, o el aceite
esencial de una planta contienen centenares de otros qumicos que pueden afectar
la calidad y estandarizacin del extracto (Bisset, 1994). La falta de uniformidad en la
composicin de los ingredientes botnicos sucede ya que el componente en los
productos botnicos no es afectado slo por la variedad de la planta sino tambin
por el origen geogrfico, la parte de la planta que se usa, edad y las condiciones de
crecimiento de la planta, el mtodo de extraccin y el mtodo de secado, la
preparacin, empaque y almacenamiento.
Dentro del estudio y uso de una planta debe incluirse la siguiente informacin: sitio
de recoleccin, tipo de cultivo: silvestre o espontneo, manejo y prcticas de
secado, condiciones de almacenamiento y prcticas de desinfeccin (Draughon,
2004).
42
2.6.3. Seguridad
La mayora de los conservantes botnicos que se han usado en alimentos no han
representado ningn peligro en su consumo. Sin embargo, es casi imposible
encontrar informacin toxicolgica al respecto. Para calcular los niveles permitidos
de un nuevo aditivo de alimentos se han definido dos niveles de estudio: Ingesta
Diaria Aceptable (ADI) y Nivel de No Efecto (NOEL) (Draughon, 2004).
Otro factor que puede afectar el uso de bioconservantes botnicos es la
sensibilidad de cierto grupo de una poblacin frente a compuestos o ingredientes
aromticos fuertes. La interaccin de algunos conservantes botnicos con la
prescripcin de las medicaciones ha demostrado en varios casos sensibilidades
importantes causando alergias. Aunque el manejo de estas excepciones puede ser
similar al que se le da a los alimentos que producen las mismas reacciones, como es
el caso del man, ya que no todos los organismos humanos son iguales, existir
siempre una limitacin de consumo (Draughon, 2004).
2.7.
MICROORGANISMOS INDICADORES
Los microorganismos indicadores, son organismos habitualmente asociados a la

presencia de patgenos. En las pruebas de inhibicin se utilizan para evaluar la
capacidad inhibitoria de las sustancias antimicrobianas estudiadas. Para el caso que
se estudia en ste proyecto, se utilizaron dos microorganismos indicadores: E. coli y
S. aureus. Cada uno representa a un grupo de bacterias Gram negativas y Gram
positivas, respectivamente, con el fin de evaluar el efecto inhibitorio de las
sustancias antimicrobianas obtenidas, ante microorganismos con paredes celulares
estructuralmente distintas.
Las bacterias Gram negativas presentan 10% de peptidoglicano en la pared celular,
poseen una capa adicional que est compuesta de lipopolisacridos. Esta capa
representa de hecho una segunda bicapa lipdica, que contienen adems
polisacridos y protenas (Madigan et al., 2001).
Las bacterias Gram positivas presentan a menudo polisacridos cidos unidos a la
pared celular denominados cidos teicoicos, que incluye a toda la pared,
membrana o polmeros capsulares que contienen glicerolfosfato o residuos de
fosfato de ribitol. Estos polialcoholes estn unidos por steres de fosfato, y
generalmente se les unen otros azcares y D-alanina. La carga negativa neta de la
superficie celular es aportada por los cidos teicoicos y puede servir para el trasiego
de iones a travs de la pared celular. Adems presenta una capa de peptidoglicano
que representa hasta el 90% de la pared y es la responsable de su rigidez (Madigan
et al., 2001).
43
La levadura Saccharomyces cerevisiae se utiliz para observar el posible efecto

antimicrobiano sobre un organismo Eucariota a diferencia de las dos especies
anteriores que corresponden a Procariotas. Esta especie es un hongo unicelular y la
mayora son ascomicetos. Normalmente son clulas ovales o cilndricas y la divisin
es habitualmente por gemacin. Las levaduras normalmente no desarrollan un
micelio, sino que permanecen en estado unicelular durante todo el ciclo de
crecimiento; sin embargo algunas pueden filamentar. Las clulas de levaduras son
mucho mas grandes que las bacterianas y pueden distinguirse no solo por su
tamao sino por la presencia de elementos intracelulares tales como el ncleo
(Madigan et al., 2001).
Las levaduras normalmente prosperan en un hbitat con abundante azcar, tales
como frutas, flores e incluso las cortezas de rboles. Las levaduras ms importantes
desde el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas de la
especie Saccharomyces cerevisiae, que es el hongo mejor conocido por ser
fcilmente manipulable y constituir un modelo excelente para el estudio de
problemas importantes que conciernen a la biologa de eucariotas (Madigan et al.,
2001).
44
3.
MATERIALES Y MTODOS
El trabajo experimental se llev a cabo en tres fases:

3.1.
FASE I: OBTENCIN DE EXTRACTOS
3.1.1. Material vegetal

Se estudiaron las especies Calndula officinalis (Figura 1) y Tropaeolum majus
(Figura 2).
Calndula officinalis se adquiri en un supermercado local: Carulla, de la ciudad de

Bogot Colombia. La planta se adquiri seca.
Tropaeolum majus:
Se recolect en Bogot Colombia, Humedal de Torca,

perteneciente a la localidad de Usaqun. Limita al oriente con la Compaa
Nacional de Reforestacin, al Sur con el Cementerio de la Paz, al Occidente con la
Autopista Norte, Calle 205 y al Norte con la escuela de Ftbol Alejandro Brand
(DAMA, 2006).
Para la realizacin del experimento se emplearon las hojas, tallos y flores de cada
una de las plantas. Para lograr una comparacin y uniformidad entre las dos
especies, Tropaeolum majus se llev a secado en estufa por 15 horas a 50C,
temperatura que no pudiera afectar los principios activos de la planta (Olaya y
Mndez, 2003), de esta manera las dos plantas se trabajaron secas.
Foto : Rolv Hjelmstad, Fagerhaug.
Figura 1. Calndula officinalis
45
Foto : Dr. Perry, L. University of Vermont.
Figura 2. Tropaeolum majus
3.1.2. Mtodo de extraccin

Las flores, ramas y hojas secas de las dos plantas mantenidas en bolsas de papel
(Olaya y Mndez, 2003), se trituraron en un procesador de alimentos, con el fin de
lograr mayor contacto de las partculas con el solvente (Naidu, 2000). El
procedimiento de elaboracin se muestra en la Figura 3.
La preparacin de los extractos se llev a cabo teniendo como referencia las
recomendaciones de elaboracin de productos homeopticos de las farmacopeas
brasilea, alemana y francesa (Carreo, 2000) y las experiencias previas de
preparaciones populares (Olaya y Mndez, 2003).
46
FIGURA 3. Obtencin de los extractos vegetales.

5 g de planta seca y triturada.
Macerar con 100 ml. de solvente Para

el extracto de aceite se utilizaron 25 ml
de solvente.
Agitar las muestras a 200 rpm durante

24 horas, a 25 C y 50 C.
Filtrar a vaco con filtro Whatman

No. 2.
Concentrar en Rotoevaporador hasta

un volumen de 20 ml, tanto el extracto
de Agua como el de Etanol.
Almacenar en tubos a 8 C hasta su

aplicacin.
Los extractos elaborados se obtuvieron con tres solventes:

U Agua potable
U Aceite vegetal, Aceite de cocina de girasol almacenado en la oscuridad a
21C.
U Etanol al 95%, ya que experimentalmente a sta concentracin el etanol no
muestra resultados inhibitorios efectivos.
Las temperaturas de extraccin fueron:
U 25C
U 50C
Y el tiempo de extraccin fue de 24 horas con frecuencia de agitacin constante a
200 revoluciones por minuto (rpm). Los extractos acuosos y etanlicos se
rotoevaporaron en Rotoevaporador Heidolph hasta obtener un volumen de 20 ml.
3.1.3. Diseo experimental Fase I
El modelo experimental est basado en un diseo factorial 3x2 para cada
experimento. Para cada especie vegetal o experimento, el primer factor se dio en
tres niveles correspondientes a los solventes de extraccin, etanol al 95%, agua y
47
aceite vegetal. El segundo factor se dividi en dos niveles, la temperatura de

extraccin, 25C y 50C. Cada tratamiento fue replicado cuatro veces. Las
condiciones experimentales se observan en la Tabla 9 y en la Figura 4. Las muestras
analizadas fueron 48 extracciones (24 extractos de cada planta).
Tabla 9. Tabla de muestras obtenidas. Frecuencia de agitacin: 200 rpm. Tiempo de
extraccin: 24 horas.
ESPECIES VEGETALES
TEMPERATURA DE EXTRACCIN
25C
50C
Calndula officinalis
Tropaeolum majus
Calndula officinalis + Etanol al 95%

Calndula officinalis + Agua potable
Calndula officinalis + Aceite vegetal
Calndula officinalis + Etanol al 95%
Tropaeolum majus + Etanol al 95%

Tropaeolum majus + Agua potable
Tropaeolum majus + Aceite vegetal
Tropaeolum majus + Etanol al 95%
FIGURA 4. Diseo experimental de la Fase I: Obtencin de extractos.
Calendula officinalis
S1
T1
S2
T2
T1
S1: Agua potable
Tropaeolum majus
S3
T2
T1
T1: 25C
S1
T2
T1
S2: Etanol al 95%
S2
T2
T2: 50C
T1
T2
T1
S3: Aceite Vegetal
S3
T2
3.1.4. Cuantificacin de los extractos

Despus de los tratamientos descritos se obtuvieron tres concentraciones: 250
g/ml, 125 g/ml y 62.5 g/ml, las cuales se calcularon as (Mukhopadhyay et al.,
2003):
3.1.4.1.
Maceracin
5g. planta + 100ml. C2H5OH

5g. planta + 100ml. H2O
[ ] Extracto etanlico
[ ] Extracto acuoso
48
Pasadas las 24 horas de maceracin, el rendimiento aproximado del etanol y el

agua fue del 50%. Por lo tanto, la primera concentracin obtenida para los
extractos se calcul teniendo en cuenta que no se parte de una sustancia pura sino
de la planta seca:
PE = Peso de la planta seca.
V1 x [ ]1 = V2 x [ ]2
100 ml. Solvente x 5 g.PE = (100 ml. Solvente x 50 %) x [ ]2
100 ml.
[ ]2 = 0.1 g.PE
ml
3.1.4.2.
Rotoevaporacin
Los extractos obtenidos se llevaron a rotoevaporacin hasta un volumen de 20 ml.

La concentracin final de los extractos etanlicos y acuosos fue:
V1 x [ ]1 = V2 x [ ]2
50 ml. Solvente x 0.1 g.PE = 20 ml. Solvente x [ ]2
ml
[ ]2 = 0.25 g.PE
ml
[ ]2 = 250 g.PE
ml
Extracto de aceite
5g. planta + 100ml. Aceite vegetal
[ ] Extracto oleoso
Como el rendimiento del aceite fue casi del 100%, este no se llev al
rotoevaporador:
V1 x [ ]1 = V2 x [ ]2
20 ml. Solvente x 5 g.PE = 20 ml. Solvente x [ ]2
20 ml.
[ ]2 = 0.25 g.PE
ml
[ ]2 = 250 g.PE
ml
49
De modo que la concentracin de la que se parte para todos los extractos es de

250 g/ml, las otras dos concentraciones, 125 g/ml y 62.5 g/ml, se lograron
completando volmenes con el solvente correspondiente (Mukhopadhyay et al.,
2003).
3.2.
FASE II: EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y

DETERMINACIN
DE
LA
CAPACIDAD
BACTERICIDA
O
BACTERIOSTTICA Y FUNGICIDA DE LOS EXTRACTOS
3.2.1. Microorganismos Indicadores
Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Saccharomyces cerevisiae

Los microorganismos se seleccionaron teniendo en cuenta su representatividad en
ensayos de susceptibilidad a antibiticos, su importancia en reas clnicas,
cosmticas y alimentarias y, la representacin de grupos de microorganismos como
son las bacterias: Gram positivas y Gram negativas y las levaduras.
Caractersticas de los microorganismos empleados para la evaluacin de la
actividad antimicrobiana de los extractos de Calndula officinalis y Tropaeolum
majus.
MICROORGANISMO
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
PROCEDENCIA
ATCC 460716
CLASIFICACIN
Coco
Gram positivo
Bacilo
Gram positivo
ATCC 25922
FERMIVIN No. 7013 INRA
Narbonne
Levadura
Gist-Brocades, Francia
PATOLOGAS
Intoxicacin alimentaria (Pascual,
M. 199x)
Intoxicacin alimentaria (Pascual,
M. 199x)
Ninguna Conocida
Las bacterias y la levadura se mantuvieron en placas de Agar Muller - Hinton y

placas de Agar Sabouraud Dextrosa 2 %, respectivamente; sto con el fin de
garantizar el trabajo homogneo con los microorganismos nombrados. A este
cepario se le llam cepas de mantenimiento y se conservaron a 4C (Modificado de
Garzn y Quintero, 1996).
3.2.2. Ensayo microbiolgico
Para la preparacin de los inculos de Escherichia coli y Staphylococcus aureus, se
trabaj con una concentracin de 108 clulas bacterianas, tomadas al finalizar su
fase logartmica (Ver Figuras 5 y 6) mientras que Saccharomyces cerevisiae se
trabaj con una concentracin de 106 clulas, tomada tambin al finalizar la fase
50
logartmica (Ver Figura 7). La razn por la cual se determin aplicar los
tratamientos de los diferentes extractos al finalizar la fase logartmica del
crecimiento de los microorganismos se debi al uso de los extractos como lo
plantea Ceylan (2004) en su articulo Antimicrobial Activity and Synergistic Effect of
Cinnamon with Sodium benzoate or Potassium Sorbate in Controlling Escherichia
coli O157:H7 in Apple Juice.
Las figuras muestran la curva de crecimiento para cada una de las cepas de los
microorganismos ensayados la cual sirvi para ubicar en qu lapso de tiempo
alcanzaban su fase exponencial.
Figura 5. Curva de crecimiento de Escherichia coli.
Curva de Crecimiento de
Escherichia coli *
10
Log (U FC/m l)
8
6
Fase Logartmica
4
2
0
0
12
16
20
24
28
32
Tiempo (horas)
Fuente: Curvas de crecimiento y Turbidez elaboradas por Henao A.L. y Trujillo S. en los laboratorios
de la Universidad de La Sabana..
51
Figura 6. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus.

Curva de Crecimiento de
10
L og (UFC/ml)
8
6
Fase Logartmica
4
2
0
0
12
16
20
24
28
32
36
Tiempo (horas)
Figura 7. Curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.

Curva de crecimiento
Saccaromyces cerevisiae *
7
6,5
Log (U FC /m l)
5,5
Fase Logartmica
4,5
4
0
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
Tiempo (horas)
de la Universidad de La Sabana.
Luego, se elabor una curva estndar de turbidez para cada microorganismo, Ver
Figuras 8 y 9 para Escherichia coli y Staphylococcus aureus, respectivamente y
52
Figura 10 para Saccharomyces cerevisiae, bajo el principio de que la turbidez es

proporcional a la cantidad de clulas.
U La turbidez es la propiedad ptica que causa que los rayos de luz sean
dispersados y absorbidos en lugar de ser transmitidos en lnea recta a travs
de una muestra, por lo tanto, en una muestra de un cultivo microbiano,
cada clula microbiana dispersar la luz, y a medida que estas clulas se
multipliquen, ms luz dispersar. La turbidez se expresa en NTU (Unidades
de turbidez Nefelomtricas). Las mediciones para construir y luego
estandarizar las muestras se hicieron en un Turbidmetro Termo ELECTRON
CORPORATION. AQUAfast II. Turbidity. Orion AQ2010. ( = 875 nm).
Figura 8. Curva estndar de Turbidez para Escherichia coli
TURBIDEZ VS UFC/ml
Escherichia coli
Lnea de
experimentacin
9,00
81,1
Log (UFC/ml)
8,00
Lnea de
experimentacin con
tendencia logartmica
12,7
7,00
4,3
6,00
1,9
5,00
y = 0,6915Ln(x) + 5,3382
4,00
R2 = 0,9544
0
20
40
60
80
100
TURBIDEZ (NTU)
Fuente: Curvas de crecimiento y Turbidez elaboradas por Henao A.L. y Trujillo S. en los
laboratorios de la Universidad de La Sabana.
Clculo de la turbidez para Escherichia coli correspondiente a 108 clulas

bacterianas.
Y 5.3382
0.6915
X=e
8 5.3382
0.6915
X=e
53
3.8493
X=e
X=
46.96 NTU
Figura 9. Curva estndar de turbidez para Staphylococcus aureus

TURBIDEZ Vs UFC/ml
Lnea de
experimentacin
Log (UFC/ml)
9,00
8,00
26,8
7,00
11
6,00
5,00
Lnea de
experimentacin con
y = 1,0979Ln(x) + 4,2654
4,00
5,5
10,5
15,5
20,5
25,5
30,5
R = 0,9955
TURBIDEZ (NTU)
Fuente: Curvas de crecimiento y Turbidez elaboradas por Henao A.L. y Trujillo S. en los
laboratorios de la Universidad de La Sabana..
Clculo de la turbidez para Staphylococcus aureus correspondiente a 108 clulas

bacterianas.
Y 4.2654
1.0979
X=e
8 4.2654
1.0979
X=e
3.4016
X=e
54
X=
30.01 NTU
Figura 10. Curva estndar de turbidez para Saccharomyces cerevisiae

TURBIDEZ Vs UFC/ml
Log (UFC/ml)
Lnea de
experimentacin
8
7
6 2,4
16,0
Lnea de
experimentacin con
85,0
27,3
y = 0,2566Ln(x) + 5,1614
R2 = 0,9688
0
20
40
60
80
100
TURBIDEZ (NTU)
Clculo de la turbidez para Saccharomyces cerevisiae correspondiente a 106

clulas.
Y 5.1614
0.2566
X=e
6 5.1614
0.2566
X=e
3.2681
X=e
X=
26.26 NTU
El procedimiento descrito en la Figura 11 resume la manera como se prepar el

inculo, es el protocolo de estandarizacin de cada microorganismo indicador para
someterlo a la exposicin de los extractos obtenidos en la Fase I..
55
FIGURA 11. Preparacin del inculo.

CEPA DE MANTENIMIENTO
Sembrar por estras en placas Muller
Hinton las bacterias y en Sabouraud
Dextrosa 2% la levadura.
Incubar a 37C por 24 horas las bacterias y a
25C por 48 horas la levadura.
Tomar una colonia y resembrar en 10 ml de
caldo Muller Hinton Sabouraud
Dextrosa 2% segn corresponda.
Incubar a 37C por 24 horas las bacterias y a
25C por 24 horas la levadura.
Resembrar 1 ml en 10 ml de caldo Muller
Hinton Sabouraud Dextrosa 2% segn
corresponda.
Incubar a 37C las bacterias y a 25C la
levadura por el tiempo que indique la curva
hasta alcanzar su fase logartmica.
Realizar diluciones de los

microorganismos con el caldo de cultivo
correspondiente hasta ajustar la
concentracin de clulas de cada cepa
segn lectura del turbidmetro.
8
6
Bacterias: 10 Levadura: 10
3.2.3. Diseo experimental Fase II

Para cada experimento obtenido de cada extracto preparado se evalu su
capacidad antimicrobiana segn diseo factorial 3x3, donde cada tratamiento se
prob por triplicado. Ver Figura 12.
56
FIGURA 12. Diseo experimental de la Fase II: Evaluacin de la actividad

antimicrobiana y determinacin de la capacidad bactericida o bacteriosttica y
fungicida o fungisttica.
Calendula officinalis y/o Tropaeolum majus
S1
S2
T1
T2
T1
T2
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
Z1
Z2
Z3
Z1
Z2
Z3
Z1
Z2
Z3
Z1
Z2
Z3
S1: Agua potable

T1: 25C
C1: 62,5 ug/ml
Z1: Escherichia coli
S2: Etanol al 95%

T2: 50C
C2: 125 ug/ml
Z2: Staphylococcus aureus
C3: 250 ug/ml

Z3: Saccharomyces cerevisiae
3.2.4. Evaluacin de la actividad antibacteriana y antifngica

Obtenidos los extractos se procedi a su evaluacin antimicrobiana contra las dos
bacterias, E. coli y S. aureus y contra la levadura, S. cerevisiae, por los mtodos que
se describen a continuacin:
3.2.4.1.
Mtodo de difusin por disco
Este mtodo permiti determinar la sensibilidad de cada cepa a los

antimicrobianos, ver Figura 13. Para evaluar la actividad antimicrobiana de los
distintos extractos se obtuvieron discos de papel absorbente de 6 mm. de dimetro,
se esterilizaron como todo material seco, a 200C por una hora, y se impregnaron
con los extractos a las tres concentraciones obtenidas: 250 g/ml, 125 g/ml, 62.5
g/ml.
Los medios de cultivo empleados fueron Muller Hinton para bacterias y la
sustancia patrn utilizada fue Sulfato de estreptomicina, usada en trabajos
preliminares por su amplio espectro (Garzn y Quintero, 1996) a una
concentracin de 500 g/ml. Para la levadura, el medio de cultivo utilizado fue
Sabouraud Dextrosa 2% y la sustancia patrn fue Nitrato de isoconazol, escogido
57
por su aplicacin en trabajados preliminares contra levaduras del mismo tipo

(Garzn y Quintero, 1996).
En cada placa se inocularon por extensin 0.1 ml del microorganismo indicador y
transcurridos 15 minutos se coloc un disco de cada concentracin sobre la
siembra. Este lapso de tiempo se consider segn recomendaciones del Comit
Americano de Estandarizacin de Laboratorios Clnicos (NCCLS, 1996). Luego, se
procedi a la incubacin de las placas dentro de los 15 minutos posteriores a la
colocacin de los discos, las bacterias a 37C por 24 horas y la levadura a 25C por
48 horas.
Cabe resaltar que la variacin de los tiempos anteriormente nombrados puede
ocasionar un desplazamiento de los resultados traducindose en errores en el
tamao de la zona de inhibicin; tambin se tuvo en cuenta que la difusin del
disco comienza instantneamente despus de apoyado sobre el agar, por lo tanto
estos nunca deben levantarse para cambiarlos de lugar pues el disco ya no tendr
la carga antimicrobiana original y el resultado del antibiograma de desviar
(Pastern et al., 2003).
Pasado el tiempo de incubacin se tom la medida en milmetros, por medio de
regleta milimetrada, del halo formado alrededor del disco, dependiendo de su
medida se logr determinar el nivel de sensibilidad del microorganismo frente al
extracto. Para aquellos halos en los que el dimetro no se form homogneamente
se promediaron los dimetros mnimos y mximos del halo de cada disco.
58
Figura 13. Evaluacin antimicrobiana por el Mtodo de difusin por disco.

Homogenizar la dilucin
indicada del
microorganismo
correspondiente.
Tubos con 20 ml del Agar

correspondiente a cada
cepa. Mantenido a 45
2C.
Muestras de extractos a
diferentes concentraciones,
blanco y sustancia patrn.
Inocular por extensin 0,1

ml del microorganismo.
Verter en cajas de Petri

estriles de 9 cm de
dimetro.
Impregnar los discos de

papel (=6 mm) con cada
muestra durante 15 min.
Dejar solidificar
Colocar sobre la superficie

del agar.
Esperar 15 minutos a
temperatura ambiente
Esperar 15 minutos a
temperatura ambiente
Incubar a 37C o 25C.
Realizar lecturas a las 24

horas para las bacterias y
48 horas para la levadura.
3.2.5. Determinacin de la actividad bactericida o bacteriosttica y

fungicida o fungisttica
3.2.5.1.
Mtodo del tubo pequeo
Este mtodo permiti medir la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) de los

extractos. Los tubos empleados fueron viales de 5 cm de altura por 2 cm de
dimetro en la base. A cada tubo con 2 ml de agar Muller Hinton para bacterias
agar Sabouraud Dextrosa 2% para la levadura, se aadieron 2 ml de extracto a
evaluar, segn las concentraciones ya nombradas. Para realizar este procedimiento
se mantuvo el agar a bao de Mara entre 45 5C para evitar su solidificacin en
el momento de preparar las muestras (Mukhopadhyay et al., 2003). Despus de
solidificado el medio, fueron inoculados 50 l del microorganismo a ensayar. El
procedimiento se ve en la Figura 14.
El mtodo se llev a cabo para cada rplica en sus tres concentraciones por
triplicado. A aquellos tubos con la mnima concentracin de sustancia donde no se
detect crecimiento, se les realiz un raspado superficial con asa estril para luego
59
inocular en placa de agar Muller Hinton agar Sabouraud Dextrosa 2%, segn
el microorganismo. Estas placas se incubaron por 24 horas a 37C para las bacterias
y 48 horas a 25C para la levadura, pasado el tiempo mnimo de incubacin se
procedi a observar si se presentaba crecimiento o no del microorganismo en la
superficie de la placa; de esta manera se determin la actividad bactericida y/o
fungicida de los extractos que no generaron nuevo crecimiento del
microorganismo y la actividad bacteriosttica y/o fungisttica para aquellos s
permitieron el crecimiento del microorganismo.
Figura 14. Evaluacin de la actividad antimicrobiana por el Mtodo del tubo
pequeo.
Viales con 2 ml del Agar
correspondiente
mantenido a 50 5C.
Homogeneizar la dilucin
indicada del
microorganismo.
Muestras de extractos a
diferentes concentraciones,
blanco y sustancia patrn.
Agregar 2 ml al agar
fundido
Aadir 50 l y distribuir
homogneamente sobre
la superficie.
Homogeneizar la mezcla en
Vortex.
Dejar solidificar
Incubar a 37C o 25C
Realizar lecturas a las 24

horas para las bacterias y 48
horas para la levadura.
3.3.
FASE III: APLICACIN DE LOS EXTRACTOS EN SISTEMAS IN VIVO
3.3.1. Materiales de ensayo

Pulpa de fruta: Guanbana
La pulpa de Guanbana marca SAS, en presentacin de 230 g. se obtuvo en el
supermercado local Carulla. La pulpa 100% natural, libre de conservantes, se
mantuvo refrigerada a 8C.
60
Jabn gel
Se obtuvo el gel base de preparacin de jabn en laboratorio qumico local. Al gel
se le realizaron pruebas preliminares de sensibilidad sobre los microorganismos de
ensayo y revel una inhibicin de crecimiento microbiano, por lo tanto se decidi
utilizar el extracto diluido en agua en un porcentaje de 50% agua - 50% extracto,
para demostrar directamente su actividad.
3.3.2. Mtodos de aplicacin
Para explorar el comportamiento de los extractos en matrices alimentarias y no
alimentarias se realiz la aplicacin de los extractos as:
3.3.2.1.
Aplicacin de los extractos acuosos como conservantes

naturales en pulpa de frutas
La muestra de pulpa inicial se dividi en dos, cada una de ellas correspondiente a

un volumen de 500 ml, al cual se inocularon 12.5 ml de E. coli y 12.5 ml S. aureus;
esta cantidad replica el porcentaje de microorganismo indicador que se inocul en
la fase II, el cual hace referencia al 2.5% de microorganismo respecto del volumen
de la pulpa.
A la pulpa contaminada con E.coli se aadieron 250 ml del extracto acuoso de
Calndula officinalis rotoevaporado con una concentracin de 250 g de PEq/ml
de la planta y a la pulpa contaminada con S. aureus, se aadieron 250 ml del
extracto acuoso de Tropaeolum majus tambin rotoevaporado y con una
concentracin de 250 g de PEq/ml de la planta. Luego, se porcionaron muestras
de pulpa de 20 ml cada una, se refrigeraron a 8C durante 8 das, cada da se
realiz siembra en placa de agar de conteo (PCA), incluyendo la muestra blanco
(Pulpa contaminada sin extracto).
3.3.2.2.
Aplicacin de los extractos etanlicos en jabn - gel

antibacterial para uso sin enjuague
Para determinar el efecto de la solucin de agua-extracto etanlico sobre un

sistema in vivo se realizaron frotis de manos de 2 individuos, haciendo colocar sus
manos despus de ejecutar actividades cotidianas sobre los siguientes medios
selectivos: Agar Placa de Conteo (PCA) para identificar microorganismos en
61
general, Agar MacConkey (MC) para enterobacterias y Agar de papa dextrosa

(PDA) para hongos y levaduras.
Las actividades cotidianas de los dos individuos fueron:
a) Tomaron un bao completo.
b) Ingirieron su desayuno y posteriormente lavaron sus manos con jabn de
tocador.
c) Tomaron un bus de transporte pblico.
d) Arribaron al laboratorio de microbiologa para someterse al frotis anteriormente
mencionado.
A los individuos que se analizaron se les aplic la locin sobre las manos y sin
enjuagar se realiz posteriormente un nuevo frotis, con el fin de comparar la
reduccin en el nmero de microorganismos identificados previamente.
62
4. RESULTADOS Y ANLISIS
4.1.
FASE I: OBTENCIN DE EXTRACTOS
Para cada extracto, a partir de 5 g de material seco y triturado de cada planta y de

100 ml de solvente puro se obtuvo aproximadamente el 50% de rendimiento.
Luego, al concentrar en un Rotoevaporador Heidolph se obtuvieron 20 ml de cada
extracto, de concentracin calculada 250 g/ml. A los extractos obtenidos se les
determin el valor de pH, medidas que se resumen en la Tabla 10.
El agua se eligi como solvente teniendo en cuenta que es un solvente puro y de
baja reactividad (Ghisalberti, 1993). El etanol al 95% es un solvente ideal para
extraer gran cantidad de sustancias naturales antimicrobianas solubles en solventes
orgnicos (William y Harborne, 1989), (Kyung et al., 1997), (Shofran et al., 1998). A
pesar de que la utilizacin del metanol se recomienda para la extraccin de
fitoantimicrobianos, este procedimiento tiene como desventaja que las saponinas
pueden llegar a degradarse, ms an s se utiliza una solucin de metanol caliente
(Massiot et al., 1996). Por ltimo, el aceite se eligi para la obtencin de sustancias
lipoflicas que pudieran presentar actividad antimicrobiana (Naidu, 2000), como es
el caso de los flavonoides y algunos aceites esenciales (Harborne, 1983).
Otra razn para escoger el etanol como solvente de extraccin fue el
planteamiento de Hirasa & Takemasa (1998), quienes aseguraron que a pesar de
que las especias son comercializadas frescas o secas, a las secas se les deben extraer
los componentes activos con solventes como el etanol ya que al utilizar solventes
puros se logra arrastrar la mayor cantidad de componentes antimicrobianos
(Ghisalberti, 1993).
Para el desarrollo de esta fase se escogieron solventes de baja reactividad
(Ghisalberti, 1993) y los solventes se obtuvieron en condiciones de extraccin
moderadas con el fin de evitar una posible inactivacin de las sustancias
antimicrobianas.
63
Tabla 10. pH de extractos vegetales de Calndula officinalis y Tropaeolum majus.

EXTRACTOS VEGETALES
pH
Calndula officinalis + Etanol al 95 %
Calndula officinalis + Etanol al 95 %
4.0
5.5
3.5
4.0
5.5
3.5
Tropaeolum majus
Tropaeolum majus + Etanol al 95 %
Tropaeolum majus + Etanol al 95 %
4.5
6.0
3.5
4.5
6.0
3.5
Un anlisis previo de estos resultados indicaron tericamente que los extractos que
tendran un mayor efecto inhibitorio sobre los microorganismos de ensayo seran
aquellos con pH ms cido, en este caso los que se obtuvieron con aceite vegetal,
los cuales se valoraron en pH de 3.5. Sin embargo, en la segunda fase de los
ensayos preliminares de la investigacin se observ que estos extractos no
inhibieron crecimiento microbiano, una explicacin a este resultado es el hecho de
que el aceite form micelas, y estas encapsularon a las sustancias activas de las
plantas, dejando a los extractos acuosos y etanlicos como los solventes que
participaron en la ejecucin de la Fase II y Fase III.
No se plante la neutralizacin de los extractos con el fin de conferir atributos
sinrgicos entre los solventes, los fito-antimicrobianos y sus respectivas
caractersticas fisicoqumicas (Garzn y Quintero, 1996).
En el Anexo 1 se observa el anlisis de inhibicin inicial de cada uno de los
extractos frente a los tres microorganismos indicadores.
4.2.
FASE II: EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y

DETERMINACIN
DE
LA
CAPACIDAD
BACTERICIDA
O
BACTERIOSTTICA Y FUNGICIDA O FUNGISTTICA
4.2.1. Evaluacin de la actividad antibacteriana y antifngica

4.2.1.1.
Mtodo de difusin por disco
64
Este mtodo permiti determinar la sensibilidad de los extractos contra los

microorganismos indicadores: E. coli, S. aureus y S. cerevisiae. La actividad
antimicrobiana de los distintos extractos se obtuvo mediante la medicin de los
dimetros formados sobre las placas de agar, resultado de la inhibicin aparente de
cada extracto. Para cada extracto se evaluaron tres concentraciones: 250 g/ml,
125 g/ml y 62.5 g/ml. Los resultados de las mediciones de los dimetros de los
halos de inhibicin de esta evaluacin se pueden observar en el Anexo 2 y en la
Figura 15.
Los extractos acuosos de Calndula officinalis obtenidos a 25C y los extractos
acuosos de Tropaeolum majus obtenidos a 25C, no presentaron actividad
antimicrobiana, en ninguna de sus concentraciones, ya que alrededor de los discos
no se evidenci ningn tipo de formacin de halo, lo que permiti determinar que
las sustancias activas presentes en estas plantas, que pudiesen inhibir crecimiento
microbiano, fueron de difcil extraccin a temperaturas medias con el agua como
solvente.
La presencia de fitofenoles puede darse en este tipo de extractos debido a la
naturaleza de la Calndula officinalis, por presentar en su composicin una fraccin
de aceites esenciales, sin embargo, ya que ciertos componentes de stas son
hidrfobos puede que el mtodo de difusin por disco no fuese el apropiado para
evaluar su actividad (Hammer et al., 1999), adems, la temperatura de extraccin,
el pH y la coexistencia con otras sustancias como protenas, lpidos y minerales
puede afectar la actividad biolgica de los fenoles.
De los 29 tratamientos aplicados, de los cuales 24 son directamente la aplicacin
de los extractos sobre los microorganismos indicadores, la cepa que ms fue
afectada fue la levadura Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, los resultados
obtenidos para las bacterias tambin mostraron resultados con diferencias
significativas entre las variables planteadas desde la variacin del solvente hasta la
reduccin de la concentracin del soluto en el extracto, pasando por dos
temperaturas, que sin ser extremas tambin determinaron diferencias significativas,
segn el ANOVA aplicado a los datos experimentales, Ver Anexo 3.
65
Figura 15. Comparacin de Promedios de dimetros de halos de inhibicin por

cada tratamiento aplicado a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae.
Comparacin de dimetros promedio de los halos de inhibicin por tratamiento aplicado a cada
microorganismo
E. coli
S. aureus
S. cerevisiae
20
15
10
5
Tratamiento 29
Tratamiento 28
Tratamiento 27
Tratamiento 26
Tratamiento 25
Tratamiento 24
Tratamiento 23
Tratamiento 22
Tratamiento 21
Tratamiento 20
Tratamiento 19
Tratamiento 18
Tratamiento 17
Tratamiento 16
Tratamiento 15
Tratamiento 14
Tratamiento 13
Tratamiento 12
Tratamiento 11
Tratamiento 9
Tratamiento 10
Tratamiento 8
Tratamiento 7
Tratamiento 6
Tratamiento 5
Tratamiento 4
Tratamiento 3
Tratamiento 2
0
Tratamiento 1
Dimetro de inhibicin (mm)
25
Tratamiento
TRAT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
SOLVENTE
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
Agua
Etanol
Patrn
Patrn
Patrn
PLANTA
T C
CONC mg/ml
C. officinalis
25
25
25
50
50
50
25
25
25
50
50
50
25
25
25
50
50
50
25
25
25
50
50
50
250
125
62,5
250
125
62,5
250
125
62,5
250
125
62,5
250
125
62,5
250
125
62,5
250
125
62,5
250
125
62,5
unica
unica
500
250
125
C. officinalis
C. officinalis
C. officinalis
C. officinalis
C. officinalis
T. majus
T. majus
T. majus
T. majus
T. majus
T. majus
C. officinalis
C. officinalis
C. officinalis
C. officinalis
C. officinalis
C. officinalis
T. majus
T. majus
T. majus
T. majus
T. majus
T. majus
La Figura 15 es una representacin de los promedios de los dimetros de inhibicin

de crecimiento de las cepas, obtenidos en cada tratamiento. Los espacios en blanco
hacen referencia a dimetros de valor cero milmetros, para el caso de los
tratamientos con agua a 25C para las dos plantas y para el blanco del agua como
solvente.
66
Desde la Figura 16 hasta la Figura 20 se presentan las grficas comparativas entre

las variables: solventes, plantas y temperaturas del experimento en la fase I para
determinar el extracto o extractos con mejores resultados segn el mtodo de
difusin por disco.
Figura 16. Comparacin de promedios por solventes de extractos aplicados a E.
coli, S. aureus y S. cerevisiae.
Comparacin de promedios por solventes de los extractos aplicados a cada
microorganismo
14,000
12,000
10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
0,000
E. coli
S. aureus
Agua mm
3,604
3,792
S. cerevisiae
5,625
Etanol mm
11,854
11,583
12,042
Microorganismo
En la Figura 16 se observan los resultados evaluados comparativamente por

solvente, en donde se determin que el etanol como solvente mostr resultados
ms significativos que los obtenidos con el agua y determinaron una diferencia
significativa segn ANOVA, ver Anexo 3, respecto a todos los tratamientos
revisados individualmente. Especficamente, para S. cerevisiae los extractos acuosos
y etanlicos muestran mayor poder antimicrobiano que para las bacterias.
67
Figura 17. Comparacin de promedios por plantas de extractos aplicados a E. coli,

S. aureus y S. cerevisiae.
Comparacin de promedios por plantas de los extractos aplicados a cada microorganismo
9,500
9,000
8,500
8,000
7,500
7,000
6,500
E. coli
S. aureus
S. cerevisiae
Calendula officinalis (mm)
7,979
7,667
8,750
Tropaleoum majus (mm)
7,479
7,708
8,917
Microorganismo
Los resultados de los promedios obtenidos comparados por planta, Figura 17,
demostraron que para E. coli los tratamientos con C. officinalis y T. majus tienen
diferencias significativas entre s segn ANOVA, ver Anexo 3; siendo la Calndula
ms efectiva sobre esta bacteria, posiblemente debido a la presencia de saponinas.
Para S. aureus y S. cerevisiae la comparacin de los tratamientos slo teniendo en
cuenta la planta permite concluir que no hay diferencia significativa en los
resultados obtenidos entre Calndula y Capuchina, esto mismo puede observarse
en la Figura 17 al comparar que los valores promedio de los dimetros de halos
formados no se alejan entre una planta y otra.
68
Figura 18. Comparacin de promedios de la interaccin entre solvente y planta de

extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae.
Comparacin de promedios de la interaccin entre solvente y planta de extractos aplicados a cada
microorganismo
14,000
12,000
10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
0,000
E. coli
S. aureus
S. cerevisiae
Agua - Calendula officinalis (mm)
4,375
3,875
5,833
Agua - Tropaleoum majus (mm)
2,833
3,708
5,417
Etanol - Calendula officinalis (mm)
11,583
11,458
11,667
Etanol - Tropaleoum majus (mm)
12,125
11,708
12,417
Microorganismo
La interaccin entre el solvente y la planta en cada extracto revel que los extractos
etanlicos, como previamente se evidenci en la comparacin de solventes, logr
obtener mayores dimetros de inhibicin frente a todos los microorganismos
indicadores, sin embargo, los extractos acuosos de C. officinalis comparados con los
extractos acuosos de T. majus lograron dimetros de inhibicin mayores tanto en la
bacterias como en la levadura, siendo ms efectivo sobre S. cerevisiae. Por otro
lado, como se observ en la Figura 18, los extractos etanlicos de T. majus fueron
ms efectivos, sobre los tres microorganismos que los obtenidos con este mismo
solvente a partir de C. officinalis. Sin embargo, sta diferencia entre los dimetros
de inhibicin obtenidos para cada juego de solvente y extracto vegetal evaluados
sobre cada microorganismo, no revela diferencias significativas ni para S. aureus, ni
para S. cerevisiae, mientras que la sinergia entre solvente y extracto vegetal frente a
E. coli s presenta diferencias significativas en sus resultados segn ANOVA, ver
Anexo 3.
69
Figura 19. Comparacin de promedios de la interaccin entre temperatura y planta

de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae.
Comparacin de promedios de la interaccin entre temperatura y planta de extractos aplicados a cada
microorganismo
14,000
12,000
10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
0,000
E. coli
S. aureus
S. cerevisiae
25 C - Calendula officinalis (mm)
5,083
4,917
5,792
25 C - Tropaleoum majus (mm)
5,958
6,000
5,833
50 C - Calendula officinalis (mm)
10,875
10,417
11,708
50 C - Tropaleoum majus (mm)
9,000
9,417
12,000
Microorganismo
En la Figura 19 se observa que los extractos obtenidos a 25C a partir de T. majus

lograron inhibir crecimiento microbiano en mayor proporcin que los obtenidos
bajo las mismas condiciones a partir de C. officinalis. Aquellos extractos obtenidos
incrementando la temperatura hasta 50C, resaltando los que se obtuvieron a partir
de C. officinalis, revelaron mejores y mayores dimetros de inhibicin, esta actividad
pudo deberse al incremento de la temperatura, la cual permiti la extraccin de
fracciones de aceites esenciales, representados por los terpenos y la obtencin de
compuestos fenlicos que al reaccionar con las protenas de la membrana
citoplasmtica de los microorganismos causa un cambio en su permeabilidad,
produciendo la fuga de solutos (Juven et al., 1994). Es importante aclarar que tanto
para E.coli como para S. aureus los resultados de las comparaciones entre
tratamientos en cuanto a la interaccin entre planta y temperatura tienen
diferencias significativas segn ANOVA, ver Anexo 3, mientras que para S.
cerevisiae no la existen tales diferencias.
70
Figura 20. Comparacin de promedios de la interaccin entre temperatura, planta

y solvente de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae.
Comparacin de promedios de la interaccin entre temperatura, planta y solvente de extractos aplicados a cada
microorganismo
14,000
12,000
10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
0,000
E. coli
S. aureus
S. cerevisiae
25 C - Calendula off icinalis - Agua (mm)
0,000
0,000
0,000
25 C - Tropaleoum majus - Agua (mm)
0,000
0,000
50 C - Calendula off icinalis - Agua (mm)
8,750
7,750
11,667
50 C - Tropaleoum majus - Agua (mm)
5,667
7,417
10,833
25 C - Calendula off icinalis - Et anol (mm)
10,167
9,833
11,583
0,000
11,917
12,000
11,667
50 C - Calendula off icinalis - Et anol (mm)
13,000
13,083
11,750
50 C - Tropaleoum majus - Et anol (mm)
12,333
11,417
13,167
25 C - Tropaleoum majus - Et anol (mm)
Microorganismo
Al analizar en la Figura 20 la interaccin de todas las variables se observa que la

actividad del extracto etanlico de T. majus obtenido a 50C se destac obteniendo
sobre S. cerevisiae el mayor dimetro de inhibicin, debido probablemente a la
presencia de cidos fenlicos, carotenoides y flavonoides dentro de este extracto
(Perry, 2004).
Para E. coli el extracto de mayor actividad fue el de C. officinalis en etanol obtenido
a 50C. El mecanismo de accin de la actividad antimicrobiana de los
bioconservantes no se entiende totalmente. Sin embargo, se piensa que los
terpenoides y fenoles poseen accin inhibitoria contra microorganismos ya que
causan la ruptura de la membrana (Cichewicz y Thorpe, 1996); (Lambert et al.,
2001). Los fenoles simples y flavonoides parecen inhibir el crecimiento ligando el
bioqumico esencial al metabolismo. Se piensa que las cumarinas y alcaloides
pueden inhibir el crecimiento de microorganismos a nivel gentico (Hoult y Paya,
1996); (Rahman y Choudhary, 1995).
Para S. aureus el mayor dimetro de inhibicin lo tuvo tambin el extracto de C.
officinalis obtenido a 50C en etanol, seguido por el extracto de T. majus obtenido a
25C en etanol, cabe resaltar que se esperaba tener resultados significativos con el
extracto etanlico de T. majus obtenido a 50C, sin embargo a esta temperatura y
con este solvente los componentes responsables de la actividad antimicrobiana de
Tropaleoum se presume que se inactivaron .
71
Los dimetros obtenidos para cada uno de los extractos en las tres concentraciones
se observan a continuacin en las fotografas resultantes de la aplicacin del
mtodo de difusin por disco, desde la Figura 21 hasta la Figura 32.
Figura 21. Fotografa de los dimetros de inhibicin de crecimiento de E. coli,
obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en Agua a una
temperatura de 50C.

obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en Etanol al 95% a una
temperatura de 50C.
72
Figura 23. Fotografa de los dimetros de inhibicin de crecimiento de S. aureus,

obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en Agua a una
temperatura de 50C.

obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en Etanol al 95% a una
temperatura de 50C.
73
Figura 25. Fotografa de los dimetros de inhibicin de crecimiento de S. cerevisiae,

obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en Agua una temperatura
de 50C.

obtenidos a partir de un extracto de Calndula officinalis en Etanol al 95 % a una
temperatura de 50C.
74

obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Agua a una
temperatura de 50C.

obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95 % a una
temperatura de 50C.
75

temperatura de 50C.

temperatura de 50C.
76

temperatura de 50C.

temperatura de 50C.
77
Las sustancias activas de la Calndula officinalis reportadas en la bibliografa

comprenden aceites esenciales, muclagos, glucsidos, xantofilas, saponinas,
(Carreo, 2000).
Las saponinas presentes en la calndula, son compuestos que protegen a la
planta del estrs bitico y promueven actividades antibacteriales y
antifngicas, demostrando su amplio espectro y postulndose como
conservantes de alimentos (Naidu, 2000).
Las saponinas de la calndula pudieron haber actuado sobre las bacterias por
medio de la interaccin con la membrana de esteroles. Las membranas que
son bajas en colesterol no presentan sensibilidad a las saponinas (Tayeka,
1997), en este caso el microorganismo ms sensible a las saponinas fue S.
cerevisiae, y teniendo en cuenta que el extracto ms efectivo fue el de
Capuchina, esta planta podra tener mayor contenido de saponinas.
Saccharomyces al pertenecer a los eucariota y presentar en su membrana
citoplasmtica esteroles, tales como el colesterol, la hace ms rgida que los
procariota. Esto permiti afirmar que las membranas plasmticas de las
bacterias, las cuales carecen de esteroles fueron menos sensibles a los
extractos de Capuchina que a los de Calndula.
El grado de actividad de las saponinas depende de la estructura de la misma y
el microorganismo objetivo (Masamitsu et al., 1998). La saponina ms comn
y ms efectiva encontrada hasta el momento contra las Gram positivas es la
de la hiedra (Kiim et al., 1987).
El efecto producido por las saponinas sobre las bacterias es la liberacin de
protenas y enzimas de las bacterias (Zablotowicz et al., 1996). Y aunque su
efecto no es especfico, las saponinas actan sobre la membrana de los
microorganismos con las protenas, esteroles y fosfolpidos causando una
predisposicin a ella. Las saponinas triterpenas y esferoidales comnmente
demuestran actividades antifngicas (Gruiz, 1996).
Venikar y Jangle (1992), evaluaron extractos acuosos y etanlicos de las hojas
y flores de Calndula officinalis contra S. aureus y E.coli concluyendo que los
extractos acuosos y etanlicos obtenidos a partir de las hojas no tuvieron
efectos significativos contra S. aureus, mientras que los extractos acuosos y
etanlicos de las flores tuvieron efectos significativos contra la misma cepa.
Por otro lado, todos los extractos tuvieron efectos significativos contra E. coli,
definiendo una mayor actividad contra las bacterias Gram negativas.
Kasiram y Sakharkar (2000), evaluaron la actividad antifngica de un extracto
de flores de calndula a partir de ter de petrleo, cloroformo, acetona y
etanol al 95%. Los cuatro extractos mostraron efectos inhibitorios contra:
Aspergillus niger, Rhizopus, Candida albicans, Candida tropicales y

Rhodotorula glutinis.
78
En cuanto a los flavonoides que se presentan en las flores, races y cortezas de

color amarillo, caracterstica que le permite a la planta protegerse de la
radiacin UV producida por el sol (Swain, 1979), tambin hicieron parte de
los fitoanimicrobianos responsables de la inhibicin causada por los extractos
de las plantas obtenidos. Los flavonoides suceden como glicsidos y los ms
conocidos como antimicrobianos son la mircetina la quercetina y el
kaempferol, estos ltimos contenidos en Tropaleoum majus al igual que en
Calndula officinalis (Cheynier y Rigaud, 1986).
Por la inestabilidad de los flavonoides y su posible degradacin se tuvo en
cuenta ser cuidadoso en el procesamiento de las plantas, pues la accin de las
enzimas de la planta fresca causan la degradacin, tanto en el secado de la
planta, como en el almacenamiento se consider controlar la temperatura por
la presencia de taninos o antocianinas. La actividad enzimtica pudo evitarse
incluyendo alcohol como solvente de extraccin (Naidu, 2000).
Cabe aclarar que la determinacin de las sustancias responsables de la
inhibicin de crecimiento de los microorganismos indicadores y estructura
qumica de las plantas de esta investigacin, no son objeto de este estudio;
sin embargo la actividad antimicrobiana evaluada de C. officinalis y T. majus
podra deberse a la presencia de alguno o varios de los fito-antimicrobianos
mencionados en el marco terico entre los que se destacan los siguientes:
-
Flavonoides: Wyman y Van Etten (1977) observaron la actividad

antimicrobiana de los flavonoides contra Pseudomonas, Xantomona y
Acromobacter, los resultados mostraron un efecto leve a moderado
contra las pseudomonas pero una fuerte actividad contra
Acromobacter.
Extractos etanlicos de las hojas de Psiadia trinervia, especie del

gnero de las Compuestas, al cual pertenece la capuchina, fueron
evaluados por Wang et al. (1983), quienes midieron la actividad
antibacterial contra Bacillus cereus dando resultados positivos y
planteando la responsabilidad del efecto antimicrobiano a los
glucosinolatos.
Los glucosinolatos tales como los Isotocianatos han mostrado un amplio

rango de efectos antibacteriales y antifngicos, sin embargo ciertos
estudios con animales revelan toxicidad en algunos de ellos cuando los
glucosinolatos estn purificados (Naidu, 2000).
Los glucosinolatos estn presente en la familia de las Tropaeolaceae, que
adems presentan un tipo de aceite de mostaza. Estos fito-antimicrobianos
se producen dentro de la planta cuando est amenazada por insectos
(Olsson y Jonasson, 1994).
79
Existen varios tipos de glucosinolatos que pueden extraerse por simple

lixiviacin con agua hasta utilizar solvente como etanol al 95%. El extracto
obtenido se debe mantener a bajas temperaturas (Kyung et al., 1997)
(Shofran et al., 1998).
Shofran et al., (1998) report el efecto inhibidor de un glucosinolato contra E.
coli, S. aureus, B. subtilis, entre otras. Delaquis y Sholberg (1997), probaron
alilisotiocioanato (AITC) gaseoso contra E. coli, Salmonella typhimurium,
Pseudomonas y Penicillium expansun, confirmando la actividad inhibidora
sobre los microorganismos nombrados.
-
Los terpenos presentes en los aceites esenciales son los principales

antimicrobianos, as lo demuestran estudios de los mecanismos por los
cuales las especias inhiben el crecimiento de diferentes
microorganismos.
4.2.2. Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria, la
actividad bactericida o bacteriosttica y fungicida o fungisttica
4.2.2.1.
Determinacin
de
la
actividad
bactericida
o
bacteriosttica y fungicida o fungisttica por medio del
mtodo del tubo pequeo
Este mtodo permiti determinar la concentracin mnima inhibitoria (CMI), la

cual se define como la concentracin de agente antimicrobiano que inhibe la
divisin celular de una clula de un microorganismo normal (Garzn y
Quintero, 1996). La menor concentracin del tubo donde se produjo
inhibicin total se consider como la CMI; sta ltima puede estar entre la
concentracin que produce la inhibicin total y la mitad de sta (Kavanagh,
1979).
Las tablas desde la 11 hasta la tabla 18 muestran los resultados de la
aplicacin de este mtodo, e indican la capacidad bactericida o
bacteriosttica y fungicida o fungisttico de los extractos. Los resultados de la
aplicacin de este mtodo en las otras 3 rplicas se pueden ver en el Anexo 4.
Es importante anotar que los siguientes valores representan
comportamiento de cada extracto sobre cada microorganismo de ensayo:
0: Representa inhibicin total de crecimiento.
1: Representa crecimiento intermedio entre el blanco y el patrn.
2: Representa el blanco de crecimiento del microorganismo.
80
el
Tabla 11. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de

Calndula officinalis a diferentes concentraciones, obtenido a 25 C, por el
mtodo de tubo pequeo.
MICROORGANISMO
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
Escherichia coli
Staphilococcus aureus
Saccaromyces cerevisiae
CONCENTRACIN g/ml
250
125
62,5
24/48 48/72 24/48 48/72 24/48 48/72
h*
h*
h*
h*
h*
h*
1
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
h*: Horas
Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras
las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h.

Calndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50 C por el
MICROORGANISMO
PATRN
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
0
0
0
1
1
1
1
1
1
2
1
1
2
2
2
2
2
2
h*: Horas

Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 25 C por el
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
0
0
0
BLANCO
2
2
2
CONCENTRACIN g/ml
125
250
62,5
24/48 h*
48/72 h*
24/48 h*
48/72 h*
24/48 h*
48/72 h*
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
h*: Horas
81

Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 50 C por el
MICROORGANISMO
PATRN
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
2
h*: Horas
Tabla 15. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae del extracto etanlico de

Calndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 25 C, por el
MICROORGANISMO
PATRN
250
BLANCO
24/48
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
h*
0
0
0
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
h*: Horas
Tabla 16. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto etanlico

de Calndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50 C, por el
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
250
24/48
h*
0
0
0
h*: Horas
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
82

de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 25C, por el
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
250
24/48
h*
0
0
0
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
h*: Horas

de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 50 C, por el
CONCENTRACIN g/ml
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
0
0
0
250
BLANCO
2
2
2
24/48
h*
0
0
0
125
48/72
h*
0
0
0
24/48
h*
1
1
1
62,5
48/72
h*
1
1
1
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
h*: Horas
La evaluacin se llev a cabo teniendo en cuenta que aquellos tubos donde

la concentracin de extracto no permiti crecimiento a las 24 horas 48
horas para la levadura y posteriormente, al raspar la superficie del tubo e
inocular nuevamente por 24 horas 48 horas para el caso de la levadura; y
no se produjo nuevamente crecimiento se definieron preliminarmente como
extractos bactericidas fungicidas segn el caso.
Dentro de este ltimo grupo se presentaron como bactericidas, tanto para E.
coli como para S. aureus, y como fungicida para S. cerevisiae, los siguientes
extractos:
U
U
U
U
U
Extracto acuoso de Tropaeolum majus obtenido a 50C

Extracto etanlico de Calndula officinalis obtenido a 25C
Extracto etanlico de Tropaeolum majus obtenido a 25C
Extracto etanlico de Calndula officinalis obtenido a 50C
Extracto etanlico de Tropaeolum majus obtenido a 50C
83
Mientras que el nico extracto que result bacteriosttico para los tres
microorganismos: E. coli, S. aureus y S. cerevisiae fue:
U Extracto acuoso de Calndula officinalis obtenido a 50C
Tabla 19. Evaluacin preliminar de la Actividad Bactericida o Bacteriosttica y
Fungicida o Fungisttica de los Extractos acuoso y etanlicos de Tropaeolum
majus y Extractos etanlicos de Calndula officinalis.
MICROORGANISMO
CONCENTRACIN
/ml
BACTERICIDA
Escherichia coli
250
Staphylococcus
aureus
250
Saccharomyces
cerevisiae
250
BACTERIOSTTICO
FUNGICIDA
FUNGIESTTICO
Tabla 20. Evaluacin preliminar de la Actividad Bactericida o Bacteriosttica y

Fungicida o Fungisttica del Extracto acuoso de Calndula officinalis
obtenido a 50C
MICROORGANISMO
CONCENTRACIN
/ml
BACTERICIDA
BACTERIOSTTICO
Escherichia coli
250
Staphylococcus
aureus
250
Saccharomyces
cerevisiae
250
4.2.2.2.
FUNGICIDA
FUNGIESTTICO
Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria

(CMI)
Los resultados experimentales de la Concentracin mnima inhibitoria

de las sustancias qumicas usadas tericamente como control: Sulfato
de estreptomicina para Staphylococcus aureus y de Nitrato de
isoconazol para Candida albicans (Garzn y Quintero, 1996), la cual a
pesar de ser patgena representa una relativa proximidad filogentica
84
con Saccharomyces cerevisiae (Hernez et al., 1997), se presentan a

continuacin:
U CMI: Sulfato de estreptomicina: 500 y 250 g/ml para S. aureus.
U CMI: Nitrato de isoconazol: est entre 62.5 y 31.75 g/ml para C.
albicans.
Para el extracto acuoso de Calndula officinalis obtenido a 25C y para el
extracto acuoso de Tropaeolum majus obtenido tambin a 25C no se detect
ningn tipo de inhibicin.
Tabla 21. Intervalos de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) de los
extractos de Calndula officinalis y Tropaeolum majus .
Concentracin Mnima Inhibitoria
g/ml
Planta
Solvente
Temperatura
Microorganismo
E. coli
S. aureus
S. cerevisiae
Agua
25C
50C
250-500
250-500
250-500
Etanol
25C
50C
250-125
250-125
250-125
250-125
250-125
250-125
Tropaeolum majus
Agua
25C
50C
250-500
250-500
250-500
Etanol
25C
50C
250-125
250-125
250-125
250-125
250-125
250-125
Esta similitud de CMI significa bsicamente que el valor real de la

concentracin mnima inhibitoria est dentro de estos rangos, que
comparndolos con los valores experimentales del trabajo de Garzn y
Quintero (1996), da muestra que los extractos que inhibieron el crecimiento
de S. aureus tienen una actividad ligeramente mayor que la que tiene el
Sulfato de estreptomicina. Por el contrario, los extractos que inhibieron el
crecimiento de S. cerevisiae tienen una CMI mayor a la que presenta el Nitrato
de isoconazol sobre C. albicans, lo cual da razn a pensar que podra ser una
alternativa de antimictico natural.
Despus de obtener los resultados anteriormente analizados se determin
para la aplicacin de la Fase III que, los extractos acuosos obtenidos a 50C,
que resultaron inhibidores de crecimiento fuesen aplicados sobre una matriz
alimentaria y que los extractos etanlicos obtenidos a 50C fuesen aplicados
como solucin desinfectante.
85
4.3.
FASE III: APLICACIN DE LOS EXTRACTOS
4.3.1. Aplicacin de los extractos acuosos como conservantes

naturales en pulpa de frutas natural sin aditivos
Previamente a la pulpa de guanbana se le hizo un recuento de mesfilos y se
le midi el pH, obteniendo los siguientes valores:
Mesfilos: 63 UFC/ml
pH: 4.5
El conteo de microorganismos realizado durante 8 das se representa a
continuacin en las Figuras 33 y 34, se tuvo un lote de pulpa contaminado
con 12.5 ml de E. coli en su fase logartmica, replicando las condiciones de la
fase II, y otro lote de pulpa, contaminado con 12.5 ml de S. aureus.
Al primer lote se lo trat con 250 ml extracto acuoso de Calndula officinalis
obtenido a 50C y al segundo, se aadieron 250 ml de extracto acuoso de
Tropaeolum majus obtenido a 50C. La concentracin lograda en cada uno
de los extractos fue de 250 g PEq/ml de cada planta, esto significa que en el
volumen de 500 ml de cada lote de pulpa se tuvieron 125 g PEq/ml de C.
officinalis para un lote y 125 g PEq/ml de T. majus para otro lote.
Segn las Normas y Procedimientos Reglamentarios de la Industria de
Alimentos (2000), emitida por el Ministerio de Salud de Colombia la cantidad
mxima de sustancias conservantes, ya sean cido benzoico o cido srbico,
que se pueden aadir a pulpas no congeladas es de 1000 mg/kg. Siendo la
concentracin de los extractos mucho menor que la norma para evitar el
sabor amargo en la pulpa, sabor que pueden conferir las plantas por sus
principios amargos.
86
Figura 33. Comparacin del efecto bioconservante del extracto acuoso de

Calndula officinalis contra E.coli y un Blanco de crecimiento de E.coli.
Curva d el efecto bioconservante en pulpa de fruta
del e xtracto a cuoso d e Calendula officinalis contra
E.coli y un Blanco de crecimiento d e E.coli
350
300
UFC/ml.
250
200
150
100
50
0
1
Das
C. officinalis vs E. c oli
Blanco
Los resultados de la Figura 33 evidenciaron una disminucin de la carga

microbiana en el segundo da debido a la presencia del extracto de C.
officinalis. Esta disminucin fue de 35 UFC. A partir del tercer da se revel
nuevamente crecimiento microbiano. El incremento en la masa microbiana se
dio de manera reducida comparndolo con el blanco de crecimiento. Se
mantuvo hasta el sexto da, pero a partir del sptimo da se elev la rata de
crecimiento bacteriano, concluyendo que la cantidad de extracto pudo no ser
suficiente para demostrarse efectivo por un tiempo mayor.
87
Figura 34. Comparacin del efecto bioconservante del extracto acuoso de

Tropaleoum majus contra S. aureus y un Blanco de crecimiento de S. aureus.
Curva del efecto bioconservante en pulpa de fruta
del extracto acuoso de Tropaeolum majus contra S.
aureus y un Blanco de crecimiento de S. aureus
350
300
UFC/ml.
250
200
150
100
50
0
1
Das
T. majus vs S . aureus
Blanco
Los resultados presentado en la Figura 34 evidenciaron una disminucin de la

carga microbiana en el segundo da gracias a la presencia del extracto de
Tropaeolum majus, la disminucin de la carga microbiana fue de 37 UFC. A
partir del tercer da se revel nuevamente crecimiento microbiano, sin
embargo se mantuvo por debajo del blanco de crecimiento de la bacteria,
permitiendo determinar la posibilidad de uso como bioconservante
complementando la adicin de conservante actuales.
Segn las Normas y Procedimientos Reglamentarios de la Industria de
Alimentos (2000), emitida por el Ministerio de Salud de Colombia, una pulpa
de fruta debe cumplir con las siguientes caractersticas microbiolgicas:
Tabla 22. Caractersticas microbiolgicas de una pulpa de frutas congelada.
Recuento de microorganismos mesfilos/g
NMP coliformes totales/g
NMP coniformes fecales/g
Recuento de esporas clostridium sulfito reductor/g
Recuento de hongos y levaduras
3
3
3
3
3
20.000
9
<3
<10
1.000
50.000
29
3.000
1
1
0
0
1
NMP: Nmero ms probable

n: Nmero de muestras a examinar.
m: ndice mximo permisible para identificar nivel de buena calidad.
M: ndice mximo permisible para identificar nivel aceptable de calidad.
c: Nmero mximo de muestras permisibles con resultado entre m y M.
Los agentes antimicrobianos pueden llegar a tener una aplicacin muy

provechosa en la industria de alimentos, tal es el caso de los fito-fenoles, tales
como las oleorosinas del aceite de oliva que han demostrado aportar
beneficios fisiolgicos al consumidor y por lo tanto, un atractivo favorable
para la industria de la comida saludable (Naidu, 2000). Las saponinas se
88
hallan en los glicsidos y se encuentran en hojas, flores, semillas y races, en

plantas comestibles como el frjol, el tomate, la avena, el t, el man, la mora y
en general en plantas usadas como saborizantes (Price et al., 1987). Los
flavonoides son cidos fenlicos de gran inters en la industria de alimentos
porque contribuyen a la calidad sensorial y nutritiva de las frutas y de los
productos derivados de ellos, adems son responsables de mejorar la
estabilidad del color en los productos derivados de las frutas (Mazza y Miniati,
1993).
La gran limitante ha sido hallar la concentracin ideal de estos componentes
antimicrobianos que resultan muy bajas para ser usadas efectivamente sin
afectar las caractersticas sensoriales de los alimentos (Naidu, 2000). En el caso
de la Calndula officinalis, que al ser agregada en ensaladas aporta cierto
sabor amargo.
4.3.2. Aplicacin de los extractos etanlicos en jabn - gel antibacterial
para uso sin enjuague
Se tomaron los frotis de dos individuos, a estos frotis se le realiz un recuento
e identificacin mediante Tincin de Gram para reconocer a las bacterias
presentes y Tincin con Azul de Metileno para distinguir a los hongos
desarrollados en los medios de siembra. En el Anexo 4, se presenta la
clasificacin y descripcin de los microorganismos identificados en los frotis
de manos, se puede observar la descripcin de los microorganismos
encontrados.
En la Tabla 23 se encuentra el conteo de los frotis, realizados por conteos
previos para cuantificar la carga microbiana existente antes de aplicar la
solucin desinfectante y un conteo posterior a la aplicacin para determinar
la reduccin de esa carga microbiana por la presencia de los extractos
etanlicos.
89
Tabla 23. Conteo previo y conteo posterior de la carga microbiana presente

en las manos de dos individuos a los cuales se les aplicaron dos soluciones
desinfectantes.
CONTEO DE FROTIS DE MANOS
Extracto de Calndula en Etanol al 95% a 50C Extracto de Capuchina en Etanol al 95% a
50C
MUESTRA 1
MUESTRA 2
PRECONTEO PCA UFC
MUESTRA 1
MUESTRA 2
PRECONTEO PCA UFC
30
29
POSTCONTEO PCA UFC
27
31
POSTCONTEO PCA UFC
1
0
PRECONTEO PDA UFC
11
18
PRECONTEO PDA UFC
36
21
POSTCONTEO PDA UFC
22
11
POSTCONTEO PDA UFC
1
2
PRECONTEO AGAR McKY UFC
0
8
PRECONTEO AGAR McKY UFC
1
0
POSTCONTEO AGAR McKY UFC
0
0
POSTCONTEO AGAR McKY UFC
La aplicacin de los extractos de Calndula officinalis obtenido en etanol al

95% a 50C y Tropaeolum majus obtenido en etanol al 95% a 50C se llev a
cabo por duplicado para confirmar los resultados de la primera muestra.
Del primer experimento, la aplicacin del extracto etanlico de C. officinalis
dio como resultado los siguientes valores, en el conteo previo de las placas de
conteo resultaron 30 UFC en la muestra 1 y 29 UFC en la muestra 2, luego de
la aplicacin de la solucin se redujo a 1 UFC en la muestra 1 y a cero UFC en
la muestra 2. en el segundo conteo previo realizado en las placas de papa
dextrosa se hallaron, 36 UFC en la muestra 1 y 21 UFC en la muestra 2,
mientras que en el conteo posterior se redujo esta cantidad a 1 UFC en la
muestra 1 y a 2 UFC en la muestra 2. Por ltimo, del conteo previo de las
placas de agar MC resultaron, 1 UFC en la muestra 1 y 0 UFC en la muestra 2.
En el conteo posterior se redujo totalmente la carga microbiana
encontrndose las dos muestras con 0 UFC.
Del segundo experimento, la aplicacin del extracto etanlico de T. majus
revel los siguientes resultados con los siguientes valores, en el conteo previo
de las placas resultaron 27 UFC en la muestra 1 y 31 UFC en la muestra 2,,
luego de la aplicacin de la solucin se redujo a 11 UFC en la muestra 1 y a
18 UFC en la muestra 2. En el segundo conteo previo realizado en las placas
de papa dextrosa se hallaron, 22 UFC en la muestra 1 y 11 UFC en la muestra
2, mientras que en el conteo posterior se redujo esta cantidad a 0 UFC en la
muestra 1 y a 8 UFC en la muestra 2. Por ltimo, del conteo posterior de las
placas de agar MC resultaron, 0 UFC en la muestra 1 y 0 UFC en la muestra 2.
90
Los datos anteriores pueden observarse en las figuras 35 a la 38 donde se

evidencia la reduccin de la carga microbiana hallada antes de la aplicacin
de la locin. Cabe anotar que en los resultados obtenidos con los extractos
etanlicos hay una actividad sinrgica que tienen las sustancias activas de las
plantas con el solvente, como se observ en la fase previa del proyecto.
Figura 35. Aplicacin del extracto etanlico de Calndula officinalis obtenido
a 50C, en la manos como locin antibacterial despus de un frotis. Muestra 1.
Efecto de la aplicacin del extracto etanlico de Calendula
officinalis como locin antibacterial
Pre conteo Muestra 1
Medio de crecimiento
1
3
Post conteo Muestra 1
36
30
1
1
0
10
15
20
25
30
35
40
UFC
Figura 36. Aplicacin del extracto etanlico de Calndula officinalis obtenido

a 50C, en la manos como locin antibacterial despus de un frotis. Muestra 2.
Efecto de la aplicacin del extracto etanlico de Calendula
officinalis como locin antibacterial
Medio de crecimiento
0
0
21
2
2
29
0
0
10
15
UFC
91
20
25
30
Figura 37. Aplicacin del extracto etanlico de Tropaeolum majus obtenido a

50C, en la manos como locin antibacterial despus de un frotis. Muestra 1.
Efecto de la aplicacin del extracto etanlico de Trpoaeolum
majus como locin antibacterial
0
0
22
0
27
11
0
10
15
20
25
30
UFC
Figura 38. Aplicacin del extracto etanlico de Tropaeolum majus obtenido a

50C, en la manos como locin antibacterial despus de un frotis. Muestra 2.
Efecto de la aplicacin del extracto etanlico de Trpoaeolum
majus como locin antibacterial
0
0
11
8
31
18
0
10
15
20
25
30
35
UFC
Las fotografas de sta fase, correspondientes las placas de agar con las
muestras previas y posteriores a la aplicacin de la locin pueden verse en los
Anexos 6 y 7.
92
5. CONSIDERACIONES FINALES
El presente estudio mediante la obtencin de extractos a partir de especies
botnicas demuestra que estas especies, que brotan de manera silvestre, tienen
potencial para ser conservantes eficaces, aunque el desarrollo del producto debe
perfeccionarse para su ptima funcionalidad, el tema del sabor es todo un desafo,
es necesario realizar ms estudios que demuestren aplicaciones de conservantes de
origen vegetal para perfeccionar su uso, adems es necesario ampliar los aportes
en investigacin bsica de apoyo para la industria alimenticia y cosmtica.
Se hace evidente que debe potencializarse el mtodo de extraccin para lograr
obtener las sustancias responsables de la actividad antimicrobiana de manera ms
efectiva.
La Calndula officinalis es una planta rica en aceites esenciales, adems al igual que
el tomillo, contiene mltiples compuestos activos que representan a las diferentes
familias qumicas. Los aceites esenciales son a menudo los compuestos ms
inhibitorios (Cate, 2000) por lo que resultara interesante evaluar directamente la
accin biolgica de estos fotoqumicos aislndolos de la planta. Debido al
contenido de aceites esenciales debe monitorearse la volatilidad y estabilidad del
producto asegurando un producto de alta calidad.
La calndula no slo tiene aplicaciones culinarias, se destaca por su amplio uso en
la industria cosmtica y en la medicina homeoptica como alternativa a
tratamientos mdicos con consecuencias no deseadas en la salud Dentro de los
usos teraputicos se encuentra que la flor de Calndula officinalis es cicatrizante y
desinflamante. Es utilizada para aliviar los sntomas posteriores a las picaduras de
insectos entre otros. En su composicin se resalta la presencia de saponinas y
glucsidos (Carreo, 2000).
La capuchina, planta originaria del Per, tiene la caracterstica de segregar una
esencia picante que inmuniza a las plantas cercanas a ella. No se conocen estudios
de extraccin fina que reporten puntualmente su contenido, sin embargo de la
presente investigacin de presume la presencia de glucosinolatos, carotenoides y
flavonoides, entre otros compuestos fenlicos, los cuales podran ser los
responsables del efecto antibitico.
El uso de Tropaeolum majus se conoce en la cocina tpica de la India, en donde se
utiliza como condimento y donde han realizado la mayor cantidad de estudios de
esta planta aportando informacin relevante para esta investigacin. Dentro de los
usos planteados en la medicina popular estn su aplicacin en decocciones de las
ramas y flores para tratar infecciones (Carreo, 2000).
Los resultados de la inhibicin de crecimiento de los microorganismos en la
aplicacin In vivo de los extractos en la fase III, en la matriz alimentaria, permite
93
plantear dos posibles aplicaciones: primero, la utilizacin de ellos en barras de

alimentos en donde el consumo de los alimentos se lleva a cabo en menos de 48
horas, tiempo en el cual fueron efectivos los extractos en la pulpa de frutas.
Segundo, incluye la aplicacin de los extractos en combinacin con otras
metodologas como parte de una tecnologa de barreras.
En la misma fase III, los resultados obtenidos con la locin son muy efectivos,
planteando su utilizacin en la industria de alimentos y cosmtica, como agente
antimicrobiano para el cumplimiento de las Buenas Prcticas de Manufactura de los
trabajadores. Tambin, como ingrediente antimicrobiano en productos cosmticos,
como agente antibacterial en jabones lavalosa, jabones de manos y cuerpo,
shampoo, etc.
94
6. CONCLUSIONES
U En la obtencin de los extractos acuosos el incremento de la temperatura
permiti mejor extraccin de los componentes activos de Calndula
officinalis y Tropaeolum majus.
U El etanol como solvente y por su accin antimicrobiana result ms

eficiente que el agua y el aceite vegetal en la extraccin de las sustancias
activas de las dos especies vegetales, al obtener mejores resultados
inhibitorios respecto a los extractos obtenidos con los otros solventes.
U El extracto ms efectivo contra E. coli fue el de Calndula officinalis en
etanol obtenido a 50C obtenindose en promedio 13 mm de dimetro
de inhibicin.
U El extracto ms efectivo contra S. aureus fue el de Calndula officinalis en
etanol obtenido a 50C con un promedio de 13.1 mm de dimetro de
inhibicin,
U El extracto ms efectivo contra Saccharomyces cerevisiae fue el de
Tropaleoum majus en etanol obtenido a 50C con 13.17 mm de dimetro
de inhibicin.
U El extracto que demostr tener amplio espectro, obteniendo en
promedio un dimetro de inhibicin de crecimiento de 12.61 mm contra
los tres microorganismos indicadores fue el de Calndula officinalis en
etanol obtenido a 50 C.
U La actividad antimicrobiana de los extractos de Calndula officinalis y
Tropaeolum majus contra los tres microorganismos indicadores no
mostraron diferencias significativas entre ellos.
U Los extractos con actividad bactericida contra E. coli y S. aureus, y fungicida
para S. cerevisiae fueron:
o Extracto acuoso de Tropaeolum majus obtenido a 50 C
o Extractos etanlicos de Calndula officinalis y Tropaeolum majus
obtenidos a 25C.
o Extractos etanlicos de Calndula officinalis y Tropaeolum majus
obtenidos a 50C.
o El nico extracto con actividad bacteriosttica para los tres
microorganismos: E. coli, S. aureus y S. cerevisiae fue el extracto
acuoso de Calndula officinalis obtenido a 50 C
95
U Los extractos acuosos de Calndula officinalis y Tropaeolum majus aplicados

como conservantes naturales en la pulpa de guanbana contaminada con
E.coli y S. aureus fueron efectivos hasta el segundo da de interaccin
dentro de la matriz alimentaria, ya que los extractos disminuyeron la carga
microbiana en 35 UFC y 37 UFC, respectivamente. A partir del tercer da se
evidenci nuevamente crecimiento microbiano en las dos matrices
alimentarias.
U El extracto etanlico de Calndula officinalis y el extracto etanlico de
Tropaeolum majus fueron efectivos en la aplicacin como locin
antibacterial al reducir la carga microbiana presente en las manos de dos
individuos.
96
RECOMENDACIONES
U Debe desarrollarse un protocolo formal para que cada lote de material
vegetal crudo presente la composicin de inters, adems de un anlisis
cuantitativo para enfocar el uso de los compuestos que puedan afectar la
actividad del ingrediente antimicrobiano y la aceptabilidad de la
preparacin, como aspectos asociados con la toxicidad del producto.
U Tambin debe presentarse informacin detallada sobre el proceso industrial,
incluyendo diagrama de flujo, y tratarse con especial atencin las
actividades y factores medioambientales que pueden afectar la estabilidad,
actividad y calidad de la preparacin botnica (FDA, 2003). La preparacin
de conservantes de origen botnico debe hacerse bajo las estrictas buenas
prcticas de manufactura, de esta manera permitirn a la industria de
alimentos utilizar las preparaciones botnicas eficazmente como
bioconservantes y poder producir alimentos de buena calidad.
U Las compaas que compran las preparaciones botnicas para el uso en su
producto como bioconservantes deben establecer las especificaciones
mnimas de variacin de lote a lote, los niveles de ingredientes activos, las
caractersticas tcnicas, el tipo de preparacin, el equivalente a la
concentracin, el almacenamiento, los niveles de toxicidad o los compuestos
biolgicamente activos, tener la seguridad que el producto es puro y que no
contiene niveles de microorganismos, solventes residuales, pesticidas,
metales pesados u otro contaminante medioambiental.
U La preparacin de productos cosmticos de calidad a partir de extractos de
Calendula officinalis y Tropaeolum majus podra llegar a compararse con la
obtencin de fitofrmacos presentes en el mercado, llegando a plantear una
colaboracin e investigacin conjunta entre la industria cosmtica y
farmacutica para explorar a fondo el uso extensivo de estos productos.
U Los extractos de C. officinalis y en particular los de sus flores muestran un
amplio espectro de acciones farmacolgicas, entre las que sobresalen:
antibacteriana, anti-inflamatoria y cicatrizante, de ah la gran importancia de
los extractos de Calendula en la cosmetologa moderna. Otras propiedades
son inmunoestimulante, antitumoral, todo lo cual apoya el amplio uso de
esta planta en la medicina tradicional mundial. Segn estudios qumicos, la
Calendula posee un extenso nmero de familias qumicas, entre las cuales
sobresalen los carotenoides, los flavonoides, triterpenos, saponinas, cidos
fenlicos, taninos, cumarinas, polisacridos, sustancias pectdicas,
hemicelulosas, aceite esencial, etc. Todo lo anterior est en concordancia
con la variedad de propiedades farmacolgicas presentadas por dicha
planta.
97
U Teniendo en cuenta que la Calendula de produccin nacional se adapta

bien a las condiciones de cultivo con buenos resultados aerotcnicos y que
las evaluaciones farmacognsticas corresponden a informacin en la
bibliografa internacional, podemos afirmar que la Calendula que crece en
nuestro pas tiene las condiciones necesarias para su comercializacin y
puede ser base para la obtencin de diferentes extractos (etreos,
etanlicos, propilnicos, etctera), que se utilizan en la confeccin de
fitofrmacos y fitocosmticos de amplia demanda y de muy buenas
potencialidades econmicas.
98
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105
ANEXOS
Anexo 1
Tabla 24. Evaluacin preliminar de la capacidad antimicrobiana de los extracto acuosos y etanlicos a partir de
Calndula officinalis y Tropaeolum majus contra E.coli, S. aureus y S. cerevisiae.
0=
1=
EXTRACTOS
25 C
Agua
Calndula
officinalis
50 C
25 C
Etanol
Calndula
officinalis
50 C
Agua
Tropaeolum
majus
25 C
Escherichia coli
1
1
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
FASE I
INHIBE CRECIMIENTO
NO INHIBE CRECIMIENTO
MICROORGANISMO
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
106
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
REPLICA
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
50 C
25 C
Etanol
Tropaeolum
majus
50 C
1
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
107
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
Anexo 2
Tabla 25. Resultados de las mediciones de los dimetros de los halos de inhibicin formados por cada sendidisco
impregnado con el extracto correspondiente a cada tratamiento.
Dimetro halos de inhibicin mm
TRATAMIENTO SOLVENTE
agua
1
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
PLANTA
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
TEMPERATURA
C
CONCENTRACIN
mg/ml
REPLICA
E. coli
S. aureus
S. cerevisiae
25
250
25
250
25
250
25
250
25
125
25
125
25
125
25
125
25
62,5
25
62,5
25
62,5
25
62,5
50
250
10
10
17
50
250
12
16
108
agua
agua
agua
5
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
50
250
11
12
16
50
250
11
11
15
50
125
13
50
125
11
50
125
11
50
125
10
50
62,5
50
62,5
50
62,5
50
62,5
25
250
25
250
25
250
25
250
25
125
25
125
25
25
125
125
3
4
0
0
0
0
0
0
109
agua
9
agua
agua
agua
agua
10
agua
agua
agua
agua
11
agua
agua
agua
agua
12
agua
agua
agua
13
etanol
etanol
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Calndula
officinalis
Calndula
25
62,5
25
62,5
25
62,5
25
62,5
50
250
10
11
15
50
250
10
16
50
250
10
11
15
50
250
10
11
15
50
125
11
50
125
12
50
125
12
50
125
11
50
62,5
50
62,5
50
62,5
50
62,5
25
250
17
12
16
25
250
16
15
17
110
etanol
etanol
etanol
14
etanol
etanol
etanol
etanol
15
etanol
etanol
etanol
etanol
16
etanol
etanol
etanol
etanol
17
etanol
etanol
etanol
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
25
250
16
15
16
25
250
16
13
14
25
125
14
16
25
125
10
14
25
125
12
15
25
125
13
25
62,5
25
62,5
25
62,5
25
62,5
50
250
17
18
17
50
250
15
17
16
50
250
17
18
18
50
250
17
15
17
50
125
14
13
14
50
125
13
14
14
50
50
125
125
3
4
13
16
14
14
14
15
111
etanol
18
etanol
etanol
etanol
etanol
19
etanol
etanol
etanol
etanol
20
etanol
etanol
etanol
etanol
21
etanol
etanol
etanol
22
etanol
etanol
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Calndula
officinalis
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
50
62,5
50
62,5
50
62,5
50
62,5
25
250
15
14
19
25
250
17
16
17
25
250
15
15
17
25
250
17
16
17
25
125
12
12
11
25
125
11
14
13
25
125
12
12
15
25
125
12
11
14
25
62,5
25
62,5
25
62,5
25
62,5
50
250
19
14
19
50
250
17
14
17
112
etanol
etanol
etanol
23
etanol
etanol
etanol
etanol
24
etanol
etanol
25
26
27
28
29
etanol
agua
agua
etanol
etanol
Patrn
Patrn
Patrn
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
Tropaleoum
majus
50
250
18
15
19
50
250
17
16
18
50
125
12
12
15
50
125
11
11
15
50
125
12
11
16
50
125
11
11
14
50
62,5
50
62,5
50
62,5
50
62,5
unica
unica
unica
unica
500
250
125
4
unica
unica
unica
unica
unica
unica
unica
8
0
0
15
16
21
20
19
8
0
0
15
16
22
20
18
0
0
0
15
16
23
21
19
113
Anexo 3
Anlisis de Varianza ANOVA Elaborado por Zimmerman, F.
The SAS System

Obs
SOLV
PLANTA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
11:40 Monday, March 7, 2005

TEMP
CONC
TRAT
REP
E_COLI
S_AUREUS
S_CEREV
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
25
25
25
250.0
250.0
250.0
250.0
125.0
125.0
125.0
125.0
62.5
62.5
62.5
62.5
250.0
250.0
250.0
250.0
125.0
125.0
125.0
125.0
62.5
62.5
62.5
62.5
250.0
250.0
250.0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
5
5
5
5
6
6
6
6
7
7
7
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10
9
11
11
9
9
9
9
7
7
7
7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10
12
12
11
8
9
9
8
7
7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
17
16
16
15
13
11
11
10
7
7
8
9
0
0
0
114
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
agua
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
25
25
25
25
25
25
25
25
25
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
50
50
50
50
50
50
250.0
125.0
125.0
125.0
125.0
62.5
62.5
62.5
62.5
250.0
250.0
250.0
250.0
125.0
125.0
125.0
125.0
62.5
62.5
62.5
62.5
250.0
250.0
250.0
250.0
125.0
125.0
125.0
125.0
62.5
62.5
62.5
62.5
250.0
250.0
250.0
250.0
125.0
125.0
115
7
8
8
8
8
9
9
9
9
10
10
10
10
11
11
11
11
12
12
12
12
13
13
13
13
14
14
14
14
15
15
15
15
16
16
16
16
17
17
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10
9
10
10
7
7
7
8
0
0
0
0
17
16
16
16
14
10
12
7
7
0
7
0
17
15
17
17
14
13
0
0
0
0
0
0
0
0
0
11
10
11
11
9
8
7
8
0
0
7
7
12
15
15
13
8
8
7
9
7
8
8
8
18
17
18
15
13
14
0
0
0
0
0
0
0
0
0
15
16
15
15
11
12
12
11
8
0
7
8
16
17
16
14
16
14
15
13
9
9
0
0
17
16
18
17
14
14
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
etanol
agua
agua
etanol
etanol
ampicilina
ampicilina
ampicilina
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
Tropaleoun majus
.
.
.
.
.
.
.
50
50
50
50
50
50
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
.
.
.
.
.
.
.
125.0
125.0
62.5
62.5
62.5
62.5
250.0
250.0
250.0
250.0
125.0
125.0
125.0
125.0
62.5
62.5
62.5
62.5
250.0
250.0
250.0
250.0
125.0
125.0
125.0
125.0
62.5
62.5
62.5
62.5
.
.
.
.
500
250
125
116
17
17
18
18
18
18
19
19
19
19
20
20
20
20
21
21
21
21
22
22
22
22
23
23
23
23
24
24
24
24
25
25
26
26
27
28
29
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
1
2
1
1
1
13
16
8
9
9
8
15
17
15
17
12
11
12
12
8
7
9
8
19
17
18
17
12
11
12
11
8
8
7
8
0
0
15
16
21
20
19
14
14
8
9
9
8
14
16
15
16
12
14
12
11
7
9
9
9
14
14
15
16
12
11
11
11
8
9
8
8
0
0
15
16
22
20
18
14
15
8
0
0
8
19
17
17
17
11
13
15
14
9
0
8
0
19
17
19
18
15
15
16
14
8
8
9
0
0
0
15
16
23
21
19
The GLM Procedure

Class Level Information
Class
Levels
TRAT
29
Values
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
29
Number of observations
103
The GLM Procedure

Dependent Variable: E_COLI
E_COLI
Source
DF
Sum of
Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
28
4067.713592
145.275485
104.88
<.0001
Error
74
102.500000
1.385135
102
4170.213592
Corrected Total
R-Square
Coeff Var
Root MSE
E_COLI Mean
0.975421
14.55252
1.176918
8.087379
Source
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
TRAT
28
4067.713592
145.275485
104.88
<.0001
Source
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr > F
117
TRAT
28
Contrast
4067.713592
145.275485
104.88
<.0001
DF
Contrast SS
Mean Square
F Value
Pr > F
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1633.500000
6.000000
468.166667
669.515625
4.380208
26.041667
187.041667
45.375000
117.041667
118.306973
438.031566
2.000000
0.000000
1633.500000
6.000000
468.166667
669.515625
4.380208
26.041667
187.041667
45.375000
117.041667
118.306973
438.031566
2.000000
0.000000
1179.31
4.33
337.99
483.36
3.16
18.80
135.03
32.76
84.50
85.41
316.24
1.44
0.00
<.0001
0.0409
<.0001
<.0001
0.0795
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.2333
1.0000
SOLVENTE
PLANTA
TEMPERATURA
CONC LINEAL
CONC CUADRAT
SOL X PLAN
SOL X TEMP
PLAN X TEMP
FATOR X AGUA(BLANCO)
FATOR X ETHANOL(BLANCO)
FATOR X AMPICILINA
AMPICILIA LIN
AMPICILIA CUA
The GLM Procedure

Dependent Variable: S_AUREUS
S_AUREUS
Source
DF
Sum of
Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
28
3549.757282
126.777046
68.48
<.0001
Error
74
137.000000
1.851351
102
3686.757282
Corrected Total
R-Square
Coeff Var
Root MSE
S_AUREUS Mean
0.962840
16.90546
1.360644
8.048544
118
Source
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
TRAT
28
3549.757282
126.777046
68.48
<.0001
Source
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr > F
TRAT
28
3549.757282
126.777046
68.48
<.0001
Contrast
DF
Contrast SS
Mean Square
F Value
Pr > F
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1457.041667
0.041667
477.041667
456.890625
0.046875
1.041667
234.375000
26.041667
115.783163
119.579082
441.011364
8.000000
0.000000
1457.041667
0.041667
477.041667
456.890625
0.046875
1.041667
234.375000
26.041667
115.783163
119.579082
441.011364
8.000000
0.000000
787.02
0.02
257.67
246.79
0.03
0.56
126.60
14.07
62.54
64.59
238.21
4.32
0.00
<.0001
0.8812
<.0001
<.0001
0.8740
0.4556
<.0001
0.0003
<.0001
<.0001
<.0001
0.0411
1.0000
SOLVENTE
PLANTA
TEMPERATURA
CONC LINEAL
CONC CUADRAT
SOL X PLAN
SOL X TEMP
PLAN X TEMP
FATOR X AMPICILINA
AMPICILIA LIN
AMPICILIA CUA
The GLM Procedure

Dependent Variable: S_CEREV
S_CEREV
Source
DF
Sum of
Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
28
4892.815534
174.743412
36.32
<.0001
Error
74
356.000000
4.810811
102
5248.815534
Corrected Total
119
R-Square
Coeff Var
Root MSE
S_CEREV Mean
0.932175
23.98256
2.193356
9.145631
Source
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
TRAT
28
4892.815534
174.743412
36.32
<.0001
Source
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr > F
TRAT
28
4892.815534
174.743412
36.32
<.0001
Contrast
SOLVENTE
PLANTA
TEMPERATURA
CONC LINEAL
CONC CUADRAT
SOL X PLAN
SOL X TEMP
PLAN X TEMP
FATOR X AMPICILINA
AMPICILIA LIN
AMPICILIA CUA
DF
Contrast SS
Mean Square
F Value
Pr > F
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
988.166667
0.666667
876.041667
1130.640625
61.880208
8.166667
651.041667
0.375000
152.870748
87.074830
430.626263
8.000000
0.000000
988.166667
0.666667
876.041667
1130.640625
61.880208
8.166667
651.041667
0.375000
152.870748
87.074830
430.626263
8.000000
0.000000
205.41
0.14
182.10
235.02
12.86
1.70
135.33
0.08
31.78
18.10
89.51
1.66
0.00
<.0001
0.7108
<.0001
<.0001
0.0006
0.1966
<.0001
0.7809
<.0001
<.0001
<.0001
0.2012
1.0000
The GLM Procedure

Least Squares Means
120
TRAT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
E_COLI
LSMEAN
LSMEAN
Number
0.0000000
0.0000000
0.0000000
10.2500000
9.0000000
7.0000000
0.0000000
0.0000000
0.0000000
9.7500000
7.2500000
0.0000000
16.2500000
10.7500000
3.5000000
16.5000000
14.0000000
8.5000000
16.0000000
11.7500000
8.0000000
17.7500000
11.5000000
7.7500000
0.0000000
15.5000000
21.0000000
20.0000000
19.0000000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
The GLM Procedure

Least Squares Means
Least Squares Means for effect TRAT
Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j)
121
i/j
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
1.0000
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
10
1.0000
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.1373
<.0001
<.0001
<.0001
0.0002
0.0188
1.0000
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
1.0000
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
1.0000
1.0000
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
0.5498
0.3704
0.0015
<.0001
<.0001
<.0001
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
1.0000
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
1.0000
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
1.0000
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.1373
0.0002
<.0001
<.0001
<.0001
0.5498
0.0006
<.0001
<.0001
0.5498
<.0001
<.0001
<.0001
0.0389
<.0001
0.0755
0.0085
<.0001
0.1373
0.0036
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.0188
<.0001
<.0001
<.0001
0.3704
0.0389
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The GLM Procedure

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TRAT
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Number
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The GLM Procedure

Least Squares Means
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<.0001
0.4228
0.0049
0.0049
0.0049
<.0001
<.0001
0.0395
0.0049
0.0049
0.0049
<.0001
<.0001
0.4228
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.5211
0.0004
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.2628
0.0007
<.0001
0.4228
0.1112
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.2628
0.0569
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.5211
0.0803
<.0001
0.3366
0.8724
<.0001
0.0803
0.0119
0.0119
0.0119
<.0001
<.0001
0.0181
0.0119
0.0119
0.0119
<.0001
<.0001
0.2628
<.0001
<.0001
0.7481
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.3366
0.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.1511
0.0002
<.0001
0.2628
0.0569
<.0001
0.7481
0.0395
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.0803
0.2012
0.0007
<.0001
<.0001
<.0001
0.2012
0.2628
<.0001
0.1112
0.4228
<.0001
0.0181
0.5211
<.0001
0.0077
0.0004
0.0077
0.0569
<.0001
0.0007
0.0803
<.0001
0.0002
0.2628
<.0001
<.0001
0.0270
0.0011
<.0001
0.0386
<.0001
0.0002
0.0031
<.0001
<.0001
0.4228
<.0001
<.0001
0.2628
<.0001
<.0001
0.3366
<.0001
<.0001
0.7481
0.0034
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.4228
<.0001
0.4228
0.3366
<.0001
0.2628
0.1112
<.0001
0.1112
0.6301
<.0001
<.0001
0.8956
0.0042
0.0356
0.1891
<.0001
0.1112
0.8724
<.0001
0.0569
0.4228
<.0001
0.0181
0.7481
<.0001
<.0001
0.6001
0.0009
0.0098
0.0705
<.0001
<.0001
0.7481
<.0001
<.0001
0.8724
<.0001
<.0001
0.2628
0.0204
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.0803
<.0001
0.7481
0.0181
<.0001
0.4228
0.2012
<.0001
<.0001
0.4322
0.0168
0.1071
0.4174
131
<.0001
0.0395
0.5211
<.0001
0.0119
0.6301
<.0001
<.0001
0.5125
0.0006
0.0074
0.0566
<.0001
<.0001
0.8724
<.0001
<.0001
0.1511
0.0386
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.0077
<.0001
0.6301
0.1112
<.0001
<.0001
0.2958
0.0279
0.1577
0.5426
<.0001
0.0019
0.2628
<.0001
<.0001
0.2400
0.0002
0.0023
0.0217

i/j
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
21
22
23
24
25
26
27
28
29
0.0077
0.0077
0.0077
<.0001
<.0001
0.0270
0.0077
0.0077
0.0077
<.0001
<.0001
0.3366
<.0001
<.0001
0.8724
<.0001
<.0001
0.8724
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.1511
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.0569
<.0001
<.0001
0.1112
0.0181
<.0001
0.4228
0.0119
<.0001
0.6301
0.0019
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.5211
0.0181
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.8724
0.0270
<.0001
0.6301
0.7481
<.0001
0.2012
0.6301
<.0001
0.1112
0.2628
<.0001
0.0395
0.0001
0.0001
0.0001
<.0001
0.0019
0.3366
0.0001
0.0001
0.0001
<.0001
0.0011
0.7481
<.0001
<.0001
0.2628
<.0001
<.0001
0.1511
<.0001
<.0001
0.2012
<.0001
<.0001
1.0000
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
0.0001
1.0000
1.0000
1.0000
<.0001
<.0001
0.0034
<.0001
<.0001
0.0204
<.0001
<.0001
0.0386
<.0001
<.0001
0.0283
<.0001
<.0001
0.0015
<.0001
<.0001
<.0001
0.7931
0.0283
0.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.8956
0.0386
<.0001
0.8956
0.6001
<.0001
0.4322
0.5125
<.0001
0.2958
0.2400
<.0001
0.1519
0.7931
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.0056
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.0023
<.0001
<.0001
0.0042
0.0009
<.0001
0.0168
0.0006
<.0001
0.0279
0.0002
<.0001
0.0566
0.0017
<.0001
<.0001
0.0067
<.0001
<.0001
<.0001
0.0450
0.0002
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.0217
0.0002
<.0001
0.0356
0.0098
<.0001
0.1071
0.0074
<.0001
0.1577
0.0023
<.0001
0.2657
0.0168
<.0001
<.0001
0.0442
0.5211
<.0001
<.0001
<.0001
0.2251
0.0023
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.1305
0.0031
<.0001
0.1891
0.0705
<.0001
0.4174
0.0566
<.0001
0.5426
0.0217
<.0001
0.7606
0.1071
<.0001
<.0001
0.1966
0.2012
0.5211
<.0001
<.0001
0.2012
0.0283
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
0.0395
<.0001
<.0001
0.1519
0.0566
0.2657
0.7606
<.0001
<.0001
0.7931
0.0017
0.0168
0.1071
0.0015
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
<.0001
132
0.0067
0.0442
0.1966
0.5211
0.2012
0.5211
Anexo 4
Tabla 26. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Calndula officinalis a diferentes
concentraciones, obtenido a 25C, por el mtodo de tubo pequeo.
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
CONCENTRACIN g/ml
250
125
62,5
24/48 48/72 24/48 48/72 24/48 48/72
h*
h*
h*
h*
h*
h*
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
h*: Horas
Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h.
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
h*: Horas
133
CONCENTRACIN g/ml
250
125
62,5
24/48 48/72 24/48 48/72 24/48 48/72
h*
h*
h*
h*
h*
h*
2
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
MICROORGANISMO
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
Escherichia coli
CONCENTRACIN g/ml
250
125
62,5
24/48 48/72 24/48 48/72 24/48 48/72
h*
h*
h*
h*
h*
h*
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
h*: Horas
concentraciones obtenido a 50C por el mtodo de tubo pequeo.
MICROORGANISMO
PATRN
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
0
0
0
h*: Horas
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
134
MICROORGANISMO
PATRN
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
0
0
0
1
1
1
1
1
1
2
1
2
2
2
2
2
2
2
h*: Horas
MICROORGANISMO
PATRN
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
0
0
0
h*: Horas
1
1
1
1
1
1
2
1
1
2
2
2
2
2
2
135
MICROORGANISMO
PATRN
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
0
0
0
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
h*: Horas
Tabla 33. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Tropaeolum majus a diferentes
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
0
0
0
BLANCO
2
2
2
CONCENTRACIN g/ml
125
250
62,5
24/48 h*
48/72 h*
24/48 h*
48/72 h*
24/48 h*
48/72 h*
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
h*: Horas
136
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
0
0
0
BLANCO
2
2
2
CONCENTRACIN g/ml
125
250
62,5
24/48 h*
48/72 h*
24/48 h*
48/72 h*
24/48 h*
48/72 h*
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
h*: Horas
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
0
0
0
BLANCO
2
2
2
CONCENTRACIN g/ml
125
250
62,5
24/48 h*
48/72 h*
24/48 h*
48/72 h*
24/48 h*
48/72 h*
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
h*: Horas
137
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h*
48/72 h*
24/48 h*
48/72 h*
24/48 h*
48/72 h*
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
h*: Horas
MICROORGANISMO
PATRN
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
0
0
0
h*: Horas.
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
1
2
138
concentraciones obtenido a 50 C por el mtodo de tubo pequeo.
MICROORGANISMO
PATRN
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
2
h*: Horas
MICROORGANISMO
PATRN
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
0
0
0
h*: Horas
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
2
139
MICROORGANISMO
PATRN
CONCENTRACIN g/ml
125
250
BLANCO
62,5
24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
2
2
h*: Horas
Tabla 41. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae del extracto etanlico de Calndula officinalis a diferentes
concentraciones obtenido a 25C, por el mtodo de tubo pequeo.
MICROORGANISMO
PATRN
250
BLANCO
24/48
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
h*
0
0
0
h*: Horas
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
1
1
2
48/72
h*
2
2
2
140
MICROORGANISMO
PATRN
250
BLANCO
24/48
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
h*
0
0
0
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
1
1
48/72
h*
2
2
2
h*: Horas
MICROORGANISMO
PATRN
250
BLANCO
24/48
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
h*
0
0
0
h*: Horas
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
1
2
48/72
h*
2
2
2
141
MICROORGANISMO
PATRN
250
BLANCO
24/48
Escherichia coli
0
0
0
2
2
2
h*
0
0
0
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
1
2
1
48/72
h*
2
2
2
h*: Horas
Tabla 45. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto etanlico de Calndula officinalis a diferentes
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
250
24/48
h*
0
0
0
48/72
h*
0
0
0
h*: Horas
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
142
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
250
24/48
h*
0
0
0
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
h*: Horas
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
250
24/48
h*
0
0
0
48/72
h*
0
0
0
h*: Horas
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
143
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
250
24/48
h*
0
0
0
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
h*: Horas
Tabla 49. Aplicacin a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto etanlico de Tropaeolum majus a diferentes
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
250
24/48
h*
0
0
0
h*: Horas
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
1
1
48/72
h*
2
2
2
144
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
250
24/48
h*
0
0
0
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
1
2
48/72
h*
2
2
2
h*: Horas
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
250
24/48
h*
0
0
0
h*: Horas
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
145
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
BLANCO
0
0
0
2
2
2
250
24/48
h*
0
0
0
48/72
h*
0
0
0
CONCENTRACIN g/ml
125
24/48
48/72
h*
h*
1
1
1
1
1
1
62,5
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
h*: Horas
CONCENTRACIN g/ml
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
0
0
0
250
BLANCO
2
2
2
24/48
h*
0
0
0
h*: Horas
125
48/72
h*
0
0
0
24/48
h*
1
1
1
62,5
48/72
h*
1
1
1
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
146
CONCENTRACIN g/ml
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
0
0
0
250
BLANCO
2
2
2
24/48
h*
0
0
0
125
48/72
h*
0
0
0
24/48
h*
1
1
1
62,5
48/72
h*
1
1
1
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
h*: Horas
CONCENTRACIN g/ml
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
0
0
0
250
BLANCO
2
2
2
24/48
h*
0
0
0
h*: Horas
125
48/72
h*
0
0
0
24/48
h*
1
1
1
62,5
48/72
h*
1
1
1
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
147
CONCENTRACIN g/ml
MICROORGANISMO
Escherichia coli
PATRN
0
0
0
250
BLANCO
2
2
2
24/48
h*
0
0
0
h*: Horas
125
48/72
h*
0
0
0
24/48
h*
1
1
1
62,5
48/72
h*
1
1
1
24/48
h*
2
2
2
48/72
h*
2
2
2
148
Anexo 5
Tabla 57. Clasificacin y Descripcin de los microorganismos identificados en los

frotis de manos.
MICROORGANISMO
CLASIFICACIN
MACRO DESCRIPCIN
MICRO DESCRIPCIN
Bacteria filamentosa Color blanco, forma redondeada.
II
Levadura
Color
rosado
redondeada.
III
Levadura
Color rojo, forma

consistencia cremosa.
IV
Moho
Color rojo - naranja y marrn, de Presencia de largas hifas en su

centro firme y cuerpo algodonoso.
estructura.
Moho
niger )
cremoso,
Filamentos alargados, semejantes a

las hifas de un hongo.
forma Pseudomicelio.
redondeada, Pseudomicelio
pequeas hifas.
(Aspergillus Color negro verdoso, centro slido y Presencia

cuerpo algodonoso.
esporas.
de
compuesto
hifas
de
pequeas
VI
Bacteria
Color amarilo - crema, de forma Se distinguen cocos Gram positivos.

redondeada, apariencia mucoide.
VII
Bacteria
Color roja, apariencia mucoide.
149
Enterobacteria,
negativos.
bacilos
Gram
Anexo 6
MUESTRA 1
Extracto de Calndula officinalis en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar PCA
PRE CONTEO
POST CONTEO
MUESTRA 2
Extracto de Calndula officinalis en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar PCA
PRE CONTEO
POST CONTEO
MUESTRA 1
Extracto de Calndula officinalis en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar PDA
PRE CONTEO
POST CONTEO
MUESTRA 2
150
Extracto de Calndula officinalis en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar PDA

PRE CONTEO
POST CONTEO
MUESTRA 1
Extracto de Calndula officinalis en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar MC
PRE CONTEO
POST CONTEO
MUESTRA 2
Extracto de Calndula officinalis en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar MC
PRE CONTEO
POST CONTEO
151
Anexo 7
MUESTRA 1
Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar PCA
PRE CONTEO
POST CONTEO
MUESTRA 2
Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar PCA
PRE CONTEO
POST CONTEO
MUESTRA 1
Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar PDA
PRE CONTEO
POST CONTEO
152
MUESTRA 2
Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar PDA
PRE CONTEO
POST CONTEO
MUESTRA 1
Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar MC
PRE CONTEO
POST CONTEO
MUESTRA 2
Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (C): 50 - Placa de agar MC
PRE CONTEO
POST CONTEO
153

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EXPLORACIN DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS DE EXTRACTOS

VEGETALES A PARTIR DE Calndula officinalis Y Tropaeolum majus Y SU USO

LORENA MARIA ACOSTA ABRIL

DIRECTOR: CLEMENTINA CUETO VIGIL

Bogot, D.C., Noviembre de 2006

La biodiversidad, aquella til biotecnolgicamente, necesita la existencia de la

Carlos Eduardo ngel Villegas, 2004

A Clementina Cueto, directora y consejera, por su gua y constancia en el desarrollo

A mis hermanas, Gina y Juanita por su cario incondicional.

A Mateo, una inspiracin de mi vida.

A Diego, por su amor incondicional y su empeo por ayudarme a lograr lo que me

A la Lnea de Investigacin de Fermentaciones de la Facultad de Ingeniera,

1. OBJETIVO GENERAL ...

1.1. OBJETIVOS ESPECFICOS ....

1.1.3. Fase III

2.1. Colombia y su biodiversidad .

2.2. Investigacin en Colombia .

2.2.1. Especies vegetales silvestres .

2.2.1.1. Calndula officinalis L.

2.2.1.2. Tropaeolum majus

2.3. Antimicrobianos naturales .

2.3.1. Fito antimicrobianos

Mtodos de extraccin .....

Mtodos de extraccin .......

Espectro antimicrobiano y mecanismos de accin

Mtodos de extraccin .....

Espectro antimicrobiano y mecanismos de accin ...

2.4. Trabajos con extractos vegetales ....

2.5. Trabajos especficos con Calndula officinalis L. y Tropaeolum

2.6. Regulacin, seguridad y estandarizacin de productos de origen

2.7. Microorganismos indicadores ............................................................................

3. MATERIALES Y MTODOS ...

3.1. Fase I: Obtencin de Extractos

3.1.1. Material vegetal

3.1.2. Mtodo de extraccin .

3.1.3. Diseo experimental Fase I

3.1.4. Cuantificacin de los extractos ..

3.2. Fase II: Evaluacin de la actividad antimicrobiana y determinacin de

3.2.1. Microorganismos indicadores .

3.2.2. Ensayo microbiolgico ..

3.2.3. Diseo experimental Fase II ..

3.2.4. Evaluacin de la actividad antibacteriana y antifngica ..

3.2.4.1. Mtodo de difusin por disco

3.2.5. Determinacin de la actividad bactericida o bacteriosttica y

3.2.5.1. Mtodo del tubo pequeo ...

3.3. Fase III: Aplicacin de los extractos en sistemas In Vivo .

3.3.1. Material de ensayo .

3.3.2. Mtodos de aplicacin ..

3.3.2.1. Aplicacin de los extractos acuosos como conservantes naturales

3.3.2.2. Aplicacin de los extractos etanlicos en jabn gel antibacterial

4.1. Fase I: Obtencin de los extractos ...................................

4.2. Fase II: Evaluacin de la actividad antimicrobiana ..

4.2.1.1. Mtodo de difusin por disco

4.2.2. Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria, la actividad

4.2.2.1 Determinacin de la actividad bactericida o bacteriosttica y

4.2.2.2. Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) ..

4.3. Fase III: Aplicacin de los extractos ....

4.3.1. Aplicacin de los extractos acuosos como conservante natural en

4.3.2. Aplicacin de los extractos etanlicos como jabn-gel antibacterial

Tabla 2. Resultados obtenidos despus de la evaluacin de actividad

Tabla 3. Resultados obtenidos despus de la evaluacin de actividad

Tabla 4. Resultados obtenidos despus de la evaluacin de actividad

Tabla 5. Resultados obtenidos despus de la evaluacin de actividad

Tabla 6. Resultados obtenidos despus del estudio comparativo y