LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS

PRCTICA 2: DESCONGELAMIENTO DE UNA LNEA CELULAR

Chantal Rodrguez Navarro A01064585
Mariana Berbeyer Castillo A01098097
Miguel Ojeda Milln A01099203

Profesor: Dra. Hera Andrade Zaldvar

Tecnolgico de Monterrey, Campus Puebla, Mxico. A 27 de

Agosto del 2015

Objetivo
Adquirir los conocimientos y destreza para realizar el descongelamiento de una lnea celular.

Introduccin
La crioconservacin es una tcnica la cual almacena clulas a una muy baja temperatura en
nitrgeno lquido, las clulas se encuentran en suspensin, la cual por lo regular es en solucin de
glicerol o de DMSO y suero con el fin de conservarse sin perder sus funciones vitales. Este proceso
es crtico, ya que un inadecuado congelamiento de la lnea celular reduce drsticamente la viabilidad
de las clulas.

Una vez asegurndonos que la crioconservacin se realiz con xito al tener disponibles clulas
sanas, en fase exponencial y sin contaminantes se procede al descongelamiento celular, esta es una
tcnica que nos permite tener disponibles las clulas congeladas, siendo un paso crucial para el
desarrollo de protocolos de investigacin o de produccin. De igual manera, en el descongelamiento
de las clulas para su propagacin se siguen pasos crticos como: descongelamiento lo ms rpido
posible, adicin lenta de medio completo para diluir el crioprotector. El realizar adecuadamente estos
pasos nos llevar a tener una viabilidad celular alta, con el consecuente xito en la propagacin de la
lnea celular.
El cultivo debe monitorearse en un microscopio y si es necesario hacer otro recuento celular. Las
clulas se recuperan del nitrgeno de forma variable por lo cual es necesario observar los cultivos
meticulosamente durante varios das y proceder a su subcultivo cuando sea preciso.

Materiales y Mtodos
Material biolgico
Medio DMEM completo (10 % suero fetal bovino + 1% de antibiticos)
Medio DMEM completo (2% suero fetal bovino + 1% de antibiticos)
PBS 1 X libre de calcio y magnesio
Alcohol al 70 % + Benzal al 05%

Material
2 o 3 Crioviales con clulas MDCK congeladas a -80C
1 botella T75 estril o T25 estril
1 vaso de precipitado de 100ml estril
1 vaso de precipitado de 250ml estril
1 frasco Duran de 100ml.
Tubos cnicos de 13 ml estriles
Puntas para micropipeta de 1000ul estriles
Pipetas estriles de varias medidas
Pipeteador automtico.
Equipo utilizado
Campana de flujo laminar

Incubadora
Centrfuga para tubos cnicos

Protocolo experimental
Descongelamiento
Sacamos del ultracongelador lo crioviales con clulas MDCK, posteriormente dentro del cuarto de
cultivo los desinfectamos con etanol 70% para colocarlos alrededor de 3 minutos dentro de la
incubadora para descongelarlas. Una vez descongeladas, procedimos a desinfectar el criovial con
etanol 70% para introducirlo a la cabina de bioseguridad. Con ayuda de una micropipeta
homogeneizamos el fluido, subiendo y bajando lentamente las clulas y transferimos todo el
contenido, aproximadamente 500 ul, a un tubo cnico estril de 13 ml, al cual aadimos lentamente
0.5 ml de suero fetal bovino (SFB) atemperado a 37C y despus 4.5 ml de medio DMEM
atemperado a 37C. Y centrifugamos a 2000 rpm durante 3 min a RT

Lavado
Dentro de la cabina de bioseguridad, con ayuda de una pipeta quitamos cuidadosamente el
sobrenadante sin daar el pellet celular, una capa formada que se precipit al fondo del tubo y no
presentaba ningn color. Logrado esto, aadimos 5 ml de PBS 1X (libre de calcio y magnesio)
atemperado a 37C y centrifugamos a 2000 rpm durante 1 min y 30 seg.

Sembrado
Dentro de la cabina de seguridad quitamos con una pipeta el sobrenadante y suspendimos las
clulas en 1 ml de medio DMEM 10% SFB (completo), subiendo y bajando el fluido
cuidadosamente para eliminar la formacin de grumos. Una vez homogeneizado, aadimos 16 ml
ms de medio, lo cual sembramos en una botella T75 s. E incubamos a 37 C en una atmsfera de
5% de CO2. Finalmente revisamos el crecimiento celular a las 24 horas y una vez visto su
adherencia en el frasco se agreg suero para mejorar su confluencia.

Resultados
Las etapas de descongelamiento, lavado y sembrado dentro del procedimiento se realizaron con la
finalidad de obtener un crecimiento celular en tipo de monocapa, en especfico este crecimiento es
clasificado como estacionario debido a que las clulas incubadas no tuvieron agitacin ni
sedimentacin. Para observar el crecimiento de las clulas se hizo uso de un microscopio de
fluorescencia, con mucho cuidado y tomando las precauciones necesarias para evitar cualquier
contaminacin se sac de la incubadora la botella T75 donde se realiz la siembra, debido a las
propiedades fsicas de la botella se pudo observar directamente en el microscopio un crecimiento
considerable y exitoso del cultivo celular animal, se logr observar que algunas clulas no se llegaron
a adherir al fondo del envase, ms sin embargo una cantidad considerable logro est adherencia. La
morfologa de las clulas adheridas fue en forma poligonal tendiendo a agruparse en lminas de
clulas poligonales.

Figura 1. Microscopa ptica de la monocapa epitelial MDCK

Discusin
Una parte muy importante para lograr el xito del cultivo celular animal es controlar la mayor cantidad
de factores posibles, en cuanto el medio la correcta concentracin del suero y de los antibiticos, su
pH, la osmolaridad, temperatura, as como conocer los requerimientos indispensables de la lnea
celular con la cual se trabaj. La importancia de la adicin del suero en el medio es que promueve el
crecimiento y facilita la adhesin al sustrato, en cuanto a los antibiticos ayudan a evitar el desarrollo
de contaminantes microbianos en el cultivo.
Otro punto importante que cabe resaltar y debe de estar en todo momento presente en el
procedimiento es la asepsia con la que se trabaje, el crecimiento celular radica en un correcto control
de asepsia, en esta se hace uso de etanol para limpiar todo el material y de una cmara de flujo
laminar en una cabina aislada y por otra parte para asegurar la esterilidad la siembra celular se
incuba a 37C
En la actualidad el cultivo celular tiene un gran auge debido a que su xito de cultivo est asociado a
sustituir ensayos con animales siendo el cultivo celular menos costoso y ms fcil de manipular.

Conclusiones
Con la realizacin de la prctica nos dimos cuenta de todo los cuidados implicados en el
descongelamiento de una lnea celular. Las clulas son muy delicadas por lo cual el procedimiento se
debe hacer los ms rpido, cuidadoso y aspticamente posible ya que errar en cualquiera de estos
factores puede afectar la viabilidad celular y ocasionar la muerte de estas. El reto de volver viables a
clulas que se encontraban congeladas no acaba solo en el proceso de descongelamiento, es decir
en el paso final de colocar las clulas con medio en condiciones favorables de crecimiento (atmsfera
de CO2 al 5% y temperatura de 37C), sino que se debe llevar a cabo una inspeccin exhaustiva a lo
largo de los das que se mantendr el cultivo, ya que nos podemos encontrar con varios factores que
afectan el crecimiento celular e incluso ocasionar la muerte, factores como falta de medio,
contaminacin o un porcentaje de confluencia alto indicativo de que se debe realizar un subcultivo.

En conclusin trabajar con clulas de mamfero representa un gran reto y compromiso del personal
de laboratorio tanto para volverlas viables como para mantenerlas viables.

Cuestionario:
1. Cules son las medidas para llevar a cabo el adecuado descongelamiento de una lnea celular?
El descongelamiento debe realizarse en el menor tiempo posible ya que esto previene la formacin
de cristales cuando la temperatura aumenta de -50 a 0C, si este proceso es realizado con lentitud
puede causar un dao celular y prdida de viabilidad. Adems se debe tener extremo cuidado al
agregar el medio de cultivo y suero bovino nuevo, ya que el poner en contacto estos con las clulas
de una forma brusca puede ocasionar un choque osmtico y en consecuencia un rompimiento
celular. Es importante realizar el procedimiento de descongelamiento con suma esterilidad ya que
cualquier tipo de contaminacin en el medio de crecimiento para las clulas es fatal para su
reanimacin.

2. Cmo se debe manipular el tanque de N2 lquido y qu medidas de seguridad se deben seguir?

Para cualquier manipulacin de nitrgeno lquido es imprescindible el uso de guantes especiales
adaptados para el entorno criognico, as como una mscara o pantalla facial y calzado cerrado;
nunca deben sumergirse las manos en el nitrgeno lquido ni cuando se usan los guantes especiales.
La va principal de exposicin es la respiratoria, por lo cual se debe evitar la inhalacin de gases ya
que puede ocasionar asfixia por el desplazamiento del oxgeno ya que el nitrgeno es ms pesado.
Para el almacenamiento y manipulacin del nitrgeno se debe designar un cuarto especial, el cual
debe estar a una temperatura por debajo de los 50C, ventilado y sealizado correctamente haciendo
nfasis en el uso adecuado de la vestimenta de seguridad.

3. Cul es el motivo por el que se adiciona lentamente el medio completo a las clulas que se
acaban de descongelar?
El motivo por el cual el medio completo es agregado lentamente es para prevenir un choque
osmtico en las clulas, las clulas se expanden debido a que contienen solutos que ocasionan un
flujo osmtico del agua hacia su interior, es decir, el medio completo funge como solucin hipotnica
(de baja concentracin de solutos), por lo cual para regular el gradiente de concentracin deja que
molculas de agua fluyan a su interior, esta expansin puede producir lisis o rompimiento celular

4. Cmo se evala la viabilidad de las clulas recin descongeladas?

La viabilidad celular puede ser evaluada realizando un conteo celular en una cmara de neubauer, se
toma una alcuota de clulas provenientes del medio y se tie con un colorante, generalmente azul
de tripano. Posteriormente se realiza un conteo de clulas vivas en el microscopio, las clulas vivas
sern aquellas que no se encuentran teidas, ya que la membrana celular impide el paso del
colorante al interior de la clula, mientras que las clulas muertas sern las que se encuentren
teidas de azul, indicativo de que hubo una lisis celular y el colorante logro penetrar el interior celular

5.- Qu es el DMSO?
El DMSO (dimetilsulfoxido) es un disolvente orgnico industrial, en la microbiologa se utiliza como
criopreservante, tiene la funcin de prevenir la formacin de cristales de agua en el interior de la
clula durante el proceso criognico, ya que la formacin de cristales puede ocasionar un
rompimiento celular.
6.- Para qu sirve el buffer PBS?
EL buffer fosfato salino (PBS) es una solucin acuosa que contiene cloruro sdico, fosfato sdico y
cloruro de potasio. Su concentracin y composicin es muy semejante a la de la matriz extracelular
de las clulas de mamferos, esta solucin se encuentra en un pH fisiolgico (7.4). El PBS se utiliza
para lavar las clulas a travs de centrifugacin, ya que es isotnico y no es txico para las clulas
7.- Cul es la composicin del medio DMEM?
Tabla 1. Composicin del medio DMEM 3

8.- Qu tipo de clulas son las clulas MDCK y cul es su morfologa?

En esta prctica trabajamos con la lnea celular epitelial MDCK, por sus siglas en ingls Rin
Canino Madin Darby, procedentes de un rin de perra adulta. Esta lnea celular generalmente se
utiliza para estudiar los mecanismos en los que algunas protenas se insertan en sitios particulares

de la membrana plasmtica. Muchos de ellos, implican estudios del brote de virus en la membrana
apical o basolateral. As mismo sta lnea celular es til para el estudio in vitro de hormonas, factores
de crecimiento y seales de transduccin 2. La morfologa de esta tipo de clulas es epitelial.
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