3ra Parte Zambrano

Lic.
Jess Zambrano Rojas
Pgina 1 de 89
ASIGANTURAS DE BIOQUIMICA ODONTOLOGIA

PRACTICA N1
VOLUMETRIA 1: PREPARACION DE SOLUCIONES
INTRODUCCION.
a) Volumetra.
La volumetra es un mtodo analtico que consiste en determinar el volumen de una solucin de
concentracin desconocido, que sea equivalente, a un volumen dado de una solucin de
concentracin conocida llamada solucin estndar. De esta manera, se determina en forma
indirecta la concentracin de una sustancia problema utilizando soluciones de concentracin
conocida.
Este es un aspecto que trataremos en la siguiente prctica, por ahora vamos a familiarizarnos con los
clculos y procedimientos necesarios utilizados para preparar soluciones, un aspecto de suma
importancia en Bioqumica, considerando que la reacciones que ocurren en el organismo requieren
que las molculas de los reaccionantes se encuentren en solucin.
b) Soluciones.
Una solucin es una mezcla de diferentes sustancias qumicas la cul es homognea con respecto a
sus propiedades fsicas y qumicas. Al referirnos a las soluciones es conveniente llamar a uno de los
componentes el solvente y a los otros los solutos. El componente de una solucin cuyo estado
fsico es preservado cuando la solucin es preparada, es conocido como es solvente. Por ejemplo,
cuando NaCI (un slido) es mezclado con agua, la solucin resultante es un lquido.
Consecuentemente, el agua es referida como el solvente y el NaCI como el soluto. Si todos los
componentes de una solucin estn en el mismo estado, aquel presente es mayor cantidad es llamado
el solvente.
Considerando el tamao de las molculas del soluto, las soluciones pueden ser coloidales y
verdaderas. La soluciones caloidales tiene partculas de soluto (llamadas micelas) de un tamao
9
comprendido entre 1 a 100 mu ( 1 mu=10 m ).
En el caso de las soluciones de protenas, cidos nucleicos y polisacridos. Las soluciones
verdaderas tienen soluto de un tamao menor a 1 mu. Las biomolecular y bioiones de bajo peso
molecular dan soluciones de esta clase.
c) Concentracin de soluciones.
La concentracin de una solucin se expresa como la cantidad de soluto por unidad de volumen de
soluciones. Para tal fin, en Bioqummica se emplea ms frecuentemente los siguientes tres sistemas:
el sistema PORCENTUAL, el sistema MOLAR, y el sistema NORMAL, de acuerdo a las unidades
empleadas para apreciar la cantidad de una sustancia disuelta.
Lic. Jess Zambrano Rojas
Pgina 2 de 89
Una solucin PORCENTUAL (%), es aquella que contiene un determinado nmero de gramos de
sustancia en 100 g de solucin (P/P) o en 100 ml de la solucin (P/V); por ejemplo, una solucin
concentrada de HCI al 36% (P/P) contiene 36 g de HCI en 100 g de solucin, y una solucin salina
fisiolgica al 0.9 % (P/V) contiene 0.9 g de NaCI en 100 ml de solucin.
Una solucin MOLAR (M), es aquella que contiene un determinado nmero de moles de la sustancia
por litro de solucin. Definiendo al mol, como la cantidad de sustancias en gramos numricamente
igual a su peso molecular. As, una solucin 1M de NaOH contiene 1 mol (40g) de NaOH por litro de
solucin y una solucin 1M de H2SO4 contiene 1 mol (98g) del cido por litro de solucin.
Una solucin NORMAL (N), es aquella que contiene un determinado nmero de equivalentes gramo
de la sustancia por litro de solucin. Definindose al Equivalente gramo, como la cantidad de la
sustancia en gramos que puede reaccionar con un tomo gramos de hidrogeno, oxhidrilo o medio
tomo gramo de oxgeno, As, una solucin 1 N de HCI contiene 1 Equivalente gramo (36.5 g) de
HCI por litro de solucin y una solucin 1N de H2SO4 contiene 1 Equivalente gramos (40g) del
cido por litro de solucin.
EXPERIMENTO 1.1. Preparacin de 100 ml de una solucin 0.1 N de Acido, Oxlico.
Objetivos:
1. Capacitar al alumno para realizar los clculos necesarios para preparar una solucin Estndar
Primaria (*)
2. Propiciar que el alumno utilice adecuadamente el material de laboratorios puesto a su
disposicin para la preparacin de soluciones.
Procedimientos:
1. Calculada la cantidad de cido oxlico requerida para preparar 100 ml de solucin 0.1 N,
pesar con mucha exactitud dicha cantidad.
2. Colocar la sustancia pesada en un beaker de 100 ml y aadir aproximadamente 50 ml de agua
destilada.
3. Mezcla con una bagueta de vidrio hasta que se disuelva completamente el cido oxlico.
4. Transferir el contenido a un frasco volumtrico (fiola) de 100 ml y completar hasta la marca
(enrasar) con agua destilada. Tapar la fiola y mezclar.
5. Transferir la solucin a un frasco limpio y rotularlo adecuadamente.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(*) Un estndar primario es un sustancia de composiciones qumica conocida, de alto grado de
pureza, muy estable a las condiciones ambientales, que puede pesarse fcilmente y cuyas soluciones
sirven para la titulacin exacta de otras soluciones. Un ejemplo lo tenemos de un cido divalente, su
equivalente gramo es 126.08/2 = 63:04 g que ser el peso que 1000 ml debe contener una solucin
1N de cido oxlico. Otro estndar primario muy utilizado, es el talato cido de potasio
(PM=204.22).
Resultados:
Pgina 3 de 89
Anote en el espacio siguiente la cantidad de cido oxlico calculado para preparar 100 ml de
una solucin 0.1 N.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------EXPERIMENTO 1.2. Preparacin de 100 ml de una solucin 0.1 N de cido Clorhdrico.

Objetivos:
1. Capacitar al alumno para realizar los clculos necesarios para preparar una solucin ms diluida
de un cido fuerte a partir de soluciones concentradas de la misma sustancia.
2. Propiciar que el alumno utilice adecuadamente el material de reactivos de laboratorios puestos a
su disposicin para la preparacin de soluciones de cidos fuertes.
Procedimientos:
1. Calcular el volumen (ml) que debe medirse de la solucin concentrada de HCI (con una
concentracin de 36% y una densidad de 1.19 g/ml), para preparar 100 ml de solucin 0.1 N.
2. Medir en una fiola de 100 ml aproximadamente 50 ml de agua destilada.
Pipetear con sumo cuidado el volumen calculado del cido concentrado y vaciarlo lentamente
sobre el agua contenida en la fiola.
3. Completar hasta la marca con agua destilada, tapar el frasco y mezclar.
4. Transferir la solucin a un frasco limpio y rotulado adecuadamente.
Resultados:
Anote en el espacio siguiente el volumen de HCI concentrado, calculado para preparar los
100 ml de la solucin 0.1 N:
----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Calcule y anote la concentracin NORMAL o NORMALIDAD de la solucin concentrada de

HCI:
----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Calcule y anote la concentracin PORCENTUAL (P/V) de la solucin concentrada de HCI:

----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Pgina 4 de 89
EXPERIMENTO 1.3. Preparacin de 100 ml de una solucin 0.1 M de cido sulfrico.

Objetivos:
1. Capacitar al alumno para realizar los clculos necesarios para preparar una solucin ms diluida
de un cido fuerte a partir de soluciones concentradas de la misma sustancia.
2. Propiciar que el alumno utilice adecuadamente el material de reactivos de laboratorios puestos a
su disposicin para la preparacin de soluciones de cidos fuertes.
Procedimientos:
1. Calcular el volumen (ml) que debe medirse de la solucin concentrada de
H 2 SO 4
(con una
concentracin de 94 % y una densidad de 1.84 g/ml), para preparar 100 ml de solucin 0.1 M.
2. Medir en una fiola de 100 ml aproximadamente 50 ml de agua destilada.
Pepitear con sumo cuidado el volumen calculado del cido concentrado y vaciarlo lentamente
sobre el agua contenida en la fiola.
3. Completar hasta la marca con agua destilada, tapar el frasco y mezclar.
4. Transferir la solucin a un frasco limpio y rotulado adecuadamente.
Resultados:
Anote en el espacio siguiente el volumen del
H 2 SO 4
concentrado, calculado para preparar
los 100 ml de una solucin 0.1 M:

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Calcule y anote la concentracin NORMAL o NORMALIDAD de la solucin concentrada de

H 2 SO 4
:
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Calcule y anote la concentracin PORCENTUAL (P/V)

H 2 SO 4
:
de la solucin concentrada de
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Pgina 5 de 89
EXPERIMENTO 1.4.
Preparacin de 100 ml de una solucin 0.1 N de cido

Hidrxido de sodio.
Procedimientos:
1. Calcular el volumen (ml) que debe medirse de la solucin saturada de Na OH (aproximadamente
19N), para preparar 100 ml de solucin 0.1 N.
2. Pipetear con sumo cuidado el volumen calculado de la solucin saturada de NaOH y vaciarlo en
una fiola de 100 ml.
3. Completar hasta la marca (enrasar) con agua destilada libre de
CO2
(**).
4. Tapar el frasco y mezclar.

5. Transferir la solucin a un frasco limpio y rotularlo adecuadamente.
Resultados:
Anote en el espacio siguiente el volumen calculado de la solucin saturada de NaOH

necesario para preparar los 100 ml de solucin 0.1 N:
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------INTERROGANTES.
1. Qu volumen de cido sulfrico 17.65 M debemos tomar para preparar?:
a) Un litro de solucin 0.02N:
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------b) Un litro de solucin con 6 umoles por ml:
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------c) Un litro de solucin con 10 miliequivalentes por 100 ml:
Pgina 6 de 89
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(*) Solucin saturada es aquella en la que la capacidad del solvente para aceptar mayor cantidad de
soluto ha llegado al mximo, y al agregar ms sustancia esta ya no se disuelve.
CO2
(**) Para Obtener agua libre de Anhdrido Carbnico
hacer hervir el agua destilada y luego
para el recipiente que la contiene. Dejar enfriar antes de usar.
2. Son rigurosamente exactas las concentraciones de las solucines preparadas en 1.2, 1.3 y 1.4? Si
su respuesta es NO, fundamente su respuesta:
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------3. Siendo actualmente recomendable el sustituir las concentraciones de las biomoleculares en los
lquidos biolgicos del organismo expresadas en forma porcentual, por las concentraciones
expresadas en el sistema molar, hagas las conversiones correspondientes para los compuestos
qumicos que a continuacin se sealan:
COMPUESTO
PM
CONCENTRACION %
(P/V)
CONCENTRACION Mm
(mmoles/litro)
Glucosa (sangre)
180
70 110 mg/dl
_______________________
Urea (sangre)
60
21 43 mg/dl
_______________________
Creatina (suero)
113
0.6 1.5 mg/dl
_______________________
Colesterol (suero)
387
150240 mg/dl
_______________________
Lcteo (suero)
140
3-7
mg/dl
_______________________
Hierro (suero)
56
50 -150 ug/dl
_______________________
Calcio (suero)
40
8.5 -10.5 mg/dl
_______________________
Fosforo (suero)
31
3.0 4.5 mg/dl
_______________________
Pgina 7 de 89
APELLIDOSNOMBRES
FECHA//.
BIOQUIMICA - ODONTOLOGIA
PRACTICA N 2. VOLUMETRIA 2: TITULACION DE SOLUCIONES (ACIDIMETRIA Y
ALCALIMETRIA)
INTRODUCCION.
a) Titulacin Acido Base.
Con frecuencia es necesario determinar el contenido cido de los lquidos biolgicos (jugo
gstrico, saliva, orina, etc.) Esto se realiza mediante la tcnica analtica volumtrica (Titulacin
Acido-Base), que se estidiar en esta pr+actica en la forma ms sencilla.
La titulacin Acido Base es un mtodo sensible y preciso que, como habamos referido, consiste
en determinar el volumen de una solucin de concentracin desconocida que sea equivalente a un
volumen dado de una solucin de concentracin exactamente conocida llamada solucin
estndar.
Como se habr deducido, las soluciones preparadas en los experimentos 1.2, 1.3, y 1.4 de la
prctica anterior, no tienen una concentracin exacta, sino aproximada. Con los cidos y bases
comnmente empleados (HCI, H2SO4, NaOH, KOH) es prcticamente imposible preparar
directamente soluciones estndar. Asi el HCI concentrado es voltil, el H2SO4 es adems
higroscpico, y los lcalis slidos absorben CO2 y agua. Por estas razones, se preparan soluciones
aproximadamente 0.1 N de esta sustancia y luego se determina la concentracin exacta de la
solucin diluida por titulacin con un estndar primario como el cido oxlico.
Las soluciones problema, as tituladas, podr entonces ser empleadas (por breve tiempo debido a
su inestabilidad) como un estndar secundario; o su concentracin, ahora ya conocida, puede
ser corregida para un uso particular (se entiende que en este caso, en ms conveniente que la
concentracin sea algo mayor que la esperada para hacer la correccin aadiendo agua destilada).
Se enfatiza que diversas determinaciones y experiencias realizadas en Bioqumica, requieren el
uso de soluciones de concentracin rigurosamente exacta.
b) Fundamento.
La Titulacin Acido-Base se fundamente en el siguiente principio: soluciones de cidos y bases
de igual normalidad se neutraliza exactamente volumen a volumen. En otras palabras, para la
titulacin estequiomtrica de un cido debe aadirse una cantidad igual de una base:
Pgina 8 de 89
N de mEq de ACIDO = N de mEq de Base

Dado que, N de mEq = ml x NORMALIDAD, podemos entonces escribir:
ml (del ACIDO) x N ( del ACIDO) = ml (de la BASE) x N (de la BASE)
Entonces se comprende porque las soluciones de cidos y bases de igual normalidad se neutraliza
exactamente volumen a volumen:
5ml (ACIDO) x 0.1 N (ACIDO) = 5ml (BASE) x 0.1 N (BASE)
Lo que no es vlido para soluciones de diferente normalidad:
5ml (ACIDO) x 0.1 N (ACIDO) = 4 ml (BASE) x 0.125 N (BASE)
Por lo cual, la siguiente expresin est plenamente justificada:
N x V = N x V y N
N xV
V
(1)
Dnde: N = Normalidad de la solucin estndar.

V = Volumen de las soluciones estndar.
N= Normalidad de la solucin a titular.
V= Volumen de las soluciones a titular.
Recordar que los ACIDOS reaccionan de las BASES se han neutralizado
El punto final de la neutralizacin puede ser determinado por el cambio de color de un INDICAR
como la Fenoltalena. Una solucin que contenga esta sustancia es incolora en un medio cido y se
vuelve de un color rojo grosella cuando se ha neutralizado.
EXPERIMENTO 2.1 Titulacin de la solucin de NaOH aproximadamente 0.1 N preparada en
el experimento 1.4
Objetivos:
1. Capacitar al alumno para una correcta utilizacin de mtodo volumtrico de titulacin que le
permitan preparar soluciones alcalinas de concentracin exactamente conocida.
2. Capacitar al alumno para el correcto empleo de la ecuacin (1), utilizada en la titulacin de
cidos y bases.
3. Familiarizar al alumno en el uso y aplicacin de los indicadores.
Pgina 9 de 89
Procedimiento:
1. En un Erlenmeyer colocar 5ml de las solucin estndar de cido oxlico 0.1 N y aadir 2
gotas del indicador fenoltalena al 1% Mezclar.
2. Llenar y enrasar una bureta de 10 ml con la solucin de NaOH aproximadamente 0.1 N
preparada en el experimento 1.4.
3. Dejar caer lentamente la solucin de NaOH sobre la solucin de cido oxlico contenida en el
Erlenmeyer, agitando ste permanentemente hasta que se aprecie un color rosado estable.
4. Leer en la bureta el volumen gastado de NaOH aproximadamente 0.1 N.
5. Realizar los clculos correspondientes empleando la ecuacin NaOH. Esta solucin as
titulada puede luego ser utilizada como estndar secundario para la titulacin de cidos.
Resultados:
1. El volumen de NaOH aproximadamente 0.1 N gastado es: ___________________________
2. La concentracin exacta de la solucin de NaOH as titulada es: _______________________

(Anote en el espacio en blanco todos sus clculos realizados)
3. Si la solucin resulta ser ms concentrada que 0.1 N, calcular el volumen de agua destilada
libre de CO2 que ser necesario aadir a la solucin ya preparada, para ajustarla a una
concentracin exactamente 0.1 N:
Pgina 10 de 89
4. Si la solucin resulta ser ms diluida que 0.1 N, cul sera el procedimiento a emplear para
ajustarla a una concentracin exactamente 0.1 N?
EXPERIMENTO 2.2 Titulacin de la solucin de HCI aproximadamente 0.1 N preparada en el

experimento 1.2
Objetivos:
1. Capacitar al alumno para una correcta utilizacin del mtodo volumtrico de titulacin que le
permitan preparar soluciones de cidos de concentracin exactamente conocida.
2. Capacitar al alumno para el correcto empleo de la ecuacin (1), utilizada en la titulacin de cido
y bases.
Procedimiento:
1. En un Erlenmeyer colocar 5ml de la solucin problema de HCI a titular y aadir 2 gotas del
indicador fenoltalena al 1% Mezcalar.
2. Llenar y enrasar una bureta de 10 ml con la solucin estndar de NaOH (de concentracin
exactamente conocida), preparada en el experimento 1.4.
3. Dejar caer lentamente la solucin de NaOH sobre la solucin de HCI contenida en el
Erlenmeyer, agitando ste permanentemente hasta que se aprecie un color rosado estable.
4. Leer en la bureta el volumen gastado de la solucin estandar de NaOH.
5. Realizar los clculos correspondientes empleando la ecuacin (1), para determinar el ttulo o
concentracin exacta de la solucin de HCI. Esta solucin as titulada, puede entonces ser
utilizada para un fin especfico, como por ejemplo, el estudio del efecto del pH sobre la
velocidad de una reaccin enzimtica, etc.
Resultados:
1. El volumen gastado de la solucin estndar de NaOH es: _______________________________
Pgina 11 de 89
2. La concentracin exacta de la solucin de HCI as titulada es:____________________________
3. Si la solucin de HCI resulta ser ms concentrada que 0.1 N, calcular el volumen de agua
destilada libre de CO2 que ser necesario aadir a esta solucin para ajustarla a una
concentracin exactamente 0.1 N:
EXPERIMENTO 2.3 Titulacin de la solucin de H2SO4 aproximadamente 0.1 M preparada

en el experimento 1.3
Objetivos:
1. Capacitar al alumno para una correcta utilizacin del mtodo volumtrico de titulacin que le
permitan preparar soluciones de cido de concentracin exactamente conocida.
2. Capacitar al alumno para el correcto empleo de la ecuacin (1), utilizada en la titulacin de cido
y bases.
Procedimiento:
1. En un Erlenmeyer colocar 5 ml de la solucin problema de H2SO4 a titular, y aadir 2 gotas de
indicador fenoltalena al 1%. Mezclar.
2. Llenar y enrasar una bureta de 10 ml con la solucin estndar de NaOH (de concentracin
exactamente conocida), preparada en el experimento 1.4.
3. Dejar caer lentamente la solucin de NaHO sobre la solucin de H2SO4 contenida en el
erlemeyer, agitando este permanentemente hasta que se aprecie un color rosado estable.
4. Leer en la bureta el volumen gastado de la solucin estndar de NaOH.
Pgina 12 de 89
5. Realizar clculos correspondientes empleando la ecuacin (1), para determinar al o

concentracin exacta de la solucin de H2SO4. Esta solucin as titulada, puede entonces ser
utilizada para un fin especfico, como por ejemplo, la determinacin de la concentracin de cido
rico en el suero sanguneo, etc.
Resultados:
1. El volumen gastado de la solucin estndar de NaOH es:_______________________________
2. La concentracin exacta de la solucin de H2SO4 as titulada es:__________________________
(Anote en el espacio en blanco todos sus clculos realizados)
3. Si la solucin H2SO4 resulta ser ms concentrada que 0.1 N, calcular el volumen de agua
destilada libre de CO2 que ser necesario aadir a esta solucin a una concentracin exactamente
0.1 N:
4. Por qu al titular la solucin de H2SO4 no se gast un volumen similar de la solucin estndar

de NaHO, al gastado cuando se titul la solucin de HCI?
INTERROGANTES.
Pgina 13 de 89
1. Las soluciones de cidos y bases de igual molaridad se neutralizan exactamente volumen a

volumen?
SI __________________NO _____________ NO NECESARIAMENTE_______________
Fundamente su respuesta:
2. Cuntos ml de NaOH 2.5 N ser necesarios para neutralizar 10 ml de cidos sulfrico

concentrado de D = 1.98 y al 98% (P/P)?
3. Si 30 ml de NaOH 0.5 N neutralizan 25 ml de cido sulfrico Cul es la concentracin molar

del cido sulfrico?
4. El principal producto de la fermentacin de los carbohidratos de la dieta por lo microorganismos

de la placa dental es cido lctico. Este cido orgnico es el principal determinante de la acidez
de la saliva y de la placa dental, especialmente despus de la ingesta de carbohidratos. Las
concentraciones elevadas del cido desmineralizan el esmalte adyacente e inicia la caries dental.
Aplicando la informacin y la experiencia ganada en esta prctica, seale brevemente como
procedera para determinas la acidez, titulable de una muestra de saliva:
Pgina 14 de 89
Procedimientos similares son empleados para la terminacin de la acidez titulable de la orina

(expresada como el nmero de ml de NaOH 0.1 N necesario para titular el volumen de orina de
24 horas, hasta un pH de 7.4), y la acidez del juego gstrico (expresada como el nmero del
mililitro de NaOH 0.1 N necesarios para neutralizar la acidez de 100 ml de jugo gstrico).
APELLIDOS.NOMBRES..
FECHA../../
BIOQUIMICA - ODONTOLOGIA
PRACTICA N 3 Ph y pK: SU DETERMINACION
INTRODUCION.
+
a) La concentracin de iones hidrgeno ([ H ] y el concepto de pH.
Pgina 15 de 89
+
La [ H ] es de considerable importancia para todos los organismos vivos, y normalmente sta bajo
un riguroso control a fin de asegurar la eficiencia de todos los procesos vitales. As pequeos cambios
en dicha concentracin, pueden producir marcados efectos metablicos y fisiolgicos capaces de
afectar la salud y la vida.
+
El principal determinante de la pequea pero efectiva [ H ] en los organismos vivos en el agua. El
+
agua es un electrolito dbil pues se disocia escasamente en iones hidronio ( H 3 O ) e OH, que en
forma simplificada puede expresarse as:
H2
+
H + OH
(1)
Aunque el agua tiene solo una muy buena ligera tendencia a disociarse, sus productos, los iones
+
H e OH, tienen profundos efectos biolgicos. Por esta vez nosotros debemos ser capaces de
expresar dicho grano de disociacin en trminos cuantitativos, para lo cual consideramos la constante
de equilibrio para la reaccin (1):
H
+
[OH ]
K eq
de donde Kep
H
+
[ 2 O]=
El valor para la Kep ha sido cuidadosamente estimada midiendo la conductividad elctrica de agua
pura a 25C y es igual a 1.8 x
1016 . Por otro lado, la concentracin del agua es relativamente
alta, 55,56 M (55.56 moles de agua en un litro), y constante en relacin a la muy baja concentracin,
1 x
107
M, de iones
+ e OH
. Por lo que Kep x

H
H
[ 2 O]
1 x 1014 . Este es
denominado producto inico del agua (Kw).

+
Pgina 16 de 89
Cuando la
+
H
, como el agua pura, se dice que la solucin es neutra. Bajo estas condiciones, la
concentracin de
+ y OH
puede ser calculada del producto inico del agua:
+
H
+
H
+ 2 y
H
Kw=
+
[ H ]=
1 x 1014=1 x 107 y [OH ] =
H =
14
1 X 10
7
=1 X 1 10
7
1 X 10
Kw
Siendo el producto inico del agua constante, siempre que la concentracin de iones
7
a 1 x 10 , la concentracin de iones OH debe ser menor que
cuando la concentracin de
+
H es mayor
1 x 107 y viceversa. Por lo tanto,
+
H es muy alta, como una solucin de HC1 1M, la concentracin de
iones OH debe ser muy baja,
14
1 x 10
M . Inversamente, cuando la concentracin de iones OH es
muy alta como en una solucin de NaOH 1M, la concentracin de iones
+
H
debe ser muy baja ,
1 x 1014 .
Pgina 17 de 89
Kw, el producto inico del agua, es as el fundamento de la escala de pH, diseada por Sorenser (un
+
H (y la de los iones OH) de
bioqumico dans) para expresar la real concentracin de iones
cualquier solucin acuosa, en un gramo de acidez entre 1M DE
+
H y 1M de OH.
Sorensen defini el trmino pH as:

H
+
H
+
pH =
= -log
log
Por lo tanto, siendo
H +
para una solucin neutra a 25C su pH ser igual a 7.0.
[H+] M
1.0
0.1
0.01
0.001
0.000 1
0.000 01
0.000 001
0.000 000 1
0.000 000 01
0.000.000 001
0.000 000 000 1
0.000.000 000 01
0.000 000 000 001
0.000 000 000 000 1
0.000 000 000 000 01
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
[OH-] M
0.000 000 000 000 01
0.000 000 000 000 1
0.000 000 000 001
0.000.000 000 01
0.000 000 000 1
0.000.000 001
0.000 000 01
0.000 000 1
0.000 001
0.000 01
0.000 1
0.001
0.01
0.1
1.0
pOH
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
b) Medicin del pH.
Pgina 18 de 89
La
no puede ser media por mtodos titimtricos ordinarios como lo demuestra el siguiente
ejemplo: volmenes iguales de cido actico 0.1 N o de HCI 0.1 N dan los mismos valores de
titulacin con NaOH 0.1 N, cuando usamos fenoltalena como indicador de neutralizacin. En otras
palabras, el cido 0.1 N y el HCI 0.1 N tiene la misma acidez titulable o capacidad de conbinacion
con iones hidroxilo. Sin embargo, la
del HCI 0.1 N es tambin 0.1 N (pH = 1), mientras que
+
la
del cido actico es de solamente 0.001342 N (pH = 2.8724). Es decir, aunque ambos cidos
tienen la misma normalidad o acidez titulable, ellos tienen diferente acidez real o pH, siendo la
diferencia atribuible al hecho que el HCI 0.1 N (un cido fuerte) est completamente disociado
mientras que el cido actico 0.1 N (un cido dbil) esta apenas disociado (0.001342 N es apenas el
1.3 % de 0.1 N).
Los cidos como el HCI,
H 2 SO 4
y el HN
O3
comunmente llamados cidos fuertes, stan
completamente disociados en soluciones acuosas diluidas; las bases fuertes como el NaOH y KOH
tambin estn completamente disociados.
En bioqumica estamos ms interesados en el comportamiento de los llamados cidos y bases dbiles,
los cuales estn dbilmente disociados cuando son disueltos en agua. Un ejemplo de cido dbil es el
cido actico (
3COOH
, el cual le da al vinagre el sabor cido. Un ejemplo de una base dbil
CH
es el amoniaco (
NH 3
. Acidos y bases dbiles son comunes en sistemas biolgicos y juegan roles
importantes en el metabolismo y su regulacin.

Recordemos que los cidos son definidos como donadores de protones o iones
+
H
y las bases
como aceptores. Un donador de protones y su correspondiente aceptor forma un par conjugado

cido - base. Por ejemplo,
3COOH
, un donador de protones, y el acetado
CH
3CO O
CH
el
Pgina 19 de 89
correspondiente aceptor de protones, constituye un par conjugado cido base relacionados entre s
por la reaccin reversible:
3COOH
CH
+
3CO O
H +
CH
(1)
Cada cido tiene una tendencia caracterstica a perder un protn. La tendencia de cualquier cido
dbil, HA, a perder su protn su base conjugada A .

Es definida por la constante de disociacin a menudo llamada Ka (a por cido). As, para la reaccin
reversible:
HA
++ A
, la Ka es:
H
H
+
A
Ka =
A mayor capacidad de disociacin del cido, mayor ser su Ka y viceversa.
Al igual que el pH facilita la expresin de la
+ , el pKa definido como el log Ka facilita la
expresin de Ka. A mayor capacidad de disociacin de un cido, menor ser su pKa y viceversa.
ACIDO
HCOOH (fnico)
3COOH
CH
Ka
1.78 x
(actico)
2 CH 3
3CH (propionico)
CH
105
pKa
3.75
4.76
4.87
3.86
2.14
6.86
1.35 x
12.40
104
1.75 x
Kb
pKb
Pgina 20 de 89
3CHOH COOH
(lcti
CH
co)
105
1.38 x
1
10
(fosfrico)
H 3 PO
7.25 x
4
2
(fosfr.
H 2 PO
1.38 x
Monobsico)
HPO4 (fosfrico dibsico)

3
(carbnico)
H 2 CO
103
7
10
3.98 x
1013
3.77
10.22
9.25
1.70 x
104
3
+
(ion bicarbonato)
HCO
6.31 x
+
NH 4 (ion amonio)
5.62 x
1011
10
10
Complete en la tabla los correspondientes valores de Kb y pKb, considerando las siguientes

relaciones.
Kw=1 x 1014=Ka x Kb y pKw=14= pKa+ pKb
Estas ecuaciones hacen posible colocar la capacidad relativa de ionizacin de cido y bases en la
misma escala, ms comnmente como Ka o pKa. Esto es fundamentalmente valioso para el estudio
de molculas como los aminioacidos y protenas, las cuales tienen grupos cidos y bsicos dbiles,
cuya capacidad de disociacin es ms fcil de estudiar cuando se compraran por el mismo patrn. Por
ejemplo, se comprende mejor que el grupo R-COOH del aminocido glicica, con un pKa = 2.34, es
+
ms cido que el grupo R-NH 3 , con un pKa = 9.6, que si comparamos este ltimo con el valor
pKb = 11.66 del primero.
Pgina 21 de 89
Ahora si estamos en condiciones de comprender mejor el fundamento de los mtodos colorimtrico

para la determinacin del pH. Estos mtodos se basan en el empleo de INDICADORES, los cuales
son cidos o bases dbiles con capacidad de cambiar de colo cuando estn ionizados:
++ Ind
HInd
COLOR A
COLOR B
Cada indicador tiene un caracterstico valor de pKa. Cuando el pH de una solucin coincide con el
valor de pKa del indicador, el 50% de sus molculas estarn ionizadas y de un color B, y el otro 50%
estarn sin disociar y de un color A. En estn condiciones el color del indicador (y por lo tanto de la
solucin que lo contiene) ser intermedio entre ambos colores.
La tabla siguiente muestra la caracterstica de los indicadores ms comnmente utilizados:
CAMBIO DE COLOR
INDICADOR
Azul de timol
Azul de Bromofenol
Anaranjado de metilo
Verde de Bromocresol
Rojo de clorofenol
Azul de Bromotimol
Rojo de fenol
Azul de timol
Fenoltalena
LIMITES DE Ph
pKa
1.2 a 2.8
2.0
3.0 a 4.6
3.8
3.1 a 4.4
3.4
3.8. a 5.4
4.7
5.1 a 6.7
6.0
6.1 a 7.7
6.8
6.8 a 8.4
7.6
8.0 a 9.6
8.8
8.3 a 10.0
9.2
A
Rojo
Amarill
o
rojo
Amarill
o
Amarill
o
Amarill
o
Amarill
o
Amarill
o
Incoloro
B
Amarillo
Azul
Amarillo
Azul
Rojo
Azul
Rojo
Azul
Rojo
A valores de pH diferentes pero en las proximidades de pKa (dentro del rango del indicador) la
solucin cambiar de color segn predomine la forma ionizada o no del indicador. Se puede entonces
determinar el pH de soluciones problema, comparando los colores de esta solucin, con los colores
de solucin patrn (de pH conocido) que tenga el mismo indicador.
Un mtodo ms exacto para la terminacin del pH de las soluciones en el laboratorio clnico y
qumico, es el mtodo potenciomtrico. En un instrumento llamada pH metro, la seal de un
Pgina 22 de 89
+
electrodo espacial de vidrio (electrodo explorador) selectivamente sensible a la [ H ], es
amplificada y comparada con la seal generada por una solucin el pH exactamente conocido.
c) Clculo terico del pH.
pH DE ACIDOS FUERTES: dado que estn completamente disociados, la concentracin molar de
+
iones H ser igual a la concentracin normal del cido por lo que se aplica directamente la
expresin:
H
1
pH =log
Ejemplos:
Cul ser el pH de una solucin de HCI 0.00634 N ?
H
Siendo un cido fuerte la +
Cul ser el pH de una solucin de
H 2 SO 4 0.0003 M
(y por lo tanto 0.0006 N?
Siendo un cido fuerte la + (numricamente igual a la normalidad del cido) y su pH = -log de
0.0006, sea pH = 3.2218.
Pgina 23 de 89
pH DE ACIDOS DEBILES: dado que esta dbilmente disociados, la + no ser igual a la del
cido, pero es posible calcular de + despejando su valor de la ecuacin (2):
+
H
+ 2 de donde
Ka [ HA ] =
+
A
Considerando que la
H
H
Conocida la + y el pH se calcula aplicando el log + o alternativamente la siguiente
ecuacin:
pH=
pKalogC
2
Ejemplo: Cul ser el pH de una solucin de cido actico 0.2 N?
Pgina 24 de 89
pH=log 0.001871=2.728
pH=
4.757(0.699)
=2.728
2
pH DE LA SAL DE UN ACIDO DEBIL Y UNA BASE FUERTE: como para el caso del acetato
de sodio (CH3 COONa) en solucin acuosa, se emplea la siguiente ecuacin:
pH=
Donde:
pKw + pKa+log C
2
pKw = log Kw, pKa = -log Ka;
pKa = -log Ka y
C = concentracin de la sal.
d) Curva de titulacin de cido dbil. La ecuacin de Henderson.Hesselbach.Accin Buffer.

De la titulacin de un cido dbil se obtiene mucha ms informacin que la sola determinacin de su
concentracin, si medimos cuidadosamente el pH del cido que est siendo titulado despus de cada
incremento de NaOH, hasta el punto de neutralizacin, Una grfica del pH de la solucin vs. La
cantidad de NaOH aadido es lo que se llama una curva de titulacin.
La forma de la curva de titulacin de cualquier acido dbil es determinada por la denominada
ecuacin de Henderson Hasselbach, la cual es fundamental para comprender la accin buffer
implcita en los mecanismos que mantienen el equilibrio cido bsico de la sangre y tejidos de los
organismos vivos.
Los Buffers o amortiguadores, son sistemas acuosos que tienden a resistir cambios en su pH cuando
pequeas cantidades de cido
o base
OH
son aadidos. Un sistema buffer consiste de un
H2O
cido dbil (el donador de protones) y su base conjugada (el aceptor de patrones), como se muestra
en el siguiente esquema:
Pgina 25 de 89
O
CH3 COOH
CH 3CO O
+
H
La ecuacin de Henderson Hesselbach, es simplemente otra forma de expresar la Ka de un cido

dbil. De la ecuacin (2):
H
+
A
Ka=
Y aplicando el log :
Tenemos que:
pH =
+
A
log
A
pKa+ log
Pgina 26 de 89
La cual en forma general puede escribirse as:
+
aceptor de H
+
donador de H
pH= pKa+ log
As, la ecuacin de Henderson Hasselbach establece las relaciones cuantitativas entre el pH, la
accin buffer de una mezcla de una acido dbil con su base conjugada, y el pKa de cido dbil.
EXPERIMENTO 3.1 Acidez Real y Acidez Titulable.

Objetivos:
1. Demostrar el diferente comportamiento de los cidos fuertes (HCI) y de los cidos dbiles
(CH3 COOH), en lo que se refiere a su capacidad de disociacin.
2. Establecer la diferencia existente entre la acidez real (pH) y la acidez titulable (normalidad),
mediante titulacin, uso del papel indicador de pH y mediante el clculo terico del pH.
3. Demostrar que soluciones de cidos dbiles o fuertes de la misma normalidad o acidez
titulable, tienen diferente acidez real o pH.
4. Demostrar que soluciones de cidos dbiles o fuertes con igual acidez real o pH, tienen
diferente normalidad o acidez titulable.
Procedimiento:
1. Uds. Dispondrn de una solucin de HCI 0.01 N, y otra de cido actico 0.01 N.
2. Medir en el Erlenmeyer 5ml de la solucin de HCI 0.01 N, aadir 2 gotas de indicador
fenoltalena al 1% y titular con NaOH 0.01 N en la forma indicada anteriormente en el
experimento 2.2.
3. Lea en la bureta el volumen gastado de NaOH 0.01N.
4. De la misma forma proceda a la titulacin de 5ml de cido actico 0.01 N con el NaOH.
5. Lea en la bureta el volumen gastado de NaOH 0.01N.
6. Utilizando papel indicador, mida el pH de la solucin de HCI 0.01 N y el de la solucin de
cido actico 0.01 N.
7. Mediante las expresiones que estime conveniente, calcule el pH terico de ambas soluciones
de cido.
Resultados: anote los resultados en la siguiente tabla:
ml gastados de NaOH
0.01 N
pH estimado
pH calculado
Pgina 27 de 89
Solucin de cido
HCI 0.01 N
Solucin de cido
actico 0.01 N
Cmo explica Ud. Estos resultados? ...
Cul ser la concentracin de una solucin de HCI para que su pH sea igual al pH de la solucin de
cido actico 0.01 N que Ud. a usado?
EXPERIMENTO 3.2. Curva de titulacin de un cido dbil y determinacin de su pKa.

Objetivos:
1. Estudiar la titulacin de un cido dbil con una base fuerte.
2. Construir y analizar la curva de titulacin de un cido dbil y determinar su pKa.
3. Establecerlas relaciones cuantitativas existentes entre el pH, el pKa, y la relacin sal/cido,
mediante la aplicacin de la ecuacin de Henderon Hasselbarh.
4. Demostrar la accin amortiguadora del pH de un sistema buffer.
Procedimiento:
1. En cada uno de 5 tubos de ensayo rotulado del 1 al 5, medir 10 ml de la soluciones de cido
actico 0.2 N.
2. Aadir 2.5 ml, 5 ml y 10 ml de NaOH 0.2 N a los tubos 2,3,4 y 5 respectivamente.
3. Mezclar y estimar con papel indicador el pH de cada tubo.
4. Mediante clculos estime el pH de cada tubo.
Resultado: complete la siguiente tabla.
TUBOS
Relacin Sal / Acido
Pgina 28 de 89
pH estimado
pH calculado
mEq de NaOH aadidos
Construya en papel milimetrado la curva de titulacin del cidos actico y seale en la grfica el pKa
aproximado. Para ello, anote ene l eje de ordenadas los pH y el eje de abscisas los mEq de NaOH
aadidos.
Adjuntar dicha grfica en este protocolo.
NOMBREFECHA
BIOQUIMICA ODONTOLOGIA
PRACTICA N 4. PROTEINAS: PROPIEDADES FISICOQUIMICAS
INTRODUCCION.
Las protenas son compuestos de alto peso molecular formados por la unin de aminocidos a travs
de enlaces peptdicos. Dependiendo del nmero, la clase y la secuencia variable de los aminocidos
que la constituyen, las protenas tendrn un tamao, forma, carga y funcin definida.
En la presente prctica realizaremos algunos experimentos relacionados con las propiedades
fisicoqumicas de las protenas, que son de importancia biolgica y que derivan de su carcter
macromolecular.
a) Solubilidad de las protenas.
Las protenas en solucin muestran profundos cambios en su solubilidad en funcin del pH, fuerza
inica
(
), propiedades dielctricas del solvente (D), y la temperatura. En los organismos vivos un pH
fisiolgico de 7.4, una fuerza inica moderada correspondiente a una solucin salina diluida, la alta
constante dielctrica del agua y una temperatura moderna, son determinantes de la solubilidad de las
protenas presentes en los lquidos biolgicos. Por otro lado, estos factores pueden ser usados a
Pgina 29 de 89
separar mixtura de protenas, desde que cada protena con una caracterstica composicin de
aminocidos, puede tener un comportamiento diferencial frente a cambios en cada uno de los factores
mencionados.
b) Las protenas como electrolitos.
Ya dijimos que las protenas estn compuestas de una cadena de aminocidos, los cuales pueden ser
separados por hidrlisis (cida, alcalina y enzimtica).
N
La frmula general de los aminocidos es:

(donde R = resto de la molcula)
(1)
Como puede verse, los aminocidos poseen funciones cidas y bsicas, lo que hace que se comporten
en soluciones de ambas maneras, dependiendo ello del pH del medio. Este tipo de electrolitos se
conocen como electrolitos enfteros o anfolitos.
A un pH determinado, el anfolito (sea un protena o un aminocido) puede estar en la forma
isoelctrica indicada en (1). Esta forma estructural se denomina zwitterion, ion hbrido o
dipolar, y el pH que determina su presencia se denomina punto isoelctrico (pI).
Al agregar iones
+
H , estos se asociarn al grupo
COO
(que as se comportan como una base
dbil) y el zwitterion se transformar a la forma catinica (cargada positivamente). Si en vez de
+
+
hacer esto agregamos iones OH , estos se cambiarn como los H del grupo NH 3 (que
as se comporta como un cido dbil), obtenindose as la forma aninica (cargada
negativamente).
N
+
H
C
H
O H
C
H
Podemos entonces afirmar, que a un pH por debajo del pI, los aminocidos y por lo tanto la protenas,
estarn en su forma catinica, y al contrario, a un pH encima del pI estarn en su forma aninica.
Pgina 30 de 89
Si bien cierto que en las protenas gran parte de los grupos
+
COOH y N H 3
estn ligados
formando uniones peptdicas y por tanto no pueden ionizarce, existirn sin embargo los grupos
+
COOH y N H 3 terminales, adems de los grupos ionizables en cadena lateral (R):
Todos los grupos se ionozan en funcin del pH del medio y su nmero y de su grado de ionizacin
depender la carga neta de la protena. Es evidente que en el pI las protenas y los aminocidos se
comportan como elctricamente neutras, por tener igual nmero de cargas positivas y negativas y por
lo tanto no migraran en un campo elctrico. Sin embargo, en su forma catinica migraran al polo
negativo a CATODO, y en su forma aninica migraran al polo positivo o ANODO. Este es el
fundamento para la separacin de aminocidos y especialmente y protenas por electroforesis.
Adems, en el pI no hay repulsin electrosttica entre las molculas de protenas y ellas tienden a
coalecer y precipitar. Sin embargo, a valores de pH por debajo o encima del pI, todas las molculas
de protena tienen una carga neta del mismo signo, positiva o negativa, por lo cual se repelen entre si
favoreciendo su solubilidad.
Por otro lado, todos los grupos se comportan como cidos y base dbiles y confieren a las protenas
propiedades importantes, como por ejemplo, la capacidad de actuar como amortiguadores del pH
celular y extracelular, o la capacidad de actuar como enzimas en el mecanismo de catlisis general
cido base.
Como sabemos, la diferente capacidad de disociacin de estos grupos est mejor expresada por su
valor de pKa, un concepto de vital importancia para el estudio y comprensin de la estructura y
propiedades de la protenas. Los valores de pKa y pI de los diferentes aminocidos se muestran en la
siguiente tabla.
Valores de pKa y pI de los aminocidos

pKa (
COOH
NH
3
pKa
Aminocidos
GRUPO I. Con grupo R NO POLAR (hidrofbico)
Alamina (Ala)
2.3
9.7
pKa (R)
pI
6.0
Pgina 31 de 89
Leucina (Leu)
2.4
9.6
Isoleucina (Iso)
2.4
9.7
Valina (Val)
2.3
9.6
Prolina (Pro)
2.0
10.6
Fenilalanina (Fen)
1.8
9.1
Triptfano (Tri)
2.4
9.4
Metionina (Met)
2.3
9.2
GRUPO II. Con grupo R POLAR sin carga a pH 7.0
Glicina (Gli)
2.3
9.6
Serina (Ser)
2.2
9.2
Treonina (Tre)
2.6
10.4
Cistena (Cis)
1.7
10.8
Tirosina (Tir)
2.2
9.1
Glutamina (Gln)
2.2
9.1
Asparragina (Asn)
2.0
8.8
pKa (
COOH
6.0
6.1
6.0
6.3
6.5
5.9
5.8
8.3
10.1
NH 3
+
pKa
Amino
pKa (R)
GRUPO III. Con grupo R POLAR cargado negativamente a pH 7.0
Glutamato (Glu)
2.2
9.7
4.3
Aspartato (Asp)
2.1
9.8
3.9
GRUPO IV. Con grupo R POLAR cargado positivamente a pH 7.0
Histidina (His)
1.8
9.2
6.0
Lisina (Lis)
2.2
9.0
10.5
Arginina (Arg)
2.2
9.0
12.5
6.0
5.7
6.5
5.0
5.7
5.7
5.4
pI
3.2
3.0
7.6
9.8
10.8
Aquellas protenas con un alto contenido de aminocidos bsicos (del grupo IV) tienen valores altos
de Ip, como las historias (pI = 10), el citocromo c (pI = 10.6) y la lysozyna (pI = 11.0). Las
protenas con un alto contenido de aminocidos cidos (del grupo III) tienen valores bajos de pI,
como la pepsina (pI = 1). La mayora de las protenas globulares como las protenas de plasma
sanguneo, tienen valores de pI que van de 4.8 para la seroalbmina a alrededor de 7.0 para las
globulinas, con un contenido similar de aminocidos bsicos y cidos. Al pH fisiolgico 7.4 las
protenas del plasma estn como aniones.
EXPERIMENTO 4.1. Accin amortiguadora del pH de las protenas del suero.

Objetivos:
Pgina 32 de 89
1. Demostrar la propiedad amortiguadora del pH de las protenas del suero sanguneo.

Procedimiento:
1. Medir en un erlenmeyer 2 ml de suero sanguneo diluido al medio y titular con NaOH 0.01 N
hasta un pH aproximado de 8.4 usando 2 gotas de fenoltaleina comoindicador.
Anotar el volumen de base gastado.
2. Medir en otro erlenmeyer 2 ml de suero sanguneo diluido al medio y titular con HCI 0.01 N
hasta un pH de 3.4, usando 2 gotas de anaranjado de metilo como indicador. Para apreciar el
color producido a este pH, preparar un erlenmeyer 2 ml de un buffer acetato de pH 3.4 con 2
gotas del anaranjado de metilo. Anotar el volumen de cido gastado.
3. Repetir los pasos 1 y 2 con suero desproteinizado (o agua destilada). Anotar los volmenes de
base y cido gastado.
Resultados:
1. Con los datos obtenidos en este experimento complete la siguiente tabla:
CON EL SUERO
ml
moles
CON EL AGUA
moles
Ml
Gasto de NaOH 0.01 N

Gasto de HCI 0.01 N
2. Calcular los mEq de cidos y base necesarios para producir un cambio de una unidad de pH del suero y
del agua.
mEq ACIDO
mEq ABASE
Suero
Agua destilada
Interrogantes:
1. Cuntos grupos ionizables tiene el pptido Arg Lis- Asp His Glu - Cis?
2. Qu carga elctrica predominante tiene este pptido a pH 7.4?
3. Cul es su forma isoelctrica y su pI?
Pgina 33 de 89
EXPERIMENTO 4.2. Estudio de la solubilidad de la casena a diferentes pH y la determinacin

de si pI.
Objetivos:
1. Estudiar el efecto del pH sobre la solubilidad de las protenas.
2. Determinar el pI de una protena.
3. Estudiar el comportamiento de las protenas en su pI.
Procedimiento:
1. Preparar una serie de 9 tubos.
2. En el tubo 1 medir 9 ml de las solucin de cido actico 0.178 N.
3. En el tubo 2 medir 9 ml de la solucin de cido actico preparada mezclando 10 ml del cido
actico preparada mezclando 10 ml del cido actico 0.178 N con 10 ml de agua.
4. En el tubo 3 medir 9 ml de la solucin de cido actico obtenida me mezclar 10 ml de la solucin
anterior con 10 ml de agua destilada.
5. Proceda en la misma forma hasta completar los 9 tubos.
6. A cada tubo aadir 1 ml de la solucin de casena al 0.5 % en acetato de sodio 0.1 N.
7. Mezclar bien y observar la turbidez o el precipitado, a 1 y 10 minutos.
8. Con papel indicador estime el pH de cada uno de los tubos.
Resultados:
1. Complete la siguiente tabla y anote los resultados de turbidez o precipitado con 0 a 5+
TUBO
N
NORMALIDAD
SAL
ACIDO
RELACIO
N
SAL/ACID
O
pH
Terico
Prctico
TURBIDEZ O
PRECIPITADO
1 min.
10 min.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Interrogantes:
1. Cul es l pI de la casena?
Pgina 34 de 89
2. Por qu precipita la casena en si pI?
NOMBRE.FECHA
ASIGNATURA DE BIOQUIMICA ODONTOLOGIA
Pgina 35 de 89
PRACTICA N 5
BIOCATALISIS
INTRODUCCION.
Las enzimas son protenas que intervienen en las reacciones qumicas de los organismos vivos,
incrementando la velocidad de esta hasta alcanzar su punto de equilibrio.
En una reaccin bioqumica catalizada por una enzima, a medida que progresa la reaccin, aumenta
la concentracin de los productos a expresas de la desaparicin de los correspondientes substratos, en
tanto que en enzima permanece inalterable.
La actividad enzimtica usualmente es expresada por:
a) La desaparicin del sustrato (P).
b) La aparicin del producto (P).
c) La modificacin de los cofactores.
Diversos factores modifican la actividad enzimtica:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
El pH del medio.
La concentracin de la enzima.
La temperatura de la reaccin.
La concentracin del sustrato.
La fuerza inica ambiental.
El tiempo de reaccin.
El efecto de inhibidores y activadores.
En la presente prctica se estudiar algunas de las propiedades de las reacciones enzimticas. Para
ello utilizaremos como modelo experimental, la accin hidroltica de la pepsina sobre la protena
albmina de huevo.
La ovoalbmina es una protena globular presente en altas concentraciones en la clara de huevo,
apareciendo en el huevo fresco como una solucin viscosa y legeramente opalescente. Esta protena
en su estado natural tiene las dimensiones de 13m , y esta constituida de 584 residuos de
aminocidos dispuestos en una sola cadena polipeptdica, con un PM de 64500 y un pI de 4.6. Esta es
la protena que ser utilizada como sustrato de la pepsina, previa desnaturalizacin. La
desnaturalizacin de laalbmona de logra hirviendo el huevo por algunos minutos; entonces, se
extrae la clara, se la lica con agua destilada y esta solucin se la filtra a travez de una gasa. Se
obtiene as, una solucin no viscosa pero turbia. Ud. tiene que observar cuidadosamente esta solucin
antes y despus de aadirle pepsina.
Pgina 36 de 89
Recuerde usted que la pepsina es una enzima proteoltica secretada por las clulas principales del
estmago al estado de zimgene o proenzima (pepsingeno). Su activacin requiere de un pH muy
cido e implica la remocin de un pptido bloquear de su extremo amino terminal.
La enzima as activada digiere a las protenas hidrolizando loa enlaces peptdicos situados hacia el
lado amino de los residuos de fenilalanina, tirosina y triptfano, adems de aspartato, glutamato y
leucina (R2). No actua si el aminocido anterior es prolina.
H
I
N
H
I
C
I
Pepsina
O
II
C
N
I
H
R1
R2
I
C
I
H
C
II
O
EXPERIMENTO 5.1 Efecto del pH sobre la velocidad de una reaccin enzimtica.

Objetivos:
1. Estudiar la influencia del pH sobre la velocidad de una reaccin enzimtica.
2. Determinar el pH ptimo para la actividad de la pepsina.
Procedimientos:
1. Preparar 5 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro:
Solucin de ovoalbmina
HCI 1.0 N
NaC
O3 10%
2.0 ml
Agua destilada
5.0
2.0
5.0
0.5
5.0
0.0
5.0
0.0
5.0 ml
0.0 ml
0.0
0.0
0.0
1.5
0.0
2.0
0.5
1.5
0.0 ml
2. El otro 5 tubos de prueba pequeos, medir 3 ml de una solucin de pepsina al 1%

3. Preincubar los 10 tubos en bao maria a 37 por 5 minutos.
4. Agregar rpidamente a cada uno de los 5 primeros tubos, los 3 ml de la solucin de pepsina
reincubada en cada uno de los segundos tubos.
Pgina 37 de 89
5. Mezclar bien y continuar la incubacin a 37C por 10 minutos. Observar cuidadosamente cada
tubo antes y despus de agregar la enzima.
6. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimtica) de cada uno de los tubos, con 0 a 5 cruces, al
final de 1, 5 y 10 minutos.
7. Haga el clculo terico del pH de los tubos 1 y 2 y compruebe con papel indicador el pH de
todos los tubos.
Resultados:
1. En papel milimetrado, haga una grfica con los resultados obtenidos, colocando en el eje de
abscisas el pH y en el eje de ordenadas la actividad enzimtica.
2. El pH ptimo de la pepsina es..
Interrogantes:
1. Por qu se debe cocer un huevo antes de comerlo?
...........................................................................................................................................................
2. Por qu la solucin de ovoalbmina que Ud. utiliza como sustrato tiene un aspecto tan diferente
a la clara de huevo?
..
Pgina 38 de 89
3. Cmo define la desnaturalizacin de una proteina? Puede esta ser irreversible?

.
4. Habrn diferencia en las dimensiones de las molculas de ovoalbmina contenidas en la clara

de huevo y en la solucin sustrato? Si las hubiera, Cul es la razon?
.
5. Por qu ocurre aclaramiento de la solucin sustrato de ovoalbmina cuando se le aade pepsina?
..
.
6. Por qu el pH afecta la actividad de las enzimas?
...
Pgina 39 de 89
EXPERIMENTO 5.2 Efecto de la [E] sobre la velocidad de una reaccin enzimtica.

Objetivos:
1. Estudiar la influencia de la [E] sobre la velocidad de una reaccin enzimtica.
Procedimientos:
Solucin de ovoalbmina
HCI 1.0 N
Agua destilada
5.0
0.5
1.5
5.0
0.5
3.5
5.0
0.5
4.2
5.0 ml
0.5 ml
4.2 ml
Preincubar los 4 sistemas como en la experiencia anterior y luego aadir:

Pepsina al 1% preincubada
Pepsina al 1% hervida
3.0
0.0
1.0
0.0
0.3
0.0
0.0 ml
0.3 ml
2. Mezclar bien y continuar la incubacin a 37C por 10 minutos. Observar cuidadosamente cada
tubo antes y despus de agregar la enzima.
3. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimtica) de cada uno de los tubos, con 0 a 5 cruces, al
final de 1, 5 y 10 minutos.
4. Calcule la concentracin de la pepsina en cada uno de los tubos en miligramos por tubo.
Resultados:
1. En papel milimetrado, haga una grfica con los resultados obtenidos, colocando en el eje de
abscisas la [E] y en el eje de ordenadas la actividad enzimtica.
APELLIDOS..NOMBRES
Pgina 40 de 89
FECHA/ ../
BIOQUIMICA ODONTOLOGIA
PRACTICA N 6. OXIDACIONES BIOLOGICAS
INTRODUCCION.
1. Reacciones de oxidoreducin
Para Lavoisier y contemporneos, oxidacin significaba adiccin de oxgeno a la sustancia
destinada a oxidarse. Reduccin por el contrario era la prdida de oxgeno. Ejemplo, la oxidacin
de un aldehdo a cido.
RCHO+1 /2 O2
RCOOH
Posteriormente se reconoci como oxidacin el proceso de prdida de hidrgenos y por

reduccin el proceso contrario; la oxidacin de un alcohol sera un ejemplo de este caso:
RC H 2 OH
RCHO+ H 2
En la actualidad se entiende por oxidacin la prdida de electrones y por reduccin la

ganancia de los mismos, como en el siguiente ejemplo:
2+
Fe
Oxidacin
Fe+3e
Reduccin
Es muy importante remarcar que las oxidaciones y reducciones no se llevan a cabo en la forma
anteriormente anotada, pues as escrita ellas son reacciones incompletas; es decir, los electrones
no permanecen al estado libre. De hecho, cada sustancia que se oxida (el agente reductor) esta
necesariamente acompaada de una substancia que se reduce (el agente oxidante) y viceversa; es
el par redox conjugado.
Los diferentes agentes reductores difieren en su tendencia a perder electrones. La tendencia de
un agente reductor a perder electrones (o a la de un agente oxidante a ganarlos) esta dad por el
potencial de xidoreduccin estandar (E).
2. Significado del potencial de xidoreduccion o potencial REDOX
El potencial de xidoreduccin estndar se define como la fuerza electromotriz en voltios dad
por una semicelda, en la cual estn presentes tanto el reductante y el oxidante a una
concentracin 1M, a 25C y un pH 7.0, en equilibrio con un electrodo que puede reversiblemente
Pgina 41 de 89
aceptar electrones de las especies reductantes. Por convencin se usa como un potencial de
referencia el E de la reaccin del electrodo de hidrgeno.
++2 2. e
H
H2
Que tiene un valor de 0.0 voltios, cuando la presin del gas hidrgeno es de 1 atm, el pH 0 y a
25C. Este valor corregido a pH 7 es de -0.41 voltios.
As tenemos que:
1) El agente reductor (que cede electrones), tiene un E negativo. Un E negativo significa que
H2
una sustancia tiene una menor afinidad por los electrones que el
.
En tanto el E sea ms negativo, menor ser la afinidad del sistema por los electrones.
2) El agente oxidante (que quita electrones), tiene un E positivo. Un E positivo significa que
H2
una substancia tiene una mayor afinidad por los electrones que el
.
En tanto el E sea ms positivo, mayor ser la afinidad del sistema por los electrones.
OXIDANTE
+
NAD
Piruvato
FAD
Fumarato
CoQ
Cit b oxid
REDUCTOR
+
NADH + H
Lactato
FAD
H2
Succinato
c 1 oxid.
Cit
Cit c oxid.
Cit a oxid.
CoQ H 2
Cit b red
Cit
1/2 O 2+ 2 H
c 1 red
N
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
E (v)
-0.32
-0.19
-0.06
+0.03
+0.04
+0.07
+0.23
+0.25
+0.29
+0.82
Cit c red
Cit a red
H2O
De esta forma los valores E nos permiten predecir la direccin de flujo de electrones de un par
redox a otro cuando ambos est bajo condiciones estndar y en presencia de un catalizador. Bajo
tales condiciones los electrones tienden a fluir de un par de redox a otro en la direccin del sistema
ms positivo, hasta la formacin de agua.
3. El G
de una reaccin de xidoreduccin.
Pgina 42 de 89
La tendencia de los electrones a fluir desde los sistemas electronegativos a los sistemas
electropositivos, es el resultado de la perdida de energa libre (G). Por ello, el cambio de energa libre
estndar o G de una reaccin de xidoredeccin, puede calcularse fcilmente a partir de la
diferencia de potencial redox de los reactantes o G
G
, empleando la siguiente ecuacin.
= -n.F. E
Donde: n es el nmero de electrones transferidos

F o Faraday = 23062 cal/vol.mol, y
E = E del par aceptor de e - E del par donador e
Por ejemplo, si consideramos la reaccin:

Piruvato + NADH +
+
H
Lactato +
+
NAD
Tenemos las siguientes ecuaciones de electrodo:

Piruvato +
+
2 H
+
NAD
++2 e
2 H
2e
Lactato
NADH +
+
H
E = -0.19v
E = -0.32v
Y la diferencia de potencial redox ( E ) ser:

E = -0.19v (-0.32v) = + 0.13v
Por lo que, el cambio de energa libre estndar ( G de la reaccin de xidoreduccin
(1) ser:
G
= -2 (23062 cal/v.mol) x (+0.13v) = -6000 cal/mol o 6 Kcal/mol
Si consideramos toda la amplitud de la cadena respiratoria tendremos la siguiente reaccin:
Pgina 43 de 89
O2+ NADH + 1 /2 H
+
H 2 O+ NAD
Cules sern las ecuaciones de electrodo para esta reaccin de xidorediccion?
Cul ser el G
de la reaccin?
4. La cadena respiratoria.
En los organismos vivos las reacciones de oxidoreduccion cumplen el importante rol de proveer
energa. De hecho, las grandes cantidades de energa producidas en las oxidaciones biolgicas son la
principal fuente de energa indispensable para impulsar las diferentes formas de trabajo celular.
Las enzimas que catalizan estas reacciones de oxidoreduccion se denominan oxidoreductasas. Un
grupo importante de ellas son las dishidrogenasas. Los electrones de los tomos de H sustrados de
los substratos por las deshidrogenasas, son tranasportados a la cadena mitocondrial de transporte de
electrones o cadena respiratoria. La secuencia de eslabones de esta cadena va en orden creciente
de su E, y la reaccin general es:
+
SUBSTRATO NAD
Flavina (FMN)
CoQ
Cit b Cit
c1
Cit c
Cit
oxidasa
O2
Donde el substrato se oxida y finalmente el oxgeno se reduce para formar agua. Otros substrato
+
2 H
2e
como el Succinato son la excepcin a este esquema, ya que los
y los
son
transferidos a una flavina (FAD) como primer eslabn, en el lugar de
del par Fumarato/Succinato es ms alto que el E del par
+
NAD , debido a que el E
+
+ NADH + H
.
NAD
Pgina 44 de 89
Aquellas deshidrogenasas que transfieren el potencial reductor desde el substrato al oxgeno en forma
indirecta, a travs de la cadena respiratoria, se denomina deshidrogenasas anaerbicas; a esta
clase pertenecen la Lactato Deshidrogenasa y la Succinato Deshidrogesana. Otras deshidrogenasas
transportan el potencial reductor directamente desde el substrato al oxgeno sin que medie la cadena
respiratoria, por lo que se llaman deshidrogenasas aerbicas; a esta clase pertenece la Xantino
Deshidrogenasa.
5. El Azul de Metileno, un aceptor artificial de electrones.
Los experimentos de la presente prctica, demuestran la actividad de deshidrogenasas de diversas
fuentes, usando Azul de Metileno como el aceptor terminal de electrones y protones.
En estos experimentos es sistema de citocromos ms el oxgeno como aceptor final del tomo de
hidrgeno (o electrones), en condiciones fisiolgicas, son reemplazados por el Azul de Metileno
como un aceptor artificial de electronos. Este colorante reacciona fcilmente con los sistemas
biolgicos de oxidoreduccin y en su forma oxidada es de color azul y cuando se reduce se vuelve
incoloro; entonces, la ocurrencia y velocidad de estas reacciones se pueden apreciar fcilmente
observando la desaparicin de color de la forma oxidada.
El azul de Metileno reducido es fcilmente reoxidado por el oxgeno del aire, y de all que en estos
experimentos es necesario cubrir los componentes del sistema como parafina lquida, para lograr
condiciones anaerbicas.
6. Inhibidores especficos de ciertas enzimas y de la cadena respiratoria.
Diversos inhibidores son frecuentemente utilizados para el estudio de la actividad enzimtica y la
dilucidacin de las vas metablicas. El malonato por ejemplo, es un inhibidor competitivo de la
Succionato Deshidrogenasa que ha contribuido al conocimiento de la especificidad de substrato de la
enzima, la naturaleza de los grupos funcionales en el sitio activo de la enzima, y los mecanismos de
actividad cataltica.
De la misma forma, diversos inhibidores que actan en ciertos puntos de la cadena respiratoria han
contribuido grandemente al estudio del transporte electrnico. Los ms importantes son:
1). La rotenona,
un producto vegetal extremadamente txico utilizando por los indios Sud
Americanos para pescar por envenenamiento. Este compuesto bloquea la transferencia de e

de NADH a ubiquinona.
2). El antibitico txico, Antimicina A, aislado de una cepa de Steptomyces, el cual bloquea la
transferencia de e
de ubiquinona a citocromo c.
3). Amital, un barbitrico el cual bloquea la transferencia de

al mismo nivel que la retonona.

Pgina 45 de 89
4). Cianuto, conocido como uno de los venenos ms letales, el cual bloquea la reduccin del oxigeno,
3+
aa3
catalizada por citocromo oxidasa (o Cit
), unindose a la forma frrica ( Fe ) de este,
5). El monxido de carbono, CO, el cual tambin bloquea la transferencia de

oxidasa al oxgeno, pero unindose a la forma ferrosa
de citocromo
2+
Fe de este.
Por otro lado, las consecuencias dramticas de estas substancias se deben al hecho de que al inhibir la
cadena respiratoria, bloquean la generacin de la energa necesaria para la produccin de ATP
por fosforilacin oxidativa y por lo tanto la muerte celular.
EXPERIMENTO 6.1
enzimtica de corazn.
Estudio de la oxidacin del Succinato por una preparacin
Objetivos:
1.
2.
3.
4.
Estudiar las reacciones de oxidoreduccin es sistemas biolgicos.

Demostrar la inhibicin a nivel del sustrato, de los fenmenos xidoreductivos.
Estudiar la accin de los aceptores artificiales de electrones.
Demostrar la actividad de la deshidrogenasa succnica en un preparado de msculo cardiaco.
Procedimiento:
1. Preparar 4 tubos de acuerdo a la siguiente tabla:
REACTIVOS
Azul de Metileno (gotas)
Succinato 0.1 M (ml)
Succinato 0.3 M (ml)
Malonato 0.2 M (ml)
Agua (ml)
ENZIMA * (ml)
1
3
4
1
2
3
2
2
1
3
3
2
2
1
4
3
2
2
1
* Preparacin enzimtica de msculo cardiaco:

Extraer el corazn de un conejo y lavarlo con agua destilada (dejarlo all siempre que sea
posible).
Con tijera desmenezarlo y colocarlo en un mortero para homogenizarlo en 25 ml de buffer
fosfato pH 7.4, 0.1 M.
Mantener la preparacin en hielo hasta ser utilizada.
Pgina 46 de 89
2. Mezclar bien cada tubo y aadir a cada uno 1 ml de parafina lquida, lentamente y por las paredes
del tubo.
3. Incubar los tubos en bao mara a 37C.
4. Expresar el aclaramiento de cada uno de los tubos, con 0 a 5 cruces, a los 5, 10 y 15 minutos de
incubacin.
5. Despus de anotar los resultados agitar por inversin todos los tubos y observar que ocurre con la
coloracin de cada tubo.
Resultados:
1. Cul es el tubo en el que ha ocurrido mayor oxidacin del succinato?
Cul es el fundamento de su respuesta?
2. Cmo explica el efecto del malanato en los tubos 3 y 4? A qu se debe la diferencia en ambos
tubos?
3. Es necesario agregar
+
NAD para que el succinato se oxide?
Cul es el fundamento de su respuesta?
4. Si al tubo 3 Ud. le agrega cianuro en lugar de malonato, que ocurrir con el aclaramiento del
tubo?
Pgina 47 de 89
5. Podra Ud. sugerir algn otro mtodo para evidenciar la actividad de la Succinato
Deshidrogenasa?
Pgina 48 de 89
NOMBRE..FECHA
ASIGNATURA DE BIOQUIMICA - ODONTOLOGICA
PRACTICA N 7 GLICOLISIS
INTRODUCCION.
La gliclisis es la va central del catabolismo dela glucosa que ocurre en todas las clulas del
organismo con la finalidad de producir la energa necesaria para la actividad celular. La gliclisis es
una va metablica que consiste en una secuencia de reacciones a travs de las cuales la glucosa se

convierte en piruvato (CH3 CO- COO ) con la concomitante produccin de ATP y la reduccin
del
+
NAD
+
NADH + H . En condiciones de anaerobiosis, es decir en ausencia de oxgeno, el
piruvato es reducido lactato CH3 CHOH -
COO ) a expresas del NADH +
+
H . En cambio,
en presencia de oxgeno los tejidos pueden oxidar exhaustivamente el piruvato formado hasta
CO2 y H 2 O
.
Glucosa
Fructosa 1,6-difosfato
2
.
2
ADP
Gliceroaldehido 3fosfato
ATP
ATP
ADP
Fosfoenolpiruvato
NADH 2
NAD+ 2
H 3COCO 2O
CH 3CHOH CO 2O
O2
CO2 + H 2 O
Pgina 49 de 89
As, la molcula de glucosa, la cual tiene 6 tomos de carbono, es degradada en una secuencia de 10
reacciones (resumidas en el esquema anterior) catalizadas enzimticamente, a producir 2 molculas
de piruvato, la cual tiene 3 tomos de carbono. Durante las reacciones secuenciales de la gliclisis
mucho de la energa libre liberada de la glucosa es conservada en la forma de ATP, de modo que el
proceso global que ocurre en las clulas podra representarse as:
Glucosa
Las enzimas de la va glicoltica se encentran en el citoplasma, existiendo un estrecha relacin con
las mitocondrias, donde ocurren:
La descarboxilacin oxidativa del piruvato a formar Acetil CoA,
Las reacciones del ciclo de Krebs a oxidar al Acetil CoA y producir el potencial reductor
NADH +H + y FADH2) para la sntesis de ATP, y
La oxidacin de este potencial reductor a travs de la cadena respiratoria, con la
concomitante sntesis de ATP para fosforilacion oxidativa acoplada a la cadena respiratoria.
En la presente prctica se demostrara el consumo de glucosa y la produccin de cido lctico
durante el proceso cataltico.
Para la determinacin de la glucosa se utilizar el mtodo de Nelson y Smogy cuyo fundamento es el
siguiente: el filtrado libre de protenas conteniendo a la glucosa de calienta en presencia de una
++
Cu 2 O
solucin cprica alcalina, obtenindose la reduccin del Cu
a
, el cual acta luego
sobre el arsenomolibdato produciendo un complejo de molibdeno reducido de color azul cuya
intensidad se mide en el fotocolormetro (fotocolorimetra).
El cido lctico se determinar por titulacin con una solucin de KOh 0.02 N utilizando el indicador
Rojo de fenol.
EXPERIMENTO 7.1. Gliclisis anaerbica en el msculo de conejo.
Objetivos:
1. Demostrar como la glucosa en ausencia de oxgeno se transforma en cido lctico, utilizando
como fuente enzimtica un homogenizado de msculo de conejo.
2. Comprobar el consumo de glucosa durante el proceso.
3. Comprobar la produccin de cido lctico en condiciones de anaerobiosis.
Procedimiento:
a) Degradacin de la glucosa:
Pgina 50 de 89
1. En un Erlenmeyer del 125 ml limpio y seco medir 10 ml de una solucin de glucosa al 1% en

+
solucin de Krebs Ringer Fosfato (*) conteniendo nicotinamida 0.03M, NAD 0.2% Y ATP
0.2%.
2. Incubar la solucin en bao mara a 37C por 10 minutos.
3. Agregar al Erlenmeyer 50 de un homogenizado de msculo al 10% (P/V), preparado
previamente en solucin Krebs Ringer Fosfato.
4. Mezclar y tomar un volumen de 20 ml en una probeta y colocarlo inmediatamente en hielo.
Esta muestra incluye la muestra basal a tiempo cero.
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(*) Solucin de Krebs Ringer Fosfato:
NaCI
0.154M
10.0 ml
KCI
0.154M
0.4 ml
CaCI 2
0.10 M
0.1 ml
MgSO4
Buffer fosfato pH
0.154M
7.4 0.1 M
0.1 ml
21.0 ml
5. Despus de haber tomado la muestra basal, aadir el erlemneyer un volumen adecuado de

parafina liquida para aislar el sistema de reaccin del oxgeno del aire y as, establecer las
condiciones de anaerobiosis. Proseguir entonces con la incubacin a 37C durante 60
minutos. Esta ser la muestra incubada.
6. Tanto en la muestra basal como en la muestra incubada por 60 minutos realizar las
determinaciones de glucosa y cido lctico.
b) Preparar el filtrado libre de protenas para la determinacin de la glucosa en las muestras
basal e incubada por 60 minutos.
1. Para cada muestra, medir en un tubo de ensayo 4ml de agua destilada y agregar 2ml de
muestra respectiva.
2. Agregar 2ml de
ZnSO 4
al 5%, agitar y dejar en reposo por 5 minutos.
OH
3. Aadir 2 ml de
0.3 N, agitar y dejar en reposos por 3 minutos.

Ba
Pgina 51 de 89
4. Filtrar a travs de un papel de filtro colocado en un embudo de vidrio. El filtrado libre de

protenas debe ser incoloro.
c) Determinacin de la glucosa.
1. Preparar 4 tubos de Folin de acuerdo a la siguiente tabla:
REACTIVOS
- Filtrado muestra Basal
- Filtrado muestra Incubada
- Solucin Estndar (*)
- Agua destilada
- Reactivo Cuproalcalino
1
1ml
---1 ml
(*) Solucin Estndar de glucosa conteniendo 50
2
-1 ml
--1 ml
3
--1 ml
-1 ml
4
---1 ml
1 ml
g/ml .
2. Colocar los tubos en bao mara hirviente por 15 minutos.

3. Enfriar los tubos en agua corriente.
4. Aadir a cada tubo 1 ml del reactivo arsenomolibdato disolviendo con suave agitacin el
Cu 2 O
producido.
5. Completar con agua destilada a 25 ml y mezclar. Reposo 5 minutos.
6. Leer ene l fotocolormetro con filtro verde y anotar.
7. Hacer los clculos respectivos y expresar la concentracin de glucosa en mg/100ml.
d) Determinacin del cido lctico.
1. En cada uno de los beakers medir 15 ml de las muestras Basal e Incubada respectivamente y
hacerlas hervir por 2 minutos teniendo cuidad que no se proyecten.
2. Enfriar y filtrar a travs de una gasa y luego a travs de papel de filtro.
3. Proceder a la titulacin de 3ml de cada muestra con KOH 0.02 N, agregando 1 gota del
indicador Rojo de Fenol, hasta obtener un color naranja rosa.
4. Anotar el volumen de soda gastado y calcular la normalidad de cido lctico.
Resultados:
Anotar sus resultados en la siguiente tabla:
Muestra Basal
Muestra Incubada
Glucosa en mg/100 ml
cido lctico en mEq/L
Pgina 52 de 89
Discuta e interprete sus resultados:

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Interrogantes:
1. Defina la gliclisis anaerbica:
2. En que clula o tejidos, la glucosa es degradada anaerbicamente, y en cules aerobicamente?
Pgina 53 de 89
3. Escriba las reacciones de la gliclisis que requieren de ATP y las producen ATP.
Reacciones que requieren de ATP:
Reacciones que producen ATP:
4. Cul es la produccin neta de ATP por la oxidacin anaerbica de 1 mol de glucosa?
5. Cmo se define la fosforilacin a nivel de sustrato? Qu enzimas de la gliclisis catalizan

estas reacciones?
6. Cul es la produccin neta de ATP por la oxidacin aerbica de 1 mol de glucosa hasta
H2O
CO2
Pgina 54 de 89
7. Cul es la importancia de la gliclisis para los eritrocitos y las neuronas?

Para los eritrocitos
Para la neuronas
8. Mediante un esquema demuestre la funcin del
+
NAD en la glicolisis:
9. A qu se llama enlace fosfato rico en energa? Qu intermediarios de la glicolisis lo presentan?
10. Nombre las reacciones irreversibles de la gliclisis y mencione aquellas enzimas que hacen
posible que estas reacciones ocurran en sentido inverso.
Pgina 55 de 89
11. Cmo se regula la gliclisis?
APELLIDOS.NOMBRES
FECHA/./
PRACTICA N 8
DEGRADACION DE LOS AMINOACIDOS: TRANSAMINACION
INTRODUCCION.
Las transaminasas son enzimas presentes en la mayora de los tejidos animales, que catalizan una de
las importantes reacciones del metabolismo de las protenas, la transferencia reversible del grupo
amino desde un aminocido hacia un cetocido; el aminocido que pierde el grupo amino se
convierte en un nuevo cetocido, y el cetocido que lo gana se convierte en el aminocido respectivo.
El cofactor de estas enzimas es el piridoxal fosfato y para casi todas las transaminasas,
cetoglutarato es el aceptor del grupo amino formndose glutamato:
Pgina 56 de 89
H
I
C
+
NH 3
I
+
NH 3
I
== 0
I
RCOCOO
O sea: L aa +
E
H
I
HC-
OOCCH 2CH 2CO COO
+
NH 3
cetoglutarato ================
cetocido + L Glu
El inters clnico est centrado especialmente de dos transaminasas: L Alanina:
cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa Glutnico Pirvica o TGP) y L Aspartato:

cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa Glutnico Oxalactica o TGO). Estas
enzimas tienen una accin eminentemente intracelular, por lo que la actividad srica es condiciones
normales es baja o nula. Un aumento de actividad ser evidencia de un deterioro de los tejidos en que
se encuentran, de los cuales resultan particularmente importantes el corazn y el hgado.
Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en el suero un marcado aumento de
la actividad de TGO, debido a la liberacin al torrente sanguneo de esta enzima, tan abundante ene l
miocardio. En este caso no existir un aumento en la actividad srica de TGP o ser mnimo.
En hepatitis virales y otras formas de enfermedad heptica que involucren necrosis de tejido, habr
tambin un incremento considerable de la actividad srica de transaminasas, incluso antes de la
aparicin de sntomas clnicos como ictericia.
En este caso, TGP ser el enzima predominante debido a su gran concentracin en el tejido heptico.
Una elevada actividad de transaminansas puede detectarse tambin en otras condiciones como
traumas accidentales o quirrgicos, pancreatitis aguda, distrofias musculares, ect.
En la presente prctica se estudiar:
1) La transaminacin de la alanina y el aspartato con el
cetoglutarato en presencia de un
preparado enzimtico de hgado de paloma, mediante un mtodo cromatogrfico.

2) La determinacin de la actividad transaminsica de TGP y TGO en el suero de personas normales
y con patologa heptica, mediante el mtodo colorimtrico de reitman y frankel, en el cual
piruvato formado (el oxalacetato es inestable y se transforma en piruvato) reacciona con la 2.4
dinitrofenilhidrazina produciendo, en medio alcalino, un compuesto coloreado que se mide a 505
nm.
Pgina 57 de 89
EXPERIMENTO 8.1 Transaminacin en presencia de un preparado enzimtico de hgado de

pichon.
Objetivos:
1. Estudiar la transaminacin de alamina y aspartato, utilizando como fuente enzemtica un
preparado de hgado de pichn.
2. Aplicacin de la tcnica de cromatografa en capa fina.
Procedimiento:
1. Preparacin de la fuerte inzimtica (polvo acetnicos)
Los higados recientemente extraidos de 4 pichones de paloma son homogenizados en 10
volmenes de acetona fra durante 1 minuto. Luego de filtrar y lavar varias veces, el residuo
obtenido es secado a temperatura ambiente, obtenindose as polvos secos fciles de conservar. El
da de la prctica se muele en un mortero: 700 mg de polvos acetnicos con 7 ml de agua destilada
y luego de centrifuga el preparado a 2000 rpm por 10 minutos. Se decanta el sobrenadamente y se
completa al volumen a 35 ml con agua destilada.
La acetona, por su accin deshidratante facilita la extraccin de enzima de los tejidos. En esta
forma, la acetona reduce la desnaturalizacin de la protenas y concomitantemente produce
desintegracin de la estructuras celulares y a disrupcin de los enlaces lipoproteicos.
2. Preparacin del experimento de transaminacin.
En 4 tubos de prueba (13 x 100 mm), previamente lavados con HN03 concentrado, medir lo
siguiente:
SISTEMAS
Alamina 0.05 M
Glutamato 0.05 M
Aspartato 0.05 M
cetoglutarato 0.1 M
Piruvato 0.1 M
Extracto enzimtico
Extracto enzimtico hervido
1
0.2 ml
0.2 ml
0.6 ml
-
2
0.2 ml
0.2
0.6
-
3
0.2 ml
0.2 ml
0.6
-
4
0.2 ml
0.2 ml
0.6 ml
Mezclar el contenido de cada sistema y luego incubar en bao mara a 37, durante 1 hora.
3. Identificacin de los productos de la reaccin por cromatografa en capa fina:
Pgina 58 de 89
Cada grupo dispondr de una placa de vidrio (200 x 200 mm) con Silica Gel, en la que se ha
marcado los puntos de origen a 15 mm del borde inferior, con una distancia entre ellos de 25 mm y
en el siguiente orden.
MUESTRA
PUNTOS DE ORIGEN
SISTEMA N
Sol. St. de aa
Ala
Glu
Asp
Rf x 100
Aplicar utilizando tubos capilates de vidrio y en el punto de origen que les corresponde, 4 l
de cada sistema incubado y 2 l de las soluciones estndar de aminocidos, en alcuotas de ms
de 1 l cada vez, dejando secar cada rea despus de cada aplicacin.
Al final, colocar la placa en la cmara cromatogrfica conteniendo como solvente 75 volmenes
de fenil y 25 de agua.
La cromatografa termina cuando el solvente alcanza la lnea marcada a 10 cm de los puntos de
origen. Entonces sacar la placa, secarla en la estufa a 110 C x 3 minutos, y revelar el
cromatograma rociando una solucin de Ninhidrina al 0.1% en n-butanol saturado en agua. Dejar
secar.
Expresin de resultados:
1. Calcular los Rf x 100 de cada mancha, completrar la tabla anterior e interpretar el cromatograma
con los resultados obtenidos.
2. Haga un comentario de cada uno de los sistemas preparados:

Sistema 1. _______________________________________________________________________
Sistema 2. _______________________________________________________________________
Sistema 3. ______________________________________________________________________
Sistema 4. _______________________________________________________________________
Pgina 59 de 89
EXPERIMENTO 8.2. Determinacin de la actividad de TGP y TGO colorimtricamente.

Objetivos:
1. Estudiar la actividad transaminsica en sueros normales y patolgicos.
2. Demostrar la aplicacin del mtodo de Reitman y Frankel para la determinacin de la actividad de
TGP y TGo en sueros.
Procedimiento:
En 3 tubos de prueba marcados B (Blanco) y D (Desconocido), colocar:
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TUBOS:
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Sustrato (TGO o TGP) *
0.25 ml
0.25 ml
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Colocar en bao de agua a 37C x 2 minutos, luego agregar:

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Suero
50
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Agua destilada
50
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Mezclar por agitacin suave e incubar exactamente: 60 minutos para TGO y 30 minutos para TGP y
agregar:
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Reactivo 2,4.DNFH
0.25 ml
0.25 ml
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Mezclar. Dejar 10 minutos a 37C. luego agregar:

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------NaOH 0.4 M
0.25 ml
2.5 ml
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Pgina 60 de 89
Mezclar por inversin y retirar del bao. Despues de 2 minutos leer en el fotocolormetro con filtro
verde (500 550 nm), llevando previamente el aparato a cero D.O. con agua destilada.
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------*
Sustrato TGP: Solucin de L-Alamina 200 mM y
cetoglutarato 2 mM en buffer fosfato 100
cetoglutarato 2 mM en buffer fosfato 100
mM, a
pH 7.4.
*
Sustrato TGO: Solucin de L-Alamina 100 mM y

mM,
a pH 7.4.
Determinar las unidades TGO o TGP, empleado la curva la calibracin correspondiente:

1. Preparacin de la curva de calibracin:
En 9 tubos de ensayo colocar:
Tub
o
ml. Sol. St de
N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Piruvato
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.40
0.50
ml
Sustrato
Agua
TGO
TGP
D.O.
TGP
1.00
0.95
0.90
0.85
0.80
0.75
0.70
0.60
0.50
destilada
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
U/L
10
20
32
47
67
93
-
U/L
6
13
19
28
35
46
66
99
0.165
0.202
0.240
0.274
0.300
0.330
0.360
0.410
0.455
Mezclar y agregar a cada tubo, cada 30 segundos, 1 ml de reactivo 2.4 DNFH. Mezclar. Incubar 10
minutos a 37C (contados desde el agregado de 2.4 DNFH al primer tubo). Luego agregar 10 ml de
NaOH 0.4 M a cada tubo, cada 30 segundos. Mezclar cada tubo inmediatamente por inversin y
retirar del bao. 10 minutos despus leer en el fotocolormetro con filtro verde. Obtener las lecturas
corregidas restando a cada lectura la obtenida en el tubo 1. En el papel milimetrado contruir la
grfica correspondiente colocando en el eje Y las lecturas corregidas de D.O. y en el eje X la
actividades para cada enzima.
Valores de referencia:
TGP: 2 a 18 U/L (5 a 35 U Karmen/ml).
TGO: 4 s 20 U/L (8 a 40 U Karmen/ml).
Pgina 61 de 89
2. Determinacin de la actividad transaminsica en las muestras de suero. Para ello y utilizando la

curva de calibracin de Ud. ha graficado en papel milimetrado, complete la siguiente tabla:
SISTEMAS
Absorbancia
Absorbancia Neta o D.O.
Actividad Transaminsica (U/L)
D
Para TGP
Para TGO
Haga un comentario de los valores de actividad transaminsica obtenidos:

INTERROGANTES.
1. Cules son las reacciones catalizadas por TGO y TGP?
2. Qu papel desempea el piridoxal fosfato en la reacciones de transaminacion?

Cul es el grupo funcional del cofactor? Explique su mecanismo.
3. Participan las reacciones de transaminacion en la biosntesis de aminocidos?
4. Qu importancia tienen las enzimas TGP y TGO para el proceso de gluconeognesis?
5. Cul es la importancia clnica de las enzimas TGP y TGO?
Pgina 62 de 89
6. Explique el mecanismo que permite la separacin de sustancias por cromatografa en capa fina.
Qu se entienden por coeficientes de participacin?
7. Qu demuestra el sistema 2 en el experimento 1?
8. Podra Ud. escribir la reaccin correspondiente entre el piruvato formado, con el 2.4 DNFH en
medio alcalino?
9. Qu es el Rf y para que se utiliza?
APELLIDOSNOMBRES
FECHA..//.
ASIGNATURA DE BIOQUIMICA - ODONTOLOGIA
PRACTICA N 09
BIOSINTESIS Y DEGRADACION DE GLUCOGENO:
Pgina 63 de 89
GLUCOGENESIS Y GLUCOGENOLISIS
INTRODUCCION.
El hgado desempea una funcin muy importante en el metabolismo glucdico del animal entero,
ya que es capaz de sintetizar y degradar glucgeno de acuerdo con los requerimientos, manteniendo
un nivel de glucosa sangunea aproximadamente constante (normoglicemia).
As, el glucgeno heptico es una forma de almacenamiento de glucosa fcilmente movilzable, que
puede sintetizarse a expensa de glucosa y otros monosacridos, por el proceso de glucognesis y
degradarse hasta glucosa por proceso de glucogenolisis:
Glucosa
Pi
ATP
Hexoquinasa y/o Glucoquinasa
Glucosa 6 fosfatasa
ADP
Glucosa 6 fosfato
Fosfoglucomutasa
Enzima desram
Glucosa 1 fosfato
ADP
UTP
2Pi
Nuclesido
difosfokinasa
G1P Uridil transferasa
PPi
UDP - Glucosa
Glucgeno
[GLUCOSA] n
Glucgeno sinteasa
Pi
[GLUCOSA] n + 1
ATP
UDP
El hecho de que existan diferentes vas para la biosntesis y para la degradacin, hace posible que los
mecanismos regulatorios acten independientemente sobre la velocidad de los dos procesos. La
glucgeno sisteasa y la glucgeno fosforilasa son las enzimas regulatorias de las sstesis y
degradacin del glucgeno, respectivamente. Ellas son reguladas recprocamente por fosforilacin
(activada fundamentalmente por ADRENALINA Y GLUCAGON) y defosforilacin (promovida
Pgina 64 de 89
G. SINTEASA ACTIVA
OH
G. FOSFORILASA INACTIVA OH
ATP
Pi
por INSULINA), de forma que cuando una es activada, la otra es simultneamente inhibida, como se
Fosfoproteina
INSULINA
Proteinakinasa (+)ADRENALINA GLUCAGON
muestrafosfatasa
en el siguiente
esquema: (+)
SINTESIS DE GLUCOGENO FAVORECIDA
H2O
ATP
G. SINTEASA INACTIVA O
G. FOSFORILASA ACTIVA
P
P
DEGRADACION DE GLUCOSA FAVORECIDA
Desde un punto de vista cuantitativo, la mayor parte de glucgeno del organismo se encuentra en el
hgado y en los msculos, aunque existe en todos los tejidos. En general, la dieta afectar ms al
contenido de glucgeno del hgado que en el msculo, mientras que el ejercicio fsico afectar ms el
contenido del glucgeno muscular que el hpatico. Adems, los depsitos de glucgeno muscular y
heptico tendr obviamente diferentes funciones; el glucgeno muscular est presente a servir como
una reserva de combustible para la sntesis de ATP dentro del msculo para la contraccin muscular,
mientras que el glucgeno heptico funcionar como una reserva de glucosa para el mantenimiento
de la concentracin de glucosa en sangre, en los periodos de ayuno entre las comidas y en
condiciones en las que aumenta la demanda.
En personas bien alimentadas la concentracin de glucgeno heptico vara entre 2 a 8 g/100 g de
tejido, con un valor prometio de 6.5 g%, siendo mayor despus de la ingesta de dietas ricas en
carbohidratos y menor en condiciones de ayuno, sobre todo despus del ayuno nocturno, llegando a
ser muy bajo en el ayuno prolongado. En cambio la concentracin usual de glucgeno en el msculo
esqueltico es de 1.4 g/100 g de tejido. Este valor apenas si vara con el ayuno nocturno o con una
dieta rica en carbohidratos; sin embargo, disminuye notablemente despus del ejercicio prolongado.
Pgina 65 de 89
Aun cuando el hgado tiene usualmente una concentracin de glucgeno mayor que el msculo, el
tejido muscular contiene en total la mayor reserva de glucgeno debido a su mayor masa. As, un
hombre que pesa 70 Kg tiene aproximadamente 28 Kg de msculo esqueltico y slo 1.6 Kg de
hgado. Considerando las concentraciones indicadas, resulta que el contenido de glucgeno es de 392
g en los msculos y slo 104 g en el hgado. La cantidad total de glucgeno teniendo en cuenta todos
los rganos, ser de algo ms de 500 g en un individuo bien alimentado, y de unos 400 g despus del
ayuno nocturno. Esta diferencia aunque pequea, representa el glucgeno heptico
transformado en glucosa durante el ayuno, un rol de tremenda importancia fisiolgica para la
homeostasis de la glicemia y del organismo entero.
En la presente prctica se estudiar cuantitativamente el efecto de la dieta y el ayuno sobre el
contenido de glucgeno heptico.
EXPERIMENTO 9.1 Estudio experimental en ratas de los factores que afectan el contenido del
glucgeno heptico.
Objetivos:
1.
2.
3.
4.
Estudiar los factores que influyen en la sntesis y degradacin del glucgeno heptico.
Estudiar el efecto de la dieta sobre el contenido de glucgeno heptico.
Estudiar el efecto del ayuno sobre el contenido glucgeno heptico.
Sealar los fundamentos de la extraccin y determinacin del glucgeno heptico.
Procedimiento:
1. PREPARACION DE LOS ANIMALES EXPERIMENTALES.
1.1.
Rata 1 bien alimentada (ad libitum).

Esta rata recibir su alimentacin habitual sin restriccin alguna hasta el momento de la
prctica, en que ser sacrificada para realizar la extraccin y determinacin del glucgeno
heptico.
1.2.
Rata 2 en ayuno de 24 horas

Esta rata pertenecer en estado de ayunas estricto (recibir slo agua), no menos de 24 horas
antes de la prctica, en que ser sacrificada para realizar la extraccin y determinacin del
glucgeno heptico.
2. EXTRACCION Y DETERMINACION DEL GLUCOGENO HEPATICO.
Pgina 66 de 89
El mtodo empleado en el de Krisman, que asocia el procedimiento clsico de la extraccin del

glucgeno por tratamiento de tejido con una base fuerte (KOH) en caliente y su precipitacin con
etanol, con la especificidad de la reaccin del glucgeno con el yodo y el aumento de la sensibilidad
CaCI 2
de esta reaccin en presencia de
.
Para cada animal experimental proceder de la siguiente forma:
2.1.
En un tubo de centrifuga medir 1.8 ml de KOH al 33% y colocarlo en un bao mara

hirviente, brevemente por algunos segundos, antes de introducir el trozo del hgado.
2.2.
Sacrificar los animales por decapitacin y tan rpido como sea posible extraer el
hgado y pesar 200 mg pernquina heptico. Colocar inmediatamente el trozo de hgado que
se ha pesado en la solucin de KOH que se encuentra en el bao hirviente y dejarlo all por 20
minutos, mezclando de vez en cuando con una varilla de vidrio para permitir la total
desintegracin de tejido y teniendo mucho cuidado de que no se proyecte su contenido.
2.3.
Retirar el tubo del bao y enfriar. Aadir 2.6 ml de etanol al 96%, mezclar y volver a
calentar la solucin hasta la ebullicin teniendo siempre mucho cuidado de que no se proyecte
su contenido. Reiterar y enfriar inmediatamente en bao de hielo por 5 minutos, para permitir
la precipitacin del glucgeno.
2.4.
Centrifugar a 3500 rpm por 10 minutos. Decantar el sobrenadante suavemente y dejar

el tubo invertido sobre un papel de filtro, tratando de eliminar el sobrenadante lo ms posible.
2.5.
Neutralizar el exceso de base aadiendo 0.4 ml de NH4CI saturado, mezclado

cuidadosamente con varilla de vidrio.
2.6.
Colocar luego el tubo en bao mara hirviente durante 5 minutos. Retirar el tubo y
enfriarlo completamente.
2.7. Aadir 0.4 ml de agua destilada y proceder luego a la reaccin colorimtrica segn el
siguiente cuadro:
REACTIVOS
Solucin obtenida (ml)
Agua destilada
Sol. St. de glucgeno 15 mg%
Reactivos de yodo
Rat.1 Rat.2
0.8
0.8
5.2
5.2
B
0.8
5.2
St.1
0.8
5.2
St.2
0.8
5.2
St.3
0.8
5.2
Pgina 67 de 89
NOTA. Hacer diluciones si fuera necesario (en los tubos que es observe abundante precipitado) luego
de neutralizar el exceso de base con NH4C1, y emplear para la reaccin de color 0.8 ml de la
solucin diluida. Anotar el factor de dilucin.
2.8. Dejar en reposo los tubos por 5 minutos. Leer la absorbancia en el fotocolormetro con filtro
verde.
Resultados:
1. Anotar el aspecto, consistencia y peso de cada hgado:
Rata 1:________________________________________________________________________
Rata 2:_______________________________________________________________________
2. Observar la cantidad de precipitado despus de centrifugar:
Rata 1:_________________________________________________________________________
Rata 2:_________________________________________________________________________
3. Calcular el factor de calibracin considerando las siguientes lecturas para los tubos BLANCO Y
ESTANDAR:
BLANCO
ESTANDAR 1
ESTANDAR 2
ESTANDAR 3
Ab. Bruta
Ab. neta
[glucgeno] mg/tubo
0.11
--0.29
0.12
0.66
0.36
0.85
0.48
FACTOR DE CALIBRACION (Fc) PROMEDIO
Fc
--
Pgina 68 de 89
Utilizando papel milimetrado, hacer la grfica de la curva de calibracin con los datos calculados
anteriormente. Incluya dicha grfica en el presente informe.
4. Calcular la concentracin de glucgeno en el hgado de cada uno de los animales de

experimentacin, de acuerdo a la siguiente tabla:
Ab. bruta
Ab. neta
[glucgeno] en mg
/200 mg
/100 mg
/ 100 g
Rata 1
Rata 2
5. Haga la interpretacin de los resultados para cada animal experimental:

Rata 1: ________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
Pgina 69 de 89
______________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
Rata 2: ________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
APELLIDOS.NOMBRES.......
FECHA/./..

PRACTICA N 10
INTEGRACION Y REGULACION DEL METABOLISMO
Diabetes Mellitus Experimental Efectos Metablicos de la Insulina
INTRUDUCCION.
Por lo general, las diferentes vas del metabolismo intermediario son estudiadas independientemente
una de otras; sin embargo, estos diferentes procesos ocurren en nuestro organismo en forma
altamente organizada, donde las diferentes vas metablicas estn enlazadas formando una verdadera
red metablica, controlada rigurosamente por diferentes mecanismos regulatorios.
Pgina 70 de 89
Esta integracin y regulacin del metabolismo, permite a cada una de las clulas a realizar sus
funciones bioqumicas, y sin duda, de sta ntima y armoniosa organizacin depender la funcin
integrada de todas la clulas que conforman un organismo, caso contrario sobrevendr una
enfermedad.
En este sentido, las hormonas cumplen un rol destacado en la integracin y regulacin del
metabolismo. As, el sistema endocrino es el componente fundamental de la adaptacin del
organismo humano a los cambios del medio ambiente externo o interno. Este sistema acta para
mantener el medio interno estable frente a cambios en el flujo de entrada a salida de nutrientes, agua,
calor, etc. Clulas endocrinas especficas, generalmente agrupadas en glndulas, perciben el cambio y
responden secretando a la circulacin sangunea las hormonas. Estas molculas especializadas son
entonces transportadas por la sangre a diversos tejidos, donde entran en contacto con las clulas
blanco (o diana) a travs de receptores especficos, y sobre la cuales ejercen sus efectos regulatorios
fundamentalmente por:
-
La activacin o desactivacin de enzimas que ya existen dentro de la clula diana, respuesta que
es mediada por un segundo mensajero generado a nivel de la membrana plasmtica de dichas
clulas, cuando la hormona se une especficamente a su receptor de membrana. Ejemplos de
tales segundos mensajeros son: AMP cclico (cAMP), GMP cclico (cGMP), inositol trifosfato
(IP3), diacilglicerol (DAG), Calcio Calmodulina, kinasas receptoras, etc. Ninguno de los
segundos mensajeros generados por la membrana es exclusivo para una determinada hormona, y
una sola hormona puede actuar a travs de mltiples mensajeros.
La induccin o represin de la sntesis de enzimas. La expresin gentica puede es este caso ser
modulada por segundos mensajeros generados a nivel de la membrana plasmtica a ms
generalmente por complejos hormona receptor intracelulares. Una vez que estos se han unido
al DNA, se induce o reprime la transcripcin de genes especficos. As, elevando o reduciendo
los niveles de molculas de RNA mensajero (mRNA) especificas, la hormona aumento o
disminuye la concentracin de determinadas protenas celulares, como las enzimas, modulando
de esta forma el metabolismo celular mantener la homeostasis.
Una de las hormonas que influencia notoriamente el metabolismo de los carbohidratos, grasas y
protenas en casi todas nuestras clulas, es la insulina. Esta protena hormonal es secretada por las
clulas del pncreas en respuesta a la hiperglicemia, para promover los procesos anablicos e
inhibir por procesos catablicos. Especficamente, la insulina incrementa la sntesis de glucgeno
(glucognesis), de lpidos (lipognesis) y protenas (proteognesis), y tambin activa la gliclisis.
Una accin importante de la insulina es que ella promueve la captacin de glucosa y aminocidos
por diferentes tejido, especialmente msculo y tejido adiposo. Por lo tanto, el nivel de glucosa en la
sangre es disminuido por la insulina (llamado el efecto hipoglicmico). La insulina inhibe la sntesis
de glucosa de novo (gluconeognesis) a partir de protenas, y la sntesis de cuerpos cetnicos
(categonesis). Muchos de los efectos de la insulina son contrarios a aquellos promovidos por
epinefrina y glucagn. En esencia epinefrina y glucagn seala que la glucosa es escasa, mientras
que la insulina indica que la glucosa es abundante.
Pgina 71 de 89
En la presente prctica estudiaremos algunas de la acciones de la insulina, usando como modelo

experimental el estado diabtico provocado por aloxono.
La diabetes mellitus es una enfermedad producida por una carencia absoluta o relativa de insulina en
el organismo y que afecta aproximadamente al 5% del a poblacin general, con una prevalencia
variada entre los diferentes grupos tnicos y regiones geogrficas. La mayora de casos reportados de
esta enfermedad son de las denominadas Tipo I o insulino dependiente, y Tipo II o no insulino
dependiente. Aunque ambos tipos comparten un fenotipo comn, hiperglicemia postprandial y en
ayunas, difieren en su etiologa y alteraciones metablicos.
-
La diabetes mellitus Tipo I, resulta ms comnmente de la destruccin autoinmune de la clulas

del pncreas. Estos pacientes tienen frecuentemente como complicacin metablica grave la
denominada cetosis (hiperproduccin de cuerpos cetnicos), y slo se alivia con la administracin
de insulina.
En cambio, la diabetes mellitus Tipo II, se caracteriza por una deficiente accin de la insulina,
como resultado de una combinacin de resistencia a la insulina (la denominada resistencia
perifrica a la insulina) y la disfuncin de la clula . En este tipo los pacientes raramente
hacen cetosis, y generalmente su mejora depende del uso de antidiabticos orales (que estimula
la secrecin de insulina por la clulas del pncreas) y dieta.
En el presente hay diversas sustancias que pueden ser utilizadas para la produccin de una diabetes
mellitus experimental. Una de las sustancias ms utilizadas es el aloxano (2,4,5,6 tetraoxipirimidina),
la cual causa un dao permanente de la clulas de los islotes de Langerhans del pncreas,
produciendo as un cuadro de diabetes mellitus experimental, muy semejante al que sufre los seres
humanos. Lo malo es que esta sustancia es tambin txica para otras clulas.
Otra sustancia utilizada a producir diabetes mellitus experimental en forma ms selectiva es la
estreptozotocina, un antibitico de amplio espectro obtenido de Streptomyces achromogenes.
EXPERIMENTO 10.1 Diabetes Mellitus Experimental.

OBJETIVOS:
1. Ilustrar y discutir los mecanismos de accin hormonal, destacado su rol en el control del
metabolismo.
2. Estableces y discutir las bases bioqumicas y fisiolgicas de enfermedades endocrinas que ocurren
comnmente en el ser humano.
3. Demostrar mediante mtodos sencillos y prcticos, algunas de las alteraciones metablicas y
fisiolgicas ocasionadas por la falta de insulina.
Pgina 72 de 89
4. Conocer el fundamento de los mtodos utilizados para la determinacin de la glicemia y la

identificacin de glucosa y cuerpos cetnicos en la orina.
PROCEDIMIENTOS
1. Preparacin de los animales:
1.1.
Produccin de Diabetes Mellitus Experimental:
A un grupo de ratas previamente pesadas y marcadas se les somete a un periodo de ayunas de

48 horas, despus del cual (previa toma de muestras de sangre y orina basales), se les inyecta
por va subcutnea una solucin de aloxano que contiene 50 mg/ml de la sustancia, a una
dosis de 200 mg/kg de peso.
A otro grupo de animales que servir de control, se les inyecta por la misma va, un volumen
similar de solucin salina fisiolgica (NaCI 0.9 %).
Despus de 48 horas se proceder a extraer muestras de sangre para realizar las

determinaciones de glucosa (glicemia) por el mtodo de Nelson Smogy, y de orina para la
determinacin de glucosa (glucosuria) por el mtodo de la glucocinta y de cuerpos cetnicos
(cetonuria) por el mtodo del nitroprusiato de sodio.
1.2.
Inyeccin intraperitoneal de insulina
Administrar insulina a las ratas diabticas, por va intraperitoneal a la dosis de 1 unidad/Kg de

peso, usando una solucin de inulina que contiene 1 unidad/ml.
A las ratas control se les administrar por la misma va un volumen similar de solucin salina
fisiolgica.
A la hora extraer muestras de sangre y orina y proceder a la determinacin de glucemia,

glucosuria y cetonuria.
2. Determinacin de la glicemia (mtodos de Nelson y Smogy)

-
Desproteinizado. En tubos de ensayo medir:

-
3 ml de NaCI 0.9 %.
0.2 ml de sangre.
0.4 ml de sulfato de Zinc al 5%
0.4 ml de hidrxido de Bario 0.3 %
Mezclar y dejar en reposo por 5 minutos, luego filtrar o centrifugar y recuperar el filtrado libre
de protenas.
Pgina 73 de 89
Para la reaccin colorimtrica. En un tubo de Foln medir lo siguiente:

-
1 ml del filtrado libre de protenas.

1 ml del reactivo cprico-alcalino (solucin A+B).
Mezclar y calentar en bao mara hirviente por 15 minutos.
Enfriar en agua corriente, luego aadir 1 ml del reactivo arsenomolibdato.
Mezclar suavemente y completar con agua destilada hasta la marca de 25 ml, mezclar por
inversin, dejar en reposo por 5 minutos y leer en el fotocolormetro con filtro verde.
Preparar un BLANCO usando 1 ml de agua destilada en lugar de filtrado y proceder como la
muetra.
Preparar los ESTANDAR de glucosa a partir de los soluciones estndar, una de 50 ug/ml y
otra de 100 ug/ml de glucosa, Para ello medir en dos tubos del Foln 1 ml de cada una de
estas soluciones estndar y proceder luego como la muestra.
Calcular la concentracin de glucosas en las muestras problema en mg%
3. Determinacin de glucosa en la orina:

Para la determinacin de glucosa en la orina se usar tiras de papel llamado comercialmente
glucocinta. El mtodo se basa en la actividad de los enzimas presentes en dicho papel, la glucosa
oxidasa y la peroxidasa, y adems presenta una sustancia cromgena que por su variacin de color
nos indica la presencia de glucosa. Las reacciones se pueden escribir de la siguiente manera:
a)
D Glucosa + 02 Gluconolactona + H2O2
b) H2O2 + Cromgeno Reducido H2O + Cromgeno Oxidado

(amarillo)
(verde)
La positividad a esta prueba se evidencia a travs de la presencia de color verde. El mtodo es

semicuantitativo y puede dar una idea aproximada de la cantidad de glucosa en orina. Para hacer esta
prueba se debe sumergir un pedazo de papel en la muestra de orina y observar el color.
4. Determinacin cualitativo de cuerpos cetnicos en la orina:

Esta prueba para cuerpos cetnicos se basa, en que la acetona y el cido acetoactico al reaccionar
con el nitroprusiato de sodio en medio alcalino forman un complejo de color violeta, indicando la
positividad de la reaccin.
Para esta prueba se coloca una gotas de orina sobre el reactivo, se mezcla bien y luego esperar unos
minutos para observar la aparicin del color.
RESULTADOS:
Pgina 74 de 89
En las siguientes tablas se muestran los resultados tpicos de esta experiencia para su discusin e
interpretacin:
1. Glicerina:
Ratas
Tratadas
Control
BASAL
71.48
74.60
GLICEMIA (mg/dl)
48 post aloxano
425.50
65.12
1 h post insulina
56.85
70.46
2. Glucosuria y cetonuria:
Ratas
Tratadas
Control
GLUCOSURIA Y CETONURIA (cualitativamente)

BASAL
48 post aloxano
+
-
1 h post insulina
-
INTERPRETACIN:
1. Explique de efecto del aloxano:
2. Explique el efecto de la insulina:
CUESTIONARIO: (emplear hojas apartes si fuera necesario)

1. Cules son los efectos de la insulina sobre el hgado, msculo, tejido adiposo y cerebro?
2. Mediante un esquema explique en forma conjunta el mecanismo de accin de la insulina,

epinefrina y glucagn, sobre la homeostasis de la glicemia:
Pgina 75 de 89
3. Cul es la diferencia entre la Diabetes Mellitus Insulino Dependiente y la Diabetes Mellitus No

Dependiente de Insulina?
4. Si una rata pesa 250 g Cules ser el volumen de solucin de aloxano que se le inyectar de
acuerdo a la dosis indicada?
5. A cul de los tipos de diabetes estudiados, se asemeja la diabetes causadas por el aloxano?
6. Cmo se explica la hiperglicemia, glucosuria y cetonuria que presentan los animales tratados
con aloxano?
PRACTICA N 11
EXTRACCION DE DNA E INDENTIFICACION DE SUS COMPONENTES
INTRODUCCION.
Los cidos desoxiribonucletidos (DNA) son compuestos complejos de elevado peso molecular,
formados por estructuras ms sencillas denominadas nucletidos.
Pgina 76 de 89
Estas unidades fundamentales del DNA estn constituidas por:

a) Una base nitrogenada: PURINAS (ADENINA Y GUANINA)
PIRIMIDINAS (CITOSINA Y TIMINA)
b) Un monosacrido de 5 tomos de carbono (DESOXIRIBOSA)
c) cido fosfrico.
De la combinacin de estas sustancias resulta pues, un NUCLEOTIDO representado muy
esquemticamente as:
Purine or
Pyrimidi
me
DRibose
Dentro del nucletido la combinacin de la pentosa (Desoxiribosa en el DNA y Ribosa en el RNA)

con una base nitrogenada, constituye el NUCLEOSIDO.
Los nucletidos fundamentos de los DNAs son:
1. Los que poseen como base nitrogenada una PURINA.
a) Desoxiadenosina Monofosfato (d
b) Desoxiadenosina Monofosfato (d
AMP) o Desoxiadenilato.
GMP) o Desoxiadenilato.
2. Los que poseen como base nitrogenada una PIRIMIDINA.

a) Desoxiadenosina Monofosfato (d
b) Desoxiadenosina Monofosfato (d
CMP) o Desoxiadenilato.
TMP) o Desoxiadenilato.
En el DNA:
1. Estos 4 nucletidos se organizan en cadenas polinucleotdicas.
Pgina 77 de 89
2. Dos cadenas polinucleotdicas antiparalelas, muy largas y delgadas enrolladas en espiral a lo

largo de un eje comn, forman una DOBLE HELICE, segn el modelo de Watson y Crick.
3. Las dos cadenas son complementarias de tal modo que enfrente de una base prica se encuentra
una base pirimidinica.
4. El estudiante debe tener presente que la secuencia variable de los cuatro nucletidos a lo largo
de las cadenas polinucleotdicas del DNA, constituye el fundamento de la identidad gentica
de cada organismo, la cual puede conservarse y transmitirse a su descendencia.
5. Para cumplir estas funciones el DNA tiene la capacidad de replicarse y de dirigir la sntesis de
protenas, de acuerdo al dogma central de la Biologa Molecular.
DN
A
Transcripc
in
mRN
A
Traducci
n
PROTEIN
AS
Replicacin
Todos los tejidos animales cuya clulas tengan ncleo, con una fuente potencial de DNA. Sin
embargo en la prctica, la obtencin de DNA de diversos tejidos es dificultosa por las siguientes
razones.
1. El tejido posee gran actividad de Desoxiribonucleasa (DNasa) difcil de inhibir y lo
suficientemente fuerte como para destruir al DNA durante las etapas extractivas (ejemplo el
pncreas).
2. La alta proporcin de otros constituyentes celulares (RNA, protenas, polisacidos, lpidos), en
relacin al DNA que pueden interferir con una extraccin y purificacin (ejemplo: huevos de
aves, de peses, etc.).
3. Si hay una fuerte unin entre el DNA y las protenas, la extraccin de hace difcil (ejemplo:
espermatozoides de mamferos).
Sin duda la mejor fuente para obtener DNA es el timo. Las clulas del timo tienen una alta relacin
ncleo/citosol y tiene una baja actividad DNsica. Otras fuentes posibles son el bazo, eritrocitos de
aves (pollo, pato, etc.) o peces (salmn, carpa, etc.).
En la presente prctica se extraer, se purificar y se identificar los componentes estructurales del
DNA del timo.
EXPERIMENTO 10.1. Extraccin y Purificacin del DNA.
Objetivos:
1. Propiciar que el alumno reconozca algunas de las propiedades fisicoqumicas del DNA.
Pgina 78 de 89
2. Familiarizar al alumno con uno de los mtodos ms utilizados para la extraccin y purificacin del
DNA de tejidos animales.
Procedimientos:
Observe cuidadosamente cada una de las etapas del procedimiento a seguir:
1. Homogenizar en una licuadora 2.0 g de timo de ternera en 25 ml de solucin salina 0.15 M
conteniendo EDTA 0.1 M, a pH 8.0
2. Transferir el homogeneizado anterior a una probeta de 100 ml con tapa esmerilada y aadir 2 ml
del detergente aninico Lauril Sulfato al 25 % Mezclar.
3. Colocar en bao mara a 60C, durante 10 minutos.
4. Aadir 6.3 ml de NaCI 5 M. Mezclar.
5. Aadir la solucin de clorofono alcohol isoamlico (24:1 v/v) en un volumen igual al obtenido
en la etapa 4.
6. Centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos y luego separar el sobrenadante con todo cuidado
para evitar la desnaturalizacin.
7. Al sobrenadante de la etapa 6 aadir los volmenes de alcohol etlico al 95% para precipitar los
cidos nucleicos. Mezclar con varilla de vidrio, tratando de enrollar los cidos nucleicos.
8. Colocar la varilla de vidrio con los cidos nucleicos enrollados en un tubo de prueba y disolvente
en 20 ml de solucin salina citrato (0.015 M 0.0015 M respectivamente). Dejar en reposo por
30 minutos.
9. Aadir 2 ml de solucin de acetato 3.0 M conteniendo EDTA 0.001 M a pH 7.0
10. Mezclar con varilla de vidrio, aadiendo simultneamente gota a gota 0.54 volmenes de
isopropanol, para precipitar selectivamente al DNA. Seguir mezclando con la varilla de vidrio
enrollando el DNA.
11. Disolver el DNA obteniendo el 20 ml de solucin salina-citrato (0.015 M 0.0015 M).
Resultados:
1. En el espacio siguiente anote todas sus observaciones:
Pgina 79 de 89
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
EXPERIMENTO 10.2 Identificacin de Desoxiribosa (Reaccin de Dische)

Objetivos:
1. Propiciar que el alumno identifique algunos de los componentes costitutivos del DNA,
comprendiendo los fundamentos de las tcnicas utilizadas.
Procedimiento:
A. Proceder primero a la Hidrlisis Acida del DNA.
Solucin de DNA obtenida del timo

Solucin salina citrato (0.015 M-0.0015M)
Acido Perclrico 7.5 N
X
0.5 ml
---0.5 ml
C
--0.5 ml
0.5 ml
2. Despus de colocar en cada tubo en embudo pequeo con su perla de vidrio, dejar los tubos en
bao mara hirviente por 30 minutos. Enfriar luego en agua corriente.
B. Proceder a identificar el fosfato inorgnico.
1. Preparar dos tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro:
Pgina 80 de 89
Contenido del tubo X anterior

Contenido del tubo C anterior
Agua destilada
Reactivo de Molibdato de Amonio 2.5 %
Reactivo Reductor
X
0.5 ml
--3.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
C
--0.5 ml
3.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
2. Mezclar el contenido de cada tubo. Dejar en reposos 5 minutos. Observar el color producido en
cada tubo.
Resultados:
En el espacio siguiente anote todas sus observaciones:
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------EXPERIMENTO 10.4. Desnaturalizacin del DNA y Efecto Hipercrnico.

Objetivos:
1. Estudiar los efectos del incremento de la temperatura sobre la conformacin nativa del DNA.
2. Observar las alteraciones que se producen en la Absorbancia (D.O.) del DNA en la regin UV,
cuando ste se desnaturaliza.
Procedimientos:
1. Colocar en un tubo de prueba 5 ml de la solucin de DNA obtenida del timo y calentarla a
ebullicin en bao mara hirviente por 15 minutos.
2. Enfriar y medir la absorbancia de la solucin en el espectrofotmetro a longitudes de onda que van
desde 240 a 300 nm.
3. Medir de la misma forma, la absorbancia de una solucin de DNA que no ha sido calentada (DNA
nativo).
Pgina 81 de 89
Un experimento de este tipo dio los siguientes resultados:
Longitud de onda
300
290
280
270
265
262
261
260
259
258
254
250
240
D.O. (DNA nativo)

0.005
0.013
0.265
0.358
0.420
0.450
0.452
0.454
0.452
0.450
0.440
0.410
0.290
D.O. (DNA desnatur.)

0.035
0.138
0.340
0.533
0.588
0.612
0.618
0.620
0.612
0.610
0.590
0.530
0.330
Resultados:
1. Construya una grfica con los resultados anteriores, en papel milimetrado, colocando en el eje de
las ordenadas la Absorvancia y en el eje de abscisas la longitud de onda. En el espacio siguiente
haga un comentario de los resultados obtenidos:

PRACTICA N 12
PROTEINAS EN SANGRE, ORINA Y SALIVA
INTRODUCCION.
La determinacin de protenas totales del suero sanguneo es una determinacin de laboratorio muy
utilizada en la clnica. Esta cuantificacin se suele realizar por diversos mtodos, sin embargo,
aquellos se utilizan ciertas reacciones de color que dan las protenas, son los ms difundidos. Uno de
ellos es el que utiliza la reaccin del Biuret. El nombre de la reaccin deriva del hecho que por
calentamiento de la urea hasta 180C, con desprendimiento de amoniaco, se forma un compuesto
denominado Biuret.
Pgina 82 de 89
Y el Biuret es presencia de iones cpricos en solucin alcalina produce un color violenta al formarse
un complejo tetracoordinado.
Esta reaccin tambin se produce en presencia de estructuras peptdicas que tengan como mnimo
dos enlaces peptdicos adyacentes. Esto permite la aplicacin de la reaccin del Biuret a la
determinacin cuantitativa de las protenas del suero sanguneo y otros lquidos biolgicos. As, los
valores normales de protenas totales del suero por este mtodo son de 6 a 8 g/dl. Por debajo de 6
g/dl se habla de hipoproteinemia y por encima de 8 g/dl de hiperproteinemia.
En muchos casos no resulta suficiente realizar la determinacin de las protenas totales del suero
sanguneo, sino que es tambin necesario establecer la concentracin de las diferentes fracciones
proteicas. En este sentido, se usa un procedimiento denominado electroforesis de las protenas del
suero el que nos permite aislar y cuantificar las diferentes facciones.
El procedimiento de la electroforesis est basado en el desplazamiento de molculas elctricamente
cargadas, en un campo elctrico. Como quiera que las protenas pueden tener una determinada carga
elctrica segn el pH del medio, pueden entonces ser susceptibles de ser separados por electroforesis.
La velocidad de migracin de est macromolculas depender fundamentalmente, de la intensidad de
su carga elctrica, su tamao y forma, y la naturaleza del soporte sobre el cual migran.
La electroforesis de las protenas del suero sanguneo, como comnmente se realiza, determina la
separacin de cinco fracciones proteicas, que ordenadas en funcin de su velocidad de migracin, son
las siguientes albmina, 1globulina , 2globulina , glubolina y globulina:
Pgina 83 de 89
La albmina en el ms homognea, con un peso molecular de 69000, un pI de 4.9 y en la de mayor

velocidad de migracin. Tiene como funciones importantes, el participar en el bilirrubina, cidos
grasos, etc. Esta protena tambin enlaza una serie de drogas que son poco solubles en un medio
ambiente acuoso, como los barbitricos, digitlicos, aspirina, etc. Normalmente el 50% del calcio
plasmtico est unido a la albmina y esto debe tenerse muy en cuenta para explicar las
manifestaciones de hipocalcemia asociadas a situaciones en las cuales disminuye la concentracin de
albmina y esto debe tenerse muy en cuenta para explicar las manifestaciones de hipocalcemia
asociadas a situaciones en las cuales disminuye la concentracin de albmina plasmtica. Esto
tambin trae consigo la disminucin de la presin coloidosmtica de la plasma sangunea a la
produccin de edema, un signo muy frecuentemente observado en pacientes desnutridos.
Las
2
globulinas
incluyen dos fracciones electroforticas, la
(con un pI de 5.5 a 5.8). Las principales
(con un pI = 5.1) y la
globulinas, son la Protena C Reactiva y
las Lipoprotenas de Alta Densidad (HDL de High Density Lipoproteins); en tanto que, las principal
2 globulinas son la haptoglobina, ceruloplasmina y protrombina.
Las
globulinas
(pI de 5,4 a 6.3), incluye a la protena transportada de hierro (la transferrina) y
a las lipoprotenas de baja densidad (LDL de Low Density Lipoprotein).

Las globulinas
(pI entre 6.3 a 7.3), contienen las diferentes inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM,
IgD, y la IgE.
La tcnica ms comnmente usada para la separacin de las protenas del suero por electroforesis,
consiste en depositar unos microlitros de suero en una tira de papel de filtro humedecida con buffer
barbital de pH 8.6. Luego los extremos de la tira son introducidos en casa uno de las dos bandejas de
la cmara electrofortica que contiene el mismo buffer y que contienen los electrodos. En vista de
que el pI de todas las fracciones es menor que el pH de buffer, se cargarn negativamente (negatively
charged proteins) y por lo tanto migrar al polo positivo. Como quiera que la intensidad de carga de
las diferentes fracciones, es distinta, al igual que su tamao, migrarn a diferente velocidad. Esto
quiere decir que una vez desconectado el aparato de la fuente elctrica, quedar separadas las
fracciones y ser posible su identificacin si las teimos con un colorante especfico para protenas
como el Amido-Black. La cuantificacin de cada fraccin se har en funcin de la intensidad de color
que tiene cada banda y que pueda hacerse por diversos mtodos, como con el uso de un aparato
Pgina 84 de 89
llamado densitmetro que nos grafica un pico para cada fraccin y cuya rea es proporcional a la
intensidad del color.
La tabla siguiente muestra los valores que podemos consideran como normales tanto en valores
absolutos (g%), como en valores relativos (porcentaje).
Albmina
Porcentaje
g/100 ml
50- 58
3.24 a 4.42
1globulina
2globulina
4 -7
0.36 a 0.48
7 11
0.54 a 0.72
globulina
11 - 15
0.78 a 1.04
globulina
14 22
0.8 a 1.6
En la tabla 2 se muestra las variaciones en la concentracin de la diferentes fracciones

electroforticas de las protenas del suero sanguneo en algunas enfermedades en donde este mtodo
es de gran ayuda en su diagnstico.
ENFERMEDAD
Infecciones agudas
Endocarditis bacteriana
Plasmocitoma Beta
Artritis reumatoidea
Hipogamaglobulinemia
Mieloma mltiple
Sndrome nefrtico
Desnutricin
Cirrosis heptica
P.T.
Albm.
1glob . 2glob . glob.
N
N
N
N
N
N
N
D (+)
NoD
N
D (+ + )
D (+)
D (+)
A (+)
A (+ +)
A
D (+)
D (+)
D (+)
glob .
A (+ +)
A (+)
N
A (++)
D (++)
A (+++)
A (+)
(A +)
Diversos autores sealan que la electroforesis de las protenas sricas (serum protein
electrophoresis), junto con la determinacin de las protenas sricas totales debe ser considerada
como un procedimiento rutinario para cualquier paciente, como ayuda en el diagnstico y en el
control de la enfermedad que tiene.
A pesar de existir una alta concentracin de protenas en el suero, normalmente no se detectan
protenas en la orina, explicable por la incapacidad de las macromolculas de la protenas de
atravesar los poros de la membrana basal del glomrulo renal. Por esta razn, el encontrar protenas
en cantidades demostrables en la orina es una situacin de mucho cuidado desde el punto de vista
mdico.
Las protenas pueden ser identificadas en la orina de manera muy sencilla, al calentar una muestra de
orina y apreciar la turbidez, lo cual es indicativo de la desnaturalizacin de la protenas por el calor.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los fosfatos tambin pueden enturbiar la orina; la distincin
puede hacerse considerando que los fosfatos se solubilizan en medio cido.
La saliva est compuesta de agua (94.0 a 99.5 %) y slidos ( 6% en saliva no estimulada 0.5 % en
saliva estimulada. Entre los constituyentes orgnicos se encuentran: urea, cido rico, glucosa libre,
aminocidos libres, lactato, cido grasos; as como diversas protenas: amilasa, peroxidasa, Iysozima,
inmunoglobulinas, etc. Entre los principales constituyentes inorgnicos estn en Na, CI, K, Ca, Mg,
Pgina 85 de 89
F, HC
O3
y NH4. Las protenas de la saliva tambin pueden ser demostradas mediante la reaccin
del Biuret.
EXPERIMENTO 12.1. Determinacin de las protenas totales del suero sanguneo.
Objetivos:
1. Mediante el uso de la reaccin del Biuret y la aplicacin del mtodo fotocolorimtrico, realizar la
determinacin cuantitativa de las protenas del suero sanguneo.
Procedimientos:
1. Preparar 3 tubos de prueba en la siguiente forma y mezclar bien:
Suero o plasma diludo 1/20
(0.1 ml de suero o plasma con
1.9 ml de agua detilada
Agua destilada
Reactivo de Biuret
X (Problema)
B (Blanco)
---4 ml
1 ml
4 ml
2. Dejar en reposo 30 minutos y medir luego la absorbancia en el fotocolorimtrico utilizando filtro

verde.
3. Durante el desarrollo de este experimento se proporcionar la lectura de un estndar (St), que se
suele preparar en la misma forma que la muestra, slo que en lugar del suero sanguneo se usa
una solucin de protenas de concentracin exactamente conocida 7.0 g%.
Resultados:
1. Llenar la siguiente tabla:
Lectura Bruta
2.
Lectura Neta
Tubo X
Tubo B
Tubo St
C
ul
es
el Factor de Calibracin?_________________________________________________
Pgina 86 de 89
3. Cul es la concentracin de protenas en la muestra problema?
4. Escriba en el espacio en blanco si el valor obtenido es normal, bajo o alto:__________________
EXPERIMENTO 12.2. Identificacin de protenas en la orina.

Objetivos:
1. Aplicar un mtodo sencillo que permita la identificacin de la presencia de protenas en la orina.
Procedimiento:
1. Medir 5 ml de orina en un tubo de ensayo y calentar hasta la ebullicin.
Observar lo que sucede. Tener cuidado de no expulsar su contenido.
2. En caso de entubamiento, aada algunas gotas de solucin de cido actico al 2%. Apreciar si la
turbidez persiste o desaparece.
3. Repita el mismo procedimiento con todas las muestras de orina que le sern proporcionadas.
Resultados:
1. Llene la siguiente tabla escribiendo + cuando hay turbidez y cuando no la hay o cuando
desaparecer la turbidez.
ORINA X
ORINA Y
ORINA Z
Calentando la muestra
Aadiendo cido actico
DIAGNOSTICO
Pgina 87 de 89
2. Escriba en los casilleros DIAGNOSTICO, las palabras normal, proteinuria o fosfaturia, segn
corresponda.
EXPERIMENTO 12.2. Identificacin de protenas en la orina.

Objetivos:
1. Demostrar la presencia de protenas en la saliva mediante la reaccin de Biuret.
Procedimiento:
1. Recolectar saliva en una beaker pequeo.
2. Preparar dos tubos de prueba de la siguiente forma:
Aadir saliva
Aadir agua destilada
Reactivo de Biuret
Tubo con saliva

4 ml
--4 ml
Tubo con agua

---4 ml
4 ml
3. Dejar en reposo 5 minutos y observar la diferencia.
Resultados:
1. Cul es el resultado observado? ___________________________________________________
2. Qu le indica este resultado?______________________________________________________
CUESTIONARIO:
1. Cul es la concentracin normal de protenas del suero?
Pgina 88 de 89
2. Cundo hay hipoproteinemia?

3. Cules son la facciones proteicas que se encuentran por electroforesis de la protenas del suero
sanguneo?
4. Dar ejemplos de protenas caractersticas de cada fraccin:
5. Qu importancia tiene el hacer la electroforesis de las protenas del suero?
6. Qu es protena? La proteinuria es normal? Cul es el significado clnico de la proteinuria?
7. Cmo podra Ud. identificar protenas en la orina?
8. Qu protenas se encuentran en la saliva? Cmo podra Ud. demostrar la presencia de protenas

en la saliva?
Pgina 89 de 89

3ra Parte Zambrano

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

3ra Parte Zambrano

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Lic.

Jess Zambrano Rojas

ASIGANTURAS DE BIOQUIMICA ODONTOLOGIA

Lic. Jess Zambrano Rojas

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------EXPERIMENTO 1.2. Preparacin de 100 ml de una solucin 0.1 N de cido Clorhdrico.

Calcule y anote la concentracin NORMAL o NORMALIDAD de la solucin concentrada de

Calcule y anote la concentracin PORCENTUAL (P/V) de la solucin concentrada de HCI:

Lic. Jess Zambrano Rojas

EXPERIMENTO 1.3. Preparacin de 100 ml de una solucin 0.1 M de cido sulfrico.

Anote en el espacio siguiente el volumen del

concentrado, calculado para preparar

los 100 ml de una solucin 0.1 M:

Calcule y anote la concentracin NORMAL o NORMALIDAD de la solucin concentrada de

Calcule y anote la concentracin PORCENTUAL (P/V)

Lic. Jess Zambrano Rojas

Preparacin de 100 ml de una solucin 0.1 N de cido

4. Tapar el frasco y mezclar.

Anote en el espacio siguiente el volumen calculado de la solucin saturada de NaOH

Lic. Jess Zambrano Rojas

0.6 1.5 mg/dl

8.5 -10.5 mg/dl

3.0 4.5 mg/dl

Lic. Jess Zambrano Rojas

Lic. Jess Zambrano Rojas

N de mEq de ACIDO = N de mEq de Base

Dnde: N = Normalidad de la solucin estndar.

2. La concentracin exacta de la solucin de NaOH as titulada es: _______________________

Lic. Jess Zambrano Rojas

EXPERIMENTO 2.2 Titulacin de la solucin de HCI aproximadamente 0.1 N preparada en el

2. La concentracin exacta de la solucin de HCI as titulada es:____________________________

EXPERIMENTO 2.3 Titulacin de la solucin de H2SO4 aproximadamente 0.1 M preparada

Lic. Jess Zambrano Rojas

5. Realizar clculos correspondientes empleando la ecuacin (1), para determinar al o

4. Por qu al titular la solucin de H2SO4 no se gast un volumen similar de la solucin estndar

Lic. Jess Zambrano Rojas

1. Las soluciones de cidos y bases de igual molaridad se neutralizan exactamente volumen a

2. Cuntos ml de NaOH 2.5 N ser necesarios para neutralizar 10 ml de cidos sulfrico

3. Si 30 ml de NaOH 0.5 N neutralizan 25 ml de cido sulfrico Cul es la concentracin molar

4. El principal producto de la fermentacin de los carbohidratos de la dieta por lo microorganismos

Lic. Jess Zambrano Rojas

Procedimientos similares son empleados para la terminacin de la acidez titulable de la orina

Lic. Jess Zambrano Rojas

1016 . Por otro lado, la concentracin del agua es relativamente

. Por lo que Kep x

denominado producto inico del agua (Kw).

Lic. Jess Zambrano Rojas

puede ser calculada del producto inico del agua:

1 x 1014=1 x 107 y [OH ] =

1 x 107 y viceversa. Por lo tanto,

iones OH debe ser muy baja,

M . Inversamente, cuando la concentracin de iones OH es

muy alta como en una solucin de NaOH 1M, la concentracin de iones

debe ser muy baja ,

Lic. Jess Zambrano Rojas

Sorensen defini el trmino pH as:

Por lo tanto, siendo

para una solucin neutra a 25C su pH ser igual a 7.0.

b) Medicin del pH.

Lic. Jess Zambrano Rojas

con iones hidroxilo. Sin embargo, la

del HCI 0.1 N es tambin 0.1 N (pH = 1), mientras que

comunmente llamados cidos fuertes, stan

. Acidos y bases dbiles son comunes en sistemas biolgicos y juegan roles

importantes en el metabolismo y su regulacin.