NDICE

CAPITULO I: INTRODUCCIN GENERAL A LA CLONACIN CELULAR........2

CAPITULO II: AMPLIFICACIN IN VITRO DEL DNA: REACCIN EN
CADENA DE LA POLIMERASA O PCR...............................................................4
1. PRINCIPIO DEL MTODO:........................................................................4
2. ETAPAS DEL PROCESO:..........................................................................6
3. ALGUNAS CARACTERSTICAS DEL PROCESO:.................................10
4. AUTOMATIZACIN DE LA PCR:.............................................................11
5. VARIANTES DEL MTODO:....................................................................11

CAPITULO I: INTRODUCCIN GENERAL A LA CLONACIN

CELULAR
Conceptualmente, el proceso de clonacin (clonado o clonaje) consiste en la
obtencin de un clon, entendido como conjunto de elementos genticamente
idnticos entre si y a su precursor. Estos elementos pueden ser molculas,
clulas, tejidos, rganos u organismos pluricelulares completos. Cada
componente individual de un clon contiene la misma informacin gentica, el
mismo genotipo, que el elemento de partida; por ello, se puede considerar que
la clonacin supone una amplificacin gentica. Ahora bien, a pesar de la
definicin anterior, entre los componentes de un clon tambin se dice que cada
uno es un clon de los otros.
Debe indicarse que la clonacin es un proceso fisiolgico normal: son clnicas
las clulas embrionarias totipotentes formadas por mitosis a partir del cigoto;
cada una de las clulas da lugar a individuos adultos formados por clulas
somticas clnicas, genticamente iguales entre si y a la clula embrionaria de
partida. En el nivel de organismos completos, son clnicos los gemelos
monocigticos o univitelinos, procedentes del mismo ovulo fecundado.
El inters de la clonacin radica esencialmente en su carcter biotecnolgico
como proceso de multiplicacin de molculas de DNA o RNA, clulas, tejidos u
organismos completos, mediante mecanismos de manipulacin gentica.
La biologa en general, y la investigacin biomdica en particular, estn
avanzando enormemente y lo harn an ms en el futuro, con la variada gama
de copias de elementos genticos ya empleados para estudiar y resolver
problemas tanto de carcter bsico como aplicado.
Globalmente, interesa describir la clonacin desde el punto de vista de su
finalidad, es decir:

Clonacin de organismos: plantas o animales completos.

Clonacin de clulas, aisladas o formando tejidos u rganos.
Clonacin de molculas, sean estos genes o fragmentos de DNA o RNA.
De acuerdo con el proceso experimental, esta clonacin puede dividirse
a su vez en dos tipos:

 Clonacin acelular, es decir, clonacin de molculas sin

intervencin de clula alguna. Es sinnimo de amplificacin in
vitro de molculas de DNA o RNA mediante la reaccin en cadena
de la DNA polimerasa.
Clonacin celular (con clulas, no de clulas). Es la amplificacin
de molculas de cido nucleico mediante su introduccin, asistida
por vectores, en clulas anfitrionas en cultivo. Emplea la
tecnologa del DNA recombinante.

CAPITULO II: AMPLIFICACIN IN VITRO DEL DNA: REACCIN

EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR
Considerada hoy en da como una herramienta imprescindible en el laboratorio
de biloga molecular e ingeniera gentica, el objetivo de esta tcnica es la
amplificacin directa de un gen o un fragmento de DNA, o indirecta de un RNA
(en este caso, a travs de su DNA complementario, o cDNA), presentes en
mezclas de muy diversas fuentes, sin necesidad de una purificacin previa de
la muestra ntegra original. Se puede partir de homogenados, extractos crudos
de tejidos, sangre completa, mezclas de fragmentos de DNA obtenidos por
enzimas de restriccin, muestras resultantes de la extraccin y aislamiento de
DNA, etc. Sin embargo, debe resaltarse que, es un requisito imprescindible que
se conozca la secuencia de una parte de la regin de DNA o RNA que se
quiere amplificar (salvo en el caso de algunas variantes del mtodo clsico,
como la PCR inversa).
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Por estas caractersticas, en especial la capacidad de amplificacin, la PCR es

un mtodo muy adecuado para preparar cidos nucleicos en una cantidad muy
superior a la de la muestra original, tanto como mtodo de clonacin acelular
como para la deteccin.
Las aplicaciones de la PCR son muy numerosas y variadas. Ejemplos:
clonacin acelular de fragmentos de DNA, deteccin de secuencias sin
purificacin previa, secuenciacin de cidos nucleicos, establecimiento de
polimorfismos de secuencia, rastreo de mutaciones, tipado de DNA para
trasplantes, diagnstico de enfermedades genticas, prenatales o no,
determinacin de secuencias especficas de DNA relacionadas con situaciones
patolgicas definidas, resolucin de problemas forenses o arqueolgicos,
estudios evolutivos, deteccin de microorganismos infecciosos, deteccin de
clulas tumorales, amplificacin de DNA para su posterior clonacin celular,
etc.
1. PRINCIPIO DEL MTODO:
La PCR no es un tcnica analtica, sino ms bien una metodologa,
resultante de la aplicacin prctica de tres conceptos.
Desnaturalizacin del DNA para dar hebras sencillas.
Hibridacin especifica de la hebra sencilla con un oligonucletido.
Tambin se denomina etapa de templado (entendido como
disminucin de temperatura que permite la reasociacin de
hebras sencillas tras la desnaturalizacin trmica; en ingls,
annealing). Esta es la etapa que explica porque se debe conocer

parte de la secuencia.
Replicacin de la hebra sencilla por una DNA polimerasa a partir
del oligonucletido anterior como cebador: tambin, elongacin o

extensin del cebador, o polimerizacin.

Mediante la aplicacin de forma clnica de estos tres procesos se
consiguen mltiples copias del fragmento de cido nucleico en un corto
espacio de tiempo.
A pesar de esta aparente complejidad, en teora es un mtodo sencillo,
sensible y relativamente rpido para amplificar secuencias. En la
prctica, se requiere un control preciso de las variables que condicionan
este triple proceso (secuencia diana, cebador, enzimas y resto de
componentes), adems de instrumentos adecuados (termocicladores de
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DNA) para establecer las condiciones de cada etapa y repetirlas

cclicamente (tiempo, temperatura, numero de ciclos, etc.). Se consigue
as amplificar secuencias de tamaos diversos, comprendidos entre 50
pb y 2,5 Kb.
Para la realizacin prctica se precisan en la mezcla de reaccin los
siguientes reactivos.
Los cuatro dNTPs, en exceso, como sustratos para la sntesis de
las innumerables copias de DNA. Para ser reconocidos por la

polimerasa, deben ir acompaados de Mg 2+.

Dos oligonucletidos de cadena sencilla,

generalmente

sintticos, de 18 a 30 nt. Sus secuencias han de ser

complementarias, respectivamente, a los dos extremos 3 de la
regin diana, uno en cada hebra, de modo que los oligos puedan
ejercer de cebadores para la replicacin de la dos hebras en la
regin diana. Por esta razn no se puede amplificar una regin
de DNA sino se conoce las secuencias de sus extremos. De
hecho, es la posicin donde hibridan los cebadores la que define
la longitud del fragmento que se amplifica (secuencia diana).

Una DNA polimerasa termoestable, es decir, enzimticamente

activa a temperaturas relativamente altas (al menos 75C, y
estable con frecuencia hasta 95C). Esta caracterstica permite
su actuacin en sucesivos ciclos sin inactivarse; adems, la
replicacin a temperaturas elevadas impide la formacin de
hbridos

parcialmente

desapareados

contribuye

la

especificidad y rendimiento del proceso. La enzima ms

empleada se llama polimerasa taq, por proceder de la bacteria
Thermus aquaticus, que vive en manantiales de agua caliente.
Esta enzima tiene el inconveniente de carecer de la actividad
correctora de pruebas (exonucleasa 3), por lo que la frecuencia
de errores es superior a la de la replicacin (alrededor de un
error por cada 5000 nucletidos incorporados); de ah que en
ocasiones se sustituya por otras DNA polimerasas termoestables.

2. ETAPAS DEL PROCESO:

Como ya se ha indicado, se requiere una sucesin de ciclos
(generalmente entre 20 y 40, de 1,5 a 5 minutos de duracin de cada
ciclo) de desnaturalizacin, hibridacin y replicacin, para conseguir una
enorme amplificacin del nmero de molculas que contienen la
secuencia de inters o diana. La duracin total es de alrededor de 2
horas, dependiendo de las condiciones experimentales concretas.
Cada ciclo de una PCR consta, pues, de tres etapas:
Desnaturalizacin: calentamiento para la separacin de las dos
hebras del DNA, mediante una incubacin breve (30-120 s) a una
temperatura entre 68 y 98 C, que debe ser superior a la de

fusin de la regin de DNA que se quiere amplificar.

Templado (o hibridacin): enfriamiento rpido por debajo de la
Tm de forma que se permite la hibridacin de las hebras sencillas
del DNA de inters con los oligos cebadores. Generalmente se
usan temperaturas de 37 a 65 C que se mantienen entre 10 y

120 s.
Elongacin (o replicacin): etapa de amplificacin propiamente
dicha (72-75 C, 1-3 min), en la que la DNA polimerasa
termoestable elonga los cebadores, empleando como molde
ambas hebras originales. La replicacin transcurre en direccin
53 a partir del extremo 3-OH de cada cebador, empleando
como sustrato los cuatro dNTPs, hasta terminar la lectura del
molde o hasta que se comience una nueva etapa de
desnaturalizacin (siguiente ciclo).

Adems de las 3 etapas de cada ciclo, comnmente se aade una etapa

previa y una final al conjunto de todos los ciclos. La previa, a la elevada
temperatura (incluso superior a la de las etapas de desnaturalizacin),
sirve bsicamente para inactivar proteasas y nucleasas de la muestra,
as como para asegurar la desnaturalizacin completa del DNA de
partida, especialmente si este es de gran tamao o posee regiones muy
compactadas (caso de un DNA genmico completo). La etapa final, por
su parte, consiste en una prolongacin de la ltima elongacin, para
permitir que se completen todos los fragmentos.

Esquemticamente, el conjunto de reacciones y los resultados

correspondientes a los 4 primeros ciclos son los siguientes:

Debe hacerse notar que si la muestra de partida, como ocurre en el

ejemplo descrito, est formada por molculas de DNA de mayor tamao
que la regin diana slo a partir del tercer ciclo aparecen copias exactas
de la diana. Si la muestra de partida hubiese sido el propio fragmento
diana, todas las copias aparecidas desde el primer ciclo serian iguales a
l.
Adems de la amplificacin global, por el aumento del nmero de
molculas de DNA, debe notarse como el nmero de copias de la diana
aumenta mucho ms rpidamente que el de otras copias ms largas.
Todo ello hace que en la mezcla final, al terminar la PCR, los fragmentos
diana superen abrumadoramente en nmero a cualquier otro tipo de
fragmento, incluyendo obviamente las molculas de DNA originales de la
muestra (que no han sido amplificadas). En la tabla siguiente, obsrvese
el enorme grado de amplificacin conseguido, de un milln de veces en
20 ciclos y un billn en 40 ciclos. Esto es lo que permite aplicar la PCR
a muestras poco purificadas y analizar los resultados directamente, en
los que solo se podr detectar el fragmento amplificado.

3. ALGUNAS CARACTERSTICAS DEL PROCESO:

Rendimiento: puesto que los productos de cada ciclo sirven de
molde para el siguiente, la acumulacin de copias (tanto totales
como dianas) es exponencial en vez de lineal. Sin embargo, en la
prctica el rendimiento de cada etapa no es completo, por lo que
las cifras se ven algo reducidas. A pesar de ellos, siguen siendo
muy elevadas. El nmero de copias al final de los ciclos
realizados se puede calcular como:
Se han desarrollado modificaciones del mtodo descrito,
encaminadas a aumentar la eficiencia, sobre todo en lo relativo a
7

la concentracin de Mg2+ (normalmente de 1 a 4 mM) y al tiempo

y temperaturas de templado.
Duracin: la duracin de cada una de las tres etapas de cada
ciclo y el nmero de ciclos deben optimizarse, dependiendo de la
secuencia concreta que se quiera amplificar. En muchos casos, la

eleccin de estas condiciones debe hacerse de forma emprica.

Especificidad: es muy elevada. Esta determinada especialmente
por la secuencia de los dos cebadores utilizados y por las
condiciones de templado. Se puede determinar la especificidad
analizando por electroforesis los productos generados; la
aparicin de una banda nica indica que la tcnica es especfica.
Por ejemplo, si la temperatura de templado se reduce
excesivamente

se

producen

falsos

positivos

debidos

fundamentalmente a apareamientos imperfectos del cebador con

secuencias distintas de la diana, aunque similares, que resultan

as tambin amplificados.
Capacidad de deteccin (comn, aunque incorrectamente,
denominada sensibilidad): es muy alta (bajo lmite de
deteccin), tanto que la PCR puede permitir detectar una nica
molcula de DNA en casi cualquier tipo de muestra clnica,
forense o arqueolgica (clula, pelo, semen, etc.). sin embargo,
esta caracterstica supone tambin un elevado riesgo de
contaminacin por molculas de origen ajeno a la muestra.

4. AUTOMATIZACIN DE LA PCR:
La automatizacin es sencilla y de bajo coste, dado el carcter cclico
del proceso, el empleo de componentes estables al calor y el desarrollo
de termocicladores para programar los cambios de temperatura. Al
mismo tiempo es imprescindible, pues solo mediante la automatizacin
se hace factible la realizacin de un nmero elevado de ciclos y se
aumenta la precisin del proceso. Ello facilita un empleo cada vez ms
especfico y sensible en el laboratorio.
5. VARIANTES DEL MTODO:
Han surgido numerosas modificaciones derivadas del mtodo bsico
inicial, con el propsito de mejorar el rendimiento o la especificidad,
adaptarse a muestras particulares, amplificar molculas de RNA en lugar
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de DNA, producir cadenas de hebra sencilla. Por ejemplo, una

modificacin muy comn en la actualidad (denominada comienzo en
caliente, hot start PCR) consiste en privar a la mezcla de reaccin de
alguno de sus componentes (frecuentemente la polimerasa) hasta que
se haya alcanzado una temperatura superior a la de templado. De este
modo, se evita la elongacin de cebadores asociados inicialmente con
poco rigor (a secuencias de homologa parcial con la diana) y, como
resultado, se aumenta mucho la especificidad de la ampliacin.
A continuacin, se comentan brevemente algunas de las variantes ms
significativas.
PCR larga:
Denominada L-PCR (long PCR) o LA-PCR (Longer and Accurate
PCR, PCR ms larga y exacta), su objetivo es superar los
lmites de la PCR convencional para amplificar con fidelidad
regiones diana de gran tamao (entre 5 y 40 Kb). El principal
factor limitante es la ausencia de actividad correctora de pruebas
en la polimerasa Taq, por lo que se aade una cantidad menor de
otra enzima con capacidad de correccin de pruebas (por
ejemplo, la Pfu) para contrarrestar la carencia de esta actividad y,
al mismo tiempo seguir aprovechando la eficacia de elongacin

de la polimerasa principal (Taq o similar).

PCR anidada:
La especificidad puede aumentarse realizando una segunda
reaccin de PCR, con dos cebadores nuevos que hibridan dentro
del fragmento diana amplificando por el primer par, dando as
lugar a productos de PCR ms cortos, pero ms especficos. Las
copias correctas de la primera diana contendrn ambas
secuencias

complementarias

los

nuevos

cebadores,

diferencia de los productos no especficos generados en la

primera PCR (que se observan en la electroforesis como varias
bandas o una banda difusa), que por ello no resultaran
amplificados en la segunda. Este mtodo tambin sirve para
aumentar el factor de amplificacin conseguido, al suponer dos
rondas de amplificacin.

PCR inversa:
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Esta variante se emplea para clonar regiones desconocidas de un

DNA, situadas en posicin vecinal a secuencias diana conocidas.
Es decir, en lugar de amplificar la regin interna, flanqueada por
los dos cebadores (PCR convencional), se amplifica la regin
externa, que flanquea a los cebadores. Para ellos es necesario
cortar el DNA a ambos lados de la regin diana con una enzima
de restriccin, de tal forma que los extremos cohesivos
resultantes puedan hibridar entre s, formando una molcula
circular. Esta es cerrada por una ligasa y se realiza la PCR con
cebadores que hibridan con los extremos 5 de la secuencia
conocida, por lo que la elongacin se extender alrededor del
crculo. Se generan copias de un DNA lineal delimitado, como en
la DNA normal, por la posicin de ambos cebadores.

PCR con adaptadores:

Tambin puede amplificarse una regin de DNA de secuencia
desconocida ligando a sus fragmentos de restriccin unos
adaptadores, oligonucletidos sintticos con extremos cohesivos
compatibles con los generados en la muestra. A continuacin, una
vez desnaturalizadas, se aaden cebadores especficos para las
secuencias 3 de los adaptadores. Se amplifica as el conjunto de
adaptadores y secuencia diana, pero debe sealarse que se
amplifican por igual todos los fragmentos de restriccin presentes,
no uno slo.

PCR asimtrica:
En este caso, se trata de generar copias de hebra sencilla de un
DNA. En la variante ms simple, se aaden cantidades muy
diferentes de ambos cebadores, de modo que tras los primeros
ciclos de PCR uno de ellos se agota y, disponibles ya suficientes
copias del DNA diana, solo una de sus hebras sigue

amplificndose gracias al cebador ms abundante.

RT-PCR: amplificacin de RNA.
El nombre, PCR con transcriptasa inversa (iniciales de reserve
transcriptase), indica que se trata de una amplificacin de RNA
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(especialmente mRNA) a travs de la sntesis previa de su cDNA

(DNA complementario al RNA), que despus se amplifica por
PCR. Es decir, no se obtienen copias de RNA de partida, sino de
DNA, aunque e conserva obviamente la secuencia de aqul.
Es el mtodo con mayor capacidad de deteccin de los
disponibles para la medida de la expresin gnica in vitro. Se
utiliza preferentemente para amplificar mRNAs de clulas
asequibles, por ejemplo sanguneas, con una expresin elevada
de ciertos genes (por ejemplo, globina). Tambin se ha aplicado al
anlisis de transcritos de genes expresados en grado mnimo.
La mezcla inicial contiene todos los componentes necesario de
RNA, transcriptasa inversa, DNA polimerasa, cebadores y dNTPs.
El proceso comienza (por ejemplo, 45 min a 48 C) con la sntesis
de una hebra de cDNA por la accin de la transcriptasa inversa,
una polimerasa de DNA dirigida por RNA, permaneciendo el
cDNA unido al molde como dplex RNA : cDNA. En la segunda
etapa (por ejemplo, 2 min a 94 C) se desnaturaliza el dplex y
comienza la amplificacin segn el mecanismo de una PCR
normal; la hebra de cDNA liberada acta como molde para un
segunda hebra de cDNA y luego el dplex se amplifica en
sucesivos ciclos.
Tericamente, basta con la molcula de RNA que est intacta
entre los dos sitios de unin al cebador para conseguir la
amplificacin. Bajo el mismo principio, tambin se puede
amplificar RNA usando la polimerasa Tth (tambin termoestable,
aislada de la bacteria termfila Thermus thermophilus), que
contiene al mismo tiempo actividades DNA polimerasa y
transcriptasa inversa.

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