PRUEBAS DE EFICACIA ANTIMICROBIANA SEGN USP 30 PARA

FARMACEUTICOS Y COSMETICOS

1.

OBJETIVO

Evaluar la eficacia de los preservativos antimicrobianos incorporados en productos farmacuticos

no estriles y cosmticos de acuerdo con la cantidad de microorganismos eliminados o cuya
proliferacin sea inhibida a lo largo de un plan de muestro (28 das).

2. DEFINICIONES.

Preservativo antimicrobiano: Sustancia que se adiciona a las formas farmacuticas no

estriles para protegerlas del crecimiento de microorganismos que sean introducidos
inadvertidamente durante o posteriormente al proceso de manufactura.
antimicrobianos presentan propiedades

Todos los agentes

txicas, por lo que para la mxima proteccin del

paciente, la concentracin de preservativo en el producto final debe ser considerablemente ms

baja que la concentracin a la concentracin a la que pueda ser txica para el hombre.

Los agentes antimicrobianos no substituyen las Buenas Prcticas de Manufactura. Estos solo se
adicionan a los productos para disminuir el riesgo de una posible contaminacin subsiguiente a
la fabricacin.
Repique: Transferencia de microorganismos de un cultivo estabilizado a un medio fresco.

3.

PROCEDIMIENTO

Principio o Fundamento

Un sistema preservante involucra tanto los preservativos como la constitucin fsico-qumica del
producto. Factores como pH, Aw, disponibilidad de nutrientes, concentracin de agentes

tensoactivos, agentes secuestrantes, componentes no acuosos, ingredientes insolubles y

materiales interferentes influirn en la preservacin de cualquier frmula cosmtica.

En el diseo de la formulacin cosmtica es necesario conocer muy bien todas las posibles
interacciones del sistema preservativo para asegurar el cumplimiento del objetivo primordial de
la preservacin que es asegurar que el producto es microbiolgicamente seguro y estable.

El ensayo de la eficacia de un preservativo es una parte esencial en la garanta de la calidad de

un producto cosmtico. La meta de este ensayo, es determinar el tipo y la concentracin mnima
efectiva de preservativo que se requiere para preservar satisfactoriamente un producto,
mientras est en los canales de mercadeo y en las manos del consumidor.

La importancia de dichos ensayos radica principalmente en:

Usar poco preservativo o uno inapropiado, permitir el crecimiento microbiano.

Usar demasiado preservativo puede causar reacciones adversas en la piel lo cual ocasionara
inconformidad en el usuario y costos elevados.

Pueden existir reacciones que inactiven la accin del preservativo en el sistema preservante
usado.

La prueba de eficacia de preservativos requiere que se inoculen individualmente especies

determinadas de microorganismos. Este enfrentamiento debera incluir representantes de
especies de bacterias Gram positivas, Gram negativas, mohos y levaduras y en suficiente
cantidad como para permitir que se obtenga informacin sobre la cintica de la reaccin.

Materiales y Reactivos

Cepas de referencia ATCC: Las cepas a usar no deben tener ms de cinco (5) repiques
en relacin con el cultivo original ATCC.

Escherichia coli ATCC 8739.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.

Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Candida albicans ATCC 10231.

Aspergillus Niger ATCC 16404.

Frascos de vidrio de 200 - 250 cm3.

Micropipeta 0.1 1 cm3.

Puntas para Micropipeta estriles.

Gradillas.

Tubos de ensayo tapa rosca de 25 x 150 mm.

Solucin salina.

Cajas de Petri estriles.

Agar TSA o PC.

Agar Sabauroud Cloranfenicol.

Tween 80.

Tubos con agar inclinado (TSA y Sabauroud).

Vasija con desinfectante en uso.

Probeta de 100 cm3.

Asa bacteriolgica.

Incubadora 22+2 C y 35 +2 C.

Autoclave.
Procedimiento Tcnico

Para fines de la prueba, los productos se definieron dentro de 4 categoras.

CATEGORIA

DESCRIPCIN DEL PRODUCTO

Inyectables, otros parenterales incluyendo

emulsiones, productos ticos, productos
nasales estriles y productos oftlmicos con

bases o vehculos acuosos.

2

Productos
tpica

empleados

preparados

de

con

manera
bases

vehculos acuosos, productos nasales

no estriles y emulsiones, incluyendo
aquellos que se aplican a membranas
mucosas
3

Productos orales a excepcin de anticidos,

preparados con bases o vehculos acuosos

Anticidos preparados con una base acuosa

Preparacin Del Inoculo. (Fase 1)

En el carro de acero inoxidable alistar:

Una vasija con el sanitizante en uso, un asa

bacteriolgica plstica estril, gradilla con 3 tubos de agar inclinado TSA o PC, o caja de
petri con agar TSA o PC, 2 tubos de agar inclinado o caja de petri con Sabouraud +
cloranfenicol , Cepas de referencia ATCC anteriormente mencionadas.

Encender la Cabina y dejar circular el aire por espacio de 10 minutos.

Rotular cada uno de los tubos o cajas con el nombre, cdigo de las cepas ATCC, Fecha y
Responsable.

Repicar las cepas ATCC en los tubos de agar inclinado o cajas de TSA - PC para bacterias y
Sabouraud ms cloranfenicol para el hongo y la levadura.

Estandarizacin De Las Cepas. ( Da 2)

A partir de la cepa de cada microorganismo, realizar una suspensin inicial, en solucin

salina al 0.85%, equivalente a al tubo 1 de la escala de Mc Farland (3 x 108 UFC/mL) para
las bacterias y una suspensin de levadura y moho (el inoculo del moho realizarlo en

solucin salina al 0.85% con adicin de tween 80 al 0.05%)

las cuales se llevarn a

recuento en placa para conocer la concentracin de dicho inoculo.

Nota: La suspensin bacteriana y de levadura puede ser almacenada hasta por 24 horas en
refrigeracin antes de ser utilizada en la prueba, la suspensin del moho puede ser almacenada
en refrigeracin hasta 7 das.
Se debe tener en cuenta que el volumen del inoculo empleado debe ser del 0.5 a 1% del
volumen de la muestra y este volumen de inoculo debe asegurar que se presente una
concentracin final de 1x105 a 1x106 UFC/mL de producto (esto para productos de categora 1,
2 3). Para productos de categora 4 la concentracin final debe estar entre 1x103 a 1x104
UFC/mL.

Para llegar a obtener la concentracin requerida en los productos de categora 1, 2, 3, los

recuentos de

levadura y moho deben tener una concentracin del inoculo sea de

aproximadamente 9x107 UFC/mL. Para el caso de las bacterias al tener una concentracin
de 3x 108 UFC/mL en la suspensin inicial tomar 3 mL de la suspensin y llevar a 7 mL de
agua peptonada para obtener una concentracin final de 9 x107 UFC/mL.

Inoculacin Del Producto

En 5 frascos estriles pesar o medir 20g/mL del producto. Rotular cada uno de los frascos
con el nmero de referencia interno de la muestra, fecha y con cada uno de los nombres de
los microorganismos o asignndoles un nmero as:

1 = E. coli
2 = S. aureus
3 = P. aeruginosa
4 = C. albicans
5

=A. niger


A partir de los inoculos de los microorganismos en concentracin 9x107 UFC/mL tomar 0.2
mL y llevar a cada uno de los respectivos frascos. Homogenizar uniformemente el inoculo
sobre la totalidad del producto.

Mediante la adicin de 0.2 mL del inoculo a una concentracin de 9 x 107 UFC/mL se est
obteniendo una concentracin final de 9 x 105 UFC/ mL de producto, requerida para los
productos de categora 1 a 3.

9 x 107 UFC ------ mL

X

------- 0.2 mL(1% del volumen total de producto)

X = 18000000 UFC/0.2mL

18x106 UFC/0.2mL ----- 1 g

X

------ 20g (volumen de producto)

X = 9X105 UFC
Adicionalmente al montaje de la muestra realizar un control positivo. Para esto tomar 5 frascos
con solucin salina estril o caldo tripticasa de soya con un volumen de 20mL e inocular 0.2 mL
de las suspensiones de los microorganismos.

Finalizado el proceso de inoculacin de la muestra tomar tubos de dilucin de 9mL de caldo
Letheen (agente inactivador o neutralizante lecitina), hacer las respectivas diluciones (10-2,
10-3) para realizar recuento en placa y estimar las concentraciones de los microorganismos.
Llevar a incubacin a 35+/-2C durante 24 48 horas para bacterias y 22+/-2C durante 5
das, para mohos y levaduras.

Realizar el mismo procedimiento para el control positivo pero las diluciones deben ser
realizadas en tubos de 9 mL de agua peptonada. Se sugiere realizar diluciones (10-3 y 10-4)

Los frascos con muestra inoculados y el control positivo se deben llevar a incubacin a 22
+/- 2C, durante el periodo establecido segn la categora del producto.

Nota: La periodicidad de siembra se debe realizar en base al tipo de categora del producto (Ver
anexo 1). Para esto se deben tomar los frascos incubados previamente inoculados, se confirma
la concentracin mediante el recuento en placa.
Se debe tener en cuenta que tericamente la concentracin debe disminuir en al menos 1 ciclo
logartmico por lo que las diluciones a servir deben ser inferiores a las realizadas en el da 0.

Reporte de Resultados
Usando las concentraciones calculadas de UFC/cm3 presentes al inicio de la prueba, calcular el
cambio en porcentajes en valores del

log10 de la concentracin de UFC/cm3 para cada

microorganismo a los das de incubacin 7, 14 y 28 das (dependiendo de la categora del

producto). Expresar los cambios en trminos de reducciones logartmicas.
Emitir el concepto de cumplimiento en base al criterio expuesto en la Tabla 1, segn categora
del producto.

4. REFERENCIAS

USP 30. Pruebas de eficacia antimicrobiana. Pgina 85 - 87. Ao 2006.

5. ANEXOS: Criterios para microorganismos evaluados (Tabla 1)

Tabla 1. Criterios para microorganismos evaluados

Categora

Microorganismo

Criterio

Bacterias

los

presentar

das,

se

debe

una

reduccin

logartmica de no menos
de1.0 desde el recuento
calculado en el inicio; a los
14

das,

una

reduccin

logartmica de no menos de
3.0 del recuento inicial; y
ningn

incremento

del

recuento entre los 14 y 28

das.
Levadura y Moho

Ningn incremento a los 7,

14 y 28 das respecto al
recuento inicial.

Bacterias

A los 14 das, una reduccin

logartmica de no menos de
2.0,

desde

el

recuento

inicial; y ningn incremento

del recuento entre los 14 y
28 das.
Levadura y Moho

Ningn incremento a los 14

y

28

das

respecto

al

recuento inicial
3

Bacterias

A los 14 das una reduccin

logartmica de no menos de
1.0 del recuento inicial y
ningn

incremento

del

recuento entre los das 14 y

28.
Levadura y Moho

Ningn incremento a los 14

y

28

das

respecto

al

recuento inicial
4

Bacterias, levadura y moho

Ningn incremento a los 14

y

28

das

recuento inicial

respecto

al

________________________________________________________

NIT 830.101.160830.101.160-5

Bogot, D.C., 06 Junio del 2014

Seores:
SOMINCORP IPS
Dra. Janeth Arias Palacios
Directora Carreras de Microbiologa Industrial
Bogot D.C.

Referencia: Informe de resultados prueba de Challenge Test.

Respetada Doctora:
Adjunto encontrar los resultados microbiolgicos de la muestra enviada para prueba de
efectividad antimicrobiana, el da 29 de Abril de 2014. Certificado de anlisis N M-14-11587.
Esta muestra se analiz siguiendo la metodologa de la USP 30 para Evaluacin microbiolgica
de eficacia antimicrobiana (Challenge Test o Pruebas de desafo).

Cualquier aclaracin o inquietud con gusto ser suministrada.

Cordialmente,
BIOTRENDS LABORATORIOS S.A.S

Fernando Murcia Rubiano

Director Tcnico

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Calle 64H No 71D31 PBX: 4820232-2915105-2915106 Bogot D.C.-Colombia www. biotrendslab.com

830.101.160-5
_________________________________________________________ NIT 830.101.160-

INFORME N M-14-091
ANEXO AL CERTIFICADO DE ANLISIS N. M 14-11587

CLIENTE:
ATENCIN:
DIRECCIN:
TELEFONO:
CIUDAD:
FECHA DE MUESTREO:
FECHA DE RECEPCION:
FECHA DE ANALISIS:
FECHA DEL INFORME:

SOMINCORP IPS
Dra. Janeth Arias Palacios
Calle 50 No 8 - 27 oficina 302
3208320 ext 4076
Bogot D.C.
N.E.
29 de Abril de 2014
29 de Abril de 2014
06 de Junio de 2014

IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA
REF. BIOTRENDS
MUESTRA
LOTE
FECHA DE PRODUCCIN
FECHA DE VENCIMIENTO
FABRICANTE

14-11587
GEL ANTIBACTERIAL Y REPARADOR - OZODERM
G-130801
N.E
01-08-2014
N.E

1. OBJETIVO.
Evaluar la efectividad antimicrobiana del preservante en la muestra mencionada para garantizar que
el producto es microbiolgicamente seguro y estable.
2. METODOLOGA USADA.
El mtodo utilizado es el recomendado por la United States Pharmacopea (USP 30).
Evaluacin a los 0, 14 y 28 das para productos categora 2: Productos de uso tpico con bases o
vehculos acuosos, productos nasales no estriles y emulsiones incluyendo aquellas que se aplican a
mucosas.
3. RESULTADOS OBTENIDOS.
Resultados prueba de Challenge Test (VER ANEXO No 1)
Informe N M - 14-091. Pgina 1 de 3

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830.101.160-5
_________________________________________________________ NIT 830.101.160-

4. SELECCIN DE LOS MICROORGANISMOS

Esta muestra se evalu siguiendo la metodologa de la USP 30 para Evaluacin microbiolgica de eficacia
antimicrobiana (Challenge Test o Pruebas de desafo). Los microorganismos utilizados fueron los
siguientes:

Aspergillus nger ATCC 16404: En la evaluacin se utiliza este microorganismo debido a que los hongos
filamentosos son a menudo agentes causales de dao a productos preservados.

Candida albicans ATCC 10231: En la evaluacin se utiliza este microorganismo debido a su patogenicidad
y porque representa resistencia a los preservativos.

Staphylococcus aureus ATCC 6538: En la evaluacin se utiliza este microorganismo como representante
de cocos gram positivos que son patgenos y estn presentes en la piel y pueden presentar
inconvenientes en los productos cosmticos durante el uso.

Escherichia coli ATCC 8739: En la evaluacin se utiliza este microorganismo como representante de
bacilos gram negativos fermentadores, que son indicadores de contaminacin fecal y de fallas de higiene.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027: En la evaluacin se utiliza este microorganismo debido a su

patogenicidad, a su presencia en diferentes ambientes y adems por su capacidad de proliferar en el agua
y adaptarse a varios sustratos, a su alta resistencia a varios sistemas de preservativos, a su potencialidad
de degradacin del producto, y por ser representativa de fallas de higiene en los procesos de
manufactura.

5. ANALISIS DE RESULTADOS
La muestra que se analiz se expuso a los siguientes microorganismos en las concentraciones
recomendadas:

Aspergillus nger ATCC 16404.

Candida albicans ATCC 10231.

Se encontr una reduccin de 99.10% (2.05 ciclos

logartmicos) a los 14 das de incubacin que se mantuvo hasta los 28 das de incubacin.
De esta manera se cumplen los requisitos de USP 30 que exige que no se presente
incremento del recuento inicial durante el periodo de evaluacin.
Se encontr una reduccin de 99.10% (2.05 ciclos
logartmicos) a los 14 das de incubacin que se mantuvo hasta los 28 das de incubacin. De
esta manera se cumplen los requisitos de USP 30 que exige que no se presente incremento
del recuento inicial durante el periodo de evaluacin.
Informe N M - 14-091. Pgina 2 de 3

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830.101.160-5
_________________________________________________________ NIT 830.101.160

Staphylococcus aureus ATCC 6538. Se encontr una reduccin de 99.10% (2.05 ciclos
logartmicos) a los 14 das de incubacin que se mantuvo hasta los 28 das de incubacin.
Cumpliendo con los requisitos de reduccin segn USP 30, en el que se debe presentar una
reduccin de bacterias del 99% a los 14 das de incubacin y mantenerse en este margen
luego de 28 das de estudio.

Escherichia coli ATCC 8739. Se encontr una reduccin de 99.10% (2.05 ciclos
logartmicos) a los 14 das de incubacin que se mantuvo hasta los 28 das de incubacin.
Cumpliendo con los requisitos de reduccin segn USP 30, en el que se debe presentar una
reduccin de bacterias del 99% a los 14 das de incubacin y mantenerse en este margen
luego de 28 das de estudio.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Se encontr una reduccin de 99.10% (2.05 ciclos
logartmicos) a los 14 das de incubacin que se mantuvo hasta los 28 das de incubacin.
Cumpliendo con los requisitos de reduccin segn USP 30, en el que se debe presentar una
reduccin de bacterias del 99% a los 14 das de incubacin y mantenerse en este margen
luego de 28 das de estudio.

6. CONCLUSIONES.
Despus de observar el comportamiento microbiolgico de la muestra con el preservante, se concluye que
el sistema preservante es efectivo frente a la eliminacin de microorganismos, contribuyendo as con la
proteccin, estabilidad microbiolgica y seguridad del producto, favoreciendo a futuro la vida til de este
y garantizando su buen desempeo durante su vida de estantera.

Cordialmente,
BIOTRENDS LABORATORIOS S.A.S

Fernando Murcia Rubiano

Director Tcnico

Analizado por: C 22
Revisado por: C 26
Informe N M - 14-091. Pgina 3 de 3

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830.101.160-5
_________________________________________________________ NIT 830.101.160ANEXO 1: REPORTE DE RESULTADOS - CERTIFICADO DE ANALISIS No: M-14-11587
PRUEBAS DE EFICACIA ANTIMICROBIANA (CHALLENGE TEST)

SOMINCORP IPS
MUESTRA
A. niger
C. albicans
S. aureus
E. coli
Ps. aeruginosa

MUESTRA
Aspergillus niger
Candida albicans
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa

MUESTRA
Aspergillus niger
Candida albicans
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa

0 das
10E+02
10E+02
10E+02
10E+02
10E+02

RECUENTOS
14 das
09E+00
09E+00
09E+00
09E+00
09E+00

28 das
09E+00
09E+00
09E+00
09E+00
09E+00

0 das
NA
NA
NA
NA
NA

% DE REDUCCIN
14 das
99,10
99,10
99,10
99,10
99,10

28 das
99,10
99,10
99,10
99,10
99,10

0 das
NA
NA
NA
NA
NA

REDUCCIN EN CICLOS LOG

14 das
2,05
2,05
2,05
2,05
2,05

28 das
2,05
2,05
2,05
2,05
2,05

0 das
02E+06
05E+06
04E+06
04E+06
04E+06

RECUENTOS
14 das
10E+08
26E+08
02E+10
01E+10
83E+08

28 das
45E+08
03E+10
03E+10
12E+10
03E+10

CICLOS LOG

99

CONTROL
SOLUCIN SALINA 0,85%
A. niger
C. albicans
S. aureus
E. coli
Ps. aeruginosa

REQUISITOS DE REDUCCIN (14 DAS)*

USP 30

Bacterias
Mohos y
levaduras

No incremento en los 28 das

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