Bioqumica I

Autores:

Elena Benavides Rivera

Juan Salazar Snchez

Lima Per
2015-II

~1~

GUA DE PRCTICAS DE BIOQUIMICA I

Derechos Reservados 2012
rea de Qumica

Segunda Edicin
Primera reimpresin

Diseo, Diagramacin e Impresin

Universidad Cientfica del Sur
Panamericana Sur Km. 19. Lima-Per 610-6400

Tiraje 1500 ejemplares

IMPRESO EN PER

~2~

MBA Rolando Vallejo Cortz

Vicepresidente Ejecutivo
Dra. Josefina Takahashi
Rectora
Dr. Edmundo Gonzales
Vicerrector Acadmico
Dra. Mara Pa Sirvent De Luca
Directora de Gestin Acadmica
M Sc. Alejandro Fukusaki
Coordinador de Cursos Bsicos de Ciencias
Q.F. Juan Salazar Snchez
Coordinador de rea Qumica
Autores
Dra. Elena Benavides Rivera
Q.F. Juan Salazar Snchez

Reservados todos los derechos: ningn material de este manual puede ser reproducido sin autorizacin expresa por escrita por los
autores. La autorizacin ser en hoja aparte y firmada y adosada a este material. Todo compromiso suscrito aparte, no se refiere a este
manual. Queda exento del compromiso, el fotocopiado interno en una cantidad no mayor de 100, solo para uso con fines educativos y
sin lucro

~3~

Me lo contaron y lo olvid, lo vi y lo entend, lo hice y lo aprend

Confucio

INDICE
Pgina
Prctica 1. Espectrofotometra

Prctica 2 . Preparacin de soluciones amortiguadoras

Prctica 3. Factores que afectan la Velocidad de Reaccin Enzimtica

Prctica 4. Digestin Enzimtica del Almidn

13

Prctica 5. Determinacin de cido rico en suero sanguneo

15

Prctica 6. Evaluacin de la Glicemia

17

Prctica 7. Balance Energtico / Evaluacin parcial de prctica.

19

Prctica 8. Efecto del ayuno sobre el contenido de glucgeno heptico

27

Prctica 9. Hidrlisis enzimtica de los lpidos

29

Prctica 1 0 . Determinacin de triglicridos y colesterol en plasma

31

Prctica 1 1 .

Determinacin

de Vitamina C en alimentos vegetales

35

Prctica 1 2 . Determinacin de protenas plasmticas

39

Prctica 1 3 . Determinacin de Hemoglobina, Determinacin de Urea en orina

41

SISTEMA DE EVALUACION:
EL ESTABLECIDO EN EL SYLLABUS POR COMPETENCIA

~4~

~5~

Entre los diversos mtodos de anlisis de tipo cuantitativo que se utilizan para la
determinacin de molculas o elementos constitutivos de los organismos se encuentra
la espectrofotometra, que utiliza la medicin de la intensidad de la luz transmitida
y/o absorbida, a determinada longitud de onda, por compuestos qumicos en solucin.
El paso de un haz de luz de una longitud de onda determinada a travs de una
solucin es reflejada en parte, mientras que la mayor fraccin de esta es absorbida por
la sustancia disuelta. La absorcin es proporcional a la concentracin del soluto.
La propiedad de una sustancia para absorber radiacin de una determinada longitud
de onda es dependiente de su estructura qumica. La ley de Lambert y Beer expresa las
relaciones antes mencionadas mediante la siguiente ecuacin:

Long

Io
--------- = .l.c.
It

Io = Luz incidente
It = Luz transmitida
= Coeficiente de extensin c= concentracin de la solucin
l = Distancia recorrida por la luz a travs de la solucin.
El log Io/It tambin se conoce como densidad ptica (D.O.) absorbancia de la solucin
y es directamente proporcional a la concentracin del soluto.
Para determinar la concentracin de una determinada sustancia puede hacerse uso del
factor de calibracin o de una curva de calibracin.
La preparacin de una curva de calibracin se realiza utilizando concentraciones
conocidas de la sustancia cuya concentracin deseamos conocer. Luego se determina
la absorbancia de cada una de dichas concentraciones y se procede a preparar un
grfico, donde en el eje de abscisas se disponen las concentraciones de la sustancia y
en el eje de ordenadas la absorbancia.
Factor de Calibracin.Se define como la relacin que existe entre la concentracin del estndar y su
respectiva absorbancia. Este factor puede obtenerse de la manera siguiente:

Factor de calibracin =

Concentracin de estndar
---------------------------------------Absorbancia

La concentracin del estndar pude expresarse como: mg/dL, ug/dL, mEq/L, U/L,
etc. Para encontrar la concentracin de una sustancia problema se multiplica el factor
de calibracin por la Absorbancia del problema, operacin que se realiza de acuerdo al
siguiente procedimiento.

~6~

Experimento 1: Preparacin de una curva de Absorcin

Para elaborar una curva de absorcin se preparar el siguiente sistema:
Solucin de azul de metileno (10 mg/dL) 1 mL.
Agua destilada
4 mL.
Luego se proceder a realizar lecturas en el espectrofotmetro a las siguientes
longitudes de onda: 560, 580, 600, 620 640, 660, 680 y 700 nm.
Graficar utilizando papel milimetrado las absorbancias en funcin de las longitudes de
onda y determinar el pico de mxima absorcin del azul de metileno, el cual
corresponde al mayor valor de la absorbancia.

Experimento 2: Preparacin de una curva de calibracin

Preparar un experimento de la siguiente manera:
Tubo N

0.5

4.5

Reactivos
mL Azul de metileno (10mg/dL)
mL Agua destilada

Con agua destilada llevar el espectrofotmetro a cero

Luego leer los tubos a una longitud de onda de 660 nm.
Graficar en un papel milimetrado los resultados, disponiendo las concentraciones en el
eje de abscisas y las absorbancias en el eje de las ordenadas, luego trazar una recta a
travs de los putos obtenidos experimentalmente.
Utilizando la curva de calibracin o el factor de calibracin determinara la
concentracin de la sustancia problema que recibirn en la presente prctica.

~7~

~8~

~9~

El poder amortiguador de los cambios de pH en un determinado sistema; es una expresin

simple de reacciones fundamentales reversibles que se establecen en el equilibrio y que se
basan en la teora cido-base. Nuestro organismo cuenta con sistemas amortiguadores tanto
intracelular como extracelular:

1. Ecuacin de Henderson-Hasselbach
La ecuacin de Henderson-Hasselbach, ha sido derivada de la Ley de accin de masas de
Gulberg y Waage, del concepto de constante de equilibrio y de la ionizacin de cidos y
bases dbiles. Se utiliza para calcular el pH terico de una mezcla de cidos dbiles y sus
sales.
Para el siguiente sistema en equilibrio:
HA(ac) <====> (H)1+(ac) + A1(ac)

Calculando Ka para el cido dbil, HA:

Ka

H1

A1
HA

Despejando la concentracin de iones hidrgeno se tiene:

H1

HA Ka
A1-

Aplicando logaritmo y multiplicando por (-1), se obtiene:

log H1

- log Ka

HA
- log 1-
A

Reemplazando:

pH = pKa + log

A1
HA

Expresin conocida como ecuacin de Henderson-Hasselbach, para un cido dbil.

~ 10 ~

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO 1.- DETERMINAR el pH TERICO y PRCTICO en las

SIGUIENTES SOLUCIONES:
NaOH 0,01 M
HCl 0,01 M
CH3COOH 0,1 M
NH4OH 0,1 M
NH4Cl 0,1 M
Determinar el valor del pH terico segn la ecuacin de Henderson-Hasselbach.
Tomar 10 mL de cada solucin y determinar el valor del pH prctico utilizando el
pH-metro.

EXPERIMENTO 2.-

INFLUENCIA DEL pH EN LA SOLUBILIDAD DE

SUSTANCIAS ORGNICAS SOLUBILIDAD DEL
BENZOATO DE SODIO
En un vaso de precipitados de 100 mL de capacidad disolver 10 mg de benzoato de
sodio con 10 mL de agua destilada, inmediatamente medir su pH, luego adicionar 5
gotas de HCl concentrado agitar y observar. Medir nuevamente el pH de la
solucin final.

EXPERIMENTO 3.- NATURALEZA AMORTIGUADORA de la ALBMINA

Preparar 4 tubos de prueba con los siguientes reactivos:
Tubo 1.- 1 gota de HCl 0,1 M + 1 gota de anaranjado de metilo + 2 mL de H20
Tubo 2.- 1 gota de HCl 0,1 M + 1 gota de anaranjado de metilo + 2 mL de H20
Tubo 3.- 1 gota de NaOH 0,1 M + 1 gota de fenolftalena + 2 mL de H20
Tubo 4.- 1 gota de NaOH 0,1 M + 1 gota de fenolftalena + 2 mL de H20
A los tubos 1 y 3 agregar 3 mL de solucin de albmina, agitar y observar.
A los tubos 2 y 4 agregar 3 mL de H2O, agitar y observar.
Explicar sus resultados.

~ 11 ~

~ 12 ~

~ 13 ~

Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que tienen la propiedad de acelerar las
reacciones qumicas sin modificar la constante de equilibrio del sistema. Su actividad es
afectada por diversos factores: concentracin de sustrato, pH, concentracin de enzima,
temperatura, inhibidores, fuerza inica, constante dielctrica, etc.

Efecto de la concentracin del sustrato

La velocidad de una reaccin catalizada por enzimas es dependiente de la concentracin del
sustrato. Esta dependencia es lineal cuando la concentracin de sustrato es menor que el valor
Km, perdindose esta relacin cuando la concentracin es muy cercana a Km, para finalmente
tornarse independiente de la concentracin de sustrato.
El experimento se realizar utilizando la enzima Fosfatasa cida de hgado de pollo, enzima que
tiene la propiedad de hidrolizar el p-nitrofenil fosfato en medio cido formando como productos
de la reaccin fosfato inorgnico y p-nitrofenol. Este ltimo compuesto absorbe a 405 nm. Con
tal propsito se prepararn los siguientes medios de reaccin:

mL. Tampn citrato

0.1M pH 5.0
mL. p-nitrofenil
fosfato 0.001 M
mL. p-nitrofenil
fosfato 0.01 M
mL. agua destilada

B-1

B-2

B-3

B-4

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

0.2

0.2

0.4

0.4

----

----

----

----

----

----

----

----

0.1

0.1

0.2

0.2

0.8

0.7

0.6

0.5

0.9

0.8

0.8

0.7

Colocar los tubos en bao mara a 37 C durante 2 minutos, luego adicionar la enzima conforme
se indica a continuacin:

mL. de enzima

----

0.1

----

0.1

----

0.1

----

0.1

Detener la reaccin EXACTAMENTE a los 2 minutos, mediante la adicin de 1 mL de NaOH 1

N. Leer en el espectrofotmetro a 405 nm

Determinar la velocidad de reaccin de cada uno de los tubos y luego graficar:

a.- velocidad en funcin de la concentracin de sustrato.
b.- 1/v versus 1/[S].
c.- Calcular los valores de Vmax y Km de la enzima.
Determinar la velocidad mxima y el Km de la enzima utilizando ambos grficos.

~ 14 ~

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA

La velocidad de una reaccin enzimtica depende directamente de la concentracin de enzima.
Los experimentos deben realizarse en condiciones de velocidad inicial. Para este propsito se
preparan los siguientes medios de reaccin:

mL. de tampn citrato 0.1 M pH 5.0

mL. p-nitrofenil fosfato 0.01 M
mL. agua destilada

1.0
0.2
0.8

1.0
0.2
0.75

1.0
0.2
0.7

1.0
0.2
0.65

Los tubos de ensayo se incubarn durante 2 minutos a 37 C a cuyo trmino se adicionar la

enzima, que dar inicio a la reaccin.

mL. de enzima

----

0.05

0.1

0.15

Se colocarn nuevamente los tubos en el bao mara durante 2 minutos EXACTAMENTE y se

detendr la reaccin mediante la adicin de 1 mL de NaOH 1 N. Se leern las densidades
pticas a 405 nm.
Graficar la actividad enzimtica o la velocidad de la reaccin en funcin de la concentracin de
enzima expresada como mL de enzima.

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.El pH del medio de reaccin afecta la velocidad con que una enzima cataliza una reaccin. La
variacin en la velocidad de catlisis ocurre debido a que el pH puede afectar la estabilidad de la
enzima, los grupos ionizables en la enzima, los grupos ionizables del sustrato, etc. Con la
finalidad de observar este efecto se prepararn los siguientes medios de reaccin:

pH

mL. tampn citrato 0.1M

mL. p-nitrofenil fosfato 0.01M 0.2
mL. de agua destilada

3.0
1.0
0.2
0.7

4.0
1.0
0.2
0.7

5.0
1.0
0.2
0.7

6.0
1.0
0.2
0.7

7.0
1.0
0.7

Colocar los tubos en el bao mara a 37 C durante 2 minutos e iniciar la reaccin mediante la
adicin de la enzima:
mL. de enzima

0.1

0.1

~ 15 ~

0.1

0.1

0.1

La reaccin se detiene transcurrida EXACTAMENTE 2 minutos, mediante la adicin de 1 mL

de NaOH 1 N, luego leer en el espectrofotmetro a 405 nm.
Graficar actividad enzimtica en funcin del pH.

~ 16 ~

~ 17 ~

El almidn constituye un importante componente de la dieta de los seres humanos. El proceso

de digestin de este nutriente se inicia en la cavidad oral, lugar en que acta la alfa-amilasa
salivar, enzima que tiene la propiedad de hidrolizar los enlaces alfa 1,4 del almidn y formar
polisacridos de menor peso molecular.

HIDROLISIS DEL ALMIDON POR LA AMILASA SALIVAR

Para realizar el experimento se prepararn los siguientes medios de reaccin:

1
mL.
mL.
mL.
mL.

tampn fosfato 0.1 M pH 6.5

de almidn al 1%
cido clorhdrico 0.5 N
de agua destilada

1.0
2.0
--2.0

1.0
2.0
--1.5

1.0
2.0
1.5
---

Colocar los tubos de ensayo en el bao mara a 37 C durante 2 min, luego adicionar:

mL. solucin de saliva

---

0.5

0.5

Colocar nuevamente los tubos en bao mara y sacar alcuotas de 0.5 mL. de cada uno de los
tubos a los 5, 10, 15 y 20 minutos, y adicionarlos a los tubos previamente preparados que
contienen 2.0 mL de cido clorhdrico 0.05 N, de acuerdo al siguiente esquema:
Tubo N
mL de cido clorhdrico

1
2.0

2
2.0

3
2.0

Luego adicionar a cada tubo:

Gotas de solucin de Lugol

I gota

I gota

1 gota

Dejar en reposo durante 1 minuto y observar el color formado.

Durante el desarrollo del experimento se observarn modificaciones del color inicial de los
tubos como consecuencia de la accin de la alfa-amilasa salivar.
El experimento concluye cuando uno de los tubos muestre un color pardo claro.

~ 18 ~

~ 19 ~

El cido rico es un compuesto que se forma en el organismo como producto de excrecin de

las purinas. Los niveles sricos se encuentran elevados en diversas enfermedades tales como:
insuficiencia cardiaca crnica, leucemia, gota, sndrome de Lesch-Nyhan, etc.

Determinacin enzimtica de cido rico en suero:

La determinacin de cido rico en suero se realiza utilizando dos enzimas, la uricasa que
transforma el cido rico en alantona y la enzima peroxidasa,
que en presencia de 4aminofenazona forma quinonimina de color rojo.

Uricasa
cido rico

2H2O

2 H2O2

4-AF

O2

Alantona

H2O2

CO2

POD
+

Quinonimina roja

Preparar lo siguientes medios de ensayo:

St

Suero o plasma

-----

20 u L

-----

Estndar

-----

-----

20 u L

Reactivo de Trabajo (mL)

1.0

1.0

1.0

Mezclar suavemente e incubar durante 5 minutos en bao mara a 37 C. Enfriar y leer la

densidad ptica en el espectrofotmetro a 505 nm.
Valores de referencia:
Hombres: 2 . 5 6.0 mg/dL
Mujeres: 2 . 0 5.0 mg/dL

~ 20 ~

~ 21 ~

~ 20 ~

La glucosa es una sustancia cuyos niveles en la sangre pueden constituir un indicio, que podra
permitir diagnosticar diversas patologas: diabetes mellitus, mixedema, hipopituitarismo, etc.

Determinacin enzimtica de glucosa en sangre (Mtodo de Trinder).

La determinacin enzimtica de glucosa sangunea se realiza utilizando 2 enzimas: glucosa
oxidasa y peroxidasa, cuyas acciones catalticas en presencia de apropiados reactivos qumicos,
permitirn la formacin de un compuesto coloreado que es directamente proporcional a la
glucosa existente en el medio de reaccin.
Glucosa oxidasa
Glucosa + H2O + 02

Acido glucnico + H2O2

Peroxidasa

2 H2O2 + 4-AF + fenol

quinona coloreada + 4 H2O

Preparar los siguientes medios de ensayo:

Suero o plasma
Standard
Reactivo de trabajo (mL)

St

------2.0

20 u L
---2.0

---20 u L
2.0

Incubar en bao mara a 37 C durante 10 minutos y leer en el espectrofotmetro a 505 nm.

~ 21 ~

~ 22 ~

~ 23 ~

El Balance Energtico es el equilibrio que debe existir entre el Gasto Energtico diario de un
individuo, de acuerdo a su metabolismo basal, edad, sexo y actividad fsica, y

la Ingesta

Energtica diaria a travs de los macronutrientes de los alimentos consumidos.

Si predomina el gasto energtico sobre la ingesta energtica, en un tiempo prolongado, el

individuo tiende a perder sus reservas, y como consecuencia se adelgaza. Por otro lado, si
predomina la ingesta, el exceso de energa se acumular en el cuerpo, en forma de triglicridos,
en el tejido adiposo, observndose un aumento de peso.

Para realizar este balance, es necesario calcular, en forma independiente,

el Gasto Energtico

en las 24 horas de cualquier da rutinario, de acuerdo a la Tasa Metablica Basal (TMB) y la

Actividad Fsica realizada, luego compararlo

con la Ingesta Energtica que proporcionaron los

alimentos consumidos el mismo da, utilizando la Tabla de Composicin

Qumica

de

los

Alimentos de Mayor Consumo en el Per, Tabla de Medidas Caseras, y los Factores de

Conversin de Peso de Alimentos Cocidos a Crudos.

OBJETIVOS:

1. Calcular las propias Necesidades Energticas (Gasto Energtico) del alumno.

2. Calcular la Ingesta Energtica del alumno.
3. Establecer el Balance Energtico.

MATERIALES:
Calculadora electrnica de bolsillo.
Lista detallada de las actividades realizadas durante las 24 horas, de un da rutinario
(6:00 a m - 6:00 a m).
Lista detallada de alimentos consumidos durante las 24 horas del mismo da.
Peso real actual.

PROCEDIMIENTO:

1. Calcular la Ingesta Energtica, utilizando:

1.1. La Tabla de Trabajo.
1.2. Listado de alimentos consumidos en 24 horas.

~ 24 ~

1.3. Tabla de medidas caseras (ANEXO N1).

1.4. Tabla de Factores de Conversin de peso de alimentos cocidos a crudos (ANEXO N2).
1.5. Tabla de Composicin Qumica de Alimentos de mayor consumo en el Per (ANEXO
N3 y N4).

2. Calcular el Gasto Energtico, utilizando:

2.1. Ecuaciones para calcular la Tasa de Metabolismo Basal (TMB) de la Tabla N1.
2.2. Tabla de Categoras y Factores de la Actividad Fsica (Tabla N2).
3. Calcular el Balance Energtico:

Balance Energtico = Ingesta Energtica - Gasto Energtico

4. Obtener la respuesta respetando el signo (+) (exceso) (-) (dficit)

4.1. EQUILIBRIO:

Ingesta Energtica = Gasto Energtico.

4.2. BALANCE (+): Ingesta Energtica

Gasto Energtico.

4.3. BALANCE (-): Ingesta Energtica

Gasto Energtico.

5. Calcular el Porcentaje de Adecuacin de la Dieta:

% de Adecuacin = (Energa ingerida / Energa requerida (*)) x 100

(*) Gasto Energtico = Necesidades energticas Energa requerida.

6. Analizar el Porcentaje de la Adecuacin de la Dieta obtenido, segn los siguientes

parmetros:

6.1 Valores normales =

90 - 110%.

6.2 Dficit

90%

6.3 Exceso

110%

CLCULO DE LA INGESTA ENERGTICA

a) En la lista de consumo de alimentos, desglosar las preparaciones de todo el da en cada uno

de sus constituyentes. En columnas ordenadas calcular mediante regla de tres el contenido de
protenas, grasas y carbohidratos de cada alimento respectivamente, segn la cantidad que se
haya consumido.

Ejemplo1: ingesta de leche fluida de vaca = 250 mL.

Leche fluida de vaca: protenas en 100 mL

3.1 g

Para calcular la cantidad de protena que existe en 250 mL de leche fluida de vaca:

~ 25 ~

100 mL. de leche --------- 3.1 g de protena

250 mL.

--------

X X = 250 x

3.1 / 100
X = 7,75 g de protenas

Ejemplo2: Ingesta de pulpa de carne de vacuno = 90 g.

Pulpa de carne de vacuno: protenas en 100 g de porcin comestible.

21.3 g.

Para calcular la cantidad de protena que existe en 90 g de pulpa de carne de vacuno:

100 g. de pulpa de carne de vacuno(*) --------- 21.3 g. de protena
90 g.

---------

X = 90 x 21.3 / 100
X = 19.17 g de protenas

(*) La tabla de Composicin

qumica

de los alimentos indica los valores en 100 g de

porcin comestible cruda (a menos que indique los valores en cocido).

b) Totalizar luego cada una de las tres columnas, y el valor obtenido en gramos de cada
macronutriente se multiplica por el factor respectivo.
Protena

4,0 kcal.

Grasa

9,0 kcal.

Carbohidrato

4,0 kcal.

c) Sumar los totales, y el resultado

obtenido

corresponde a la cantidad de energa

(Kilo/caloras) que aportaron los alimentos consumidos ese da.

TABLA DE TRABAJO

Alimentos

Cantidad en
medida casera

Cantidad
(g)

Protenas (g)

Grasas
(g)

Desayuno
Almuerzo

Comida
Entre
comidas
Sub-total:
Factor:

x4

~ 26 ~

x9

x4

Carbohidratos (g)

TOTAL
: (kilo/caloras)
INGESTA ENERGTICA = (kcal)/d

CLCULO DEL GASTO ENERGTICO

G.E. = TMB

Factor de Actividad

a) Se calcula la Tasa Metablica Basal (TMB) o gasto en reposo, aplicando la

frmula de la siguiente tabla.

TABLA N1

Ecuaciones para calcular la Tasa de Metabolismo Basal (TMB) a partir del peso corporal (P)

Rango de edad (aos)

kcal/da

Hombres:
0 -3

60,9 P - 54

3 - 10

22,7 P + 495

10 - 18

17,5 P + 651

18 - 30

15,3 P + 679

31 - 60

11,6 P + 879

> 60

13,5 P + 487

Mujeres:
0-3

61,0 P - 51

3 - 10

22,5 P + 499

10 18

12,2 P + 746

18 - 30

14,7 P + 496

30 - 60

8,7 P + 829

> 60

10,5 P + 596

OMS(1985)
Ejemplo: La TMB para una estudiante de 19 aos de edad , con 55 kg. de peso, ser:
TMB = 14.7 P + 496

~ 27 ~

TMB = 14.7

55 + 496

TMB = 1 305 kcal/d

b) Con la lista de actividades,

se agrupan stas por categoras, tomando en cuenta el tiempo

empleado (en minutos) y multiplicndolas por el mltiplo de la TMB o factor de actividad

(o gasto de energa promedio por actividad).
Las categoras de actividad fsica son las siguientes:

TABLA N2

Actividad Fsica

Categora

Mltiplo de la TMB o
Factor por actividad

Dormir, descansar.
Manejando

automvil,

escribiendo

mquina,

Reposo

1,0

Muy ligera

1,5

Ligera

2,5

Moderada

5,0

Pesada

7,0

atendiendo clase, trabajando en laboratorio, viendo TV,

cocinando,

planchando,

jugando

cartas,

tocando

un

instrumento musical .
Caminando a 4 - 5 km/h,
limpieza

de la

casa,

atendiendo al pblico,

cuidando

nios,

trabajo

de

carpintera y electricidad, jugar tenis de mesa.

Caminando a 5.5 - 6.5 km/h ,Manejando bicicleta,
bailando,

trabajando

en jardinera,

cargando

bultos

pesados.
Jugando ftbol, vley, bsquet, caminando con carga
pesada cuesta arriba, cortando rboles, trabajo de
excavacin manual.
* Asignar 1/3 de hora para el mantenimiento cardiovascular y muscular.
Recomendacin FAO/OMS 1985.
Ejemplo:

1) Ordenar las actividades de acuerdo al tiempo empleado:

HORA

ACTIVIDAD

TIEMPO

06:00 a.m. a 06:15 a.m.

Aseo personal

15

06:15 a.m. a 06:45 a.m.

Tomar desayuno

30

06:45 a.m. a 07:00 a.m.

Caminar para tomar el bus

15

~ 28 ~

07:00 a.m. a 08:00 a.m.

Viajar en bus

60

08:00 a.m. a 10:00 a.m.

Asistir a clase

120

etc. (Debe completar 1440 minutos).

2) Agrupar por categora de actividad:

Categora de actividad

Tiempo
empleado

Mltiplo de la TMB
o

factor por

Factor de TMB
ponderado

(Horas)

actividad

En reposo

1,0

8,0

Muy ligera

14

1,5

21,0

Ligera

2,5

5,0

TOTAL

34,0

Promedio / hora

1.417

(Factor de TMB/ 24 h)
Gasto Energtico

1 850,0

(1.417 x TMB)*
GASTO ENERGTICO = 1.417 TMB
= 1.417 1 305
GASTO ENERGTICO = 1 850,0 kcal/d

~ 29 ~

~ 30 ~

~ 31 ~

El hgado es el rgano que almacena glucgeno como un elemento de particular importancia

energtica, que le permite al organismo mantener la glicemia durante los periodos en que no
ingiere alimentos. A diferencia del tejido muscular, el hgado puede degradar el glucgeno y
liberar glucosa a la sangre.

Extraccin de glucgeno de hgado de rata.Preparacin de los animales de experimentacin.- Se dispondrn de 2 ratas en jaulas
individuales, una de las cuales recibir su dieta habitual, mientras que la otra ser sometida a un
ayuno de 24 horas. A ambas se les proporcionar agua "ad libitum".
Extraccin del glucgeno.- Se sacrificarn ambos animales previamente anestesiados
con cloroformo y se proceder a extraerles el hgado. Luego, se realizar una observacin del
tamao y color del mencionado rgano. Se pesar 0.5 g de hgado de cada animal se colocarn
en tubos de boca ancha. y se les adicionar 1 mL de KOH al 30%. Se colocar en la boca de
cada tubo un embudo pequeo y se les someter al bao mara hirviente durante 30 minutos.
Despus de enfriar, se les adicionar 3 mL de agua destilada y 5 mL de alcohol etlico. Se
formar
precipitado en aquel hgado que contenga glucgeno. Se centrifugar durante 10
minutos a 3000 rpm a cuyo trmino se eliminar el sobrenadante. Disolver el precipitado en 200
mL de agua destilada. La determinacin del glucgeno se realizar con la antrona.

Se prepararn los siguientes medios de reaccin:

mL disolucin rata en ayunas

disolucin rata normal
mL estndar de glucosa (5mg/dL)
mL agua destilada

1.0
-------

--1.0
-----

----1.0
---

4
--- mL
----1.0

Colocar los tubos en agua helada y adicionar 5.0 mL del reactivo de antrona. Llevar los tubos al
bao mara durante 15 minutos, enfriar y leer a 660 nm.

~ 32 ~

~ 33 ~

~ 34 ~

Hidrlisis de los lpidos por la lipasa pancretica.Los lpidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por accin de la lipasa pancretica.
En este proceso juegan un papel muy importante las sales biliares, compuestos que tienen la
propiedad de emulsionar los lpidos para una eficiente accin de la lipasa pancretica.
Con la finalidad de mostrar experimentalmente la accin hidroltica de esta enzima se
prepararn los siguientes medios de reaccin:

mL. de tampn fosfato 0.1 M pH 7.8

mL. de aceite
mL. de sales biliares al 1%
mL de agua

B
2.0
1.0
2.0
5.0

1
2.0
1.0
2.0
---

2
2.0
1.0
--2.0

3
--1.0
2.0
2.0

Aadir II gotas de fenolftalena a cada uno de los tubos, luego adicionar gota a gota una
solucin de NaOH 0.05N hasta que aparezca una coloracin dbilmente grosella estable, luego
adicionar:
mL. de solucin de pancreatina al 1%

---

5.0

5.0

5.0

Volver a incubar los tubos a la misma temperatura durante 1 hora, agitndolos cada 5 minutos.
Al finalizar el tiempo de incubacin adicionar nuevamente a cada tubo II gotas de
fenolftalena y proceder a titular, utilizando una bureta, con una solucin de NaOH 0.05 N
hasta que aparezca nuevamente la coloracin ligeramente grosella.
Los resultados se expresarn como miliequivalentes de cido esterico liberado por accin de la
lipasa pancretica.

~ 35 ~

~ 36 ~

~ 37 ~

La determinacin de triglicridos en plasma constituye un dato muy importante en el manejo de

ciertas dislipidemias. Su incremento en el plasma constituye un factor de riesgo positivo para
aterosclerosis.

Determinacin de triglicridos en plasma

Los triglicridos del plasma son hidrolizados por una lipoprotena lipasa (LPL) que forma como
productos glicerol y cidos grasos. El glicerol en presencia de ATP por accin de la glicerol
quinasa es convertido en glicerol-1-fosfato, compuesto que es convertido por la glicerol fosfato
oxidasa (GPO) en dihidroxiacetona fosfato y perxido de hidrgeno, este compuesto en
presencia de 4-aminofenazona (4-AF), clorofenol y peroxidasa (POD) es transformado en una
quinonimina de color rojo.
LPL
Triglicridos

cidos grasos

Glicerol

Glicerol quinasa
Glicerol

ATP

ADP

Glicerol-1-fosfato

GPO
Glicerol-1-fosfato

O2

Dihidroxiacetona fosfato

+ H2O2

POD
2 H2O2

4-AF

clorofenol

Quinonimina roja

B
Suero o plasma
Standard
Reactivo de Trabajo

--- -

20 u L
---2 mL

St
----

---2 mL

20 u L
2 mL

Mezclar e incubar durante 5 minutos en bao mara a 37 C, luego leer en el espectrofotmetro a

505 nm.

Determinacin de colesterol total

El colesterol es una sustancia cuyos niveles en la sangre mantienen una estrecha relacin con
diversas patologas, por cuyo motivo su determinacin puede contribuir al diagnstico de:
aterosclerosis, mixedema, diabetes mellitus, nefrosis, hipertiroidismo, etc.

Determinacin de colesterol total en sangre

La tcnica utilizada para la determinacin se fundamenta en la hidrlisis previa de los steres
de colesterol por la colesterol esterasa, la posterior accin de la enzima colesterol oxidasa que
formar perxido de hidrgeno en cantidades estequiomtricas y finalmente la participacin de

~ 38 ~

la peroxidasa que en presencia de reactivos qumicos formar un compuesto coloreado

proporcional a la cantidad de colesterol existente en la muestra de sangre.

Colesterol esterasa
Esteres de colesterol + H2O

Colesterol + AGNE

Colesterol oxidasa
Colesterol + O2

colesten-3-ona + H2O2

Peroxidasa
2 H2O2 + 4-AF + fenol

quinona coloreada

4 H2O

Preparar el siguiente sistema:

B
Suero o plasma
Standard
Reactivo de trabajo (mL)

------2.0

20 uL
---2.0

St
---20 u L
2.0

Incubar durante 5 minutos en bao mara a 37 C y leer en el espectrofotmetro a 505 nm.

~ 39 ~

~ 40 ~

~ 41 ~

La vitamina C es un compuesto que el ser humano debe ingerir necesariamente en su dieta

habitual, debido a que no dispone de las enzimas necesarias para sintetizarlo, como ocurre en las
ratas.

Determinacin de vitamina C en frutas ctricas

La vitamina C puede determinarse cuantitativamente utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu,
para cuyo propsito se proceder de la siguiente manera:
Preparacin de la muestra.Se proceder a extraer el jugo de una fruta ctrica como el limn o la naranja y se proceder a
diluirlo al 1/2 con cido tricloroactico al 10%, luego se filtrar y centrifugar a 2500 rpm
durante 10 minutos.
Para la determinacin cuantitativa de vitamina C se proceder de la siguiente manera:

St

mL. del jugo de fruta diluido

---

0.1

---

mL. del reactivo de Folin-Ciocalteu al 10%

0.2

0.2

0.2

mL. de estndar de cido ascrbico (0.1 mg/mL)

---

---

0.1

mL. de agua destilada

1.8

1.7

1.7

Dejar en reposo durante 10 minutos y proceder a leer en el espectrofotmetro a 750 nm.

Para realizar los clculos es necesario considerar la dilucin de la muestra problema.

Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la vitamina C en frutas.En un tubo de cultivo con tapa rosca medir 2 mL del jugo de fruta diluido y luego colocarlo en
un bao mara a 100 C. Determinar el contenido de vitamina C de acuerdo a la tcnica antes
descrita a los 20 minutos y luego a los 40 minutos de incubacin, para cuyo propsito se
tomarn alcuotas de 0.1 mL.
En un papel milimetrado graficar el % del contenido de vitamina C en funcin del tiempo el
logaritmo del porcentaje de vitamina C remanente en funcin del tiempo.

~ 42 ~

36

~ 43 ~

~ 44 ~

Las protenas plasmticas cumplen diversas funciones que son muy importantes para un
apropiado funcionamiento de los diversos tejidos del organismo. Pueden cumplir funciones de
transporte, catalticas, coagulacin, etc. Su determinacin cuantitativa es muy til para el
diagnstico de algunas patologas como: desnutricin, deshidratacin, cirrosis, etc.

Determinacin de protenas plasmticas total (Mtodo de Biuret):

La determinacin de las protenas totales se realiza utilizando iones cpricos que en medio
alcalino reacciona con las protenas formando compuestos de coordinacin de color violeta,
cuyo pico de mxima absorcin es de 540 nm y su intensidad es proporcional a la concentracin
de protenas.
Preparar los siguientes medios de reaccin:

B
Agua destilada
Suero
Standard de protenas
Reactivo EDTA/Cu (mL)

50 u L
------3.5

St

---50 u L
---3.5

------50 u L
3.5

Incubar durante 15 minutos a 37 C y leer en el espectrofotmetro a 540 nm.

Determinacin de albmina:
La albmina reacciona con el Bromo cresolsulfonftalena a pH 3.8 formando un compuesto
coloreado que absorbe a 625 nm. Preparar el siguiente sistema:

Suero estndar
Suero
Reactivo BCF (mL)

St

------3.5

10 u L
----3.5

X
---10 u L
3.5

Colocar los tubos en una gradilla a temperatura ambiente durante 10 minutos y leer en el
espectrofotmetro a 625 nm.

~ 45 ~

~ 46 ~

~ 47 ~

La hemoglobina es una protena que tiene un papel muy importante en el transporte de gases en
todo el organismo. Sus niveles en sangre mantiene una estrecha relacin con la anemia,
policitemia o deshidratacin.

Determinacin de hemoglobina (Mtodo de Drabkin):

La determinacin de hemoglobina se realiza utilizando el reactivo de Drabkin, en cuya
composicin se encuentra el ferricianuro de potasio, cianuro de potasio y bicarbonato de sodio.
El ferricianuro transforma las hemoglobinas en metahemoglobina, compuesto que luego
reacciona con el cianuro de potasio para formar cianometahemoglobina, que tiene la propiedad
de absorber a 540 nm.
Preparar el siguiente sistema:

X
Sangre
Standard de hemoglobina
Reactivo de trabajo (mL)

20 u L
----

St
---20 u L

5.0

5.0

Mezclar y despus de 3 minutos leer en el espectrofotmetro a 540 nm llevando el equipo a

cero con el Reactivo de trabajo.
UREA
La urea es un compuesto nitrogenado que se sintetiza en el hgado a partir del ion amonio,
bicarbonato y ATP. La enzima que cataliza esta primera reaccin es la carbamoil fosfato
sintetasa I, cuya actividad es regulada por el N-acetil glutamato. La excrecin de urea por la
orina depende fundamentalmente de la ingesta proteica. Un incremento de urea en sangre puede
ocurrir a causa de una probable disfuncin renal.

Determinacin de urea en orina.La determinacin de urea en orina se fundamenta en la accin que ejerce la enzima ureasa sobre
la urea, descomponindola en anhdrido carbnico y amoniaco. Este amoniaco reacciona con
hipoclorito y fenol en medio alcalino, formando un compuesto azul denominado azul de
indofenol, cuya intensidad es proporcional a la concentracin de urea.
Preparar el siguiente sistema:

Estndar (0.60 g/L)

Orina diluida
Ureasa
Mezclar mediante agitacin e
incubar a 37 C x 5 minutos
Reactivo 1
Reactivo 2
Mezclar e incubar a 37 C por
5 minutos, luego agregar:
Agua destilada

Blanco
----I gota

Estndar
20 u L
--I gota

1 mL
1 mL

1 mL
1 mL

1 mL
1 mL

10 mL

10 mL

10 mL

~ 48 ~

Problema
--20 u L
I gota

Mezclar los tubos por inversin, retirar del bao mara, dejar en reposo durante 10 minutos y
leer en el espectrofotmetro a 540 nm.
Nota.- Debido a que la densidad de la orina est relacionada con la concentracin de urea, es
necesario diluirla de acuerdo al esquema siguiente:
Densidad hasta 1.015 . Diluir 1/10
Densidad de 1.016 a 1.025 ... diluir 1/20
Densidad mayor a 1.025 . diluir 1/40
Es necesario preparar un Blanco de orina. El procedimiento difiere ligeramente del
correspondiente al Blanco. La diferencia radica en que debe aadirse al tubo de ensayo 20 L
de orina despus de haber aadido el Reactivo 1, es decir, antes de aadir el Reactivo 2. Con el
Blanco se lleva el espectrofotmetro a Cero.

~ 49 ~

~ 50 ~

PRCTICA 13
INFORME
DETERMINACIN DE UREA EN ORINA
Apellidos

Nombre(s)

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 51 ~

Mesa N

Fecha

PRCTICA 13
INFORME
DETERMINACIN DE HEMOGLOBINA
Apellidos

Nombre(s)

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 52 ~

Mesa N

Fecha

PRCTICA 12
INFORME
DETERMINACIN DE PROTEINAS PLASMTICAS
Apellidos

Nombre(s)

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 53 ~

Mesa N

Fecha

~ 54 ~

PRCTICA 11
INFORME
DETERMINACIN DE VITAMINA C EN ALIMENTOS
Apellidos

Nombre(s)

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 55 ~

Mesa N

Fecha

~ 56 ~

PRCTICA 10
INFORME
DETERMINACIN DE TRIGLICRIDOS Y COLESTEROL EN PLASMA
Apellidos

Nombre(s)

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 57 ~

Mesa N

Fecha

~ 58 ~

PRCTICA 9
INFORME
HIDRLISIS ENZIMTICA DE LOS LIPIDOS

Apellidos

Nombre(s)

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 59 ~

Mesa N

Fecha

~ 60 ~

PRCTICA 8
INFORME
EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DE GLUCOGENO HEPTICO
Apellidos

Nombre(s)

1. Objetivos

2. Resultados
a.- Rata con dieta normal.-

b.- Rata en ayuno de 24 horas.-

3. Conclusiones

~ 61 ~

Mesa N

Fecha

~ 62 ~

PRCTICA 6
INFORME
EVALUACIN DE LA GLICEMIA

Apellidos

Nombre(s)

1. bjetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 63 ~

Mesa N

Fecha

~ 64 ~

PRCTICA 5
INFORME
DETERMINACIN DE CIDO RICO EN SUERO

Apellidos

Nombre(s)

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 65 ~

Mesa N

Fecha

~ 66 ~

PRACTICA N 4
INFORME
DIGESTIN ENZIMTICA DEL ALMIDON
Apellidos

Nombre(s)

Mesa N

Fecha

1. Objetivos

2. Resultados
Tubo N
1

Tiempo (min.)

Color observado

............................................

10

...........................................

15

...........................................

20

...........................................

............................................

10

...........................................

15

...........................................

20

...........................................

............................................

10

...........................................

15

...........................................

20

..........................................

3. Conclusiones

~ 67 ~

~ 68 ~

PRACTICA 3
INFORME
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Apellidos

Nombre(s)

Mesa N

Fecha

1. Objetivos

2. Resultados
a.- Efecto de la concentracin de sustrato.Densidad ptica

Concentracin de sustrato

.............

...............

.............

...............

.............

...............

.............

...............

b.- Efecto de la concentracin de enzimas.Densidad ptica

Concentracin de enzima

.........................

.................................

.........................

.................................

.........................

.................................

c.- Efecto del pH.Densidad ptica

pH

.........................

...............................

.........................

..............................

.........................

..............................

3. Conclusiones

~ 69 ~

~ 70 ~

PRACTICA 2
INFORME
PREPARACION DE SOLUCIONES BUFFERS

Apellidos

Nombre(s)

Mesa N

Fecha

1. Objetivos

2. Resultados
DETERMINAR

SOLUCIN
NaOH 0,01 M
HCl 0,01 M
CH3COOH 0,1 M
NH4OH 0,1 M
NH4Cl 0,1 M

el

pH

TERICO y
SOLUCIONES:

PRCTICO

pH - TERICO

3. Conclusiones

~ 71 ~

en

las

SIGUIENTES

pH - PRCTICO

~ 72 ~

PRACTICA 1
INFORME
DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMTRICAS

Apellidos

Nombre(s)

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 73 ~

Mesa N

Fecha

~ 74 ~