Caracterizacin microscpica y macroscpica de Escherichia

coli y Fusarium oxysporum mediante tcnicas de tincin,

mtodos de cuantificacin del crecimiento microbiano, medios de
cultivo y mtodos de siembra
Microbiologa Ambiental
Facultad de Ingeniera Ambiental
UNIVERSIDAD EL BOSQUE
Bocanegra Daniela Maria, Cardona Ana Mara, Ramrez Oscar David
Resumen
Objetivo. Se analiz y observo caractersticas macroscpicas y microscpicas de hongos y
bacterias. En bacterias se elabor el recuento de colonias teniendo en cuenta los mtodos de
tincin empleados para cada ensayo y, luego, se calcul para cada muestra, mediante el mtodo
de cuantificacin del crecimiento microbiano la cantidad de colonias observadas. Materiales y
mtodos. Las tcnicas de tincin empleadas como: Coloracin de gram, tincin de hongos con
ayuda de la tcnica de azul de lactofenol, coloracin de cpsulas y endosporas; fueron trabajadas
mediante unos requerimientos estrictos de higiene y responsabilidad. Los anlisis del crecimiento
microbiano se trabajaron con diferentes medios de cultivo, cada uno ligados a unos mtodos de
siembra que son de total importancia para observar sus caractersticas microscpicas y
macroscpicas. Resultados. Se pudo determinar que por medio de las tinciones se puede
identificar las condiciones y caractersticas macroscpicas y microscpicas de bacterias y hongos.
Conclusiones. Gracias a las tcnicas de tincin pudimos conocer, observar y distinguir las
caractersticas microscpicas y macroscpicas de las bacterias y de los hongos, tambin se pudo
observar la estructura interna y externa de las Bacterias y de los Hongos y por ultimo aprendimos a
realizar cultivos para bacterias y hongos.
Palabras clave: Bacterias, hongos, PDA, agar, avena, tincin.
factores adicionales de crecimiento
condiciones ms estrictas. (7)

Introduccin
Los microorganismos estn en constante
relacin en la vida de cualquier ser vivo,
stos se encuentran en cualquier medio ya
sea inerte o biolgico y, as mismo, pueden
proporcionar un dao o un beneficio. Por esta
razn, es de vital importancia tener algn
conocimiento
previo
sobre
los
microorganismos, en especial, las bacterias y
hongos, y conocer cmo es su morfologa,
desarrollo, reproduccin, etc.
Ciertos microorganismos son capaces de
crecer con facilidad en medios simples y con
un margen amplio en cuanto a caractersticas
de los mismos, en tanto que otros requieren

Las bacterias son organismos procariotas,

unicelulares, su morfologa es de cocos
(esfricas), bacilos (bastones), espirilos
(filamentos) y vibrios. En la estructura de las
bacterias se encuentran elementos tanto
permanentes como variables, entre estos
estn: cpsula, pared celular, membrana,
polmeros de reserva, flagelos, citoplasma,
pilis, ribosomas y material nuclear. Las
bacterias tienen un gran potencial para
reproducirse ya que lo hacen por divisin
binaria y en condiciones apropiadas, resulta
un proceso continuo en el que la clula se
alarga y se divide en dos clulas hijas, esto
hace que sean partcipes en diferentes
enfermedades. (1)(7)

Los hongos son organismos eucariotas y su

reproduccin se puede dar de manera sexual
o asexual, no son fotosintticos y tambin
son agentes patgenos de gran importancia.
Su tamao es muy variable, pues existen
hongos que se pueden observar a simple
vista, como tambin, se pueden observar
microscpicamente; una caracterstica muy
interesante, es que los hongos que son
visibles microscpicamente muchos son
causa de enfermedad mictica.(1)
Se analiz y observo caractersticas
macroscpicas y microscpicas de hongos y
bacterias. En bacterias se elabor el
recuento de colonias teniendo en cuenta los
mtodos de tincin empleados para cada
ensayo y, luego, se calcul para cada
muestra,
mediante
el
mtodo
de
cuantificacin del crecimiento microbiano la
cantidad de colonias observadas.

inmersin
al
visualizacin.

portaobjetos

para

su

Tincin de hongos: En un portaobjetos se

agreg 1 gota de azul de lactofenol que luego
fue
recubierto
con
cinta
pegante
transparente, despus de esto se observ en
el microscopio con el objetivo 40x.

Coloracin de estructuras
Coloracin de la cpsula: Para querer
observar la cpsula del microorganismo se
debi mezclar una gota de la muestra con
una gota de tinta china sobre el portaobjetos
y se extendi la mezcla hasta crear una capa
fina, luego se dej secar a temperatura
ambiente para poder adicionar aceite de
inmersin y despus visualizar la muestra en
el microscopio.

Coloracin
Materiales y mtodos
Preparacin del frotis
Frotis a partir de medio lquido y
slido: Para esta preparacin, el
portaobjetos estuvo estrictamente limpio. Se
agregaron dos gotas con el asa recta en el
centro de la lmina y luego se extendi hasta
formar una pelcula delgada, se dej secar y
el portaobjetos fue expuesto en llama al
mechero para que as elimine totalmente los
residuos y, con esto, realiz la coloracin que
luego fue observado en el microscopio.

Tinciones
Coloracin

de Gram: Este mtodo

permite
clasificar
las
bacterias
en:
grampositivas y gramnegativas. Se adicion
cristal violeta hasta cubrir por completo el
frotis durante 1 minuto, despus de esto es
necesario lavar con agua. Se agreg Lugol
durante 1 minuto despus del secado y luego
se lav con agua. Se adicion alcohol
acetona durante 30 segundos despus del
secado y luego se lav con agua. Se agreg
fuscina bsica durante 1 minuto despus del
secado y se lav con agua. Despus de
lograr esto, se calibr el microscopio con el
objetivo 100x y se agreg 1 gota de aceite de

de
Endosporas:
El
portaobjetos se coloc con el frotis en un
bao de agua de ebullicin y se cubri el
frotis con un pedazo de toalla de papel para
mantenerlo saturado con el verde de
malaquita (5%), durante este proceso, se
mantuvo hirviendo el agua durante 5 minutos
y, as, los vapores cumplieron su funcin de
secado. Se agreg HCl en solucin al 1% en
etanol y luego se lav la lmina con agua de
manera cuidadosa. Luego se agreg fuscina
cida durante un lapso de tiempo entre 30-60
segundos y despus lav con agua y se
sec. Se llev la lmina al microscopio para
poder observar.
Medios de cultivo y mtodos de
siembra
El agar nutritivo, agar PDA, agar Avena
fueron exclusivamente preparados por la
asistente encargada del laboratorio. Esta
razn facilit en la prctica para empezar a
realizar los debidos cultivos de bacterias y
hongos.

Aislamiento de bacterias
mtodo de agotamiento

por

el

Se tom una colonia de agar de sangre con

la bacteria Escherichia coli y se cultiv de
manera uniforme con una serie de estras

que fueron manipuladas alrededor de la caja

petri con el respectivo agar.
Para este mtodo es necesario mantener el
asa esteril y fra y manipular el inculo con la
mayor suavidad posible para que el mtodo
sea efectivo. Se realizaron 4 series de estras
alrededor de la caja y se hizo una ltima
serie en el centro de la caja. Se culmin el
cultivo llevando a incubacin durante 8 das a
37C.

Tabla 1.
Caracter
izacin

Microscpica

Muestra
La bacteria manipulada fue
Escherichia coli.

Car
A partir de la tincin de
coli y de haberla colo
aumento 100x (Vease f
Gram dio positiva, por
ya que en este labora
morada con formacin

El
hongo
manipulado fue
Fusarium oxysporum

Luego de haberle agr

que estaba en una lm
poder observarlo en e
el hongo Fusarium oxy
esporas fcilmente r
media luna.

Siembra de hongos
Con la ayuda de la aguja de diseccin se
tom un trozo de agar PDA con el hongo
Fusarium oxysporum y se seleccion un
trozo de este para que luego fuera puesto en
otra caja con agar PDA y dur en encubacin
8 das a 28C.

Mtodos de cuantificacin del

crecimiento microbiano
Esta etapa de cuantificacin del crecimiento
microbiano fue realizada con bacterias
(recuento por placa), en este caso,
Escherichia coli. Cada vez que se hace una
curva o un muestreo se debe hacer un Gram
para mirar la pureza del cultivo. Debido al
manejo de la muestra con Escherichia coli su
prueba
resultante
arroj
clulas
gramnegativas y se hizo el respectivo
recuento de colonias despus de haber
hecho una curva de 40 minutos.
En la cuantificacin del crecimiento de
hongos se trabaj con Fusarium oxysporum y
se adicion entre 5 y 10ml de solucin salina
al 0.85% al cultivo, despus se rasp el
cultivo con ayuda de un portaobjetos hasta
obtener una solucin concentrada. Se
hicieron diluciones seriadas 10-6 y con ayuda
de la micropipeta se tomaron 10l de la
dilucin indicada y se hizo el montaje en la
cmara de newbauer.

Resultados
En el laboratorio, se obtuvieron los siguientes
resultados a partir de las siguientes tcnicas
que se trabajaron:

Tabla 2.
Caracterizacin
Muestra
El hongo manipulado
fue Fusarium oxysporum

Macroscpica
Caractersticas
El hongo Fusarium oxysporu
AVENA, en estos tipos de co
manera rpida (en este labora

de neubawer y
mediante placas

en

el

indirecto

En AVENA se tuvo como resultado un hongo de color rojiso

mas concentrado en el centro, con forma filamentosa y una
elevancion convexa. (Vase fig. 3)

fig. 5
Para
esto se tuvieron en cuenta los
siguientes clculos:
BACTERIAS (vase fig. 5)
Caja 1: 17
Caja 2: 95
Fd= 106
Dln= 10-6

En el caso del
17+ 95
e . coli
= 23 x 10
7
un hongo de color blanco
con
ms
2 amarillento,
mlcolor amarillo
en el centro,
producto de la contaminacin con otros
microorganismos que estn en el medio. (Vase fig. 4).
HONGOS
Caja 1: 12
Caja 2: 68
Fd= 103
Dln= 10-3

Mtodos de cuantificacin del

crecimiento microbiano
Se realiz un conteo de colonias por
dos tipos de mtodos: Directos e
indirectos. En los directo se llev a
cabo el conteo mediante la cmara

12+68
2

40 x 104

fusarium
ml

Discusin

Dada la siembra de la bacteria

Escherichia coli en el agar nutritivo,
se determin una coloracin morada
en la colonia al hacer los procesos
de tincin y al mirarlos al microscopio
se pudo evidenciar que los bacilos
adoptaron una coloracin morada
definida , lo que evidenci que son
gram positivos
luego de aadir el lactofenol sobre la
lmina podemos realizar la impronta
de la cinta sobre el hongo fusarium y
as se pudo observar en el
microscopio a 40x que el hongo
Fusarium oxysporum es filamentoso
y posee
esporas
fcilmente
reconocibles, por su forma de media
luna

Conclusiones

Gracias a la utilizacin de la tincin

de Gram y la tincin de Hongos
pudimos
conocer,
observar
y
distinguir
las
caractersticas
microscpicas y macroscpicas de
las bacterias y de los hongos.
Se pudo observar la estructura
interna y externa de las Bacterias y
de los Hongos por medio de las
tinciones de Gram y de hongos.
Se aprendi a realizar los cultivos de
bacterias y de hongos y conocer las
temperaturas y condiciones bajo las
cuales crecen y se reproducen sus
colmenas.

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