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Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas


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PRCTICA
DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BRADFORD Y
LOWRY.

Nombre: Rodrguez Elizarraras Miguel ngel


Grupo: 5QM1
Seccin: 2
Fecha de entrega: 6-oct-15
Nombre profesora: Olgun Ruiz Gabriela E.

Instituto Politcnico Nacional


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Objetivos

Elaborar una curva de calibracin para la cuantificacin de


protenas empleando un mtodo fotomtrico.
Determinara si hay diferencia estadsticamente significativa en la
precisin y la exactitud entre los mtodos de Bradford y Lowry.
Conocer el efecto de sustancias no protenicas, en el desarrollo
de color.
Analizara las ventajas y desventajas del mtodo Lowry, con
respecto a otros mtodos para la cuantificacin de protenas.

Fundamento
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es
una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de
purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la
actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico
de enfermedades, as como para otros muchos propsitos.
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos
de estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las
protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados
qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos
colorantes. En la Tabla I se recogen los mtodos ms usados as como
sus respectivas sensibilidades. Cada uno de estos mtodos tiene sus
ventajas e inconvenientes, las principales se recogen en la siguiente

Tabla.

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Mtodo de Lowry:
Es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A
la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con
las protenas, siendo la intensidad de color proporcional a la
concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer
Este mtodo consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando
complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos
complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan
el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena,
exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a participar en la
segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina
en forma de su complejo con tartrato.
2)
La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de FolinCiocalteau, por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina,
presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como
catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es
el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por
los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.
Mtodo de Bradford:
Est basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue
G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este
compuesto interacciona con aminocidos bsicos (especialmente
arginina) y aromticos. Esta unin del colorante con las protenas
provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde 465 a
595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul
Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores
diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el
colorante se une a la protena. Experimentalmente se mide la diferencia
de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).
DATOS EXPERIMENTALES
Tabla 1. CURVA DE CALIBRACIN DE HEMOGLOBINA POR EL MTODO DE
LOWRY
Tubo N
1

Cantidad de
Protena (g)
25

A590
Serie A
0.020

Serie B
0.024

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2
3
4
5

50
75
100
125

0.060
0.100
0.134
0.170

0.062
0.104
0.128
0.159

a) Calcule y escriba los valores de la pendiente, la ordenada al origen, y


el coeficiente de correlacin; diga cmo se interpretan para la curva de
calibracin.
b = 0.0015 se refiere a la sensibilidad del mtodo, a= 0.0154 es una
constante lo cual quiere decir que este valor no depende del cambio en
la concentracin de protena, siendo un valor de referencia de la curva
(blanco), el valor del coeficiente de correlacin r= 0.9988 refiere a la
reproducibilidad de los datos lo que acredita al analista.
b) Cumple su curva la ley de Bouger y Beer? Entre que lmites de
cantidad de protena?
Este mtodo si lo cumple ya que se encuentra entre los lmites de 25125 microgramos, y por lo tanto esto nos indica que la cantidad de
protena aumenta con respecto a la absorbancia de la muestra.
c) A partir de la recta ajustada por regresin lineal y la ecuacin de la
misma obtenga la expresin matemtica para calcular la cantidad de
protena.
En la grfica esta explicita.

A59

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g de
protena
Fig. 1 Curva tipo para la determinacin de protenas por el
mtodo de Lowry

Tabla 2.
LOWRY

REPLICAS PARA EL ANLISIS ESTADISTICO DEL METODO DE

Tubo N

A590

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0.101
0.093
0.072
0.089
0.083
0.083
0.094
0.108
0.092
0.103

Tabla 3.
LOWRY

Cantidad de
protena (g)
77.6
72.26
58.26
69.6
65.6
65.6
72.93
82.26
71.6
78.93

RESULTADOS DEL ANALISIS ESTADISTICO DEL METODO DE


S

S2

% C.V

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7.14

51.037

9.99

66.35-76.56

71.46
TABLA 4. EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS NO PROTEINICAS EN EL
MTODO DE LOWRY
Tubo N

Sustancia

A590

Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a

2
3
4
5

0.083

Cantidad
de protena
(g)
45.06

Tipo de
interfencia
generada
Negativa

0.152

91.06

Positiva

0.104

59.06

Negativa

0.142

84.4

Positiva

0.116

67.06

No
interferencia

Tabla 5. CURVA DE CALIBRACION DE HEMOGLOBINA POR EL MTODO DE


BRADFORD
Tubo N
1
2
3
4
5

Cantidad de Protena
(g)
25
50
75
100
125

A595
Serie A
0.929
1.119
1.094
1.122
1.341

Serie B
0.49
1.089
1.127
1.11
1.372

a) Calcule y escriba los valores de la pendiente, la ordenada al origen, y


el coeficiente de correlacin; diga cmo se interpretan para la curva de
calibracin ajustada.
b= 0.0033, se refiere a la sensibilidad del mtodo, a= 0.8729 es una
constante, es decir, que este valor no depende del cambio en la
concentracin de protena, siendo un valor de referencia de la curva
(blanco), y r= 0.7953 se refiere a la reproducibilidad de los datos en el
anlisis.
b) Cumple su curva la ley de Bouger y Beer? Entre que lmites de
cantidad
de
protena?
El mtodo de bradford sigue la ley ya que la concentracin de protena

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aumenta con respecto a la absorbancia es decir sigue una


tendencia creciente.
c) A partir de la recta ajustada por regresin lineal y la ecuacin de la
misma obtenga la expresin matemtica para calcular la cantidad de
protena.
En la grfica esta explicita.
g de
protena

A59
5

Fig. 2 Curva tipo para la determinacin de protenas por el


mtodo de Bradford.

Tabla 6. REPLICAS PARA EL ANLISIS ESTADISTICO DEL METODO DE


BRADFORD
Tubo N

A595

1
2

1.055
1.100

Cantidad de
protena (g)
55.18
68.81

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1.110
1.097
1.094
1.100
1.102
1.086
1.114
1.092

4
5
6
7
8
9
10

71.84
67.90
67
68.81
69.42
64.57
73.06
66.39

Tabla 7. RESULTADOS DEL ANALISIS ESTADISTICO DEL METODO DE


BRADFORD

67.29

S2

% C.V

4.92

24.27

7.31

63.77-70.80

TABLA 8. EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS NO PROTEINICAS EN EL


MTODO DE BRADFORD
Tubo N

Sustancia

A595

Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a

1.109

Cantidad
Tipo de
de protena interfencia
(g)
generada
71.54
Positiva

1.184

94.27

Positiva

1.357

146.69

Positiva

1.171

90.33

Positiva

1.223

103.09

Positiva

Cantidad de protena en g
Bradford
Mtodo de prueba

Diferencia
B-L

55.18
68.81
71.84
67.90
67

22.42
3.65
-13.58
1.7
-1.4

2
3
4
5

Tabla 9. Cantidad de protena en g

Lowry
Mtodo de
referencia
77.6
72.26
58.28
69.6
65.5

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65.6

68.81
69.42
64.57
73.06
66.39
2
S : 24.27

72.93
82.26
71.6
78.93
2
S : 51.037

-3.21
3.51
17.99
-1.49
12.54
:
4.213

S:10.71

Calculo de T de Student y F de Fisher


T de Student
T calculada: 1.24
T tablas: 2.262

F de Fisher
F calculada: 2.102
F tablas: 4.03

T calculada > T tablas: Hay diferencia


tablas: Hay diferencia
T calculada T tablas: No hay diferencia
No hay diferencia
Mtodo
Lowry

Bradford

Biuret

Ventaja
Econmico
El color dura ms
tiempo 2 horas
Muy sensitivo
(0.2-5 de prot)
Constante de una
protena a otra
Libre de
interferencia por
otros
componentes
celulares y sales.

Es reproducible

F calculada > F
F calculada F tablas:

Desventaja
El color de los
analitos al
producirse el color
no es constantes
Provoca la
precipitacin de
protenas ya que
esta disuelto en
etanol al 96 por
ciento e
interviene en los
resultados
Requiere ms
cantidad de
protena (1-20
mg)

Discusiones
Empezamos analizando las curvas de calibracin de ambos mtodos,
para Lowry podemos decir que los valores duplicados no varan
demasiado por lo que se obtuvo un r de 0.9988 lo cual nos indica la
precisin y exactitud del analista, sin embargo en la curva de
calobracin por el mtodo de Bradford existen valores que caen muy por
debajo de la lnea de tendencia, esto se atribuye; al comparar estos dos

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datos con los restantes, a un error en el analista que realizo


la determinacin y que pudo haberse causado en la medicin de las
concentraciones de los tubos (puede observarse en la grfica de curva
de calibracin de la hemoglobina.
Como ya haba mencionado anteriormente los dos mtodos tanto Lowry
y Bradford cumplen la ley de Bouger- Beer ya que la tendencia de la
curva estndar es en forma creciente (se puede observar en las grficas
de ambos mtodos). Este aumento progresivo en forma proporcional de
las concentraciones de protena con respecto a las absorbancias dadas
por el equipo fotomtrico, aunado al cumplimiento de la ley de Bouger
Beer reflejan que a mayor intensidad de color la absorbancia del analito
aumenta y por lo tanto su concentracin lo hace de la misma manera de
forma directamente proporcional.
Los lmites de confianza en la grfica del Mtodo de Lowry denotan que
en las rplicas de Hemoglobina son mayores que el mtodo de bradford
adems de tener un coeficiente de variacin de 9.9% lo que refiere una
ligera variacin para la viabilidad de los resultados, esto lo demuestra la
diferencia de absorbancias en el caso de algunos de estos replicados.
Por el contrario la grfica de Bradford los lmites son menores por lo que
el coeficiente de variacin disminuye al 7.31% lo que demuestra que
existe mayor sensibilidad en este mtodo que en el de Lowry.
Haciendo una comparacin de estos mtodos con otros basndonos en
la bibliografa se demuestra que las ventajas ms relevantes del mtodo
de Lowry son su sensibilidad y su costo ya que este es bajo como se
observa en la tabla de comparacin de mtodos, sin embargo, tambin
tiene desventajas ya que el color de los analitos al producirse la reaccin
no es constante y, por tanto; es necesario elegir correctamente los
estndares de comparacin para asegurar la eficacia del mtodo. Por el
contrario el mtodo de Bradford la ventaja ms relevante es su
sensibilidad ya que es 4 veces mayor a la sensibilidad en el mtodo de
Lowry, esto le permite al analista contar menor concentracin de
protenas en una muestra, el orden de aplicacin de los reactivos no
altera el progreso de la reaccin, es importante tambin recalcar que es
libre de otras sustancias celulares, por otro lado su mayor desventaja es
que este reactivo esta diluido en etanol al 96% lo que provoca la
precipitacin de protenas en un tiempo determinado y afecta
directamente al resultado del mtodo.
Tambin en estos mtodos pueden haber sustancias que interfieran en
la reaccin como se observa en los resultados para ambos mtodos, se
trataron los analitos con sustancias interferentes no protenicas, cuando
la cantidad de protena es mayor que el lmite de confianza se considera
una interferencia negativa, y viceversa se considera interferencia
positiva si est por arriba del lmite superior del analito.
Con respecto a la precisin y exactitud de los mtodos, este anlisis
estadstico muestra que no hay diferencias significativas en ninguno de

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los dos rubros ya que tanto la t de student calculada como la


F de Fischer calculada no son mayores a los patrones registrados en las
tablas.

Conclusiones

Con base a la bibliografa consultada se puede llegar a la


conclusin de que no existe diferencia significativa en precisin y
exactitud entre el mtodo de Lowry y de Bradford.
En base a la observacin de estos mtodos se puede concluir que
la intensidad de color aumenta de manera proporcional con
respecto a la concentracin del analito.
Durante la metodologa se pudo observar el efecto que tuvieron
las sustancias de naturaleza no proteica con respecto a los
factores fisicoqumicos.

Referencias

Clark, J. M. 1966. Bioqumica Experimental. Editorial Acribia. Zaragoza,


Espaa pp. 95 104.
www2.uah.es/sancho/farmacia/practicas

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