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PRCTICA
DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BRADFORD Y
LOWRY.
Objetivos
Fundamento
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es
una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de
purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la
actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico
de enfermedades, as como para otros muchos propsitos.
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos
de estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las
protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados
qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos
colorantes. En la Tabla I se recogen los mtodos ms usados as como
sus respectivas sensibilidades. Cada uno de estos mtodos tiene sus
ventajas e inconvenientes, las principales se recogen en la siguiente
Tabla.
Mtodo de Lowry:
Es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A
la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con
las protenas, siendo la intensidad de color proporcional a la
concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer
Este mtodo consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando
complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos
complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan
el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena,
exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a participar en la
segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina
en forma de su complejo con tartrato.
2)
La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de FolinCiocalteau, por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina,
presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como
catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es
el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por
los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.
Mtodo de Bradford:
Est basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue
G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este
compuesto interacciona con aminocidos bsicos (especialmente
arginina) y aromticos. Esta unin del colorante con las protenas
provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde 465 a
595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul
Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores
diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el
colorante se une a la protena. Experimentalmente se mide la diferencia
de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).
DATOS EXPERIMENTALES
Tabla 1. CURVA DE CALIBRACIN DE HEMOGLOBINA POR EL MTODO DE
LOWRY
Tubo N
1
Cantidad de
Protena (g)
25
A590
Serie A
0.020
Serie B
0.024
2
3
4
5
50
75
100
125
0.060
0.100
0.134
0.170
0.062
0.104
0.128
0.159
A59
g de
protena
Fig. 1 Curva tipo para la determinacin de protenas por el
mtodo de Lowry
Tabla 2.
LOWRY
Tubo N
A590
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.101
0.093
0.072
0.089
0.083
0.083
0.094
0.108
0.092
0.103
Tabla 3.
LOWRY
Cantidad de
protena (g)
77.6
72.26
58.26
69.6
65.6
65.6
72.93
82.26
71.6
78.93
S2
% C.V
7.14
51.037
9.99
66.35-76.56
71.46
TABLA 4. EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS NO PROTEINICAS EN EL
MTODO DE LOWRY
Tubo N
Sustancia
A590
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
2
3
4
5
0.083
Cantidad
de protena
(g)
45.06
Tipo de
interfencia
generada
Negativa
0.152
91.06
Positiva
0.104
59.06
Negativa
0.142
84.4
Positiva
0.116
67.06
No
interferencia
Cantidad de Protena
(g)
25
50
75
100
125
A595
Serie A
0.929
1.119
1.094
1.122
1.341
Serie B
0.49
1.089
1.127
1.11
1.372
A59
5
A595
1
2
1.055
1.100
Cantidad de
protena (g)
55.18
68.81
1.110
1.097
1.094
1.100
1.102
1.086
1.114
1.092
4
5
6
7
8
9
10
71.84
67.90
67
68.81
69.42
64.57
73.06
66.39
67.29
S2
% C.V
4.92
24.27
7.31
63.77-70.80
Sustancia
A595
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
Hemoglobin
a
1.109
Cantidad
Tipo de
de protena interfencia
(g)
generada
71.54
Positiva
1.184
94.27
Positiva
1.357
146.69
Positiva
1.171
90.33
Positiva
1.223
103.09
Positiva
Cantidad de protena en g
Bradford
Mtodo de prueba
Diferencia
B-L
55.18
68.81
71.84
67.90
67
22.42
3.65
-13.58
1.7
-1.4
2
3
4
5
Lowry
Mtodo de
referencia
77.6
72.26
58.28
69.6
65.5
65.6
68.81
69.42
64.57
73.06
66.39
2
S : 24.27
72.93
82.26
71.6
78.93
2
S : 51.037
-3.21
3.51
17.99
-1.49
12.54
:
4.213
S:10.71
F de Fisher
F calculada: 2.102
F tablas: 4.03
Bradford
Biuret
Ventaja
Econmico
El color dura ms
tiempo 2 horas
Muy sensitivo
(0.2-5 de prot)
Constante de una
protena a otra
Libre de
interferencia por
otros
componentes
celulares y sales.
Es reproducible
F calculada > F
F calculada F tablas:
Desventaja
El color de los
analitos al
producirse el color
no es constantes
Provoca la
precipitacin de
protenas ya que
esta disuelto en
etanol al 96 por
ciento e
interviene en los
resultados
Requiere ms
cantidad de
protena (1-20
mg)
Discusiones
Empezamos analizando las curvas de calibracin de ambos mtodos,
para Lowry podemos decir que los valores duplicados no varan
demasiado por lo que se obtuvo un r de 0.9988 lo cual nos indica la
precisin y exactitud del analista, sin embargo en la curva de
calobracin por el mtodo de Bradford existen valores que caen muy por
debajo de la lnea de tendencia, esto se atribuye; al comparar estos dos
Conclusiones
Referencias