Herramientas moleculares I:

parmetros y validacin para el diagnstico bioqumico

MDULO 1
Introduccin a las herramientas para la
deteccin de cidos nucleicos
(PARTE I)

Dr. Diego Chouhy

INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO

Pipetas
Microcentrfuga
Vortex

Pipetas
Microcentrfuga

Pipetas
Microcentrfuga
Cicladores trmicos
Cubas de electroforesis
Fuentes de poder
Transiluminador UV
Microondas

Sala de preparacin de reactivos

Preparacin de
reactivos para la PCR

Preparacin de la mezcla
de PCR

Sala de preparacin de muestras

Procesamiento de
Agregado de cidos
muestras clnicas.
nucleicos a los tubos
Aislamiento de cidos
de reaccin de PCR
nucleicos

Sala de amplificacin y deteccin

PCR (termocicladores)

Deteccin de los
productos amplificados

MTODOS MOLECULARES
ETAPAS EN EL PROCESAMIENTO
1- REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA
OBTENCIN
- sangre entera anticoagulada con EDTA
- plasma / suero
- lquido cefalorraqudeo
- biopsia
- etc
CONSERVACIN
- dentro de las 24 horas: 2 - 8C
- ms de 24 horas congelar a 20C o 70 C.

EXTRACCION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

2- AMPLIFICACIN
3- DETECCIN

MTODOS MOLECULARES

Amplificacin No Isotrmica

Standard PCR
RT-PCR
Multiplex PCR
Nested PCR
real time PCR

Amplificacin Isotrmica

TMA
NASBA
3SR
SDA
LMPA

AMPLIFICACIN DE
CIDOS NUCLEICOS

AMPLIFICACIN DE
LA SEAL

Branched DNA signal amplification (bDNA)

AMPLIFICACIN DE
LA SONDA

Ligase Chain Reaction (LCR)

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Amplificacin Gnica

KARY MULLIS
1985: PCR
1993: PREMIO
NOBEL DE QUMICA

Luego de 30-40 ciclos 109 1012 copias

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La PCR es una metodologa que consiste en la amplificacin enzimtica en
ciclos repetidos de un fragmento especfico de ADN utilizando la enzima
ADN polimerasa termoestable (Taq)

La amplificacin in vitro del ADN se logra

en tres pasos bsicos:
3).-Copia de las de
1).-Desnaturalizacin
2).-Hibridacin
cadenas
los del
cebadores
delimitadas
ADN a copiar
al ADN
por
(molde
molde
los
cebadores.
mediante
o diana)Semediante
laconsigue
disminucin
elelevando
incremento
de lala
temperatura
a lalatemperatura
de
reaccin
ptima
anillado
de la temperatura
(92-95C).a lade
de la
polimerasa
utilizada.
losADN
cebadores
(55-65C).

Luego de 30-40 ciclos 109 1012 copias

N=4
N=2
N=1

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

COMPONENTES DE LA PCR

Oligonucletidos (cebadores)
Tampn (Buffer)
ADN Polimerasa termoestable
Desoxinucletidos (dNTPs)
Cloruro de Magnesio (MgCl2)
ADN molde

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

COMPONENTES DE LA PCR
1- Oligonucletidos
Secuencias cortas de ADN (18 - 24 nucletidos) que flanquean el fragmento
a amplificar y actan como iniciadores (cebadores) de la polimerizacin.

2- Tampn (Buffer)
Necesario para crear las condiciones ptimas para la actividad de la ADN
polimerasa. A menudo contienen Tris-HCl, KCl, y a veces, MgCl2.

3- Desoxinucletidos (dNTPs)
Sustrato necesario para la formacin de las cadena de ADN.
Unen iones Mg2+. Para 1.5 mM de MgCl2, la [dNTPs] ideal es de 200 M.
Pequeos incrementos en la [dNTPs] pueden inhibir la reaccin porque
atraparan los iones Mg2+ necesarios para que la ADN-polimerasa funcione.
Si cambiamos la [dNTPs] es importante tener en cuenta que existe una
relacin entre las cantidades de MgCl2 y las de dNTPs en la reaccin.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

COMPONENTES DE LA PCR
4- Cloruro de Magnesio (MgCl2)
La [MgCl2] afecta a la incorporacin de dNTPs, la actividad polimerasa y
temperatura de hibridacin del hbrido cebador-ADN templado.
[MgCl2] Especificidad de la reaccin.
[MgCl2] Eficiencia de la reaccin
Efecto de la concentracin de MgCl2
A: 0,5 mM - B: 0,8 mM - C: 1,5 mM
D: 2,0 mM - E: 2,5 mM - F: 3,0 mM

5- ADN molde
Producto final debe estar limpio y libre de cualquier residuo de buffers.
Estos productos residuales pueden inhibir la accin de la enzima o
modificar la concentracin salina del buffer de reaccin.
Inhibidores en la muestra (Columnas vs Tcnicas manuales de extraccin)

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

COMPONENTES DE LA PCR
6- ADN Polimerasas
Direccin de polimerizacin 5-3.
Solamente aaden desoxirribonucletidos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a una
cadena cebadora ya existente unida a una cadena molde.
No inicia sntesis de ADN de novo.

Taq ADN polimerasa

Hot Start Taq ADN polimerasa

Pfu ADN polimerasa

Mix de enzimas
http://www.thermoscientificbio.com

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIN

Componente

Volumen

Concentracin
final

Tampn (buffer) 10X

5 l

1X

dNTP 2 mM

5 l

0.2 mM

Cebador sentido (10

pmol/l)

0.5-5.0 l

0.1-1.0 M

Cebador antisentido (10

pmol/l)

0.5-5.0 l

0.1-1.0 M

MgCl2 25 mM

2-8 l

1-4 mM

ADN templado

5 l

10 pg 1 g

0.2-0.5 l

1.0-2.5 U

Taq ADN polimerasa 5 U/l

H2O (libre de nucleasas)
Volumen Total

hasta 50 l
50 l

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIN

Paso

Temperatura

Tiempo

Ciclos

Desnaturalizacin inicial

95C

3-5 min.

Desnaturalizacin

95C

30-60 seg.

Anillado

50-68C

30-60 seg.

elongacin

72C

30-60 seg.

Elongacin final

72C

5-10 min.

25-40
1

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

RT-PCR
ARN
Retrotranscripcin, M-MLV
ADNc
cebadores

PCR, Taq

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

PCR multiplex

PCR

200 pb

500 pb

300 pb

En esta modificacin de la PCR se incluyen dentro de la misma

reaccin de amplificacin mltiples pares de cebadores especficos
para diferentes dianas, por lo que se produce una co-amplificacin
500 pb
de diferentes dianas.
300 pb
Esta modificacin tiene las siguientes ventajas:
se pueden testear grandes regiones de una nica secuencia de 200 pb
ADN en busca de alteraciones o modificaciones.
se pueden testear segmentos no relacionados del genoma diana.
se pueden incluir controles internos de amplificacin de la muestra.
se puede testear una misma muestra contra diferentes patgenos.

Electroforesis

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Nested-PCR o PCR anidada

1 amplificacin

2 amplificacin

500 pb
250 pb

Ventajas:
Mejor sensibilidad.
Se puede detectar una sola copia de
la diana sin necesidad de hibridar
con sondas marcadas.
Mejor especificidad.
La re-amplificacin con el par de
cebadores internos sirve para
verificar la especificidad de la
primera ronda de amplificacin.

Desventaja:
Mayor probabilidad de contaminacin.
No es recomendable la apertura del 1 tubo de amplificacin (sobre todo en laboratorios de
diagnstico clnico), ya que durante la transferencia se producen aerosoles que pueden
contaminar reacciones sucesivas. Para evitar esto se han desarrollado alternativas a fin de
evitar la transferencia de un tubo a otro tras la 1 amplificacin.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Real time-PCR o PCR en tiempo real

Los procesos de amplificacin y deteccin se producen simultneamente.
Disminucin del riesgo de contaminacin.
Por deteccin fluorescente se puede medir la cantidad de ADN sintetizado en
cada momento durante la amplificacin .
Posibilidad de cuantificacin La emisin de fluorescencia producida en la
reaccin es proporcional a la cantidad de ADN formado.
Los sistemas de deteccin por fluorescencia
empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de
dos tipos:
Agentes intercalantes: fluorocromos que
aumentan la emisin de fluorescencia al unirse al
ADN de doble hlice. Baja especificidad.
Sondas de hibridacin especficas: sondas
marcadas con 2 fluorocromos (un donador y un
aceptor) y el fenmeno de Transferencia de
energa fluorescente mediante resonancia (FRET).

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

DETECCIN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS

1- Electroforesis
Electro se refiere a la electricidad y foresis (del griego phoros) significa trasladar.

Separacin de molculas
Matriz tamponada (agarosa, acrilamida)
Separacin de molculas mediante el uso
de un campo elctrico
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORTICA
Agarosa
Tampn o Buffer de corrida
Tampn o Buffer de carga (Loading Buffer)
Visualizacin

1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORTICA
AGAROSA
Polisacrido extrado de algas.
Electroforesis rpida, pero con una resolucin limitada.
Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene
determinada por su concentracin.
Un fragmento de ADN migra a
diferentes velocidades a travs de
los geles segn la concentracin
de agarosa.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORTICA
BUFFER DE CORRIDA
La movilidad electrofortica del ADN est afectada por la composicin y la
fuerza inica del medio.
En ausencia de iones, la conductancia elctrica es mnima y el ADN migra
lentamente o ni siquiera se desplaza.
Con elevada fuerza inica la conductancia elctrica es muy elevada y se
genera una importante cantidad de calor. Generalmente el gel se funde y el
ADN se desnaturaliza.
Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE),
tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una
concentracin de 50 mM (pH 7,5 7,8).
EDTA vs degradacion enzimtica.
Debido a la carga negativa del ADN, la migracin
en la corrida es hacia el nodo (color rojo).

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORTICA
BUFFER DE CARGA
Xylene cyanol
Migra a aprox. 4Kb

Aadir color a la
muestra

aumentar la densidad de las

muestras para que el ADN caiga
uniformemente en el pocillo

Azul de bromofenol
Ayuda a visualizar que la
muestra este migrando en el
gel. Migra a aprox. 200 - 400
pb (depende del porcentaje
de la agarosa)
GLICEROL
Aade densidad a la muestra.

incorporar un colorante a la muestra que,

en un campo elctrico, se desplace hacia el
nodo a una velocidad previsible.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

1- Electroforesis
CARGADO DE MUESTRA

Aplicar 80 V
De 30-40 min

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORTICA
VISUALIZACIN

Para cuantificar y/o visualizar el ADN se utilizan agentes colorantes

fluorescentes, los cuales aumentan notablemente su emisin cuando se unen a
la doble hlice.
Son agentes intercalantes que se introducen entre las bases del ADN.
Generalmente son policclicos aromticos, hidrofobos y planares:
BROMURO DE ETIDIO
Reactivo mutagnico, por lo que se
deben trabajar con equipo de seguridad.
El material contaminado con ellos
generalmente se trata con nitrito sdico y
cido hipofosforoso para su degradacin.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

1- Electroforesis
DETECCIN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO
1.
2.
3.
4.

Colocar gel sobre un transiluminador, encender la lmpara de UV

Visualizar bandas de ADN
Tomar fotografa
Determinar el peso molecular de las bandas
Marcador de peso molecular

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

DETECCIN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS

2- Enzimoinmunoanlisis
AMPLIFICACIN CON CEBADORES BIOTINILADOS
B

PCR

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

DETECCIN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS

2- Enzimoinmunoanlisis
HIBRIDACIN CON SONDA ESPECFICA
F

CAPTURA EN MICROPLACA DEL HBRIDO

F
B

Microplaca revestida con

Estreptavidina

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

DETECCIN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS

2- Enzimoinmunoanlisis (EIA)
DETECCIN COLORIMTRICA DEL HBRIDO

peroxidasa

Reactivo

NEGATIVO

cromforo
F
B

Microplaca revestida con

Estreptavidina

F
B

POSITIVO

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

EIA-PCR - Amplificacin NO isotrmica de cidos nucleicos

Paso 1
Concentracin y Purificacin del ARN diana
Centrifugado a alta velocidad
Eliminacin de componentes plasmticos (por lavado)

Paso 2
Amplificacin
Retrotranscripcin (RT)
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Paso 3
Deteccin
Hibridizacin
Revelado colorimtrico

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

EIA-PCR - Amplificacin NO isotrmica de cidos nucleicos

GuSCN Lysis Buffer
+ CI

1000 L
100 L

600 L

800 L
Mix,
Incubar 10 min

Centrifugar
1 hora

Isopropanol

Centrifugar 15 min
Retirar SN

Plasma

50L
HCV
Tubos con
Master Mix

200 L

Diluyente de
muestra

HIV
Resuspender
Pellet

HBV

70% Ethanol
1 ml
Lavar Pellet,
Centrifugar 5 min
Retirar SN

FIN DE LA PARTE 1 MDULO I