PROPIEDADES FSICO- QUMICOS DE LOS CIDOS

NUCLEICOS
1. DESNATURALIZACIN
La desnaturalizacin de cidos nucleicos como el ADN por altas temperaturas
produce una separacin de la doble hlice, que ocurre porque los enlaces o
puentes de hidrgeno se rompen. Esto puede ocurrir durante la reaccin en
cadena de la polimerasa; las cadenas del cido nucleico vuelven a unirse
(renaturalizarse) una vez que las condiciones "normales" se restauran. Si las
condiciones son restauradas rpidamente, las cadenas pueden no alinearse
correctamente.
Si se somete el ADN a temperatura alta (100), las dos cadenas quedaran
separadas, es decir, los puentes de hidrogeno se romperan y por lo tanto se
producira la desnaturalizacin del ADN.

La temperatura concreta de desnaturalizacin de una molcula de ADN

(temperatura de fusin), depende de la composicin de cada molcula de ADN,
va a depender en concreto de la cantidad de Guanina (G) y Citosina (C) que
contenga esa molcula; cuanto ms elevadas sean las cantidades de G y C
ms alta va a ser la temperatura de fusin, ya que las C y G se unen por triples
enlaces, al haber ms C y G hay que romper ms enlaces (romper ms puente
de H2) y por lo tanto se necesita mayor energa para romperlos
La separacin en dos hebras lleva aparejados una serie de cambios en las
variables macroscpicas de una disolucin de ADN:

Se pierde la viscosidad caracterstica de las disoluciones de ADN de

doble cadena. Esto se debe a la prdida de la conformacin
helicoidal, relativamente rgida y que forma hilos largos, y la
sustitucin por una estructura sin conformacin definida, capaz de

formar ovillos que presentan mucha menos friccin intermolecular y,

por tanto, menos viscosidad.
Se produce un aumento de la absorcin a 280 nm. Este es el llamado
efecto hipercrmico, que se produce porque la prdida de las
interacciones hidrofbicas y las fuerzas de Van der Waals entre las
bases libera a los electrones que estaban anteriormente implicados,
con lo que ahora contribuyen a la absorcin de radiacin. Este
aumento puede llegar a ser de un 40% entre las formas de cadena
doble y sencilla, pero la forma del espectro no cambia.

2. RENATURALIZACIN DEL ADN

La renaturalizacin de molculas de ADN es el proceso contrario al de la

desnaturalizacin, es decir, se parte de dos hebras sencillas para volver a
formar una doble hlice. ste es tambin un proceso cooperativo en el que
hace falta un primer apareamiento estable que haga de semilla para despus
seguir a lo largo de las hebras a modo de cremallera. La formacin de esas
primeras interacciones se llama nucleacin, y necesita una mnima cantidad de
tiempo para que se den los contactos necesarios entre las bases
complementarias. Sin embargo, a diferencia de la desnaturalizacin, para la
correcta renaturalizacin del ADN hace falta que se baje la temperatura
lentamente y no muy por debajo de la TM (10 15 C menos) para mantener el
equilibrio desnaturalizacin-renaturalizacin (que las molculas puedan
moverse y encontrarse, pero que las uniones no correctas no sean tan estables
ni permanentes) y evitar que apareen secuencias ligeramente homlogas
donde no deben. Si se bajara la temperatura bruscamente se formara un gel
de molculas de hebra sencilla parcialmente apareadas en segmentos cortos
con homologa secuencial, incluso dentro de una misma hebra. Esta
caracterstica se utiliza para guardar muestras de ADN que se quieran
conservar como hebras sencillas.

3. HIBRIDACIN DE ADN
Las tcnicas de hibridacin de ADN se basan en la deteccin de secuencias
especficas, ya sea sobre tejido (hibridacin in situ; para ver la localizacin
celular del cido nucleico que se busque) o sobre cidos nucleicos purificados
(sobre ADN tcnica de Southern; sobre ARN tcnica de Northern), mediante el
empleo de sondas. stas son fragmentos cortos de cido nucleico sintetizado
en el laboratorio, cuya secuencia es la complementaria de aqulla que se
busca y estn marcados de algn modo para poder luego detectarlos con
facilidad. Existen varios tipos de sondas:

ADNss: Se utiliza para detectar ARNm. Generalmente slo puede tener

una marca radiactiva en un extremo.

ADNds: Primero se desnaturaliza y se enfra rpidamente para obtener

ADNss, que es el que se usa. Sin embargo, este mtodo provoca la
competencia entre las mismas molculas de la sonda, con lo que se
pierde efectividad. La ventaja es que suelen ser ms largos que los
ADNss y, al ser de cadena doble, se puede introducir ms radiactividad y
a la postre el resultado puede ser ms sensible.

ADNc (ds): Son copias complementarias a un ARNm, utilizados como las

sondas anteriores.

ARNc (ss): A veces es la tcnica ms sensible. Para esto se parte del

ADNc de la protena que se quiere estudiar, al que se le aade un
promotor y un sitio de corte al final. Sobre esto se aade la polimerasa
correspondiente a ese promotor y una coleccin de nucletidos, que
pueden estar todos marcados. El ARN que se forma es el ARNc, con
secuencia complementaria a la del ARNm. Si no se conoce la orientacin
del ARNm, entonces se colocan dos promotores y dos sitios de
restriccin a sendos lados del ADNc, y se obtiene una coleccin de ARNc,
cada uno complementario de una hebra, y la mitad de ellos
complementarios del ARNm. Como se incorpora una gran cantidad de
marca, despus se trata con una ARNasa que elimina los restos de
ARNss para resaltar el contraste, y sta es la gran ventaja frente a las
sondas de ADN.

Los experimentos de hibridacin se basan en la complementariedad de bases,

pero tambin puede haber secuencias cortas o incluso componentes celulares
que hibriden o se asocien inespecficamente a la sonda. Para minimizar este
problema se juega con las condiciones de hibridacin (renaturalizacin: T,
concentraciones) y de lavado (desnaturalizacin), sobre todo con estas ltimas.
Se puede hibridar a temperaturas ms altas, para que la unin sea ms
especfica, pero sobre todo se procede a un lavado riguroso despus de
hibridar a unas condiciones poco severas, aumentando la temperatura y
bajando la concentracin de iones para que slo queden apareadas las sondas
con sus secuencias complementarias.