PRCTICA No.

1
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO CLINICO
Definicin: Conjuntos de normas y procedimientos para obtener una situacin carente
de riesgos o con riesgos limitados.
PRECAUCIONES UNIVERSALES:
1. Acceso restringido, permitido solo a personas autorizadas
2. Prohibido usar el celular, comer, fumar, beber o almacenar comidas o cualquier
objeto de uso personal dentro del laboratorio.
3. Usar ropa protectora de trabajo como mandil, mascarillas, guantes (de ltex) la
misma que debe ser retirada antes de abandonar el laboratorio. Botas y gorra en
casos de exposicin a microorganismos de alta peligrosidad.
4. Antes de iniciar cualquier actividad en el laboratorio asegurarse de que en la
mano no existan escoriaciones. En caso contrario cubrir las mismas de manera
adecuada.
5. Cambio inmediato de los guantes en caso de rotura y lavado de manos.
6. No tocarse la boca ni los ojos con las manos enguantadas
7. Evitar la formacin de aerosoles y gotas.
8. Manejo adecuados de los objetos corto punzantes. Una vez utilizados se deben
almacenar en recipientes rgidos y eliminarse luego de ser decontaminados.
9. Terminantemente prohibido pipetear con la boca. Debe utilizarse
los
pipeteadores automticos.
10. Decontaminar las superficies de trabajo una vez terminado el trabajo diario.Se
recomienda el uso de hipoclorito de sodio al 10%
11. Evitar conductas inseguras y de riesgo.
12. Manejo adecuado de los desechos desde el lugar de origen y realizar tratamiento
adecuado especialmente de los infecciosos.
13. Los desechos de los fluidos corporales pueden eliminarse por las caerias
habituales una vez que hayan sido decontaminados.
14. Lavarse las manos con abundante agua y jabn luego de haber terminado el
trabajo diario.
15. Plan de inmunizaciones para el personal de laboratorio
TRABAJO EN CLASE:
Poner en prctica las normas anteriores durante cada sesin de laboratorio

PRACTICA No. 2
Tema: Toma de muestras de sangre (venosa y capilar)
Autora: Dra. Celia Bowen

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Objetivos:
1. Conocer la tcnica para la obtencin de muestras de sangre como medio para
mantener la integridad del profesional de salud y la del paciente
2. Adiestramiento adecuado para el manejo de instrumentos necesarios en la toma
de muestras sanguneas
3. Aplicar las precauciones universales de bioseguridad en el laboratorio con
respecto al manejo de lquidos biolgicos y material infeccioso
4. Conocer los usos de los diferentes anticoagulantes empleados en el laboratorio
Fundamento terico:
La relativa facilidad con que se obtiene la sangre venosa hace de esta tcnica el
principal mtodo de obtencin de sangre en los laboratorios de anlisis clnicos. A partir
de la sangre sin anticoagulante se obtiene suero, si la sangre contiene anticoagulante, se
obtiene plasma. Del plasma forma parte el fibringeno, sustancia de la que carece el
suero.
Materiales:
-Torniquete
-Algodn
-Alcohol antisptico (isoproplico al 70%)
-Jeringuillas
-Sistema vacutainer: capsula, tubos alvaco, agujas de toma mltiple
- Lancetas
-Tubos capilares heparinizados
-Plastilina
Tcnica de la puncin venosa:
1. Se identifica al paciente comprobando que la solicitud de exmenes corresponda
al mismo
2. Si se solicita una muestra en ayunas, debe comprobarse que efectivamente el
paciente no ha ingerido alimentos
3. Hay que dirigirse al paciente e informarle sobre el procedimiento a que va a ser
sometido. Se debe tranquilizarle, eliminando en lo posible su tensin.
4. Se ha de colocar adecuadamente al paciente, segn ste se encuentre sentado, o
en decbito prono, para tener acceso fcil y cmodo a la fosa antecubital.
5. Hay que preparar todo el material, incluidos los tubos para recogida de la
muestra, el torniquete, los objetos que se emplean para limpiar la piel, las
jeringas, cuando sea necesario, la aguja estril para extraccin de sangre y
dispositivo utilizado para fijar la aguja al tubo de extraccin al vaco.
6. Se solicita al paciente que cierre el puo para que las venas resulten ms
palpables.
7. Se seleciona una vena adecuada para la puncin. Se prefieren las venas de la
fosa antecubital, en particular la cubital interna y la ceflica. Tambin pueden
utilizarse las venas de la mueca, el tobillo y la mano. Si existiera ya un catter
intravenoso en un brazo, se utilizar el otro para la extraccin de la muestra.
8. Preparar la cpsula insertando la aguja pero dejando un poco flojo la capucha de
la parte externa de la misma para retirarlo al momento de la puncin.
9. Se aplica un torniquete varios centmetros por encima de la zona de puncin
(aproximadamente a cuatro dedos sobre el doblez del brazo). No hay que dejar
Autora: Dra. Celia Bowen

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nunca el torniquete ms de 1 minuto. En casos excepcionales no debe usarse el

torniquete, por ejemplo cuando en el pedido est el Calcio.
10. Se limpia la zona de la venopuncin con una torunda embebida en solucin en
alcohol antisptico. Se comienza en el punto de la puncin y se prosigue la
limpieza hacia fuera siguiendo un movimiento en espiral. Se deje que la zona se
seque y no se toca con ningn objeto que no haya sido esterelizado previamente.
11. Se fija firmemente la vena tanto por encima como por debajo del lugar de
puncin, con la ayuda de los dedos pulgar y medio, o ndice y pulgar.
12. Se realiza la venopuncin. a) Se penetra a travs de la piel con la aguja
formando un ngulo de aproximadamente 15 con el brazo y con el bisel hacia
arriba. Se sigue la direccin de la vena con la aguja. B) Se introduce la aguja con
suavidad pero con la suficiente rapidez para reducir las molestias del paciente.
No hay que enterrar la aguja. C) Si se utiliza una jeringa, se tira hacia atrs del
mbolo, con tensin lenta y uniforme a medida que la sangre va fluyendo en su
interior. No debe realizarse este movimiento con excesiva rapidez, ya que podra
hemolizarse la sangre o colapsarse la vena. d) Si se utiliza un tubo al vaco, en
cuanto la aguja haya penetrado en la vena, se dirigir el tubo todo lo posible
hacia delante en el dispositivo de sujecin. Al mismo tiempo se sujeta
tenuemente la aguja en su lugar. Una vez que haya llenado el tubo, se retira,
cogindolo por su extremo y tirando suavemente de l.
13. Cuando la sangre comience a fluir, se suelta el torniquete.
14. Una vez que se haya extrado toda la muestra, hay que indicar al paciente que
relaje el puo y que no bombee con la mano.
15. Se coloca suavemente sobre el punto de la puncin una bola de algodn estril.
Se extrae la aguja y a continuacin se ejerce presin sobre la zona.
16. Se venda el brazo. En general es suficiente una tira de esparadrapo sobre la bola
de algodn, para detener la hemorragia.
17. Se mezclan los tubos con el anticoagulante. Si la muestra ha sido extrada con
jeringa, se transferir la sangre a los tubos correspondientes tomando las debidas
precauciones para evitar la hemlisis de las muestras.
18. Se comprobar el estado del paciente; por ejemplo, si se ha mareado y si la
hemorragia est controlada.
19. Se elimina el material contaminado: agujas, jeringas, algodones, etc.
20. Se marcan las etiquetas y se registra la hora en que se extrajeron las muestras.
21. Se envan los tubos de sangre para su anlisis a los correspondientes
departamentos del laboratorio. Si es preciso, se hace constar la hora en la
solicitud.
Puncin capilar:
1. Tener todo el material en perfecto orden: algodn, alcohol, lancetas, tubos
capilares y plastilina.
2. Pedir al paciente que se frote el dedo pulgar hasta que obtenga una buena
irrigacin de la zona de puncin.
3. Desinfectar la zona y secarla con otro algodn libre de alcohol
4. Sacar la lanceta y realizar la puncin de forma rpida y firme.
5. Deshechar la primera gota para evitar contaminacin con restos de alcohol.
6. Colocar el capilar en la zona e ir llenndolo hasta las tres cuartas partes del tubo.
7. Retirarlo de la zona y colocar un algodn con poco alcohol y solicitar al paciente
que se sostenga por unos minutos para que deje de fluir la sangre.
Autora: Dra. Celia Bowen

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8. El capilar sellarlo con plastilina y colocarlo en el lugar designado para ese

paciente.
Anticoagulantes utilizados con mas frecuencia
EDTA (tapn lila): Tubo estril con anticoagulante EDTA: sal de cido etileno
diamina tetractico di o tripotasica o di sdica, concentracin: 1,2 a 2,0mg/ml de
sangre(4,1 a 6,8mmol/l de sangre) basado en EDTA anhidro. Para uso en hematologa
Citrato de sodio (tapn azul 1/9 y tapn negro 1/4): citrato trisdico con 0,100 a
0,136 mol/l de cido ctrico. Se recomienda 0,105 mol/l para lograr la estandarizacin
recomendada por la WHO para que quede a 3,2%. Se usa para pruebas de coagulacin
(TP, TTP, fibringeno), utilizar l parte de citrato y 9 de sangre entera.
Tapn rojo: Tubo estril sin anticoagulantes ni aditivos ni geles separadores. Para
obtener suero.
Los tapones de colores con una banda Gris agregada indican que el tubo corresponde
a uno los anteriores y que adems contiene gel separador de suero o plasma
TRABAJO EN CLASE:
Estudiar bien las instrucciones anteriores para ponerlo en prctica con algn compaero
de clase
PRACTICA No. 3
Tema: Soluciones y diluciones
Objetivos:
- Conocer lo que es un soluto y un solvente para preparar soluciones a diferentes
concentraciones
- Conocer dos formas de expresar matemticamente la proporcin de soluto a
solvente dentro de una solucin (p/v y v/v)
- Realizar diluciones simples a partir de una solucin
Fundamento terico:
Las soluciones son mezclas homogneas de dos o ms substancias, que pueden
separarse por mtodos fsicos en sus diversas substancias componentes. En una
solucin, aquella substancia que se encuentra en mayor proporcin se conoce como
Solvente y las dems como Solutos.
Existen varias formas de expresar la concentracin de una solucin, esto es, la
proporcin de soluto a solvente. Para efectos cualitativos, frecuentemente se habla de
soluciones diluidas, concentradas, saturadas o sobresaturadas. Aunque existen diversas
formas de expresar matemticamente la proporcin de soluto a solvente dentro de una
solucin, las de uso mas extendido suelen ser Molaridad, el Porcentaje Peso a Volumen,
el Porcentaje Peso a Peso y las Partes por Milln.
Autora: Dra. Celia Bowen

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El porcentaje Peso a Volumen es una relacin que expresa los gramos de soluto que se
hallan contenidos en cada 100 mililitros de solucin.
Materiales y reactivos:
Materiales:
- Probeta graduada de 50 ml
- Vaso de precipitacin de 50 ml
- Matraz aforado de 50 ml
- Pipetas graduadas de : 1, 2, 5 y 10 ml.
- Peras de seguridad
- Tubos de ensayo
- Gradillas
- Balanza
- Varilla de vidrio
Reactivos:
- Safranina en polvo
- Cloruro de sodio en polvo
- Agua destilada
Procedimiento:
1. Mtodo para preparar soluciones:
Unidades de medidas:
p/v = peso de soluto sobre volumen de solvente expresado en gr/ 100ml
v/v = volumen de soluto sobre volumen de solvente expresado en ml/100 ml.
Ejemplo de soluciones p/v:
Preparar 50 ml. de solucin de NaCl (cloruro de sodio) al 0.85% en agua destilada
Datos
V1= 50 ml.
V2= 100 ml
Concentrac. Solucin= 0.85% (pesar 0.85 gramos de NaCl y aforar con agua
destilada hasta obtener 100 ml de solucin)
0.85 gr. NaCl
100 ml agua destilada
X
50 ml agua destilada
X= 0.425 gr. de NaCl disolver en agua destilada hasta
obtener 50 ml de solucin
Ejemplo de soluciones v/v:
Preparar 40 ml. de solucin de Etanol al 70% en agua destilada
Datos
V1= 40 ml.
V2= 100 ml
Concentrac. Solucin= 70% (70 ml de etanol puro diluidos en 100 ml de agua
destilada)
70 ml de etanol
100 ml agua destilada
X
40 ml agua destilada
Autora: Dra. Celia Bowen

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X= 28 ml. de etanol puro diluir en 12 ml de agua destilada para

obtener una solucin de 40 ml de etanol al 70%
2. Mtodo para realizar diluciones
Partiendo de una solucin cualquiera que sea su concentracin las diluciones se
realizan del siguiente modo:
Si se tiene una solucin HCl (cido clorhidrico) y se quiere diluir en agua destilada
1:20 para obtener un volumen final de 50 ml se realiza los siguientes clculos:
1ml de soluc. HCl
20 ml. de agua destilada
X
50 ml de agua destilada
X =2.5 ml de HCl se necesita para obtener una
solucin de 50 ml en agua destilada (medir 47.5 ml de agua)
3. Para obtener el factor de dilucin:
Utilizando el ejemplo anterior el factor de dilucin se obtiene del siguiente modo:
Fd =

Volumen mayor
=
Volumen menor (alcuota)

50 =
2,5

20

La solucin en efecto est diluida 20 veces

PRACTICA No. 4
Tema: Elemental y microscpico de orina
Objetivos:
1. Analizar la orina realizando exmenes macrscopico, qumicos y microscpicos
en la misma
2. Correlacionar los parmetros analizados con enfermedades renales o del tracto
urinario
Definicin de examen rutinario de orina: Es un examen fsico y/o qumico de la
orina y comprende una serie de pruebas qumicas y microscpicas para evaluar
infecciones del tracto urinario, enfermedad renal y enfermedades de otros rganos
que provocan la aparicin de metabolitos anormales (productos de descomposicin) en
la orina.
El examen elemental y microscpico de orina consta de tres partes:
1) Macroscpico: color, aspecto
2) Qumico (tira reactiva): pH, leucocitos, protenas, glucosa, urobilingeno,
bilirrubina, cuerpos cetnicos, sangre
3) Microscpico: leucocitos, eritrocitos, clulas bajas, clulas altas (se reporta
numero por campo en 10 camposcon lente de 40x), moco, bacterias, cristales,
parsitos, hongos (se reporta por cruces en 10 campos con lente de 40 x) y
cilindros se reporta nmero por placa (con lente de 10x).
1. Instrucciones para recoger una muestra parcial de orina
a. El frasco tiene que ser suministrado por el Laboratorio, o adquirir en la farmacia
uno estril apropiado para la recoleccin de orina.
Autora: Dra. Celia Bowen

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b. Es preferible que la orina sea la primera orina de la maana.

c. Practicar previo aseo genital, con agua y jabn, sin dejar residuos. Esto es
especialmente importante en la mujer que debe lavarse el rea entre los labios de
la vagina y evitar la contaminacin de la muestra con crema, antispticos y
secreciones vaginales. Los hombres y nios deben limpiarse la cabeza del pene
d. Deje escapar la porcin inicial de la miccin al inodoro, a continuacin recolecte
en el frasco la porcin media (10 ml) y descarte la porcin final de la miccin
nuevamente en el inodoro.
e. Tape bien el frasco y entrguelo rpidamente al Laboratorio (mximo dos horas
luego de tomar la muestra).
f. NO recoger la muestra durante el Periodo Menstrual
2. Mtodo para el anlisis de orina macroscpico y qumico:
a. Despus de recibir la orina en el laboratorio, analizarla tan pronto como sea
posible. Antes del anlisis las muestras de orina deben estar a la temperatura
ambiente
b. Realizar la homogenizacin de la orina
c. Con movimientos moderados en el recipiente transportado hasta el laboratorio
(bien mezclada y no agitada)
d. Verter en un tubo de ensayo de 16 x 100 mm aproximadamente 10 ml
e. Determinar el color, aspecto (nitidez)
f. Registrar la presencia de un olor inusual y de cantidades anormales de espuma
coloreada
g. Sumergir brevemente la tira reactiva, no ms de un segundo (evitar tocarla con
los dedos, ya sea antes o despus de sumergirla)
h. Eliminar el exceso de orina en la tira,: limpiar el borde de la misma con el
reborde del tubo o con papel secante
i. No permitir que los reactivos de la tira se junten
j. No depositar la tira reactiva directamente sobre la superficie de trabajo
k. Seguir exactamente las recomendaciones en cuanto al tiempo para cada test
qumico
l. Mantener la tira reactiva junto a la carta de colores y leer bajo una buena
iluminacin
m. Tener en cuenta las fuentes de error, la sensibilidad y la especificidad de cada
prueba con la tira reactiva
2.1.
Parmetros que se observan en el examen macroscpico :
En el examen macroscpico se analiza el aspecto como por ejemplo si es trasnparente,
ligeramente turbia, turbia, espesa, opaca y el color de la orina que puede ser amarilla
plida, amarilla oscura, mbar, roja, verde, azul entre otros.
2.2.

Parmetros que se observan en el examen qumico:

Densidad ( gravedad especfica): Registra la concentracuin inica de la

orina (es decir, qu tan concentrada o diluida se encuentra). Se basa en la
liberacin de protones por un formador de complejos en presencia de cationes.
Esto causa un viraje de color del indicador azul de bromotimol, de azul hacia
amarillo, pasando por verde azulado
pH: Indican la acidez o alcalinidad de la orina. Los valores pH ms frecuentes
en orina fresca de personas sanas se encuentran entre 5 y 6. El test es

Autora: Dra. Celia Bowen

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especfico para la deteccin de iones hidronio, siendo el valor pH el logaritmo

decimal negativo de la concentracin de iones hidronio. El papel reactivo
contiene los indicadores rojo de metilo, fenolftalena y azul de bromotimol.
Leucocitos: Comprueba la actividad estersica de granulocitos. Esta enzimas
desdoblan un ster de indoxilo a indoxilo, que reacciona con una sal de
diazonio formando un colorante violeta. se detectan leucocitos intacto y
tambin los lisados (indicio de IVU)
Nitrito: Los agentes patgenos ms frecuentemente causantes de infecciones
de las vas urinarias, E. coli y la mayora de los grmenes patgenos urinarios,
transforman el nitrato absorbido con la alimentacin en nitrito. Este es
detectado por una coloracin del rosa al rojo de la zona reactiva. El ensayo se
basa en el principio de la prueba de Griess y es especfico para el nitrito.
(indicio de IVU)
Protenas: El test se basa en el principio del error proteico de indicadores de
pH y reacciona de manera especialmente sensible a la albmina.
Glucosa: La deteccin de glucosa se efecta segn el mtodo especfico de la
glucosa-oxidasa-peroxidasa.
Cuerpos cetnicos: La deteccin se realiza en el principio de la prueba de legal
y reacciona ms intensamente al cido acetilactico que a la acetona. Las
cetonas son un subproducto del metabolismo de las grasas, presente con
inanicin y diabetes.
Urobilingeno: Es un producto de degradacin de la bilirrubina. El test se basa
en que una sal de diazonio estable produce con el urobilingeno, casi
instantneamente un colorante azico rojo
Bilirrubina: En la orina es un producto de degradacin de la hemoglobina. La
deteccin se basa en la copulacin de una sal de diazonio con bilirrubina para
formar un colorante azoico. Incluso los ms leves matices rosa ya deben ser
considerados como positivos.
Hemoglobina: Es un indicio de hemlisis. La mioglobina cataliza la oxidacin
del indicador por el hidroperxido orgnico contenido en el papel reactivo.
Puntos verdes aislados hasta acumulados en la zona reactiva amarilla indican
la presencia de eritrocitos intactos. La hemoglobina as como los eritrocitos
hemolizados o la mioglobina son indicados por una coloracin verde
homognea de la zona reactiva.

3. Mtodo para realizar el examen microscpico del sedimento urinario

a. Una vez realizado el examen microscpico y qumico de la orina, se la
centrifuga por 5-10 minutos a 1500-2000 rpm con la orina previamente
homogenizada
b. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante. El volumen final utilizado para
resuspender el sedimento puede variar segn el sistema estandarizado que se
use, pero debe ser siempre constante en cualquier laboratorio dado.
c. Resuspender con suavidad el sedimento, eliminar las dos primeras gotas y
colocar la tercera gota en una placa portaobjetos, cubrir con un cubreobjetos.
Dejar que la orina se deposite durante 30 a 60 segundos.
d. Observar al microscopio con objetivos de pequeo y gran aumento. Para
detectar algunas entidades del sedimento con un ndice bajo de refraccin
ser necesaria una luz amortiguada o una iluminacin de contraste de fase.
El foco fino debe variarse continuamente mientras se examina. Progresar de
Autora: Dra. Celia Bowen

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e.

f.

g.
h.
i.
j.
k.

manera sistemtica a lo largo de toda la placa, teniendo cuidado de examinar

los bordes en busca de cilindros.
Recuento del nmero de cilindros por lo menos en 10 campos de pequeo
aumento (10x) y anotar en el informe el nmero de cilindros por campo.
Puede utilizarse un margen razonable, es decir, 0 a 2, 2 a 5, 5 a 10, etc. Usar
el gran aumento (40x) para indicar el tipo de cilindros. Los cilindros se
apreciarn si se utiliza microscopio de contraste de fase.
Identificacin y recuento de los eritrocitos, leucocitos y clulas epiteliales
renales utilizando el objetivo de gran aumento (40x). Efectuar el recuento
por lo menos 10 campo de gran aumento y expresarlo como clulas por
campo. En el informe puede utilizarse un margen razonable.
Reportar:
Las clulas epiteliales (bajas) y altas si estn presentes en gran nmero o
como fragmentos (clulas transicionales)
Bacterias, levaduras, microorganismos. Una bacteriuria detectable a pequeo
aumento puede expresarse por lo menos como 2 +.
Los cristales se cuantifican bajo pequeo aumento. La presencia de cristales
anormales debe confirmarse qumicamentey correlacionarse con la historia
del paciente
Grandes cantidades de moco

OBSERVACIN: Para el siguiente literal por favor revisar el atlas para segundo
nivel ubicado en el internet cuya pgina es ftp.puce.edu.ec
3.1.
Elementos que se observan en el examen microscpico:

Las bacterias y otros microorganismos (normalmente no estn presentes)

Cilindros urinarios
Cristales
Grasa
Moco
Glbulos rojos (un indicio de dao en los tbulos)
Clulas tubulares renales
Clulas epiteliales de transicin
Glbulos blancos (un indicio de infeccin del tracto urinario)

TAREA EN CLASE:
Cada estudiante debe traer su muestra de orina siguiendo las instrucciones anteriores,
realizar el anlisis clnico durante la prctica y realizar el reporte de la misma para
archivar en la carpeta.
PRACTICA No. 6

CARBOHIDRATOS: Determinacin de glucosa en sangre

1. Objetivos:
1. Conocer la tcnica mediante la cual se determina la glucosa en sangre
2. Diferenciar pacientes con hipo e hiperglicemia
Autora: Dra. Celia Bowen

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2. Fundamento terico:
La glucosa es la principal fuente de energa de las clulas en el organismo. La glucosa
es un monosacrido con una concentracin postpandrial de 90 mg/dl en la sangre y sirve
como una fuente de energa indispensable para la funcin celular.
El diagnstico de los trastornos del metabolismo de los hidratos de carbono se apoya en
parte en la medicin de la glucosa plasmtica, ya sea en ayuna o tras estimulacin o
pruebas de supresin.
Los resultados de la glucosa plasmtica pueden clasificarse como hiperglucmicos
(como la diabetes mellitus) o hipoglucmicos.
Principio de la reaccin:
La prueba utilizada se determina mediante el mtodo enzimtico colorimtrico, basado
en la reaccin de Trinder.
Glucosa + O2 + H2O

GOD (glucosa oxidasa) cido glucnico + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol

POD (peroxidasa)

quinoneimina (rojo) + 4H2O

La glucosa se determina despus de la oxidacin enzimtica en presencia de glucosa

oxidasa. El perxido de hidrgeno formado reacciona bajo la catlisis de peroxidasa con
fenol y 4-aminoantipirina formando un complejo rojo violeta llamado quinoneimina.
Punto final de una reaccin: Las reacciones catalizadas por enzimas son nicas en el
sentido de que presentan aumentos muy grandes de la velocidad en relacin a las
reacciones no catalizadas y muestran una cintica de saturacin, es decir la velocidad de
la reaccin alcanza un valor mximo a una concentracin determinada de sustrato, no
dan por resultado aumento de la velocidad de la reaccin. La medida se realiza siempre
en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc. En estas
condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (V max). La
velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la
desaparicin de los reactivos.
En el caso de la reaccin de la glucosa catalizada por la enzima glucosa oxidasa y la
peroxidasa llega a su punto final cuando todo el sustrato (glucosa) se ha oxidado, y
despus se mide el cambio de color.
Espectofotmetro:
La absorbancia y la transmitancia de una sustancia en disolucin se miden con un
aparato denominado espectrofotmetro, el cual consta bsicamente de los siguientes
componentes:
Fuente de luz: Lmpara que emite una mezcla de longitudes de onda.
Colimador: Conjunto de lentes que enfocan la luz convirtindola en un haz de rayos
paralelos.
Autora: Dra. Celia Bowen

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Monocromador: Dispositivo que selecciona luz de una nica longitud de onda.

Detector fotoelctrico: Transductor de luz en electricidad. La luz provoca el
desplazamiento de electrones en el metal del detector, produciendo una corriente
elctrica que es proporcional a la intensidad de la luz recibida.
Registrador: Mide la seal del detector, la compara y genera una medida en una escala
determinada.

A) Esquema de un espectrofotmetro de un solo haz

B) Esquema de un espectrofotmetro de doble haz, en el cual se corrigen las
variaciones espectrales de los diferentes elementos pticos que lo componen
El funcionamiento del espectrofotmetro es el que sigue: la luz de una fuente continua
pasa a travs de un monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitudes de
onda del haz incidente.
Esta luz monocromtica atraviesa una muestra de espesor b, y se mide la
potencia radiante de la luz que sale. Es necesario calibrar el espectrofotmetro con un
blanco antes de medir las absorbancias de la disolucin problema. Esta celda o cubeta
de referencia sirve para compensar los efectos de reflexin, dispersin o absorcin de
luz
de
la
celda
con
el
disolvente.
Cuando emerge poca luz de la muestra (absorbancia alta), la intensidad es difcil
de medir. Cuando emerge mucha luz de la muestra (absorbancia baja), es difcil detectar
la diferencia de absorbancia entre las celdas de muestra y de referencia.
3. Parte experimental:
3.1. Procedimiento:
Ensayo:
Autora: Dra. Celia Bowen

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Longitud de onda: Hg 546 nm.

Paso de luz: 1 cm
Temperatura: 20-25C
Medicin: frente a un blanco de reactivo. Se requiere un blanco de reactivo por serie
Esquema de pipeteo:
Microdeterminacin
Pipetear en las cubetas

Blanco de reactivo

STD muestra

STD muestra
5 ul

Reactivo para glucosa

500 ul
500 ul
Mezclar, incubar por 10 minutos de 20-25C 5 minutos a 37C. Medir la absorbancia
del STD y las muestras frente a un blanco de reactivo antes de 60 minutos.

Materiales y reactivos:
Materiales

Reactivos

Espectrofotmetro

Reactivo para glucosa

Tubos de ensayo

Estndar de glucosa (100 mg/dl)

Gradilla

Muestras de suero sanguneo ( plasma)

Pipetas automtica
Puntas de plstico para pipetas automt..
Reloj
Cubetas de plstico para espectrofot.
Nota: El espectrofotmetro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las
absorbancias.
1. Clculo de la concentracin de la glucosa
C (mg/dl)= 100 x A muestra
A Estndar
Autora: Dra. Celia Bowen

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Valores de referencia: 70 100 mg/dl

TRABAJO EN CLASE:
Realizar el anlisis de glucosa en un suero sanguneo y luego reportar los clculos en la
carpeta con la respectiva interpretacin del resultado

PRCTICA No 7
LPIDOS: Determinacin de colesterol en sangre
1. Objetivos:
3. Conocer la tcnica mediante la cual se determina el colesterol en sangre
4. Diferenciar pacientes con hipo e hipercolesteremia
2. Fundamento terico:
Los principales lpidos del plasma humano son el colesterol, los steres del colesterol,
los triglicridos, los fosfolpidos y los cidos grasos no esterificados. El colesterol es un
importante componente estructural de las membranas celulares y un precursor para la
biosntesis de los cidos biliares y las hormonas esteroideas.
El riesgo cardiovascular es una funcin continua de la concentracin de colesterol y que
los individuos situados en el lmite superior del margen normal tienen un riesgo mayor
que los que estn situados en el lmite inferior.
La prueba utilizada para determinar colesterol es mediante el mtodo enzimtico
colorimtrico del siguiente modo:
Principio de la reaccin:
Esteres de colesterol + H2O

CHE(colesterol esterasa) colesterol + cidos grasos

Colesterol + O2

CHO (colesterol oxidasa) colesterol- 3-ona + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol POD (peroxidasa)

Quinoneimina (rojo) + 4 H2O

El colesterol se determina despus de hidrlisis enzimtica y oxidacin. El indicador es

la quinoneimina (complejo rojo) formada por el perxido de hidrgeno y 4aminoantipirina en presencia de fenol y peroxidasa.
2. Parte experimental:
2.1. Procedimiento:
Ensayo:
Autora: Dra. Celia Bowen

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Longitud de onda: Hg 546 nm.

Paso de luz: 1 cm
Temperatura: 20-25C
Medicin: frente a un blanco de reactivo. Se requiere un blanco de reactivo por serie
Esquema de pipeteo:
Microdeterminacin
Pipetear en las cubetas

Blanco de reactivo

STD muestra

STD muestra
5 ul

Reactivo para colesterol

500 ul
500 ul
Mezclar, incubar por 10 minutos de 20-25C 5 minutos a 37C. Medir la absorbancia
del STD y las muestras frente a un blanco de reactivo antes de 60 minutos.

Materiales y reactivos:
Materiales

Reactivos

Espectrofotmetro

Reactivo para colesterol

Tubos de ensayo

Estndar de colesterol (200 mg/dl)

Gradilla

Muestras de suero sanguneo (o plasma)

Pipetas automtica
Puntas de plstico para pipetas automt..
Reloj
Cubetas de plstico para espectrofot.
Nota: El espectrofotmetro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las
absorbancias.
2. Clculo de la concentracin de colesterol
C (mg/dl)= 200 x A muestra
A Estndar
Valores de referencia: hasta 200 mg/dl
Autora: Dra. Celia Bowen

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TRABAJO EN CLASE:
Realizar el anlisis de colesterol en un suero sanguneo y luego reportar los clculos en
la carpeta con la respectiva interpretacin del resultado
CONSULTA:
Criterios de la OMS para:
- Sndromes metablicos
- Factores de riesgo cardiovascular
Nota: Archivar en la carpeta y estudiar para la evaluacin parcial

PRCTICA No. 8
TEMA: Mtodo para electroforesis de protenas en suero
Objetivo:
Aplicar la tcnica de electroforesis para separar las diversas fracciones protecas del
suero humano
Fundamento terico:
La electroforesis es una tcnica basada en los movimientos de molculas cargadas en un
campo elctrico, cada molcula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (ctodo y
nodo), este movimiento denominado electroforesis da nombre a la tcnica. En el
transporte electrofortico, a la fuerza del campo elctrico se opone la resistencia viscosa
del medio, producindose, cuando se igualan una velocidad constante de
desplazamiento de las partculas.
En resumen, puede decirse que cuando una molcula cargada se coloca en un campo
elctrico se mover hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga elctrica, 2)
su tamao, 3) la intensidad del campo elctrico y 4) la temperatura del medio.
La electroforesis se aplica en el campo de la Bioqumica a la separacin de compuestos
que poseen grupos ionizables (aminocidos, pptidos, protenas, cidos nucleicos)
teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en
que se encuentren. Si la molcula tiene carga positiva migrar hacia el ctodo, si tiene
carga negativa hacia el nodo. La fuerza inica de la solucin tampn tiene una
importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite
velocidades de migracin de los solutos ms rpidas y con menor desprendimiento de
calor.
Las protenas estn compuestas de aminocidos que poseen grupos ionizables
(principalmente -COO- y NH+ 3), pueden encontrarse cargadas positiva o
negativamente, o bien de permanecer elctricamente neutras segn la proporcin de los
diversos grupos ionizados a un determinado pH. En su punto isoelctrico (pI o pH I), la
Autora: Dra. Celia Bowen

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protena tiene carga neta cero. Por debajo de pI las protenas estarn cargadas
positivamente y por encima del pI negativamente.
El porcentaje normal de estas protenas en el suero humano es:
-Albmina54-62%
--globulinas9-15%
--globulinas14-19%
--globulinas14-19%

En el siguiente cuadro se observa la concentracin normal en mg/dl , peso molecular

(PM) y funciones de las protenas (el cuadro no presenta una clasificacin completa de
las protenas, se observan unos cuantos ejemplos que se encuentran en mayor
concentracin)
PROTENAS
PM
CONCENTRACIN FUNCIN
1)Albmina
69000
3500 a 4500 mg/dl
Presin onctica y
transporte
2)Globulinas alfa1
Alfa1 glucoprotena 40000
55 a 140 mg/dl
Protena de fase
cida
aguda
Alfa 1 antitripsina
54000
200 400 mg/dl
Proteasa inhibidora
3)Globulinas alfa2
Alfa2
725000
140 420 mg/dl
Proteasa inhibidora
macroglobulina
Haptoglobina
90000
380 a 780 mg/dl
Liga HB circulante
3.Globulinas beta
Transferrina
76000
200 a 300 mg/dl
Transporte del Fe
Hemopexina
5700
50 a 100 mg/dl
Liga el hem
4.Gama globulinas
IgG
150000
700 a 1500 mg/dl
Anticuerpos
IgA
150000 a 300000
Anticuerpos
IgM
750000 a 900000
Anticuerpos
Crioglobulinas
220
Desconocido
TRABAJO EN CLASE:
Realizar el anlisis de las protenas en un suero sanguneo y luego reportar en la carpeta
con una foto los resultados con una posible patologa de la respectiva consulta (realizar
un ejemplo de cada una en la misma foto)
CONSULTA:
Patologas que se presentan cuando hay aumento disminucin de cada una de las
proteinas (albmina, alfa1 y alfa2 globulina, beta1 y beta globulina, gamma globulina)
Nota: Archivar en la carpeta y estudiar para la evaluacin parcial

Autora: Dra. Celia Bowen

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PRCTICA No. 9
TEMA: Determinacin de urea (Mtodo enzimtico-colorimtrico)
Fundamento terico:
La urea es el principal compuesto nitrogenado no proteico ms imporatnte en la mayora
de los lquidos biolgicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo
proteco. Se produce en el hgado y es excretada en la orina a travs de los riones.
Una elevacin de la concentracin srica de urea, se interpreta generalmente como una
posible disfuncin renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los
valores sricos de urea se encuentran ntimamente relacionados con la dieta y el
metabolismo proteico, por lo que cualquier alteracin en estas variables se traducir en
un cambio de la concentracin de urea en suero.
Fundamento del mtodo:
La urea se hidroliza por accin de la ureasa en presencia de agua para producir
amonaco y dixido de carbono. En una reaccin de berthelot modificada los iones
amonio reaccionan con hipoclorito y salicilato produciendo un complejo verde llamado
indofenol que se determina colorimtricamente.
ureasa
NH2 CO NH2 + H2O

(NH4+)2 + CO2
Nitroprusiato (no es enzima)
(NH4+)+salicilato+ClONa+ 2-oxoglutarato

Indofenol (verde)

Parte experimental:
1.Procedimiento (en suero o plasma):
1.1. En cuatro tubos de ensayo marcados como B (blanco), S (Standard), M1 (muestra
1) y M2 (muestra 2) agregar:
B
S
M1
M2
Standard
10 ul
Suero o plasma
10 ul
10 ul
Reactivo 1
1000 ul
1000 ul
1000 ul
1000 ul
Enzima ureasa
5 ul
5 ul
5 ul
5 ul
Mezclar por agitacin suave e incubar 10 minutos a 20-25 C o por 3 minutos a 37C
Reactivo 2
1000 ul
1000 ul
1000 ul
1000 ul
Mezclar por agitacin suave e incubar 10 minutos a 20-25 C o por 5 minutos a 37C.
Leer la absorbancia de la muestra (A muestra) y del estndar (A Estndar) en
espectrofotmetro a Hg 578 nm frente a un blanco reactivo antes de 60 minutos
Clculos de concentracin de urea:
C (mg/dl)= A_muestra x 80
A estandar
Valores de referencia en suero: 10 50 mg/dl
Parmetros a considerar:
- El espectrofotmetro debe estar encendido 20 minutos antes de realizar las lecturas de
las muestras
Autora: Dra. Celia Bowen

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2.Materiales y reactivos:
2.1. Materiales:
-Gradilla
-Cuatro tubos de ensayo
-Espectrofotmetro
-Pipetas automticas
-Puntas de plstico para pipeta automtica
-Cubetas de plstico para espectrofotmetro
-Reloj
2.2.Reactivos:
-Reactivo 1: Buffer fosfatos (pH 7.0), Salicilato de sodio, Nitroprusiato de sodio,
EDTA
-Reactivo 2: Buffer fosfato (pH 13), hipoclorito
-Standard: solucin de urea 80 mg/dl
-Ureasa (enzima): Solucin estabilizada y tamponada de alta potencia
-Suero sanguneo
TRABAJO EN CLASE:
Realizar el anlisis de urea en un suero sanguneo y luego reportar los clculos en la
carpeta con la respectiva interpretacin del resultado
PRCTICA No. 10
TEMA: Determinacin de transaminasas : TGO y TGP
Las transaminasas son unas enzimas, principalmente localizadas en el hgado. Las ms
importantes son:
- TGO: Transaminasa glutmicooxalactica. Est presente en casi todos los
rganos, dentro de las clulas y que cuando se encuentran en sangre en niveles
muy elevados significa que ha habido destruccin celular.
- TGP: Transaminasa glutmicopirvica. Se localiza principalmente en el hgado y
su misin es la fabricacin de glucosa.
Se utilizan en la clnica para la confirmacin diagnstica del infarto agudo de miocardio
y para el estudio de enfermedades hepticas o musculares.
Para realizar el examen en sangre, previamente es necesario que el paciente, unos das
antes, haga una dieta en la que no sobrecargue el hgado, no tomando alcohol, escasas
protenas y grasas y tambin es necasrio no realizar esfuerzos fsicos importantes
Parte experimental:
1.Procedimiento (en suero o plasma) tanto para TGO como para TGP:
Longitud de onda: Hg 334 nm
Temperatura: 25 C
Cubeta: 1 cm paso de luz
Ajuste cero: contra el aire
Autora: Dra. Celia Bowen

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Reactivo de trabajo
Muestra

1000 ul colocar en la cubeta

100 ul colocar en la cubeta

Mezclar e incubar por 1 minuto a temperatura de 25 C, leer en el espectrofotmetro

(A1), repetir las lecturas exactamente al 2do.( A2) y 3er. Minuto(A3)
Realizar los clculos:
A/ min = A1 - A2 (usando los dos primeros minutos de lecturas de absorbancia)
A1/ min = A1 - A2 (usando los tres minutos de lecturas de absorbancia)
A2/ min = A2 A3
A/ min = (A1 + A2)/2
Concentracin de TGP = A x 1790
Concentracin de TGO= A x 1790
Reportar los resultados en U/l
Valores de referencia (vara de acuerdo a la marca comercial del reactivo y a la
temperatura de medicin):
TGO: Mujeres hasta 32 U/l
Hombres hasta 38U/l
TGP: Mujeres hasta 31 U/l
Hombres: hasta 41 U/l
Parmetros a considerar:
- Espectrofotmetro encender 20 minutos antes de realizar las lecturas de las muestras
2.Materiales y reactivos:
2.1. Materiales:
Espectrofotmetro, pipetas automticas, puntas de plsticos para pipeta, cubetas, reloj
2.2.Reactivos:
TGO y TGP
TRABAJO EN CLASE:
Realizar el anlisis de TGO TGP en un suero sanguneo y luego reportar los clculos
en la carpeta con la respectiva interpretacin del resultado

PRCTICA No. 11
TEMA: Determinacin de bilirrubina total y directa
El 80-85% de la bilirrubina se origina de la degradacin de la hemoglobina con un 1520% que es derivada del citocromo, mioglobina y catalasas. La bilirrubina no
conjugada, la cal se liga a la albmina del plasma, es producida en el curso de la
degradacin en el sistema reticuloendotelial, clulas Kupffer del hgado, bazo y mdula
Autora: Dra. Celia Bowen

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sea. Los ensayo de bilirrubina son posible para evaluar el grado de severidadad de los
sntomas clnicos de la ictericia as como para evaluar la funcin y el estado del hgado.
Significado de los resultados anormales
La ictericia es la coloracin amarillenta de la piel y de la esclertica del ojo, que ocurre
cuando la bilirrubina se acumula en la sangre a un nivel mayor a 2.5 mg/dL
aproximadamente. La ictericia se presenta porque los glbulos rojos se estn
descomponiendo demasiado rpido para que el hgado los procese, lo cual podra
suceder debido a una enfermedad heptica o a una obstruccin de las vas biliares.
Si hay una obstruccin de las vas biliares, la bilirrubina directa se acumular, escapar
del hgado y terminar en la sangre. Si los niveles son lo suficientemente altos, una
parte de ella aparecer en la orina. Slo la bilirrubina directa aparece en la orina. El
aumento de la bilirrubina directa generalmente significa que las vas biliares (secrecin
heptica) estn obstruidas.
El aumento de la bilirrubina indirecta o bilirrubina total pueden ser un signo de:

Sndrome de Crigler-Najjar
Eritoblastosis fetal
Enfermedad de Gilbert
Cicatrizacin de un hematoma grande (moretn o sangrado bajo la piel)
Anemia hemoltica
Enfermedad hemoltica del recin nacido
Hepatitis
Ictericia fisiolgica (normal en los recin nacidos)
Anemia drepanoctica
Reaccin a una transfusin
Anemia perniciosa

El aumento de la bilirrubina directa puede indicar:

Obstruccin de las vas biliares

Cirrosis
Sndrome de Dubin-Johnson (muy raro)
Hepatitis
Colestasis intraheptica (acumulacin de bilis en el hgado) debido a cualquier
causa

En presencia del acelerador cafena, la bilirrubina total se acopla con el cido sulfnico
para formar un complejo azobilirrubinado rojo, la intensidad del color es proporcional a
la concentracin de la bilirrubina. La determinacin de la bilirrubina directa es
desarrollada sin aditivo de cafena. La adicin de tartrato alcalino causa una
transformacin del complejo rojo de la azobilirrubina a un complejo azul y las lecturas
de las absorvancias son entre 546-578 nm.
Bilirrubina total:
Acido sulfanlico + NaNO2

cido sulfnico diazotizado

Autora: Dra. Celia Bowen

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Bilirrubina + cido sulfnico diazotizado

Azobilirrubina + tartrato

cafena

azobilirrubina (rojo)

complejo verde

1. Esquema de pipeteo:
Bilirrubina total
Microdeterminacin
Pipetear en las cubetas

Blanco de reactivo

Muestra

Reactivo 1

100 ul

100 ul

Reactivo 2

------

25 ul

Reactivo 3

500 ul

500 ul

Muestra

100 ul

100 ul

Mezclar, incubar por 10-60 minutos a temperatura ambiente. Aadir:

Reactivo 4

500 ul

500 ul

Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 5-30 minutos. Leer la absorbancia de la

muestra contra el blanco
Bilirrubina directa
Pipetear en las cubetas

Blanco de reactivo

Muestra

Reactivo 1

100 ul

100 ul

Reactivo 2

------

25 ul

Solucin NaCl 0.9%

1000 ul

1000 ul

Muestra

100 ul

100 ul

Mezclar, incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Leer la absorbancia de la

muestra contra el blanco
2. Clculos:
Bilirrubina total:
C (mg/dl)= 10.8 x A bilirrubina total
Bilirrubina directa: C (mg/dl)= 13.7 x A bilirrubina directa
Bilirrubina indirecta: BI= Bilirrubina total (BT) - bilirrubina directa (BD)
Autora: Dra. Celia Bowen

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3. Materiales y reactivos:
Materiales

Reactivos

Espectrofotmetro

Reactivos para bilirrubina

Tubos de ensayo

Muestras de suero sanguneo ( plasma)

Gradilla
Pipetas automtica
Puntas de plstico para pipetas automt..
Reloj
Cubetas de plstico para espectrofot.
Nota: El espectrofotmetro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las
absorbancias.
Valores de referencia:
Bilirrubina total: hasta 1.0 mg/dl
Bilirrubina directa: hasta 0.25 mg/dl
TRABAJO EN CLASE:
Realizar el anlisis de las bilirrubinas en un suero sanguneo y luego reportar los
clculos en la carpeta con la respectiva interpretacin del resultado
BIBLIOGRAFIA:

ngel M., G. y M. ngel R., Interpretacin Clnica del Laboratorio, 6. edicin, Editorial
Mdica Panamericana, Bogot, 2.001
Henry, J. B., Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio, 9. Edicin, Editorial
Salvat Mdica, Mxico, 1.993
Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, O. M. S., Ginebra, 1.994
Mtodos Bsicos de Laboratorio en Parasitologa Mdica, O. M. S., Ginebra, 1.992
Morn Villaroto, Obtencin de Muestras Sanguneas de Calidad Analtica, Editorial Mdica
Panamericana, Mxico, 2.001

Autora: Dra. Celia Bowen

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