TERAPIA GENICA

La terapia gnica consiste en la insercin de elementos funcionales ausentes en el genoma de un individuo. Se realiza
en las clulas y tejidos con el objetivo de tratar una enfermedad o realizar un marcaje.
La tcnica todava est en desarrollo, motivo por el cual su aplicacin se lleva principalmente a cabo dentro de ensayos
clnicos controlados, y para el tratamiento de enfermedades severas o bien de tipo hereditario o adquirido. Al principio se
plante slo para el tratamiento de enfermedades genticas, pero hoy en da se plantea ya para casi cualquier
enfermedad.
Entre los criterios para elegir este tipo de terapia se encuentran:
Enfermedad letal sin tratamiento.
La causa sea un nico gen que est ya clonado.
La regulacin del gen sea precisa y conocida.
Tipos de terapia gnica
Terapia gnica somtica: se realiza sobre las clulas somticas de un individuo, por lo que las modificaciones que
implique la terapia slo tienen lugar en dicho paciente.
Terapia in vivo: la transformacin celular tiene lugar dentro del paciente al que se le administra la terapia. Consiste en
administrarle al paciente un gen a travs de un vehculo (por ejemplo un virus), el cual debe localizar las clulas a
infectar. El problema que presenta esta tcnica es que es muy difcil conseguir que un vector localice a un nico tipo de
clulas diana.
Terapia ex vivo: la transformacin celular se lleva a cabo a partir de una biopsia del tejido del paciente y luego se le
trasplantan las clulas ya transformadas. Como ocurre fuera del cuerpo del paciente, este tipo de terapia es mucho ms
fcil de llevar a cabo y permite un control mayor de las clulas infectadas. Esta tcnica est casi completamente reducida
a clulas hematopoyticas pues son clulas cultivables, constituyendo as un material transplantable.
Terapia gnica germinal: se realizara sobre las clulas germinales del paciente, por lo que los cambios generados por
los genes teraputicos seran hereditarios. No obstante, por cuestiones ticas y jurdicas, sta clase de terapia gnica no
se lleva a cabo hoy en da.
Procedimiento
Aunque se han utilizado enfoques muy distintos, en la mayora de los estudios de terapia gnica, una copia del gen
funcional se inserta en el genoma para compensar el defectivo. Si sta copia simplemente se introduce en el husped, se
trata de terapia gnica de adicin. Si tratamos, por medio de la recombinacin homloga, de eliminar la copia defectiva y
cambiarla por la funcional, se trata de terapia de sustitucin.
Actualmente, el tipo ms comn de vectores utilizados son los virus, que pueden ser genticamente alterados para
dejar de ser patgenos y portar genes de otros organismos. No obstante, existen otros tipos de vectores de origen no
vrico que tambin han sido utilizados para ello. As mismo, el ADN puede ser introducido en el paciente mediante
mtodos fsicos (no biolgicos) como electroporacin, biobalstica...
Las clulas diana del paciente se infectan con el vector (en el caso de que se trate de un virus) o se transforman con el
ADN a introducir. Este ADN, una vez dentro de la clula husped, se transcribe y traduce a una protena funcional, que
va a realizar su funcin, y, en teora, a corregir el defecto que causaba la enfermedad.
Vectores en terapia gnica
La gran diversidad de situaciones en las que podra aplicarse la terapia gnica hace imposible la existencia de un solo
tipo de vector adecuado. Sin embargo, pueden definirse las siguientes caractersticas para un "vector ideal" y adaptarlas
luego a situaciones concretas:
Que sea reproducible.
Que sea estable.
Que permita la insercin de material gentico sin lmite de tamao.
Que permita la transduccin tanto en clulas en divisin como en aquellas que no estn proliferando.
Que posibilite la integracin del gen teraputico en un sitio especfico del genoma.
Que se integre una vez por clula, para poder controlar la dosis.
Que reconozca y acte sobre clulas especficas.
Que la expresin del gen teraputico pueda ser regulada.
Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.
Que pueda ser caracterizado completamente.
Que sea inocuo o que sus posibles efectos secundarios sean mnimos.
Que sea fcil de producir y almacenar.

Que todo el proceso de su desarrollo tenga un coste razonable.

Los vectores van a contener los elementos que queramos introducir al paciente, que no van a ser slo los genes
funcionales, sino tambin elementos necesarios para su expresin y regulacin, como pueden ser promotores,
potenciadores o secuencias especficas que permitan su control bajo ciertas condiciones.
Podemos distinguir dos categoras principales en vectores usados en terapia gnica: virales y no virales.
Virus
Todos los virus son capaces de introducir su material gentico en la clula husped como parte de su ciclo de replicacin.
Gracias a ello, pueden producir ms copias de s mismos, e infectar a otras clulas.
Algunos tipos de virus insertan sus genes fsicamente en el genoma del husped, otros pasan por varios orgnulos
celulares en su ciclo de infeccin y otros se replican directamente en el citoplasma, por lo que en funcin de la terapia a
realizar nos puede interesar uno u otro.
Algo comn a la mayora de estrategias con virus es la necesidad de usar lneas celulares "empaquetadoras" o virus
helpers, que porten los genes que les eliminamos a nuestros vectores y que permiten la infeccin.
Retrovirus
El genoma de los retrovirus est constituido por ARN de cadena sencilla, en el cual se distinguen tres zonas claramente
definidas: una intermedia con genes estructurales, y dos flanqueantes con genes y estructuras reguladoras. Cuando un
retrovirus infecta a una clula husped, introduce su ARN junto con algunas enzimas que se encuentran en la matriz,
concretamente una proteasa, una transcriptasa inversa y una integrasa.
La accin de la retrotranscriptasa permite la sntesis del ADN genmico del virus a partir del ARN. A continuacin, la
integrasa introduce este ADN en el genoma del husped. A partir de este punto, el virus puede permanecer latente o
puede activar la replicacin masivamente.
Para usar los retrovirus como vectores vricos para terapia gnica inicialmente se eliminaron los genes responsables de
su replicacin y se reemplazaron estas regiones por el gen a introducir seguido de un gen marcador.
Del genoma vrico quedaban las secuencias LTR; y los elementos necesarios para producir los vectores a gran escala y
para transformar las clulas son aportados desde otros vectores, bien plasmdicos o bien en lneas celulares especficas.
En el caso de usar vectores plasmdicos, estrategias como cotransformar con varios plsmidos distintos que codifiquen
para las protenas del retrovirus, y que la transcripcin de sus secuencias est sometida a promotores eucariotas puede
contribuir a minimizar el riesgo de que por recombinacin se generen virus recombinantes.1
Actualmente se buscan estrategias como la anterior para conseguir una mayor seguridad en el proceso. La adicin de
colas de poliadenina al transgn para evitar la transcripcin de la segunda secuencia LTR es un ejemplo de esto.
Los retrovirus como vector en terapia gnica presentan un inconveniente considerable, y es que la enzima integrasa
puede insertar el material gentico en cualquier zona del genoma del husped, pudiendo causar efectos deletreos como
la modificacin en el patrn de la expresin (efecto posicional) o la mutagnesis de un gen silvestre por insercin.
Ensayos de terapia gnica utilizando vectores retrovirales para tratar la inmunodeficiencia combinada grave ligada al
cromosoma X (X-SCID) representan la aplicacin ms exitosa de la terapia hasta la fecha. As, ms de veinte pacientes
han sido tratado en Francia y Gran Bretaa, con una alta tasa de reconstitucin del sistema inmunitario. Sin embargo,
ensayos similares fueron restringidos en los Estados Unidos cuando se inform de la aparicin de leucemia en pacientes.
[cita requerida] Hasta hoy se conocen cuatro casos de nios franceses y uno britnico que han desarrollado leucemia
como resultado de mutagnesis por insercin de los vectores retrovirales, y todos menos uno de estos nios
respondieron bien al tratamiento convencional contra la leucemia. [cita requerida] En la actualidad, la terapia gnica para
tratar SCID contina siendo exitosa en Estados Unidos, Gran Bretaa, Italia y Japn.[cita requerida]
Adenovirus.
Los adenovirus presentan un genoma de ADN bicatenario, y no integran su genoma cuando infectan a la clula husped,
sino que la molcula de ADN permanece libre en el ncleo celular y se transcribe de forma independiente. Esto supone
que el efecto posicional o la mutagnesis por insercin no se dan en estos vectores, lo cual no quiere decir que no
tengan otros inconvenientes. Adems, debido al hecho de que en su ciclo natural se introducen en el ncleo de la clula,
pueden infectar tanto clulas en divisin como clulas quiescentes.
A los vectores de primera generacin se les elimin parte del gen E1, bsica para la replicacin, y a los de 2., se les
eliminaron otros genes tempranos en el ciclo del virus. En ambos casos, cuando se realiza una infeccin con una
concentracin elevada de virus, se produce la expresin de otros genes que provocan una respuesta inmune
considerable.
Por ello, los ltimos vectores basados en adenovirus prcticamente han sido desprovistos de la mayor parte de sus
genes, con la excepcin de las regiones ITR (regiones repetidas de forma invertida), y la zona necesaria para la
encapsidacin.
Virus Adenoasociados (AAV)
Los AAV son virus pequeos con un genoma de ADN monocatenario. Pueden integrarse especficamente en el
cromosoma 19 con una alta probabilidad. Sin embargo, el VAA recombinante que se usa como vector y que no contiene
ningn gen viral, solo el gen teraputico, no se integra en el genoma. En su lugar, el genoma vrico recombinante fusiona

sus extremos a travs del ITR (repeticiones terminales invertidas), apareciendo recombinacin de la forma circular y
episomal que se predice que pueden ser la causa de la expresin gnica a largo plazo.
Las desventajes de los sistemas basados en AAV radican principalmente en la limitacin del tamao de DNA
recombinante que podemos usar, que es muy poco, dado el tamao del virus. Tambin el proceso de produccin e
infeccin resultan bastante complejos. No obstante, como se trata de un virus no patgeno en la mayora de los
pacientes tratados no aparecen respuestas inmunes para eliminar el virus ni las clulas con las que han sido tratados.
Muchos ensayos con VAA estn en curso o en preparacin, principalmente en el tratamiento de msculos y
enfermedades oculares, los dos tejidos donde el virus parece ser particularmente til[cita requerida]. Sin embargo, se
estn comenzando a realizar pruebas clnicas, donde vectores basados en el VAA son utilizados para introducir los genes
en el cerebro[cita requerida]. Esto es posible porque VAA pueden infectar clulas que no estn en estado de divisin,
tales como las neuronas.
Herpes virus
Los herpesvirus son virus de ADN capaces de establecer latencia en sus clulas husped. Son complejos genticamente
hablando, pero para su uso como vectores tienen la ventaja de poder incorporar fragmentos de DNA exgeno de gran
tamao (hasta unas 30 kb). Adems, aunque su ciclo ltico lo realizan en el lugar de infeccin, establecen la latencia en
neuronas, las cuales estn implicadas en numerosas enfermedades del sistema nervioso, y son por ello dianas de gran
inters.
Los vectores herpesvricos puestos en marcha han usado dos estrategias principales:
- La recombinacin homloga entre el genoma del virus completo y el contenido en un plsmido que llevaba el transgn
en la zona que codifica para genes no esenciales en lo que se refiere a replicacin e infeccin.
- El uso de vectores con orgenes de replicacin del virus as como las correspondientes secuencias de
empaquetamiento, y su introduccin en estirpes celulares bien coinfectadas con virus silvestres o bien portadoras del
resto de genes del mismo implicados en la encapsidacin y replicacin, para permitir la formacin de partculas virales
recombinantes con las que realizar el tratamiento.
No obstante, el uso de vectores basados en el HSV (virus del herpes simple), slo puede llevarse a cabo en pacientes
que no hayan sido infectados previamente por l, pues pueden presentar inmunidad.
Protena "pseudotyping" de vectores virales
Los vectores virales descritos anteriormente tienen poblaciones naturales de clulas husped que ellos infectan de
manera eficiente. Sin embargo, algunos tipos celulares no son sensibles a la infeccin por estos virus.
La entrada del virus a la clula est mediada por protenas de su superficie externa (que pueden formar parte de una
cpside o de una membrana). Estas protenas interaccionan con receptores celulares que pueden inducir cambios
estructurales en el virus y contribuir a su entrada en la clula por endocitosis.
En cualquier caso, la entrada en las clulas husped requiere una interaccin favorable entre una protena de la
superficie del virus, y una protena de la superficie de la clula. Segn la finalidad de una determinada terapia gnica, se
podra limitar o expandir el rango de clulas susceptibles a la infeccin por un vector. Por ello, se han desarrollado
vectores conocidos como "pseudotyped", en los cuales la cubierta vrica de protenas silvestre ha sido remplazada por
pptidos de otros virus, o por protenas quimricas, que constan de las partes de la protena vrica necesarias para su
incorporacin en el virin, as como las secuencias que supuestamente a interaccionar con receptores especficos de
protenas celulares.
Por ejemplo, el vector retrovrico ms popular para el uso en pruebas de terapia gnica ha sido el virus de la
inmunodeficiencia en simios revestido con la cubierta de protenas G del virus de la estomatitis vesicular. Este vector se
conoce como VSV y puede infectar a casi todas las clulas, gracias a la protena G con la cual este vector es
revestido[cita requerida].
Se ha intentado en numerosas ocasiones limitar el tropismo (capacidad de infectar a muchas clulas) de los vectores
virales.Este avance podra permitir la administracin sistemtica de una cantidad relativamente pequea del vector. La
mayora de los intentos han utilizado protenas quimricas para la envuelta[cita requerida], las cuales incluan fragmentos
de anticuerpos.
Mtodos no virales
Estos mtodos presentan ciertas ventajas sobre los mtodos virales, tales como facilidades de produccin a gran escala
y baja inmunogenicidad. Anteriormente, los bajos niveles de transfeccin y expresin del gen mantenan a los mtodos
no virales en una situacin menos ventajosa; sin embargo, los recientes avances en la tecnologa de vectores han
producido molculas y tcnicas de transfeccin con eficiencias similares a las de los virus.
ADN desnudo
ste es el mtodo ms simple de la transfeccin no viral. Consiste en la aplicacin localizada de, por ejemplo, un
plsmido con ADN desnudo. Varios de estos ensayos dieron resultados exitosos[cita requerida]. Sin embargo, la
expresin ha sido muy baja en comparacin con otros mtodos de transformacin. Adems de los ensayos con
plsmidos, se han realizado ensayos con productos de PCR, y se ha obtenido un xito similar o superior. Este logro, sin
embargo, no supera a otros mtodos, lo que ha llevado a una investigacin con mtodos ms eficientes de

transformacin, tales como la electroporacin, la sonicacin, o el uso de la biobalstica, que consiste en disparar
partculas de oro recubiertas de ADN hacia las clulas utilizando altas presiones de gas.
Oligonucletidos
El uso de oligonucletidos sintticos en la terapia gnica tiene como objetivo la inactivacin de los genes implicados en el
proceso de la enfermedad.
Existen varias estrategias para el tratamiento con oligonucletidos
Una estrategia, la terapia "antisentido" utiliza oligonucletidos con la secuencia complementaria al RNAm del gen
diana, lo que activa un mecanismo de silenciamiento gnico. Tambin se puede usar para alterar la transcripcin del gen
defectuoso, modificando por ejemplo su patrn de edicin de intrones y exones.
Tambin se hace uso de molculas pequeas de RNAi para activar un mecanismo de silenciamiento gnico similar al
de la terapia antisentido
Otra posibilidad es utilizar oligodesoxinucletidos como un seuelo para los factores que se requieren en la activacin
de la transcripcin de los genes diana. Los factores de transcripcin se unen a los seuelos en lugar de al promotor del
gen defectuoso, lo que reduce expresin de los genes diana. Adems, oligonucletidos de ADN monocatenario han sido
utilizados para dirigir el cambio de un nica base dentro de la secuencia de un gen mutante.
Al igual que los mtodos de ADN desnudo, requieren de tcnicas de transformacin para introducirse en la clula.
Mtodos hbridos
Debido a las deficiencias de muchos de los sistemas de transferencia gnica se han desarrollado algunos mtodos
hbridos que combinan dos o ms tcnicas. Los virosomas son un ejemplo, y combinan liposomas con el virus inactivado
VIH o el virus de la gripe.
Dendrmeros
Un dendrmero es una macromolcula muy ramificada con forma esfrica o variable. Su superficie puede ser funcional de
muchas formas y de sta derivan muchas de sus propiedades. Adems, su tamao, en la escala nano-, permite su uso
en biomedicina.
En particular, es posible construir un dendrmero catinico, es decir, con carga superficial positiva. De esta forma,
interacciona con el cido nucleico, cargado negativamente, y forma un complejo que puede entrar por endocitosis en la
clula. Esto es til en terapia gnica, para introducir genes exgenos.
Los costes de produccin son elevados, pero se estn desarrollando tcnicas que permiten abaratarlo, puesto que se
trata de una tcnica con una toxicidad muy baja, y su principal desventaja es a nivel productivo.
Clulas Diana.
Las clulas diana se seleccionan en funcin del tipo de tejido en el que deba expresarse el gen introducido, y deben ser
adems clulas con una vida media larga, puesto que no tiene sentido transformar clulas que vayan a morir a los pocos
das. Igualmente, se debe tener en cuenta si la diana celular es una clula en divisin o quiescente, porque determinados
vectores virales, como los retrovirus, slo infectan a clulas en divisin.
En funcin de estas consideraciones, las clulas diana ideales seran las clulas madre, puesto que la insercin de un
gen en ellas producira un efecto a largo plazo. Debido a la experiencia en trasplante de mdula sea, una de las dianas
celulares ms trabajadas son las clulas madre hematopoyticas. La terapia gnica en estas clulas es tcnicamente
posible y es un tejido muy adecuado para la transferencia ex vivo. Otras dianas celulares con las que se ha trabajado
son:
Linfocitos: son clulas de larga vida media y fcil acceso (se encuentran en la sangre perifrica). Constituyen un blanco
para terapias ex vivo de melanomas e inmunodeficiencias.
Epitelio respiratorio: son clulas de divisin muy lenta y en ellas no es posible la transferencia ex vivo, pero s su
transformacin mediante adenovirus y lipoplexes.
Hepatocitos: su transformacin en posible tanto ex vivo (es factible cultivar las clulas y transplantarlas por la circulacin
portal) como in vivo (se estn desarrollando receptores proteicos especficos de hepatocitos).
Fibroblastos drmicos: son clulas de fcil acceso y cultivo, y pueden transformarse tanto ex vivo como in vivo, pero
suelen tener efectos transitorios.
Clulas musculares: pueden transformarse mediante inyeccin in vivo de ADN y tambin mediante adenovirus, pero con
un xito muy limitado en este ltimo caso

Genotipo

Fenotipo

IA IA; IA Io

IB IB; IB Io

IA IB

AB

Io Io