Microbiologa del agua

Dr. Flix Daniel Andueza

Facultad de Farmacia y Bioanlisis
Universidad de los Andes
Mrida. Venezuela
Prometeo SENESCYT
Escuela de Bioqumica y Farmacia
ESPOCH. Riobamba. Ecuador
San Jos de Costa Rica, Octubre 2014

Anlisis Microbiolgico

Mtodos de determinacin de
microorganismos

Siembra en profundidad.
Siembra por extensin.
Mtodos del nmero ms probable
(NMP).
Mtodo por filtracin.
Impedancia
Biologa molecular

RECUENTO DE MICROORGANISMOS
TOTALES Y VIVOS
10 ml

1 ml de naranja de acridina o
0,2 ml del kit Baclight live/dead

5 min en la oscuridad
filtrar

Bacterias vivas:
Bacterias muertas:

Microscopio de
epifluorescencia

MICROORGANISMOS
TOTALES Y VIVOS

Bacterias aerobias mesfilas

RECUENTO DE BACTERIAS
AEROBIAS MESOFILAS
1 mL

AGAR R2A
INCUBAR A 22 C POR 5 DAS

AGAR PCA
INCUBAR A 37 C POR 2 DAS

RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS

MESFILAS
1 ml c/u

PETRIFILM

INCUBAR A 30 C POR 2 DAS

1 ml c/u

PETRIFILM
INCUBAR A 37 C POR 2 DAS

RECUENTO DE BACTERIAS
HETERTROFAS
50 mL

AGAR R2A
INCUBAR A 22 C POR 5 DAS

AGAR PCA
INCUBAR A 37 C POR 2 DAS

RECUENTO DE COLIFORMES
TOTALES Y FECALES
250 mL

AGAR CHAPMAN-LACTOSATRIFENIL-TETRAZOLIO
INCUBAR A 30 C POR 24 - 48 h

AGAR CHAPMAN-LACTOSATRIFENIL-TETRAZOLIO
INCUBAR A 44,5 C POR 24 - 48 h

RECUENTO DE COLIFORMES
TOTALES Y FECALES
1 ml c/u

PETRIFILM

INCUBAR A 37 C POR 2 DAS

1 ml c/u

PETRIFILM
INCUBAR A 44 C POR 2 DAS

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES

POR EL METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE
(NMP)

1 ml

1 ml

Caldo Lactosa Lauril sulfato

INCUBAR A 37 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE GAS

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES

PRUEBA CONFIRMATORIA

0,1 ml

Caldo Bilis Verde Brillante

INCUBAR A 37 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE GAS y SE BUSCA EL
NMP EN LA TABLA

RECUENTO DE COLIFORMES FECALES

POR EL METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE
(NMP)

1 ml

1 ml

Caldo Lactosa Lauril sulfato

INCUBAR A 37 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE GAS

RECUENTO DE COLIFORMES FECALES

PRUEBA CONFIRMATORIA

0,1 ml

Caldo E.C

INCUBAR A 44,5 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE GAS y SE BUSCA EL
NMP EN LA TABLA

RECUENTO DE ENTEROCOCOS
250 ML

AGAR GLUCOSA-FOSFATOAZIDA-TRIFENIL TRIAZOLIO

INCUBAR A 37 C
POR 48 HORAS
COLONIAS MARRONES
O NEGRAS (+)

INCUBAR A 44 C
POR 2 HORAS

CONFIRMAR
COLONIAS

AGAR BILIS ESCULINA

PRECALENTADO A 44 C

RECUENTO DE ENTEROCOCOS
POR EL METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE
(NMP)

1 ml

1 ml

CALDO AZIDA DEXTROSA

INCUBAR A 37 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE TURBIDEZ O
PRECIPITADO

RECUENTO DE ENTEROCOCOS
PRUEBA CONFIRMATORIA

0,1 ml

Caldo Azida violeta de etilo

INCUBAR A 37 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE PRECIPITADO AZUL

RECUENTO DE ESPORAS DE
CLOSTRIDIUM SULFITO-REDUCTORES

CALENTAR
A 80 C
POR 10
MINUTOS

INCUBAR A 37 C
POR 72 HORAS

10 ml c/u

INCUBAR A 45 C
POR 48 HORAS

(+)
AGAR SULFITO DE HIERRO
A DOBLE CONCENTRACIN

DETECCIN DE AEROMONAS
250 mL

AGAR ALMIDN-AMPICILINA

INCUBAR A 37 C POR 24 - 48 h

AGAR ALMIDN-AMPICILINA

INCUBAR A 37 C POR 24 - 48 h

INVESTIGACIN DE Campylobacter

250 mL

Caldo Preston de enriquecimiento

AISLAR E IDENTIFICAR
INCUBAR A 42 C
POR 12 HORAS. MICROAEROFILIA

AGAR PRESTON
INCUBAR A 42 C POR 48 HORAS. MICROAEROFILIA

INVESTIGACIN DE Legionella
pneumophila
100 mL
AISLAR
E
IDENTIFICAR

Incubar a 37 C
por 15 das

(filtro)

Tratamiento
cido

Agar BCYE-

Tratamiento
trmico

Lavar con 2 ml
de agua estril

INVESTIGACIN DE Pseudomonas
aeruginosa
250 mL

AISLAR
E
IDENTIFICAR

AGAR CETRIMIDA
INCUBAR A 42 C
POR 24 HORAS

INVESTIGACIN DE Staphylococcus
aureus

muestra

AISLAR E IDENTIFICAR

1 ml de la muestra

AGAR BAIRD PARKER

INCUBAR A 37 C POR 48 HORAS

INVESTIGACIN DE Staphylococcus
aureus
250 mL

CALDO CASEINA- SOJA

AISLAR E IDENTIFICAR
INCUBAR A 37 C
POR 24 HORAS

AGAR BAIRD PARKER

INCUBAR A 37 C POR 48 HORAS

INVESTIGACIN DE Salmonella
250 mL

INCUBAR A 37C
POR 24 HORAS
CALDO CASEINA- SOJA

INCUBAR A 37 C POR 48 HORAS

tetrationato

selenito

Incubar a 37 C por 24 horas

AISLAR E IDENTIFICAR

Incubar a 37 C
por 24 horas

Agar bilis
verde brillante

Agar
SS

Agar
bismuto
sulfito

RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

FILTRAR
100 ml

FILTRAR
10 ml

AGAR SABOURAUD
IDENTIFICACIN

RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

1 ml c/u

PETRIFILM MOHOS Y LEVADURAS

INCUBAR A 25 C POR 7 DIAS

1 ml c/u

PETRIFILM MOHOS Y LEVADURAS

INCUBAR A 25 C POR 7 DIAS

ESPECIES DE MOHOS ENCONTRADAS

EN AGUAS

Penicillium spp.

Aspergillus spp.

Cladosporium spp.

Chrysosporium spp.

Curvularia spp.

Cladosporium spp.

Microscopio de contraste
de fase. Objetivo 40 x

Fusarium spp.

Acremonium spp.

RECUENTO DE
MICROORGANISMOS HALFILOS
MODERADOS
10 ml
INCUBAR A 30 C
POR 10 DAS

AGAR HALFILO

100 ml

AISLAR E
IDENTIFICAR

INVESTIGACIN DE ALGAS Y
CIANOBACTERIAS
100 mL

MEDIO PARA ALGAS

Y CIANOBACTERIAS

INCUBAR A 24 C
POR 30 DAS CON
ILUMINACIN
OBSERVAR E
IDENTIFICAR

CIANOBACTERIAS Y ALGAS

Synechocystis spp

Chlorococcum spp

Microscopio de contraste
de fase y de fluorescencia.
Objetivo 40 x

TAPETES Y BIOFILMES
5m

Science 2000; 290

5m

Adaptacin fisiolgica inespecfica:

secreccin exopolmeros
capacidad de dividirse
(SVNC)
LTSEM-BSE, Microscopa Electronica de
Barrido a Bajas Temperaturas en la
modalidad de Electrones Retrodispersados

patogenicidad

Secuenciamiento genes ARN 16S

PCR
Of 16S
rDNA genes

16S
Ligation
rDNA
amplicons

Transformation

Total DNA:

Sequencing

Analysis

Insert
PCR

(Giuseppe dAuria)

DIVERSIDAD MICROBIANA Y ESPECIFICIDAD

Ecosistemas de las aguas minerales muestran elevada diversidad microbiana
fenotpica y genotpica

Microbiota autctona de
aguas minerales

16S rRNA

RFLP

890 cepas: 378 ribotipos

Restriction Fragment Length Polimorphism

no de polimorfismos con inequvoca resolucin de bandas en todos

grupos, sp en cepas productoras pigmentos fluorescentes: 174 cepas: 72 rbt

Cabina de flujo laminar

Identificacin de cepas microbianas

Observaciones de cultivo
Observaciones microscpicas
Evaluacin bioqumica
Evaluacin fisiolgica

Aguas de uso farmacutico

Agua para uso farmacutico

Se basan en las farmacopeas

Buenas prcticas de manufactura (GMP)
Aseguramiento de la calidad

Tipos de agua de uso farmacutico

Agua purificada
Agua altamente purificada
Agua para inyectables

Limites microbiolgicos

Agua purificada

BH Menor de 100 UFC/ml (USP 30-FE-2007)

Endotoxina menor 0,25 EU/ml (FE-2007)

Agua para inyectables

Menor de 10 UFC/ml (USP 30-FE-2007)

Endotoxinas menor 0,25 EU/ml (USP 30-FE-2007)

Agua altamente purificada

Menor 10 UFC/ml (FE-2007)

Endotoxina menor 0,25 EU/ml (FE-2007)

Pirogenos
Prueba del LAL
Test de coagulacin
a 37 C por 1 hora
Serie de diluciones
reactivo LAL
(Lymulus amebocite
lysate)
Test Pyrosate,
Combrex y Pirgeno

Limites microbiolgicos del agua en la

industria farmacutica

Ufc/ml

Tratamiento del agua

Agua
cruda
Cribado

Clarificador
Cloracin

Sedimentacin
Canales de
sedimentacin

Almacenamiento

Cmara de
mezcla del
floculante
Cmara de
floculacin
Distribucin

Desinfeccin de los sistemas de agua en

la industria farmacutica

Bibliografa
OMS (2004). Gua
para la calidad del
agua potable. OMS
WHO (2005). Good
manufacturing
practices. Serie
(Report 39)
USP (2007).
Pharmacopeia.

European
Pharmacopeia. 6th
edition, 2007