Praca Magisterska Agaty PDF

UNIWERSYSTET WROCAWSKI
WYDZIA NAUK PRZYRODNICZYCH

INSTYTUT BIOCHEMII I BIOLOGII MOLEKULARNEJ
AGATA KOPE
KWANY FIBROBLASTYCZNY CZYNNIK WZROSTU

BADANIE STABILNOI I ODDZIAYWANIA Z INNYMI
BIAKAMI
Praca magisterska wykonana

w Zakadzie Inynierii Biaka
pod kierunkiem prof. dr hab.
Jacka Otlewskiego.
Wrocaw 2000
Skadam serdeczne podzikowania profesorowi

Jackowi Otlewskiemu za stworzenie moliwoci
realizacji pracy magisterskiej w Zakadzie Inynierii
Biaka oraz za opiek i cenne uwagi.
Pragn rwnie gorco podzikowa mgr
Agnieszce Grzesiak i mgr Katarzynie Kocielskiej za
nieocenion pomoc oraz wszystkim osobom , ktre w
jakikolwiek sposb przyczyniy si do powstania
niniejszej pracy magisterskiej.
moim rodzicom
Spis treci
SPIS TRECI
RYSUNKI
TABELE
VII
STRESZCZENIE
VIII
1 WSTP
1.1 Oglna charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych
1.2 Struktura aFGF i oddziaywanie z heparyn
1.3 Funkcja aFGF w komrce
1.4 Aktywno jdrowa aFGF
1.4.1
Mutant aFGF-CAAX
10
1.4.2
Mutant aFGF K132E
12
1.4.3
FIBP - biako wewntrzkomrkowe wice aFGF
13
2 CEL PRACY
15
3 MATERIAY
16
3.1 Odczynniki
16
3.2 Enzymy
17
3.3 Markery masy
17
3.4 Odczynniki do sekwencjonowania
18
3.5 Antybiotyki i skadniki poywek
18
3.6 Szczepy bakteryjne i fagowe
19
3.6.1
Oporno na antybiotyki poszczeglnych szczepw bakteryjnych
20
3.7 Plazmidy i ich mapy restrykcyjne
20
3.8 Oligonukleotydy
25
4 SPRZT
Spis treci
26
-i-
5 METODY
27
5.1 Preparacja bakterii kompetentnych
27
5.2 Transformacja bakterii kompetentnych
27
5.3 Elektroporacja
28
5.4 Elektroforeza w elu agarozowym
28
5.4.1
Okrelanie stenia DNA na elu agarozowym
29
5.4.2
Elektroforeza preparatywna w elu agarozowym
30
5.5 Izolacja DNA z elu agarozowego metoda QIAEX II
30
5.6 Spektrofotometryczne oznaczanie stenia biaek i kwasw nukleinowych
31
5.7 Izolacja plazmidowego DNA za pomoc metody QIAGEN-tip-20
32
5.8 Ukierunkowana mutageneza
34
5.8.1
Preparacja matrycy zaznaczonej uracylem
37
5.8.2
Przygotowanie oligonukleotydu do wprowadzenia mutacji
38
5.8.3
Waciwa reakcja mutagenezy in vitro
39
5.8.4
Transformacja mieszaniny reakcyjnej do bakterii kompetentnych szczepu MM 294
40
5.9 Trawienie restrykcyjne
40
5.9.1
Trawienie restrykcyjne plazmidu pBSN-FIBPf
41
5.9.2
Trawienie restrykcyjne plazmidu pMal-c2
42
5.9.3
Trawienie restrykcyjne zmutowanego plazmidu pET-25b(+)
42
5.10 Reacja PCR
43
5.11 Reakcja ligacji
43
5.12 Sekwencjonowanie
44
5.12.1 Przygotowanie plazmidowej matrycy do sekwencjonowania
46
5.12.2 Przyczenie startera
46
5.12.3 Znakowanie radioizotopem i sekwencjonowanie
46
5.12.4 Przygotowanie elu i warunki przeprowadzenia elektroforezy
47
5.13 Ekspresja FIBP w systemie pMal-c2 jako biako fuzyjne z MBP

5.13.1 Oczyszczanie biaka fuzyjnego MBP-FIBP na kolumnie z immobilizowan amyloz
5.14 Ekspresja aFGF w systemie pET-3c
48
48
49
5.14.1 Oczyszczanie aFGF na kolumnie z immobilizowan heparyn
50
5.15 Elektroforeza biakowa w warunkach denaturujcych (ang. SDS-PAGE)
50
5.16 Techniki spektroskopowe
52
Spis treci
- ii -
5.16.1 Fluorymetria
52
5.16.2 Dichroizm koowy
52
6 WYNIKI
54
6.1 Klonowanie FIBPs do wektora pMal-c2
54
6.1.1
Oznaczenie ste uywanych plazmidw
54
6.1.2
Trawienie restrykcyjne
55
6.1.3
Elektroforeza preparatywna trawionych plazmidw
56
6.1.4
Izolacja insertu i wektora z elu agarozowego
56
6.1.5
Elektroforeza analityczna
56
6.1.6
Ligacja
58
6.1.7
Selekcja wyizolowanego DNA poprzez trawienie restrykcyjne i analiz w elu agarozowym 59
6.1.8
Sprawdzenie poprawnoci klonowania poprzez sekwencjonowanie
6.2 Ekspresja FIBP w systemie pMal-c2 jako biako fuzyjne z MBP

6.2.1
6.2.2
60
61
Oczyszczanie wyekspresjonowanego biaka fuzyjnego MBP-FIBP metod chromatografii

powinowactwa na kolumnie z immobilizowan amyloz
63
Rozcicie FIBP od MBP za pomoc fXa
64
6.3 Klonowanie FIBPs do wektora pET-25b(+)

6.3.1
Mutageneza ukierunkowana
6.3.2
Trawienie restrykcyjne zmutowanego plazmidu pET-25b(+) przygotowanie wektora do
66
67
klonowania
70
6.3.3
Elektroforeza preparatywna i izolacja wektora pET-25b(+) metod Qiaex II
70
6.3.4
Reakcja PCR w celu uzyskania sekwencji kodujcej FIBPs
71
6.3.5
Ligacja
75
6.3.6
Trawienie wyizolowanego DNA enzymem SpeI i NcoI
77
6.4 Ekspresja FIBPs w bakteriach szczepu BL
78
6.5 Wyznaczenie masy produktu ekspresji
79
6.6 Ekspresja dzikiego typu aFGF oraz jego mutantw w systemie pET-3c
81
6.6.1
Oczyszczanie aFGF i jego mutantw na kolumnie z immobolizowan heparyn
6.7 Badanie stabilnoci aFGF metodami fluorymetrii i dichroizmu koowego
81
82
6.7.1
Fluorymetria
82
6.7.2
CD
86
7 DYSKUSJA
Spis treci
91
- iii -
7.1 Ekspresja i oczyszczanie obu form FIBP w systemie pMal-c2
91
7.2 Ekspresja i oczyszczanie FIBPs w systemie pET-25b(+)
93
7.3 Badanie stabilnoci aFGF
94
8 LITERATURA
Spis treci
96
- iv -
Rysunki
Rysunek 1. Struktura krystaliczna ludzkiego aFGF (Blaber i wsp., 1996). ____________________________ 4
Rysunek 2. Widok centralnej jamki w strukturze aFGF. __________________________________________ 4
Rysunek 3. Czsteczka siarczanu heparyny. ____________________________________________________ 6
Rysunek 4. Transdukcja sygnau do wntrza komrki po zwizaniu si aFGF z receptorem
powierzchniowym. ________________________________________________________________ 9
Rysunek 5. Schemat reakcji farnezylacji (wg L. Stryer Biochemia PWN). _________________________ 11
Rysunek 6. Mapa restrykcyjna plazmidu pET-3c. _______________________________________________ 21
Rysunek 7. Mapa restrykcyjna plazmidu pBSN-1. ______________________________________________ 22
Rysunek 8. Mapa restrykcyjna plazmidu pMal-c2. ______________________________________________ 23
Rysunek 9. Mapa restrykcyjna plazmidu pET-25b(+). ___________________________________________ 24
Rysunek 10. Schemat reakcji mutagenezy ukierunkowanej przeprowadzanej metod Kunkela. __________ 36
Rysunek 11. Schemat trawienia restrykcyjnego plazmidu pBSN-FIBPf. _____________________________ 41
Rysunek 12. Schemat trawienia restrykcyjnego plazmidu pMal-c2._________________________________ 42
Rysunek 13. Schemat trawienia restrykcyjnego wektora pET-25b(+). _______________________________ 42
Rysunek 14. Schemat przedstawiajcy metod sekwencjonowania z uyciem dideoksy analogw
rybonukleotydowych. _____________________________________________________________ 45
Rysunek 15. Schemat kolejnych etapw procesu klonowania fragmentu DNA kodujcego FIBPs z plazmidu
pBSN-FIBPf do wektora pMal-c2. __________________________________________________ 54
Rysunek 16. Wynik elekroforezy analitycznej - okrelanie stenia insertu FIBPs oraz wektora pMal-c2. __ 57
Rysunek 17. Wynik elektroforezy analitycznej - selekcja wyizolowanego DNA poprzez trawienie
restrykcyjne. ____________________________________________________________________ 60
Rysunek 18. Autoradiogram z sekwencjonowania plazmidu pMal-c2-FIBPs._________________________ 61
Rysunek 19. Wynik elektroforezy w warunkach denaturujcych. __________________________________ 63
Rysunek 20. Profil elucyjny kolumny z immobilizowan amyloz oczyszczanie biaka fuzyjnego MBPFIBPs._________________________________________________________________________ 64
Rysunek 21. Wynik SDS-PAGE - cicie FIBP-MBP czynnikiem Xa. _______________________________ 65
Rysunek 22. Wynik SDS-PAGE - cicie FIBP-MBP czynnikiem Xa przez 48 godz. ____________________ 65
Rysunek 23. Schemat kolejnych etapw procesu klonowania fragmentu DNA kodujcego FIBPs z plazmidu
pMal-c2 do wektora pET25b(+). ____________________________________________________ 67
Rysunek 24. Wynik analizy elektroforetycznej prb zawierajcych plazmid pET-25b(+) w formie ssDNA
(cieka nr 1,2,3); cieka 4 - marker ssDNA. _________________________________________ 68
Rysunek 25. Analiza elektoforetyczna zmutowanych form plazmidu pET-25b(+) poddanych trawienu
restrykcyjnemu enzymem SpeI. _____________________________________________________ 69
Rysunek 26. Analiza elektroforetyczna wstpnej reakcji PCR._____________________________________ 72
Rysunek 27. Wyznaczanie stenia wypreparowanego wektora i produktu reakcji PCR. ________________ 74
Rysunki
-v-
Rysunek 28. Wynik elekroforezy analitycznej przeprowadzonej w celu ustalenia stenia fragmentu DNA
kodujcego FIBPs. _______________________________________________________________ 75
Rysunek 29. Wynik elektroforezy analitycznej - trawienie plazmidu pET-25b(+)-FIBPs enzymem
SpeI i NcoI. ____________________________________________________________________ 78
Rysunek 30. Wynik elektroforezy w warunkach denaturujcych. __________________________________ 79
Rysunek 31. Wykres zalenoci ruchliwoci elektroforetycznej skadnikw biakowego markera masy (Wide
range MW) w 12% elu poliakrylamidowym od logarytmu ich mas.________________________ 80
Rysunek 32. Profil elucyjny kolumny z immobilizowan heparyn - oczyszanie dzikiego typu aFGF. _____ 81
Rysunek 33. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF w pH 5.0 bez dodatku i z dodatkiem heparyny. ____ 84
Rysunek 34. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF w pH 4.0 bez dodatku i z dodatkiem heparyny. ____ 84
Rysunek 35. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF i jego mutantw w pH 4.0. ____________________ 85
Rysunek 36. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF w obecnoci heparyny oraz mutanta Cys43-Cys139 bez
dodatku heparyny w pH 4.0. _______________________________________________________ 86
Rysunek 37. Widma CD dzikiego typu aFGF w funkcji pH. ______________________________________ 87
Rysunek 38. Widma CD dzikiego typu aFGF w funkcji pH w obecnoci i bez dodatku heparyny._________ 87
Rysunek 39. Krzywe denaturacyjne w funkcji pH dla dzikiego typu aFGF oraz mutanta Cys11-Cys59. ____ 88
Rysunek 40. Widma CD obu mutantw aFGF w pH 2.0 i 5.0 w obecnoci i bez dodatku heparyny. _______ 89
Rysunek 41. Krzywe denaturacyjne w funkcji pH obu mutantw aFGF w obecnoci i bez dodatku heparyny.90
Rysunki
- vi -
Tabele
Tabela 1. Charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych (Burgess i wsp., 1989).______ 2
Tabela 2: Sekwencje aminokwasowe aFGF i jego homologw. _____________________________________ 5
Tabela 3. Fragment sekwencji aminokwasowej aFGF rnych przedstawicieli (Klingenberg i wsp., 1995)._ 12
Tabela 4. Charakterystyka stosowanych enzymw restrykcyjnych. _________________________________ 17
Tabela 5. Oporno na antybiotyki uywanych szczepw bakteryjnych i fagowych. ____________________ 20
Tabela 6. Charakterystyka uywanych oligonukleotydw. ________________________________________ 25
Tabela 7. Zaleno procentowoci elu agarozowego od wielkoci rozdzielanych fragmentw DNA. _____ 29
Tabela 8. Skady buforw stosowanych w preparacji plazmidowego DNA metod Qiagen (wg Qiagen
Plasmid Mini Handbook). ________________________________________________________ 34
Tabela 9. Objtoci poszczeglnych roztworw wykorzystywanych przy preparacji DNA plazmidowego na
kolumienkach Qiagen-tip 20 (wg Qiagen Plasmid Mini Handbook). ______________________ 34
Tabela 10. Skad roztworw z zestawu do sekwencjonowania (wg Step-by-step protocols for DNA
sequencing). ____________________________________________________________________ 47
Tabela 11. Skad buforw uywanych w elektroforezie w warunkach denaturujcych. _________________ 51
Tabela 12. Skad elu rozdzielajcego w zalenoci od procentowoci. ______________________________ 51
Tabela 13. Skad elu zagszczajcego. _______________________________________________________ 51
Tabela 14. Bilans przeprowadzonych ekspresji biaka fuzyjnego MBP-FIBPf . _______________________ 64
Tabela 15. Skad mieszanin wstpnej reakcji PCR.______________________________________________ 71
Tabela 16. Ruchliwoci elektroforetyczne oraz logarytmy mas skadnikw biakowego markera masy (Wide
range MW). ____________________________________________________________________ 80
Tabela 17. Bilans przeprowadzonych ekspresji dzikiego typu aFGF i jego mutantw. __________________ 82
Tabele
- vii -
STRESZCZENIE
aFGF jest jednym z pierwszych biaek mitogennych, dla ktrych udowodniony zosta
podwjny sposb przekazywania sygnau polegajcy zarwno na oddziaywaniu z receptorem
powierzchniowym, jak i wymagajcy obecnoci mitogenu w jdrze. Podczas przekazywania
sygnau przez aFGF niezbdny jest wic etap translokacji biaka przez bon, ktry jak dotd
nie zosta wyjaniony. Nieznana pozostaje te funkcja aFGF w jdrze komrkowym.
Prawdopodobnie jest ona powizana z innymi biakami, ktre oddziaujc z aFGF mog
mediowa
jego
aktywno
wewntrzkomrkow.
Jak
dotd
oprcz
heparyny
wewntrzkomrkowe oddziaywanie z aFGF stwierdzono dla biaka FIBP (ang. aFGF

intracellular binding protein) znalezionego w bibliotece genomowej metod two-hybrid
system (Kolpakova i wsp., 1998). Scharakteryzowano dwie formy FIBP tzw. FIBPs (ang.
FIBP short) pozbawione 54 reszt aminokwasowych na N-kocu oraz FIBPf (ang. FIBP full
length) o sekwencji obejmujcej ca ramk odczytu.
Niniejsza praca opisuje ekspansj w komrkach bakteryjnych szczepu E.coli obu form
rekombinowanego biaka FIBP w systemie pMal-c2, jego oczyszczanie na kolumnie z
immobilizowan amyloz oraz prby przeprowadzenia proteolizy biaka fuzyjnego
czynnikiem Xa. Ekspresj biaka fuzyjnego FIBPs przeprowadzono z wydajnoci 15 mg/l,
natomiast w przypadku FIBPf wydajno wyniosa 10 mg/l. Niestety nie udao si efektywnie
rozdzieli biaka fuzyjnego przez proteoliz czynnikiem krzepnicia Xa ze wzgldu na
precypitacj wolnego FIBP. Aby omin problem zwijania in vitro przeklonowano geny FIBP
do peryplazmatycznego systemu ekspresyjnego pET-25b(+), ktry umoliwia otrzymanie
natywnej formy biaka w fuzji z ogonkiem histydynowym na C-kocu FIBP.
Drugim celem pracy bya ekspresja i zbadanie stabilnoci dzikiego typu aFGF w
obecnoci i bez dodatku heparyny. Wczesne badania dotyczce denaturacji aFGF wskazuj,
e jest to biako mao stabilne (Burke i wsp., 1993). Naturalnym ligandem podwyszajcym
stabilno aFGF jest heparyna. W niniejszej pracy zosta udowodniony jej stabilizujcy
wpyw poprzez widma fluorescencji i CD. Stwierdzono, e w obecnoci heparyny w niskim
pH aFGF nie denaturuje zupenie, ale pozostaje w stanie MG. Najprawdopodobniej aFGF
przechodzi przez bon do wntrza komrki wanie w stanie MG. Podjto rwnie prby
podniesienia stabilnoci aFGF poprzez wprowadzenie mostka disiarczkowego naturalnie w
czsteczce nie wystpujcego. Otrzymano dwa rekombinowane mutanty aFGF z mostkami w
STRESZCZENIE
- viii -
pozycjach: Cys11-Cys59 i Cys43-Cys139. Po ich oczyszczeniu na kolumnie z

immobilizowan heparyn badano ich stabilno metodami CD i fluorescencji. W przypadku
mutanta Cys43-Cys139 stwierdzono stabilizujacy wpyw mostka disiarczkowego na
czsteczk aFGF.
STRESZCZENIE
- ix -
Oglna charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych
1 WSTP
1.1 Oglna charakterystyka rodziny fibroblastycznych

czynnikw wzrostowych
Rodzina fibroblastycznych czynnikw wzrostowych (FGF, ang. fibroblast growth
factor) obejmuje czternacie biaek, wykazujcych wysok homologi sekwencyjn i
strukturaln, co wskazuje na pochodzenie od tego samego genu. Wspln cech dla
wszystkich biaek z rodziny FGF jest rwnie zdolno wizania heparyny. Pomimo
strukturalnych i sekwencyjnych podobiestw, biaka te wykazuj du rnorodno w
aktywnoci biologicznej. Oprcz dziaania na fibroblasty, czynniki te indukuj rnorodn
odpowied biologiczn m.in. komrek nerwowych, miniowych, siatkwki, embrionowych
komrek egzo- i endodermy, makrofagw czy komrek nowotworowych (Tabela 1). Kwany
fibroblastyczny czynnik wzrostu (aFGF, ang. acidic FGF) oraz zasadowy fibroblastyczny
czynnik wzrostu (bFGF, ang. basic FGF) s gwnymi, a zarazem pierwszymi
zidentyfikowanymi przedstawicielami rodziny FGF. Ludzki aFGF zbudowany jest ze 155
reszt aminokwasowych. W swojej sekwencji, oprcz dwch konserwatywnych reszt Cys
(pozycja 30 i 97), posiada dodatkow reszt cysteinow w pozycji 131. Cysteiny nie tworz
jednak wewntrzczsteczkowych mostkw disiarczkowych. Cech charakterystyczn jest
take brak sekwencji liderowej, bdcej sygnaem do sekrecji syntetyzowanych biaek na
zewntrz komrki drog przez retikulum endoplazmatyczne i aparat Golgiego. Badania
wykazay jednak, e aFGF po biosyntezie jako biako cytosolowe moe by wydzielany na
zewntrz przez niepoznany jeszcze mechanizm (Jackson i wsp., 1992) lub translokowany do
jdra komrkowego (Immamura i wsp., 1990; Zhan i wsp., 1992, 1993; Immamura i wsp.,
1994; Widocha i wsp., 1994).
WSTP
-1-
Oglna charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych
Tabela 1. Charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych (Burgess i wsp.,

1989).
Masa
Przedstawiciel
czsteczkowa
rodziny
[kDa]
Sekwencja
sygnaowa
Miejsce
glikozylacji
Miejsce wytwarzania
int-2
27 - 32
wystpuje
wystpuje
hst-1
hst-2
czynnik
wzrostu
Kaposiego
czynnik
wzrostu
keranocytw
K-GF
czynnik
wzrostu
indukowany
androgenem
czynnik
wzrostu
osonki
glejowej
22
wystpuje
wystpuje
komrki mini gadkich,

komrki nabonka,
neurony,
hepatocyty,
fibroblasty,
makrofagi,
keranocyty
komrki siatkwki (astrocyty),
komrki T,
pytki krwi,
keranocyty,
megakariocyty,
fibroblasty,
neurony,
komrki nabonka,
embrionowe komrki,
egzo- i endodermy
tkanki embrionowe,
nowotwr piersi
tkanki embrionowe
25
wystpuje
wystpuje
minie szkieletowe
32 - 38
wystpuje
wystpuje
tkanki embrionowe,
miniak Kaposiego
aFGF
bFGF
17 - 18
18
22
22.5
24
brak
brak
brak
brak
formy rni si
miejscem start
translacji
WSTP
28
wystpuje
wystpuje
fibroblasty,
minie gadkie cian pcherza
moczowego,
komrki mezenchymy
embrionalnej
28
wystpuje
wystpuje
ektoderma embrionowa (tylko

u myszy)
30
3 reszty
wystpuje
nowotwr tkanki nerwowej
-2-
Struktura aFGF i oddziaywanie z heparyn
1.2 Struktura aFGF i oddziaywanie z heparyn

Badania krystalograficzne przeprowadzone przez Zhu X. i wsp. (1990) doprowadziy do
okrelenia struktury ludzkiego aFGF. Biako zbudowane jest z 12 wkien , uoonych
wzgldem siebie antyrwnolegle, stanowicych 50 - 60% struktury. Reszt struktury
stanowi: 20% zgicia, 10% -helisy, 15% struktury nieuporzdkowane (Rysunek 1).
Ludzki aFGF jest przykadem interesujcego typu zwinicia biaka, okrelanego jako
struktura -koniczynki. Podobna konformacja acucha gwnego do obserwowanej w
czynnikach wzrostu fibroblastw wystpuje w tak rnych biakach, jak sojowy inhibitor
trypsyny typu Kunitza (STI), hisaktofilina (Habazettl i wsp., 1991) czy interleukina 1
(Tabela 2).
W strukturze trzeciorzdowej wkna ukadaj si w pary. Trzy z nich (1- 12, 45, 8- 9) tworz baryk, a pozostae trzy pary tworz jej przykrycie. Ukad posiada
trjktn o symetrii. Powtarzajcym si motywem jest patek koniczynki, skadajcy si z
czterech wkien i ptli.
W strukturze aFGF odkryto wewntrzn jamk w rdzeniu hydrofobowym uformowan
przez konserwowane reszty Leu14, Leu23, Leu44, Ile56, Leu65, Phe85, Tyr 97, Val109 i
Phe132 (Rysunek 2). Objto jamki wynosi okoo 20 48 3 (w zalenoci od tego, ktr z
czterech czsteczek w jednostce asymetrycznej krysztau analizowano), a jej minimalny
promie 1.2 . Prawdopodobnie przestrze t mog wypenia nieuporzdkowane czsteczki
wody, przyczyniajc si do niskiej stabilnoci aFGF (Blaber i wsp., 1996).
WSTP
-3-
Rysunek 1. Struktura krystaliczna ludzkiego aFGF (Blaber i wsp., 1996).

Kolorem jasnoniebieskim przedstawiono struktury , kolorem
tym -helisy. Na schemacie zaznaczono wybrane reszty
oddziaujce z: heparyn (kolor ciemnoniebieski), domen D2
receptora aFGF (kolor zielony), domen D3 receptora aFGF
(kolor czerwony).
Rysunek 2. Widok centralnej jamki w strukturze aFGF.
WSTP
-4-
Tabela 2: Sekwencje aminokwasowe aFGF i jego homologw.

Tustym drukiem wyrniono reszty konserwatywne.
11 12 13 14 15 16 17
aFGF
1-10
PKLLYCS
21 22 23 24 25 26
18-20
YFLRIL
30 31 32 33 34
27-29
TVDGT
42 43 44 45 46 47 48
35-41
IQLQLAA
bFGF
PKRLYCK
FFLRIH
RVDGV
IKLQLQA
IL-1
NCTLRDS
KSLVMS
ELKAL
VVFSMS?
52 53 54 55 56 57 58 59
aFGF
49-51
EVYIKST
60-62
63 64 65 66 67 68
QFLAMD
72 73 74 75 76 77
69-71
LLYGS
83 84 85 86 87 88 89 90
CLFLERI
77-82
bFGF
VVSIKGV
RYLAMK
RLLSAS
CFFFERI
IL-1
PVALGLK
LYLSCV
TLQLE
FVFNKIE
94 95 96 97 98 99 100
aFGF
90-93
YNTYISK
7 8 9 10 11 12
101-106
WF VGLK
16 17 18 19 20
113-115
RSKLG
40 41 42 43 44 45
121-139
ILFLPLP
bFGF
YNTYRSR
WYVALK
QYKLG
ILFLPMS
IL-1
KLEFESA
WYISTS
PVFLG
TDFTMQ
Nawet w temperaturach fizjologicznych aFGF nie wystpuje w konformacji natywnej

(Mach i wsp., 1993). Najprawdopodobniej w temperaturach tych aFGF znajduje si w stanie
stopionej globuy (MG, ang. molten globule). Stan ten charakteryzuje si brakiem
oddziaywa trzeciorzdowych pomimo zachowania struktury drugorzdowej. Wystpowanie
aFGF w stanie MG wie si z jego waciwociami biologicznymi. Jedn z nich jest
zdolno przechodzenia przez bon (Widocha i wsp., 1992). Dowiedziono, e aby biako
przechodzio przez bon musi znajdowa si w stanie czciowego rozwinicia MG
(Bychkova i wsp., 1988; Ren i wsp., 1998).
Niekorzystne dla aFGF jest rwnie rodowisko kwane (Pineda-Lucena i wsp., 1994).
Naturalnym czynnikiem chronicym aFGF przed denaturacj, a take stymulujcym jego
aktywno, jest czsteczka heparyny (Burgess i wsp., 1989; Dabora i wsp., 1991).
WSTP
-5-
Heparyna jest polisacharydem z grupy glikozaminoglikanw zbudowanych z

glukozaminy i kwasu glukuronowego powizanych wizaniem -14-glikozydowym.
Pocztkowo syntetyzowana jest jako pozbawiony grup siarczanowych proteoglikan, ktry
nastpnie ulega deacetylacji i przyczeniu grup siarczanowych (Rysunek 3). Ten ujemnie
naadowany polisacharyd wystpuje w granulocytach zasadochonnych i po jego pobudzeniu
wraz z innymi czsteczkami uwalniany jest w postaci gstych ziaren do przestrzeni
zewntrzkomrkowej (L. Stryer Biochemia PWN, Warszawa 1997).
CH2 OSO2O- COO-
NHSO2 O-
CH2OSO2O- COO-
OH NHSO2 O-
OH
OSO2 O-
Rysunek 3. Czsteczka siarczanu heparyny.
Oddziaywanie heparyny z aFGF ma charakter elektrostatyczny. Z ujemnie

naadowanymi grupami heparyny oddziauj dodatnio naadowane reszty aminokwasw
zasadowych aFGF (gwnie Lys112, Lys118, Arg122). Zostaa rwnie okrelona
stechiometria oddziaywania aFGF z heparyn (Mach i wsp., 1992, 1993). Pojedynczy
acuch heparynowy o masie 16 kDa moe wiza 14 15 czsteczek aFGF (z czego okoo
10 wizanych jest z wysokim powinowactwem), w taki sposb, e kada czsteczka aFGF
przypada na 5 - 7 monomerw sacharydowych acucha heparyny.
Nie poznano jeszcze dokadnie roli heparyny wicej si z aFGF. Przypuszcza si, e
heparyna dziaa poprzez stabilizowanie natywnej konformacji biaka. Wskazuj na to wyniki
uzyskane z bada nad denaturacj aFGF w obecnoci mocznika. Denaturacja w obecnoci
mocznika przebiega wedug modelu dwch stanw, a punkt przejcia denaturacyjnego, w
zalenoci od iloci stabilizujcego ligandu, znajduje si midzy 2M a 4M steniem
mocznika. W nieobecnoci heparyny aFGF denaturuje przy steniu mocznika [mocznik] =
2.3 M. Warto ta wzrasta do 3.5 M w obecnoci 3x nadmiaru molowego heparyny. Podobnie
wzrasta Gapp wraz ze wzrostem stenia ligandu. Przy 3 - 10x
nadmiarze heparyny
wystpuje efekt wysycenia dalszy wzrost stenia heparyny nie ma ju wpywu na zmian
parametrw denaturacji. Jedynym wyjtkiem jest 0.1x nadmiar stenia heparyny, przy
ktrym Gapp jest nisze ni w przypadku nieobecnoci liganda. Mona to wytumaczy
moliwoci zaistnienia dodatkowych midzyczsteczkowych oddziaywa pomidzy
WSTP
-6-
Funkcja aFGF w komrce
czsteczkami aFGF, znajdujcymi si na tym samym acuchu heparyny (Burke i wsp.,

1993).
Zostao dowiedzione rwnie, e jedynie w obecnoci heparyny nastpuje aktywacja
receptora aFGF (Spivak-Kroizman i wsp., 1994). Heparyna inukujc oligomeryzacj
czsteczek aFGF przyczynia si do powstania oddziaywania aFGF-receptor, ktre zachodzi
w stosunku 1:1. Jednoczesne zwizanie si dwch czsteczek aFGF do dwch czsteczek
receptora powoduje dimeryzacj tych ostatnich, a tym samym ich aktywacj i dalsze
przekazywanie sygnau do komrki, co opisano dokadnie w nastpnym rozdziale.
1.3 Funkcja aFGF w komrce

Podstawow funkcj aFGF jest pobudzanie mitogenezy w rnego typu komrkach.
aFGF stymuluje take komrki do migracji chemotaktycznej, co ma znaczenie w procesie
angiogenezy (rozwoju naczy) i gojenia si ran. Pod wpywem FGF komrki wydzielaj
proteazy, w tym aktywator plazminogenu, kolagenazy czy elatynazy. Zaobserwowano take
zdolno rnych typw komrek (m.in. fibroblastw) do rnicowania si pod wpywem
FGF (Klingenberg, 1999).
Badania nad przekazywaniem sygnau przez aFGF dowiody istnienia dwch typw
swoistych receptorw bonowych dla tego mitogenu. Wyrniono receptory o wysokim
powinowactwie do aFGF (HAR, ang. high affinity receptor lub FGFR, ang. FGF receptor) o
aktywnoci kinaz tyrozynowych oraz receptory niskiego powinowactwa (LAR, ang. low
affinity receptor) sklasyfikowane jako heparany powierzchniowe (Johnson i Williams, 1993;
Galzie i wsp., 1997).
Do tej pory sklonowano i scharakteryzowano 4 geny dla receptorw HAR. Kady z
nich koduje biako transmembranowe zawierajce w czci zewntrzkomrkowej dwie lub
trzy domeny z motywami ptli charakterystycznych dla czsteczek immunoglobulin (domeny
Ig-like). W czci cytoplazmatycznej znajduj si natomiast domeny o aktywnoci kinaz
tyrozynowych, poprzez ktre odbywa si przewodnictwo sygnau do jdra. Domeny
zewntrz- i wewntrzkomrkowe receptora poczone s domen transmembranow.
Strukturalne warianty FGFR-1, FGFR-2, FGFR-3 i FGFR-4 powstaj przez alternatywny
splicing transkryptw mRNA.
Proces przekazywania sygnau przez bon polega na jednoczesnym zwizaniu si
dwch czsteczek czynnika FGF z dwoma czsteczkami swoistego receptora, co powoduje
dimeryzacj receptora i w konsekwencji doprowadza do jego autofosforylacji w czci
WSTP
-7-
Funkcja aFGF w komrce
cytoplazmatycznej. Wyzwala to nastpnie kaskad zdarze zwizanych z przekazywaniem

sygnau do jdra komrkowego (ang. downsteram signaling cascade). Ufosforylowana
Tyr766 w cytoplazmatycznej czci receptora FGFR-1 suy jako miejsce wice dla biaek
posiadajcych domeny SH2 i SH3 (domeny homologii z kinazami tyrozynowymi z rodziny
Src), zwizanych z kolejnym etapem transdukcji sygnau. Naley do nich m.in. fosfolipaza
C (PLC, ang. phospholipase C) oraz podjednostka p85 3-kinazy fosfatydyloinozytolu (PI3, ang. phosphoinositide 3-kinase). Aktywacja PLC prowadzi z kolei do aktywacji kinazy
biakowej C (PKC, ang. protein kinase C), a ta moe dalej aktywowa serynowo-treoninow
kinaz Raf-1. Kinaza Raf moe by take aktywowana przez biaka Ras (z rodziny biaek G).
Kolejnym ogniwem kaskady s kinazy MAP (MAPK, ang. mitogen actiavated protein
kinases), znajdyjce si pod kontrol kinaz Raf i MAPKK (kinazy kinaz MAP). Kinazy MAP
fosforyluj dalej czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za indukcj ekspresji genw.
Naley do nich kompleks transkrypcyjny AP-1 aktywowany poprzez fosforylacj jego
biakowych skadnikw Fos i Jun (Widocha, 1996).
WSTP
-8-
Aktywno jdrowa aFGF
Rysunek 4. Transdukcja sygnau do wntrza komrki po zwizaniu si

aFGF z receptorem powierzchniowym.
(wg Konarska L. Molekularne mechanizmy przekazywania
sygnaw w komrce, PWN Warszawa 1995).
1.4 Aktywno jdrowa aFGF

Opisany wyej schemat przekazywania sygnau do wntrza komrki obowizywa od
lat 70 i by oglnie przyjtym paradygmatem transdukcji sygnau przez bon komrkow.
Dlatego te pierwsze prace dotyczce translokacji aFGF przez bon i jego obecnoci w jdrze
komrkowym podczas mitozy wzbudziy wiele kontrowersji. Oglny model transportu biaek
przez bon komrkow nie uwzgldnia bowiem polipeptydw. Dodatkowo, wedug oglnie
przyjtych zasad, aFGF po aktywacji receptora powinien zosta strawiony w strukturach
WSTP
-9-
Aktywno jdrowa aFGF
lizosomalnych komrki. Budowa tego czynnika nie wskazuje na moliwo translokacji przez
bon do cytosolu, gdy nie zawiera on powierzchniowych sekwencji hydrofobowych.
Uywajc toksyny dyfterytu jako wektora sucego do translokacji aFGF grupa naukowcw
z Oslo udowodnia istnienie podwjnego mechanizmu przekazywania sygnau przez aFGF i
pokazaa, e jego obecno w jdrze komrkowym jest niezbdna do syntezy DNA
(Widocha i wsp., 1994).
Postawiono wobec tego pytania: w jaki sposb sam aFGF jest translokowany przez bon i
jaki efekt wywiera w jdrze komrkowym?
Pierwsze badania nad transportem aFGF do jdra pokazay, e jest to proces NLS
zaleny. Oznacza to, e na N-kocu biaka znajduje si sekwencja NLS (ang. nuclear
localization sequence), obejmujca cztery aminokwasy w kolejnoci KKPK, odpowiedzialna
za transport biaek z cytosolu do jdra. Mutanty aFGF nie zawierajce sekwencji NLS nie
posiadaj waciwoci mitogennych, chocia zdolne s do oddziaywania ze swoistym
receptorem, aktywacji go oraz kaskady prowadzcej do aktywacji szlaku sterowanego przez
kinazy MAP. Wklonowanie innej sekwencji NLS (z histonu drodowego 2B) cakowicie
przywraca aktywno mitogenn aFGF (Immamura i wsp., 1990). Dodatkowe badania
wykazay, e dodany z zewntrz aFGF transportowany jest do jdra podczas przejcia z fazy
G0 do G1, czyli w momencie kiedy komrka dostaje sygna do mitozy (Zhan i wsp., 1993).
1.4.1 Mutant aFGF-CAAX

Niepodwaalnych dowodw na jdrow aktywno aFGF dostarczyy dowiadczenia z
mutantem czynnika wzrostowego posiadajcym przy kocu C sekwencj aminokwasow
CAAX, gdzie X oznacza dowolny aminokwas. Sekwencja CAAX jest sygnaem do
izoprenylacji modyfikacji potranslacyjnej biaek zachodzcej tylko w cytosolu i
prawdopodobnie w jdrze. Polega ona na przyczeniu reszty izoprenylowej (farnezylowej lub
geranyl-geranylowej) do zawartej w sekwencji CAAX cysteiny, a nastpnie usuniciu trzech
ostatnich reszt aminokwasowych a przyczeniu reszty metylowej (Rysunek 5). W
konsekwencji tego procesu biaka, posiadajce C-kocow sekwencj CAAX, zostaj
zaopatrzone w acuch lipidowy umoliwiajcy zakotwiczenie zmodyfikowanego biaka w
bonach wewntrzkomrkowych (dotyczy to np.: biaek G tj. Ras, Rab, Rho). Ze wzgldu na
to, e enzymy odpowiedzialne za proces farnezylacji (m.in. transferaza reszty farnezylowej)
nie wystpuj w adnych innych przedziaach komrkowych oprcz cytosolu i jdra,
farnezylacja dodanego z zewntrz mutanta aFGF-CAAX byaby bezporednim dowodem na
WSTP
- 10 -
Aktywno jdrowa aFGF
zdolno przekroczenia bariery bony i osignicia przez ten czynnik cytosolu. Fragment A
toksyny z aFGF-CAAX by modyfikowany przez transferaz reszty farnezylowej, zgodnie z
przewidywaniami, jedynie gdy znajdowa si w cytosolu (Widocha i wsp., 1995).
Farnezylacj zaobserwowano jedynie w przypadku gdy aFGF-CAAX dodany by do komrek
posiadajcych swoiste receptory dla aFGF. W komrkach bez FGFR mutant czynnika
wzrostu nie ulega modyfikacjom, chocia wiza si z powierzchniowymi heparanami i by
internalizowany. Obecno farnezylowanego aFGF-CAAX stwierdzono take w jdrze.
Powysze obserwacje wskazuj na moliwo zwizku receptora z transportem aFGF do
cytosolu czy jdra.
Rysunek 5. Schemat reakcji farnezylacji (wg L. Stryer Biochemia PWN).
WSTP
- 11 -
Aktywno jdrowa aFGF
1.4.2 Mutant aFGF K132E

Kolejnym krokiem w badaniu wewntrzkomrkowej aktywnoci aFGF byy
dowiadczenia zwizane z mutantem K132E. Tabela 3 przedstawia sekwencj aminokwasow
aFGF z konserwatywn ewolucyjnie reszt lizyny w pozycji 132. Odpowiada ona m.in. za
wizanie si czynnikw z rodziny FGF do heparyny. Jest rwnie pozycj, ktra atwo ulega
metylacji w warunkach in vitro, co wskazuje na jej powierzchniowe pooenie.
Tabela 3. Fragment sekwencji aminokwasowej aFGF rnych
przedstawicieli (Klingenberg i wsp., 1995).
Tustym drukiem wyrniono reszty konserwatywne K
nalece do sekwencji fosforylowanej przez PKC
(podkrelone reszty).
POZYCJA
Przedstawiciel
125
132
140
czowiek
LKKNGSCKRGPRTHYG
winia
LKKNGSCKRGPRTHYG
krlik
LKKNGSCKRGPRTHYG
chomik
LKKNGSCKRGPRTHYG
bydo
LKKNGRSKLGPRTHYG
kurczak
LKKNGNSKLGPRTHYG
Zbadanie waciwoci mutanta K132E wykazao jego osabione oddziaywanie z

heparyn oraz heparanami powierzchniowymi. Swoiste wizanie i aktywacja receptora FGFR
zachodzi natomiast z identyczn wydajnoci jak dla typu dzikiego aFGF. Rwnie proces
transportu mutanta do jdra (badania z uyciem toksyny boniczej jako nonika) przebiega
bez rnic, na co wskazuje obecno farnezylowanej formy mutanta K132E-CAAX w
cytosolu. W szeregu bada dowiedziono jednak, e mutant K132E nie wykazuje aktywnoci
jdrowej nie stymuluje syntezy DNA oraz nie wie heparyny.
Okazuje si, e mutacja w pozycji 132 niszczy konsensus (S/T)X(R/K), (Tabela 3 podkrelone reszty aminokwasowe), dla fosforylacji przeprowadzanej przez kinaz biakow
C (PKC) na serynie lub tyrozynie. Proces ten moe mie znaczenie w aktywnoci jdrowej
aFGF (Klingenberg i wsp., 1995).
WSTP
- 12 -
Aktywno jdrowa aFGF
1.4.3 FIBP - biako wewntrzkomrkowe wice aFGF

Brak waciwoci mitogennych mutanta K132E, pomimo jego obecnoci w jdrze,
wskazywa na prawdopodobiestwo istnienia dodatkowego biaka wewntrzkomrkowego
zwizanego z aktywnoci wewntrzkomrkow aFGF, ale nie mutanta K132E. Metod
pozwalajc na identyfikacj oddziaujcych ze sob makroczsteczek jest drodowy system
dwuhybrydowy (ang. two-hybrid system) (Chien i wsp., 1991). Opiera si ona o regulacj
ekspresji genu dla -galaktozydazy - enzymu niezbdnego do metabolizowania laktozy.
Metoda dwuhybrydowa wykorzystuje waciwoci drodowego czynnika transkrypcyjnego
GAL4. Biako to jest dwudomenowe: zawiera domen uatwiajc kontakt czynnika
transkrypcyjnego z DNA bd (ang. binding domain) oraz domen o aktywnoci
transkrypcyjnej ad (ang. activation domain). Metodami inynierii genetycznej mona
konstruowa plazmidy kodujce biaka hybrydowe. Jedno z nich skada si z domeny bd
czynnika GAL4 oraz znanego biaka, dla ktrego poszukujemy partnera. Pozostae biaka
hybrydowe kodowane s przez plazmidy zawierajce cDNA domeny ad czynnika GAL4
poczone z cDNA rnych biaek z biblioteki genomowej. Tak przygotowane konstrukty
plazmidowe wprowadza si do komrek drodowych. Oddziaywanie midzy znanym
biakiem i biakiem z przeszukiwanych bibliotek powoduje odtworzenie czsteczki czynnika
GAL4, aktywacj genu reporterowego zawierajcego miejsce wizania GAL4 i w nastpstwie
transkrypcj genu dla -galaktozydazy. Izolacja cDNA z klonw pozytywnych i oznaczenie
ich sekwencji pozwala na zidentyfikowanie szukanego biaka. Wiarygodno otrzymanych
wynikw jest wysoka ze wzgldu na prowadzenie poszukiwa w warunkach in vivo.
W celu odnalezienia partnera aFGF przeszukano bibliotek komrkow HeLa.
Zidentyfikowano hydrofilowe biako o masie ~42 kDa i pI rwnym 6.6, ktre nazwane
zostao FIBP (ang. aFGF intracellurar binding protein). Jako pierwsz odkryto tzw. krtk
form FIBP (FIBPs, ang. FIBP short) zoon z 314 reszt aminokwasowych. Pniej okazao
si, e istnieje take forma pena (FIBPf, ang. FIBP full length) zawierajca 372 reszty
aminokwasowe. Obydwie formy FIBP rni si powinowactwem do aFGF forma FIBPs
silniej wie dziki typ aFGF (informacja prywatna prof. S. Olsnesa). Wyniki pochodzce z
mikroskopii fluorescencyjnej i Northern blottingu wykazay, e FIBP jest biakiem
wystpujcym przede wszystkim w jdrze. W mniejszym stopniu wystpuje jako biako
zwizane z mitochondriami i innymi bonami komrkowymi, prawdopodobnie z RE.
Podobnie jak aFGF, FIBP nie zawiera N-terminalnej sekwencji sygnalnej niezbdnej do
transportu biaka do retikulum endoplazmatycznego i mitochondrium. Ekspresja genu FIBP
WSTP
- 13 -
Aktywno jdrowa aFGF
zachodzi gwnie w miniach, mzgu i trzustce. Dowiedziono, e nie istnieje oddziaywanie

aFGF-FIBP w obecnoci 0.6M NaCl, co wskazuje na elekrostatyczny charakter
oddziaywania. Dodatek heparyny rwnie uniemoliwia oddziaywanie FIBP z aFGF. Nie
stwierdzono take oddziaywania pomidzy FIBP a mutantem K132E (Kolpakova i wsp.,
1998).
Nie wiadomo, niestety, jaka jest dokadnie rola FIBP. Fakt odnalezienia FIBP w jdrze
jak i zarwno w cytoplazmie wskazuje na moliwo jego krenia po komrce jako
transportera. Jednake obecno w jdrze rwnie mutanta aFGF K132E wyklucza funkcj
FIBP jako transportera aFGF do jdra. Moliwe, e aFGF po wnikniciu do komrki czy si
z FIBP i aktywuje komponent jdrowy zwizany z inicjacj syntezy DNA.
WSTP
- 14 -
Aktywno jdrowa aFGF
2 CEL PRACY
Zasadniczym
celem
niniejszej
pracy
byo
wyekspresjonowanie
wewntrzczsteczkowego biaka oddziaujcego z aFGF FIBP w systemie pMal-c2 jako

biaka fuzyjnego z MBP. Podjto rwnie prb oczyszczania biaka MBP-FIBP na kolumnie
z immobilizowan amyloz, a nastpnie proteolitycznego odcicia FIBP z biaka fuzyjnego.
Drugim celem byo udowodnienie stabilizujcego wpywu heparyny na czsteczk
aFGF oraz zbadanie stabilnoci zarwno typu dzikiego, jak i mutantw aFGF z
wprowadzonymi mostkami disiarczkowymi (Cys11-Cys59 oraz Cys43-Cys139).
CEL PRACY
- 15 -
Odczynniki
3 MATERIAY
3.1 Odczynniki
IPTG (izopropylo--D-tiogalaktozyd)
CaCl2 (chlorek wapnia)
MgCl2 (chlorek magnezu)
NaCl (chlorek sodu)
KCl (chlorek potasu)
DTT (1,4-ditiotreitol)
EDTA (etylenodiaminotetraoctowy kwas)
Tris
bromek etydyny
bkit bromofenolowy
bkit Coomasie G-250
agaroza
glukoza
maltoza
MBP (biako wice maltoz)
zoe amylozowe
zoe heparynowe (Heparin Sepharose CL-6B)
mocznik
SDS (dodecylo siarczan sodu)
N,N'-metyleno-bis-akrylamid
akrylamid
APS (nadsiarczan amonu)
TEMED (N,N,N,N-tetrametylenodiamina)
MOPS (kwas (3-N-morfolino)propanosulfonowy)
PEG (glikol polietylenowy)
PMSF (fenylometylosulfonylofluorek)
glicyna
urydyna
2-propanol
fenol
etanol 96%
butanol
chloroform
glicerol
dideoksynukleotydy dNTP
kwas fosforanowy
kwas borowy
kwas octowy
octan sodu
cytrynian sodu
MATERIAY
- 16 -
Bachem
Merck
Sigma
Riedel de Haen GmbH
POCh
Bachem
Sigma
Sigma
Stratagene
POCh
Serva
BioProducts
POCh
Sigma
New England BioLabs
Pharmacia Biotech AB
Pharmacia Biotech AB
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
Merck
Merck
Sigma
Sigma
Sigma
Polfa
Sigma
Merck
Merck
ZPS "Polmos" S.A.
POCh
POCh
POCh
United States Biochemicals
Fluka
Merck
POCh
POCh
POCh
Enzymy
3.2 Enzymy
restrykcyjne
Tabela 4. Charakterystyka stosowanych enzymw restrykcyjnych.
charakterystyka
ENZYM RESTRYKCYJNY
BamHI
Firma
SpeI
5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5
5 CCATGG 3
3 GGTACC 5
5 ACTAGT 3
3 TGATCA 5
100mM NaCl
10mM Tris-HCl
5mM MgCl2
1mM DTT
1mM
2-merkaptoetanol
(pH 8.0 w 37C)
100mM NaCl
50mM Tris-HCl
10mM MgCl2
1mM DTE
100mM NaCl
50mM Tris-HCl
10mM MgCl2
1mM DTE
100mM NaCl
50mM Tris-HCl
10mM MgCl2
1mM DTE
(pH 7.5 w 37C)
(pH 7.5 w 37C)
(pH 7.5 w 37C)
37C
37C
37C
37C
Temperatura
inkubacji
Definicja jednostki
aktywnoci
NcoI
5 GGATCC 3
3 CCTAGG 5
Rozpoznawana
sekwencja
Bufor
Reakcyjny
EcoRI
1U trawi 1g DNA
1U 1g DNA
1U trawi 1g DNA
1U trawi 1g AD2
(48502bp) w 1 godz. (48502bp) w 1 godz.
(48502bp) w 1 godz.
DNA (35500bp) w 1
(5 miejsc restr.)
(5 miejsc restr.)
(4 miejsca restr.)
godz. (3 miejsca restr.)
Boehringen
Boehringen Mannheim Boehringen Mannheim Boehringen Mannheim
Mannheim
czynnik Xa
New England BioLabs
T4 ligaza
T4 DNA polimeraza
Amersham
T4 DNA polimeraza Vent
New England BioLabs
T4 kinaza
Amersham
RNaza A
Qiagen
3.3 Markery masy
DNA
Marker XIV
Marker XVII
RPL43A/EcoRI
MATERIAY
Boehringen Mannheim
Boehringen Mannheim
(plazmid zawierajcym cDNA
- 17 -
Odczynniki do sekwencjonowania
biaka rybosomalnego trawiony

enzymem EcoRI)
Amersham
Marker ssDNA (z faga M13)
Biaek
Wide range MW marker
New England BioLabs
3.4 Odczynniki do sekwencjonowania
Radioizotop [-35S]dATP
DuPont NEN
Zestaw do sekwencjonowania
Wywoywacz W16 do rcznej

obrbki bon rentgenowskich
Foton, Bydgoszcz
Utrwalacz U5 do rcznej
obrbki bon rentgenowskich
Foton, Bydgoszcz
Bibua 3MM
Whatman
3.5 Antybiotyki i skadniki poywek
Ampicylina
Polfa
Chloramfenikol
Sigma
Chlorowodorek tetracykiny
Merck
poywka LB pynna (1 litr)

10 g ekstraktu drodowego
Merck
5 g peptonu z kazeiny
Merck
10 g NaCl
poywka LB-agar (1 litr)

Merck
Merck
10 g NaCl
15 g agaru
Merck
poywka SB pynna (100ml)

Merck
Merck
1 g MOPS
MATERIAY
- 18 -
Szczepy bakteryjne i fagowe
poywka SOC (40ml)

0.8 g peptonu z kazeiny
Merck
0.2 g ekstraktu drodowego
Merck
100 l 1M KCl
80 l 5M NaCl
oraz dodane po sterylizacji:
800 l 20% glukozy
400 l 1M MgCl2
3.6 Szczepy bakteryjne i fagowe
DH5
F-80dlacZ(lac ZYA-argF)V169 deoR recA1 endA1
o genotypie
hsdR17(rK-,mK+)phoA supE44 - tchi-1 gyrA69 relA1

firmy GibcoBRL
uywany
do
ekspresji
rekombinowanych
biaek
namnaania
DNA
plazmidowego
BL(DE3)pLysS
o genotypie
E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal (DE3) [pLysS Camr]
firmy Stratagene
uywany do ekspresji rekombinowanych biaek
XL-1 blue
o genotypie
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F proAB

lacIqZM15 Tn10 (Tetr)]c
firmy Stratagene
uywany do elektroporacji
CJ236 dut-, ungo genotypie
dut-, ung-, thi1, relA1/pCJ105(Cmr)
firmy Stratagene
uywany do namnaania jednoniciowego DNA zawierajcego reszty uracylu
zamiast reszt tyminy (mutageneza)
MATERIAY
- 19 -
Plazmidy i ich mapy restrykcyjne
MM294 dut+, ung+

dut+, ung+ endA1 hsdR17 supE44 thi-1
o genotypie
firmy Stratagene
uywany do namnaania DNA plazmidowego (m.in. w mutagenezie)
Fag pomocniczy VCS - M13

firmy Stratagene
uywany w reakcji mutagenezy
3.6.1 Oporno na antybiotyki poszczeglnych szczepw

bakteryjnych
Tabela 5. Oporno na antybiotyki uywanych szczepw
bakteryjnych i fagowych.
ANTYBIOTYKI
Szczep
stenie kocowe w poywce

20 g/ml
12 g/ml
chloramfenikol
tetracyklina
DH5
BL(DE3)pLysS
XL-1 blue
CJ236 dut-, ung-
MM294 dut+, ung+
Fag M13
3.7 Plazmidy i ich mapy restrykcyjne
pET-3c-aFGF
Wektor plazmidowy pET (ang. plasmid for expression by T7 RNA polymerase) o
wielkoci 4638 bp jest uywany do ekspresji rekombinowanych biaek w komrkach

bakteryjnych E.coli. Zawiera on promotor faga T7 rozpoznawany jedynie przez polimeraz
fagow RNA. Produkcja rekombinowanego biaka nastpuje wic dopiero po ekspresji RNA
polimerazy faga T7, inicjowanej przez infekcj fagow lub indukcj szczepu zawierajcego
MATERIAY
- 20 -
kopi genu fagowej polimerazy (np.: szczep BL21(DE3), DH5 ). Wszystkie plazmidy typu
pET zawieraj miejsce pocztku replikacji ori ColE1. W skad wektora pET-3c wchodzi
rwnie gen opornoci na ampicylin oraz region z miejscami restrykcyjnymi, w obrbie
ktrego znajduj si przede wszystkim sekwencje rozpoznawane przez enzymy NcoI oraz
BamHI.
Plazmid pET-3c, zawierajcy wklonowan sekwencj kodujc aFGF, dostarczony
zosta przez zesp prof. S. Olsnesa z Wydziau Biochemii Instytutu Bada nad Rakiem w
Oslo. Rwnie plazmidy pET-3c zawierajce sekwencje kodujce mutanty aFGF ze
wstawionymi wewntrzczsteczkowymi mostkami disiarczkowymi (Cys11-Cys59, Cys43Cys139) pochodziy z powyszego zespou. Rysunek 6 przedstawia schemat wektora pET-3c
oraz map restrykcyjn regionu do klonowania.
Rysunek 6. Mapa restrykcyjna plazmidu pET-3c.
MATERIAY
- 21 -
pBSN-FIBPf
Rysunek 7. Mapa restrykcyjna plazmidu pBSN-1.
pMal-c2
Wektory pMal-2 su do ekspresji rekombinowanych biaek w formie fuzyjnej w
komrkach bakteryjnych E.coli. Wyrnia si wektory pMal-2 typu p i typu c

(odpowiednio od sowa peryplazmatyczny i cytoplazmatyczny). Rni si one od siebie
tym, e w wektorze pMal-c2 brakuje fragmentu 1531-1605, stanowicego sekwencj
sygnaln kwalifikujc dane biako do transportu do przestrzeni peryplazmatycznej. Biaka
ekspresjonowane w systemie pMal-c2 s otrzymywane jako cytoplazmatyczne biaka fuzyjne
z MBP (ang. maltose binding protein).
Dokonuje si tego poprzez insercj genu dla danego biaka w obrbie tzw. policznika
(polilinkera) - odcinka DNA zawierajcego graniczce ze sob miejsca restrykcyjne dla
rnych enzymw zlokalizowanego za genem malE. Biako fuzyjne oczyszcza si
wykorzystujc naturaln waciwo MBP wizania si do maltozy (metoda chromatografii
powinowactwa). Rozdzielenie sfuzjowanych biaek odbywa si nastpnie przez proteolityczne
cicie czynnikiem Xa, ktry rozpoznaje specyficzn sekwencj Ile-Glu-Gly-Arg, wystpujc
pomidzy MBP a biakiem rekombinowanym.
MATERIAY
- 22 -
Transkrypcja wektorw pMal-2 zaczyna si od promotora Ptac, dla ktrego induktorem

jest IPTG dodawane z zewntrz, a represorem produkowana przez gen lacIq czsteczka
represora Lac. Promotor Ptac znajduje si take pod kontrol terminatora. W skad wektorw
wchodz take geny opornoci na ampicylin oraz miejsca pocztku replikacji: bakteryjne
ColE1 ori oraz M13 ori pochodzce z bakteriofaga M13. To ostatnie pozwala na produkcj
jednoniciowego DNA poprzez infekcj komrek zawierajcych plazmid pMal-2 fagami
pomocniczymi. Jednoniciowe plazmidowe DNA moe by nastpnie wykorzystywane do
metody sekwencjonowania z uyciem startera lub mutagenezy ukierunkowanej (pMal-2
System Manual). Rysunek 8 przedstawia schemat wektora pMal-c2 oraz map restrykcyjn
policznika.
Rysunek 8. Mapa restrykcyjna plazmidu pMal-c2.
MATERIAY
- 23 -
W niniejszej pracy badawczej uywano systemu pMal-c2 do ekspresji penej oraz

krtkiej formy FIBP. Wektor pMal-c2-FIBPf otrzymano gotowy z Oslo, natomiast wektor
pMal-c2-FIBPs skonstruowano samodzielnie metodami biologii molekularnej opisanymi w
rozdziale 5.
pET-25b(+)
Wektor pET-25b(+), zoony z 5547 bp, zawiera N-terminaln sekwencj sygnaln
pelB, dziki ktrej biako bdce produktem transkrypcji kierowane jest do peryplazmy.
Rysunek 9. Mapa restrykcyjna plazmidu pET-25b(+).
MATERIAY
- 24 -
Oligonukleotydy
Wektor posiada rwnie sekwencje umoliwiajce oczyszczanie wyekspresjonowanego

biaka. Jedn z nich jest sekwencja His-Tag kodujca 6 reszt histydynowych, ktre w biaku
znajdowa si bd na kocu C. Umoliwia ona oczyszczanie biaka metod chromatografii
na kolumnie z immobilizowanymi jonami niklu, ktry jest koordynowany przez 6 reszt His.
3.8 Oligonukleotydy
Wszystkie uywane oligonukleotydy pochodziy z firmy MWG-Biotech AG.
Tabela 6. Charakterystyka uywanych oligonukleotydw.

Oligonukleotyd pET25b (+SpeI)
sekwencja
stenie
5 - GTG GTG GTG GTG GTG ACT AGT ATC CTC GGG GTC TTC C - 3
16.83 pm/l
masa
11490 g/mol
czsteczkowa
Tm
> 75C
Oligonukleotyd prNcoI (FIBP, 5)

sekwencja
stenie
5 - ATC GAG GGT AGG GCC ATG GAC - 3

38.98 pm/l
masa
6536 g/mol
czsteczkowa
Tm
63.7C
Oligonukleotyd prSpeI (FIBP, 3)

sekwencja
stenie
5 - GAC GAG ACT AGT GAG CAA CTT TAT TGT CAG C - 3
71.65 pm/l
masa
9559 g/mol
czsteczkowa
Tm
MATERIAY
50C
- 25 -
Oligonukleotydy
4 Sprzt
medyczna ania wodna LW102
Zakad Urzdze Elektronicznych
wirwka labolatoryjna 1-15
Sigma
wirwka MPW 375
Mechanika Precyzyjna, Warszawa
aparat do elektroforezy zanurzeniowej
BioRad
zasilacz
BioRad
lampa UV (312nm) TFX-20M

do analizy eli agarozowych
CONSORT
aparat do PCR, DNA Engine
MJ RESEARCH
aparat do sekwencjonowania DNA
C.B.S SCIENTIFIC CO.
suszarka do eli poliakrylamidowych
SLG
elektroporator-Electro cell Manipulator 600
BTX Electronic Genetics
spektrofotometr diodowy HP 8452A
Hewlett Packard
waga labolatoryjna WPE-300
RADWAG
waga BP-110S
Sartorius
pH-metr
Metrohm
wytrzsarka Roto-mix
Barnstead / Thermolyne
wytrzsarka do hodowli bakterii
INFORS AG
cieplarka do stacjonarnej hodowli bakterii
ELKON
autoklaw
Barnstead
komora gbokiego zamraania
New Brunswick Scientific
spektrofluorymetr FP-750
Jasco
spektropolarymetr J-715
Jasco
Sprzt
- 26 -
Preparacja bakterii kompetentnych
5 METODY
5.1 Preparacja bakterii kompetentnych

Tradycyjn metod preparacji bakteryjnych komrek kompetentnych jest standardowa
metoda chemiczna z uyciem chlorku wapnia (Taketo i wsp., 1972). Potraktowanie komrek
bakteryjnych 50 mM CaCl2 powoduje zwikszenie przepuszczalnoci ich bony komrkowej
dla DNA plazmidowego.
Kultury bakterii E.coli zwykle hodowane byy w 50 ml poywki selekcyjnej LB
(dodatek antybiotykw w zalenoci od szczepu Tabela 5) do wartoci OD650 = 0.5. Po
osigniciu takiej wartoci komrki wirowano przy 6000 obr./min. przez 5 minut i
przemywano schodzonym do 4C fizjologicznym roztworem 10mM NaCl (w celu
odpukania komrek bakteryjnych z poywki pynnej). Nastpnie wirowanie powtrzono w
takich samych warunkach, a do osadu komrek bakteryjnych dodano schodzonego roztworu
50 mM CaCl2 i pozostawiono na 20 minut na lodzie. Po kolejnym wirowaniu komrki
zawieszono w objtoci pocztkowej CaCl2 i dodano glicerolu do stenia kocowego
30%. Komrki kompetentne mona przechowywa w -70C przez kilka miesicy. Naley
jednak pamita, e wraz z upywem czasu spada ich wydajno w pniejszym procesie
transformacji.
5.2 Transformacja bakterii kompetentnych

Transformacj bakterii przygotowanych w sposb opisany wyej przeprowadzano za
pomoc metody tzw. szoku cieplnego (ang. heat-shock). Do rozmroonej na lodzie porcji
bakterii kompetentnych (250 l) dodano 210 ng DNA plazmidowego i inkubowano na
lodzie (4C) przez 30 minut. Po tym czasie mieszanin podgrzano do 42C przez 2 minuty i
ponownie schodzono na lodzie. Gwatowna zmiana temperatury jest czynnikiem, ktry w
obecnoci CaCl2 powoduje wnikanie DNA plazmidowego do komrek. Stransformowane
komrki hodowano w trzech objtociach medium (~750 l) w temperaturze 37C przez
godzin. Ostatnim krokiem byo wysianie posiadanej hodowli na stae podoe selekcyjne z
antybiotykiem, ktrego oporno gwarantuje plazmid.
METODY
- 27 -
Elektroporacja
5.3 Elektroporacja
Znacznie
wydajniejsz
metod
transformacji
komrek
bakteryjnych
DNA
plazmidowym jest elektroporacja. Pozwala ona na okoo tysickrotne zwikszenie wydajnoci

w porwnaniu do metody szoku cieplnego. Elektroporacja polega na poddaniu komrek
elektrokompetentnych dziaaniu wysokiego napicia (ok. 2000V) przez kilka milisekund.
Reakcj przeprowadzano w specjalnych kuwetkach (o szczelinie 2 mm). Bakterie
elektrokompetentne (XL1-blue) uzyskano poprzez odpukanie ich z poywki, w ktrej
prowadzona bya hodowla, za pomoc wody, co doprowadzio do okoo tysickrotnego
zagszczenia hodowli. Tak przygotowane komrki przechowywano w 10% glicerolu w
-70C. Zastosowany puls elektryczny prowadzi do utworzenia kanaw w bonie
komrkowej, co z kolei przyczynia si chwilowo do zwikszenia transporu czsteczek do
wntrza komrki. Natychmiast po ustaniu pulsu mieszanin zawieszono w 5 ml poywki SOC
i hodowano przez godzin w 37C. W odpowiednio dobranych warunkach podczas
elektroporacji nie nastpuje uszkodzenie komrek. Mieszanina poddawana elektroporacji
powinna zawiera bardzo mae stenie soli. W przeciwnym wypadku dojdzie do powstania
tzw. uku elektrycznego i zniszczenia elektroporowanej mieszaniny wraz z kuwetk.
5.4 Elektroforeza w elu agarozowym

Elektroforeza w elu agarozowym jest standardow metod stosowan do
rozdzielania, identyfikacji i oczyszczania fragmentw DNA (Sambrook i wsp., 1989).
Pooenie DNA w elu mona okreli przy pomocy dodawanego do elu bromku etydyny,
ktry interkaluje kwasy nukleinowe i powoduje ich fluorescencj pod wpywem
promieniowania UV. Metoda ta pozwala na rozdzielanie fragmentw DNA o dugoci od 50
bp do 50 kb, w zalenoci od procentowoci stosowanego elu (Tabela 7).
METODY
- 28 -
Elektroforeza w elu agarozowym
Tabela 7. Zaleno procentowoci elu agarozowego od

wielkoci rozdzielanych fragmentw DNA.
Agaroza
Wielko rozdzielanych
[%]
fragmentw
0.3
5-60 kb
0.5
1-30 kb
0.6
1-20 kb
0.7
0.8-12 kb
1.0
0.5-10 kb
1.2
0.4-7 kb
1.5
0.2-3 kb
2.0
50 bp-2 kb
Elektroforez w elu agarozowym prowadzono w orientacji horyzontalnej w polu

elektrycznym o staym napiciu i nateniu. W zalenoci od aparatu i wielkoci elu
stosowano napicie od 30 do 130 V. Wyjciowe stenie bromku etydyny wynosio 10
mg/ml, a kocowe stenie w elu 0.5 g/ml.
5.4.1 Okrelanie stenia DNA na elu agarozowym

W celu oznaczenia stenia maej iloci preparatu DNA (np.: po mini preparacji metod
Qiagen tip-20 - podrozdzia 5.7), stosuje si metod polegajc na porwnywaniu
intensywnoci wiecenia prkw w elu agarozowym z prkami pochodzcymi od
markerw masy (znane stenie DNA w danym prku). Generalnie, aby oznaczy t metod
stenie DNA plazmidowego, jako wzorca uywano roztworu tego samego plazmidu, ktrego
stenie byo wczeniej oznaczone spektrofotometrycznie (podrozdzia 5.6) oraz markerw
wielkoci DNA (wymienione w podrozdziale 3.3).
Rozdzia elektroforetyczny przeprowadzano w elu agarozowym, o procentowoci
zalenej od rozdzielanych fragmentw DNA, w buforze 1xTBE (10xTBE = 0.9M Tris-boran,
20mM EDTA, pH 8.0) z dodatkiem bromku etydyny. Skady poszczeglnych prb
poddawanych rozdziaom elektroforetycznym podano w wynikach (rozdzia 6).
METODY
- 29 -
Izolacja DNA z elu agarozowego metoda QIAEX II
5.4.2 Elektroforeza preparatywna w elu agarozowym

Aby wyizolowa DNA (np.: insert lub wektor po trawieniu z mieszaniny restrykcyjnej
patrz podrozdzia 5.9) przeprowadzano elektroforetyczny rozdzia mieszanin zawierajcych
DNA i wycinano z elu odpowiednie fragmenty. Elektroforez preparatywn prowadzano w
elu agarozowym w buforze 1xTAE (50xTAE = 2M Tris-octan, 50mM EDTA, pH 8.0),
zapewniajcym wysz wydajno. Po wyciciu fragment elu przenoszono do zwaonej
wczeniej ependorfki (w celu okrelenia masy wycitego fragmentu elu).
5.5 Izolacja DNA z elu agarozowego metoda QIAEX II

Interesujce nas fragment DNA oczyszczano i izolowano z elu agarozowego przy
pomocy mleczka silikonowego QIAEX II. Metoda polega na rozpuszczeniu agarozy, a
nastpnie selektywnej i ilociowej adsorpcji DNA do silikonowego mleczka w warunkach
wysokiego stenia soli oraz pH poniej 7.5. Elucj DNA przeprowadzano za pomoc
roztworu o niskim steniu soli i pH z zakresu 7 8.5 (np.: 10mM Tris-HCl pH 8.0).
el zostaje rozpuszczony w 50C za pomoc buforu QX1, zawierajcego chaotropow
sl, w obecnoci ktrego rozerwane zostaj wizania wodorowe midzy cukrami w agarozie.
Wizanie si do silikonowego mleczka fragmentw DNA o wielkoci mniejszej ni 100 bp
wymaga dodatkowego zwikszenia stenia soli, co osiga si poprzez podwojenie iloci
dodawanego buforu QX1 (2 x 3 objtoci pocztkowe). Dokadny przepis postpowania
opisano poniej:
Do elu zawierajcego DNA dodano 3 objtoci buforu QX1 oraz 10 l zawiesiny

mleczka silikonowego.
Inkubowano 10 min. w 50C co chwil mieszajc na mieszadle.
Zwirowano krtko (30 sek.).
Supernatant usunito, a pozostae mleczko zawieszono w 500 l buforu QX1.
Supernatant usunito, a pozostae mleczko zawieszono w 500 l buforu PE.
Supernatant usunito, a pozostae mleczko zawieszono w 500 l buforu PE.
METODY
- 30 -
Spektrofotometryczne oznaczanie stenia biaek i kwasw nukleinowych
Supernatant dokadnie usunito, pozostae mleczko wysuszono poprzez pozostawienie

otwartych probwek na okoo 30 min.
Izolacj DNA z mleczka silikonowego przeprowadzono za pomoc 10mM TrisHCl pH 8.0

postpujc wedug instrukcji:
Do suchego mleczka dodano 20 l 10mM Tris-HCl pH 8.0 i inkubowano 10 min. w 50C.
Supernatant przeniesiono do nowej probwki.
Do pozostaego osadu dodano ponownie 20 l 10mM Tris-HCl pH 8.0 i inkubowano 10

min. w 50C.
Supernatant przeniesiono do probwki z wczeniejszym supernatantem.
Zwirowano krtko (30 sek.) w celu zupenego pozbycia si resztek mleczka i supernatant,
w ktrym znajdowao si czyste DNA, przeniesiono do nowej probwki.
Skady buforw uywanych w metodzie QIAEX II chronione s patentem przez firm.
5.6 Spektrofotometryczne oznaczanie stenia biaek i

kwasw nukleinowych
Stenia biaek (FIBP, aFGF) wyznaczano spektrofotometrycznie w kuwetach
kwarcowych przy dugoci fali 280 nm (Pace i wsp., 1994). Przy obliczaniu wartoci stenia
korzystano z nastpujcych wielkoci molowego wspczynnika absorpcji:
dla aFGF
= 17420 [M-1cm-1]
dla FIBPs
= 24533 [M-1cm-1]
dla FIBPf
= 31793 [M-1cm-1]
i zalenoci:
c=
A280
l
gdzie dugo drogi optycznej
l =1.
Znajomo iloci DNA zawartego w posiadanej prbce jest istotna dla powodzenia
wielu
technik
biologii
molekularnej
oraz
uzyskania
powtarzalnych
wynikw
przeprowadzanych eksperymentw. W celu dokadnego okrelenia iloci DNA w bardziej
METODY
- 31 -
Izolacja plazmidowego DNA za pomoc metody QIAGEN-tip-20
stonych roztworach mierzono absorpcj przy dugoci fali 260 nm w kuwecie kwarcowej, a
nastpnie z uzyskanej wartoci obliczono stenie DNA korzystajc z zalenoci:
stenie jednoniciowego DNA (np.: oligonukleotyd):

c = A260 33 [g / ml]
stenie dwuniciowego DNA (np.: plazmid):
c = A260 50 [g / ml]
5.7 Izolacja plazmidowego DNA za pomoc metody

QIAGEN-tip-20
Metoda oczyszczania DNA firmy QIAGEN oparta jest o metod zmodyfikowanej lizy
alkalicznej stransformowanych komrek bakteryjnych, a nastpnie zwizanie DNA
plazmidowego do ywicy anionowymiennej (QIAGEN Anion-Exchange Resin) przy
odpowiednio niskim steniu soli i odpowiednim pH. Stosowany w kolumienkach do
oczyszczania DNA nonik jest silnie dodatnio naadowan, makroporowat ywic o rednicy
czstek wynoszcej 100 m, pokryt polimerem z grupami DEAE (dietyloaminoetylowymi).
RNA, biaka, barwniki i niskoczsteczkowe zanieczyszczenia wymywane s z nonika
buforem o rednim steniu soli. Czyste DNA plazmidowe eluowane jest buforem o wysokim
steniu soli (1.25M NaCl), a nastpnie zagszczane i odsalane przez strcanie
izopropanolem. Preparacj DNA metod Qiagen mona przeprowadza, w zalenoci od
potrzeb, na skal: mini, midi czy maxi.
Szczegowy opis preparacji na skal mini, skady uywanych buforw oraz ich iloci
stosowane w zalenoci od skali preparacji podano poniej.
W celu wyizolowania pojedynczych klonw plazmidw, koloniami z pytek po
transformacji zaszczepiono 3 mililitrowe hodowle pynne (o odpowiednim skadzie i
zawartoci antybiotykw do uywanych szczepw bakteryjnych). Po nocnej hodowli w 37C
przy 220 obr./min. hodowle bakteryjne zwirowano przy 5000 obr./min., 10 min., 4C.
Po usuniciu supernatantu, osady bakteryjne osuszono i pozostawiono na co najmniej 15

min. w -20C.
Rozmroony osad zawieszono w 0.3 ml buforu P1.
METODY
- 32 -
Izolacja plazmidowego DNA za pomoc metody QIAGEN-tip-20
Do zawiesiny dodano 0.3 ml buforu P2 (poddanie osadu bakteryjnego lizie za pomoc

SDS/NaOH w obecnoci RNazy A).
Wymieszano przez kilkakrotne odwrcenie probwki i inkubowano 5 min w temperaturze

pokojowej (zoptymalizowany czas lizy (5 min) zapewnia uwolnienie DNA plazmidowego
bez uwolnienia DNA chromosomalnego, jak rwnie zabezpiecza przed nieodwracalnym
zdenaturowaniem plazmidu).
Dodano 0.3 ml schodzonego buforu P3 (neutralizacja lizatu prowadzca do poprawnej

renaturacji kowalencyjnie zamknitego DNA plazmidowego oraz wytrcenie razem z
kompleksami SDS-sl zdenaturowanych biaek, pozostaoci komrkowych razem z DNA
chromosomalnym).
Szybko wymieszano przez kilkakrotne odwrcenie probwki i inkubowano 5 min na

lodzie.
Wirowano 20 min. w 4C przy 13000 obr./min w celu usunicia biaek. W trakcie

wirowania naley zrwnoway kolumienki nanoszc po 1 ml buforu QBT.
Supernatanty ostronie przeniesiono na kolumienki (tak by nie nanie rwnie osadu

biaek).
Po wnikniciu caego roztworu w zoe, kad kolumienk przepukano czterokrotnie 1

ml buforu QC.
DNA ze zoa odmyto do sterylnej probwki za pomoc 0.8 ml buforu QF.
Do roztworu DNA dodano 0.56 ml izopropanolu, a nastpnie zwirowano przy 13000

obr./min, 4C, 35 min.
Po ostronym usuniciu supernatantu, do osadu dodano 0.5 ml 70% etanolu (w celu

pozbycia si resztek izopropanolu) i ponownie wirowano przy 13000 obr./min, 4C, 10
min.
Po usuniciu supernatantu osad, zawierajcy wypreparowane DNA, wysuszono a

nastpnie zawieszono w 40 l sterylnej wody.
METODY
- 33 -
Ukierunkowana mutageneza
Tabela 8. Skady buforw stosowanych w preparacji plazmidowego DNA metod Qiagen (wg
Qiagen Plasmid Mini Handbook).
Bufor do zawieszania
osadu bakteryjnego
P1
50mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 100g/ml RNazy A, pH 8.0
Bufor do lizy
P2
200mM NaOH, 1% SDS
Bufor neutralizujcy
P3
3M octan potasu, pH 5.5
Bufor do
rwnowaenia nonika
QBT
750mM NaCl, 50mM MOPS, 15% izopropanol, 0.15% Triton X100, pH 7.0
Bufor do
przepukiwania
nonika
QC
1M NaCl, 50mM MOPS, 15% izopropanol, pH 7.0
Bufor do elucji DNA
QF
1.25M NaCl, 50mM Tris-HCl, 15% izopropanol, pH 8.5
Tabela 9. Objtoci poszczeglnych roztworw wykorzystywanych przy preparacji DNA

plazmidowego na kolumienkach Qiagen-tip 20 (wg Qiagen Plasmid Mini
Handbook).
Minipreparacja
Midipreparacja
Maxipreparacja
QIAGEN-tip 20
QIAGEN-tip 20
QIAGEN-tip 20
hodowla
3 ml
100 ml
500 ml
P1
0.3 ml
4 ml
10 ml
P2
0.3 ml
4 ml
10 ml
P3
0.3 ml
4 ml
10 ml
QBT
1 ml
4 ml
10 ml
QC
4 x 1 ml
2 x 10 ml
2 x 30 ml
QF
0.8 ml
5 ml
15 ml
izopropanol
0.56 ml
3.5 ml
10.5 ml
TE/woda
40 100 ml
500 l
500 l
roztwr
5.8 Ukierunkowana mutageneza

Technika mutagenezy ukierunkowanej wykorzystana zostaa w celu wprowadzenia
miejsca restrykcyjnego dla enzymu SpeI na wektorze pET-25b(+), ktre nie wystpuje na
oryginalnym plazmidzie (mapa restrykcyjna podrozdzia 3.7). Reakcj mutagenezy
ukierunkowanej zaprojektowano tak, aby sekwencja rozpoznawana przez enzym SpeI
znajdowaa si w zmutowanym plazmidzie midzy sekwencj HSV-Tag a His-Tag.
METODY
- 34 -
Restrykcja enzymatyczna (enzymem SpeI oraz NcoI) tak skonstruowanego wektora w

dalszych etapach bdzie prowadzi do otrzymania liniowej formy wektora z zachowan
sekwencj His-Tag, niezbdn do oczyszczania wyekspresjonowanego biaka.
Istnieje
kilka
ronych
technik
umoliwiajcych
wprowadzanie
sposb
ukierunkowany punktowych zmian do sekwencji DNA. Jedn z nich jest stosowana metoda
Kunkela z wykorzystaniem jednoniciowej formy plazmidu. Polega ona na wprowadzeniu
mutacji do DNA zawierajcego zamiast reszt tyminy reszty uracylu. Taka forma DNA
produkowana jest przez mutanty bakterii E.coli - CJ236 o genotypie dut-, ung-, ktre nie
posidaj enzymw dUTP-azy
oraz uracylo-N-glikozylazy, odpowiadajcych za rozkad
dUTP i usuwanie uracylu z nici DNA. W efekcie braku tych dwch enzymw moliwe jest
wbudowywanie reszt uracylu do dwuniciowego DNA. Uzyskanie jednoniciowej matrycy do
mutagenezy moliwe jest dziki skorzystaniu z pomocy fagw wkienkowych M13.
Jedn z cech tych wirusw jest jednoniciowy genom, z rwnoczesn - obecn w trakcie
propagacji w komrkach - dwuniciow form replikacyjn. Plazmidy (zwane fagemidami),
dla ktrych moliwe jest wykorzystanie techniki mutagenezy opartej o jednoniciow matryc,
musz zawiera midzygenowy segment DNA faga wkienkowego z informacj (sygnaem)
niezbdn do uzyskania DNA w postaci jednoniciowej i osonicia jej kapsydem fagowym.
Pozostae sekwencje, ktre dostarczaj biaek zwizanych z tymi procesami, pochodz z DNA
faga pomocniczego.
Waciwa reakcja mutagenezy przeprowadzana jest in vitro na matrycy z wbudowanym
uracylem. Po przyczeniu do jedniniciowej matrycy startera, ktrym jest oligonukleotyd
zawierajcy zmieniony kodon, nastpuje dobudowywanie drugiej nici DNA za pomoc T4
DNA polimerazy. Dobudowywana ni zamykana jest nastpnie w form kolist za pomoc
T4 DNA ligazy. W kolejnym etapie mieszanin reakcyjn transformuje si bakterie szczepu
E.coli MM 294 o genotypie dut+, ung+, wewntrz ktrych ni zawierajca uracyl (i

jednoczenie dzik wersj mutowanego genu) jest degradowana. W efekcie uzyskuje si
plazmid zawierajcy zmutowany kodon.
Rysunek 10 przedstawia schemat reakcji mutagenezy ukierunkowanej przeprowadzanej
metod Kunkela oraz szczegowy tok postpowania.
METODY
- 35 -
Zaznaczanie matrycy uracylem

Transformacja kompetentnych komrek szczepu E.coli CJ236
plazmidem - matryc z wklonowanym genem, do ktrego ma by
wprowadzona mutacja. Hodowla transformowanych bakterii w
obecnoci odpowiednich antybiotykw (ampicylina, chloramfenikol) i
urydyny - umoliwienie namnoenia uracylowej wersji plazmidu.
Otrzymanie jednoniciowej matrycy (z uracylem)

Dodanie fagw pomocniczych do posiadanej hodowli bakterii w celu
umoliwienia upakowania czstek fagw zawierajcych jedn, zawsze
t sam, ni plazmidu. Izolacja czstek fagw z hodowli, a nastpnie
izolacja z nich DNA (uzyskanie jednoniciowej, uracylowanej matrycy
do mutagenezy).
Doklejenie mutagennego oligonukleotydu
Do przygotowanej jednoniciowej matrycy
oligonukleotyd wprowadzajcy podan mutacj.
doklejany
jest
Waciwa reakcja mutagenezy in vitro

Druga ni plazmidu odtwarzana jest poprzez T4 DNA polimeraz, a
nastpnie zamykana przez T4 DNA ligaz.
Namnoenie plazmidu o zmienionej sekwencji

Transformacja szczepu E.coli MM odtworzonym in vitro plazmidem
majca na celu usunicie uracylowej nici wyjciowego plazmidu, a
nastpnie namnoenie dwuniciowego plazmidu zawierajcego
wprowadzan mutacj. Wysianie bakterii na pytkach w celu
uzyskania
pojedyczych
kolonii,
zawierajcych
populacj
jednakowych wersji plazmidu.
Rysunek 10. Schemat reakcji mutagenezy ukierunkowanej przeprowadzanej metod Kunkela.
METODY
- 36 -
5.8.1 Preparacja matrycy zaznaczonej uracylem

Przygotowanie jednoniciowej matrycy polega na namnoeniu faga M13 zawierajcego
zamknity w kapsydzie jednoniciowy fagemid, ktry chcemy mutowa, a nastpnie na
izolacji DNA z otrzymanych fagw.
5.8.1.1 Namnoenie fagw
3 mililitrowe hodowle (LB + ampicylina + chloramfenikol) zaszczepiono pojedynczymi

koloniami CJ 236 uzyskanymi na pytkach po transformacji i hodowano przez noc w 37C
przy 200 obr./min.
Rano przeszczepiono po 50 l nocnych hodowli CJ do 1.5 ml poywki: LB + ampicylina

+ chloramfenikol + urydyna (stenie urydyny w poywce 25 g/ml).
Bakterie hodowano ok. 2 godzin, 37C, 220 obr./min. (hodowle powinny uzyska gsto
optyczn OD650nm 0.5).
Hodowle odwirowano w eppendorfkach (po 1.5 ml) przy 5500 obr./min., 4C, 10 min.
Kad porcj osadu bakterii zawieszono w 50 l roztworu faga pomocniczego (ok. 100
czstek faga na 1 komrk) i hodowano przez 20 min. w 37C przy 180 obr./min.
Do kadej probwki dodano 1.5 ml LB (+ ampicylina + urydyna + chloramfenikol), a

nastpnie zawiesin bakterii przeniesiono do probwek do hodowli i hodowano w 37C
przy 220 obr./min. przez 4 godziny.
Hodowle zawierajce komrki bakterii oraz namnoone czstki fagw odwirowano w

eppendorfkach przy 5500 obr./min. w 4C przez 10 min.
Supernatanty przeniesiono do nowych eppendorfek po 750 l i strcono z nich fagi

dodajc po 150 l roztworu 20% PEG, 15% NaCl.
Po 30 min. inkubacji na lodzie wytrcone fagi zwirowano przy 13000 obr./min., 4C, 15
min.
Osady zawieszono w 100 l TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) i pozostawiono

na noc w -20C.
5.8.1.2 Izolacja DNA z fagw - ekstrakcja fenolem / chloroformem
Do roztworu fagw w TE dodano 50 l fenolu, wymieszano intensywnie i zwirowano.
Faz wodn (grn) przeniesiono do nowej eppendorfki.
Do fazy wodnej dodano 50 l chloroformu, wymieszano intensywnie i zwirowano.
METODY
- 37 -
Faz wodn (grn) przeniesiono do nowej eppendorfki.
Do fazy wodnej dodano 0.1 objtoci 3M octanu sodu, pH 4.5 oraz 2 objtoci 100%
zimnego etanolu.
Pozostawiono w -70C na 30 min.
Prbki zwirowano przez 20 min., 13000 obr./min., 4C.
Supernatanty usunito.
Do osadw dodano 0.5 ml zimnego 70% etanolu i wirowano 10 min., 13000 obr./min.,
4C.
Supernatanty usunito.
Osady jednoniciowego DNA wysuszono, zawieszono w 15 l TE i pozostawiono na

lodzie.
5.8.1.3 Oznaczenie wypreparowanego ssDNA
W celu sprawdzenia czy wypreparowane DNA jest form jednoniciow (ssDNA ang.
single strand DNA) na 1% el agarozowy naniesiono prbki zawierajce 5 l DNA oraz

marker ssDNA. Rozdzia elektroforetyczny prowadzono w buforze TBE przy nateniu 50V.
5.8.2 Przygotowanie oligonukleotydu do wprowadzenia mutacji

5.8.2.1 Projektowanie oligonukleotydw
Technika mutagenezy ukierunkowanej wymaga zaprojektowania dla danej mutacji
jednego oligonukleotydu, zawierajcego zmian wprowadzan w sekwencji. Oligonukleotydy
projektuje si tak, by w centralnej czci zawieray zmienian sekwencj, a po obu jej
stronach posiaday po co najmniej 12 nukleotydw komplementarnych do sekwencji
mutowanej (sekwencj nukleotydu podano w podrozdziale 3.8)
5.8.2.2 Fosforylowanie oligonukleotydw
Mutagenny olignukleotyd suy jako starter DNA przez T4 DNA polimeraz, ktra na
jednoniciowej matrycy dobudowuje drug ni. Aby w nastpnym etapie T4 DNA ligaza
moga zamkn dosyntetyzowan ni potrzebna jest grupa fosforanowa na 5 kocu
oligokleotydu. Poniewa grupa ta nie znajduje si w zamawianych oligonukleotydach,
wprowadza si j za pomoc T4 kinazy polinukleotydowej (przeniesienie z ATP na woln
METODY
- 38 -
grup 5-OH oligonukleotydu). Reakcj t przeprowadza si przed przyczeniem

oligonukleotydu do matrycy jednoniciowej.
Reakcj fosforylowania przeprowadzono na 400 pmolach oligonukleotydu pET-25b(+),

po wczeniejszym oznaczeniu spekrofotometrycznie jego stenia (podrozdzia 5.6).
Do r-ru oligonukleotydu dodano 4 l stonego buforu dla kinazy (Kinase Buffer (10x) 500mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 100mM merkaptoetanol) oraz 4 l 10mM ATP
i uzupeniono do 38 l wod.
T4 kinaz polinukleotydow rozcieczono 10 razy buforem Kinase Dillution Buffer

(50mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM 2-merkaptoetanol, 0.1M EDTA, 50% glicerol)
bezporednio przed reakcj i dodawano porcjami (po 2 l) do oligonukleotydu w 15
minutowych odstpach czasu (reakcj prowadzano przez 45 min. w 37C).
Reakcj zatrzymano przez dodanie do mieszaniny reakcyjnej 1 l 0.5M EDTA,

chelatujcego jony magnezowe niezbdne do dziaania enzymu.
Enzym dezaktywowano poprzez inkubacj roztworu w 70C przez 10 min.
Fosforylowany oligonukleotyd przechowywano do czasu waciwej reakcji mutagenezy w

-20C.
5.8.3 Waciwa reakcja mutagenezy in vitro

W celu przyczenia oligonukleotydu do matrycy (jednoniciowego DNA zawierajcego
uracyl) przygotowano mieszanin zawierajc:
5 l jednoniciowego DNA
1 l fosforylowanego oligonukleotydu (10 pmoli)
2.5 l 10x stonego buforu SSC (1.5M NaCl, 150mM cytrynian sodu, pH 7.0)
16.5l sterylnej wody
Mieszanin pozostawiono w 70C przez 2 min., a nastpnie powoli schadzano przez 30

min.
Do schodzonej mieszaniny dodano:

20 l 5x stonego Polymerase Mix (100mM Tris-HCl, pH 8.0,
10mM DTT, 50mM MgCl2, 2.5mM dNTP, 5mM ATP)
55 l sterylnej wody
Po zwirowaniu do prbki dodano:
METODY
- 39 -
2 l (2U) T4 ligazy
0.6 l (2.5U) T4 DNA polimerazy
Ponownie zwirowano.
Inkubowano 5 min. na lodzie, 5 min. w temperaturze pokojowej, a nastepnie 2 godziny w

37C.
Reakcj zatrzymano przez dodanie 3 l 0.5M EDTA.
5.8.4 Transformacja mieszaniny reakcyjnej do bakterii

kompetentnych szczepu MM 294
Mieszanin po reakcji mutagenezy stransformowano bakterie kompetentne szczepu
E.coli MM 294 wedug metody opisanej w podrozdziale 5.2. Bakterie te przeprowadzaj

degradacj nici DNA zawierajcej uracyl (i jednoczenie dzik wersj mutowanego genu).
W efekcie uzyskuje si plazmid zawierajcy zmutowany kodon.
Izolacj DNA plazmidowego z pojedynczych kolonii po transformacji przeprowadzono
za pomoc metody Qiagen-tip20 opisanej w podrozdziale 5.7.
5.9 Trawienie restrykcyjne

Metoda trawienia restrykcyjnego uywana w biologii molekularnej wykorzystuje
naturaln aktywno endonukleaz restrykcyjnych, polegajc na rozcinaniu obcego DNA.
Enzymy restrykcyjne rozpoznaj bardzo specyficznie sekwencje od czterech do omiu par
zasad i hydrolizuj wizanie fosfodiestrowe kadej z obu nici tego rejonu DNA.
Rozpoznawane sekwencje maj charakter palindromowy, a miejsca zerwania nici DNA
usytuowane s symetrycznie.
Tabela 4 zawiera uywane enzymy restrykcyjne oraz ich charakterystyk. Na podstawie
informacji doczanych przez firm przy zakupie enzymu restrykcyjnego oraz korzystajc z
poniszego wzoru okrelano iloci jednostek aktywnoci poszczeglnych enzymw
potrzebnych do strawienia danego DNA w cigu godziny:
wielkosc DNA wzorcoweg o
ilosc miejsc restrykcyj nych

dla danego enzymu w DNA
wzorcowym
METODY
1 jednostka
ilosc miejsc restrykcyj nych
dla danego enzymu w naszym
DNA
- 40 -
wielkosc naszego DNA
5.9.1 Trawienie restrykcyjne plazmidu pBSN-FIBPf

Jednym z celw pracy byo przeklonowanie z plazmidu pBSN-FIBPf fragmentu DNA
kodujcego FIBPs do wektora pMal-c2. Umoliwioby to dalsz ekspresj biaka FIBPs w
systemie pMal-c2.
Aby uzyska insert (FIBPs) plazmid zawierajcy sekwencj kodujc FIBPf poddano
trawieniu nastpujcymi enzymami restrykcyjnymi: NcoI i BamHI (koniecznie zachowujc
kolejno trawie). Rysunek 11 przedstawia sekwencje nukleotydowe charakterystycznie
rozpoznawane przez te enzymy.
Rysunek 11. Schemat trawienia restrykcyjnego plazmidu pBSN-FIBPf.
Powsta po trawieniu enzymem NcoI, liniow form plazmidu pBSN-FIBPf poddano

reakcji tworzenia tzw. tpych kocw. Dokonano tego za pomoc T4 DNA polimerazy,
ktra w obecnoci dodanych z zewntrz dezoksyrybonukleotydw (dNTP) dobudowuje
brakujce w nici plazmidowego DNA nukleotydy. Stosunek objtociowy dodanych dNTP do
mieszaniny restrykcyjnej (plazmidowe DNA + bufor dla enzymu + enzym restrykcyjny)
powinien wynosi 1:10. Po dodaniu 0.5 l T4 DNA polimerazy mieszanin pozostawiono na
godzin w temperaturze 37C. Po tym czasie do mieszaniny dodano 1 l 0.5M EDTA i
inkubowano w 65C przez 10 min. (w celu zahamowania aktywnoci polimerazy). DNA w
formie liniowej wyizolowano nastpnie z mieszaniny przeprowadzajc ekstrakcj
fenolem/chloroformem (analogicznie do podpunktu 5.8.1.2). Preparat liniowego DNA
poddano nastpnie drugiemu trawieniu restrykcyjnemu enzymem BamHI.
METODY
- 41 -
5.9.2 Trawienie restrykcyjne plazmidu pMal-c2

W celu przygotowania wektora do klonowania plazmid pMal-c2 poddano trawieniu
enzymami restrykcyjnymi w nastpujcej kolejnoci: EcoRI, BamHI. Rysunek 12 przedstawia
sekwencje nukleotydowe specyficznie rozpoznawane przez te enzymy.
Rysunek 12. Schemat trawienia restrykcyjnego plazmidu pMal-c2.
Reakcj trawienia, izolacj wektorowego DNA i oznaczanie jego stenia

przeprowadzono w sposb analogiczny do opisanych powyej etapw dla insertu FIBPs
(punkt 5.9.1). Rny by tylko pierwszy stosowany enzym restrykcyjny.
5.9.3 Trawienie restrykcyjne zmutowanego plazmidu pET-25b(+)

Przeklonowanie genu FIBPs z wektora systemu ekspresyjnego pMal-c2 do pET25b(+)
wymagao trawienia restrykcyjnego plazmidu pET-25b(+), po jego wczeniejszy zmutowaniu
(podrozdzia 5.8), enzymami NcoI i SpeI. Rysunek 13 przedstawia sekwencje nukleotydowe
specyficznie rozpoznawane przez te enzymy.
Rysunek 13. Schemat trawienia restrykcyjnego wektora pET-25b(+).
METODY
- 42 -
Reacja PCR
5.10
Reacja PCR
Reakcj PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) wykorzystano w celu pozyskania genu
FIBPs, ktry nastpnie uyto jako insert do konstrukcji plazmidu pET25b(+)-FIBPs. Zalet
reakcji PCR jest moliwo rwnoczesnego otrzymania genu i wyposaenia go w
odpowiednie miejsca restrykcyjne, pozwalajce na ligacj z DNA wektorowym trawionym
takimi samymi enzymami. Jako matrycy do reakcji PCR uyto skonstruowanego poprzednio
plazmidu pMalc2-FIBPs. Insert namnoono poprzez zastosowanie zaprojektowanych
wczeniej starterw (ang. primer) komplementarnych do miejsc ograniczajcych sekwencj
FIBPs na matrycy (Tabela 6)oraz termostabilnej DNA polimerazy Vent. W tym celu
zastosowano kolejne cykle denaturacji termicznej (uzyskanie jednoniciowej matrycy),
przyczania starterw (ang. annealing) oraz aktywno polimerazow, prowadzc do
powstania na bazie matrycy komplementarnych fragmentw DNA. Korzystajac z poniszego
wzoru wyliczono temperatur annealingu dla komplementarnych do matrycy fragmentw
oligonukleotydw prNcoI (FIBP, 5) oraz prSpeI (FIBP, 3):
Tm = nAT 2C + nGC 4C
gdzie: Tm oznacza temperatur annealingu, nAT i nGC odpowiednio liczb par zasad
AT i GC w komplementarnym do matrycy fragmencie oligonukleotydu.
Oligonukleotyd prNcoI (FIBP, 5) by cakowicie komplementarny do matrycy, podczas

gdy w prSpeI (FIBP, 3) na kocu 5 obecna bya sekwencja GAC GAG ACT AGT
niekomplementarna, zawierajca miejsce restrykcyjne dla enzymu SpeI (ACT AGT). W
kolejnych cyklach reakcji PCR pocztkowo nie w peni komplementarny starter sta si
cakowicie kompatybilny do matrycy, na skutek wykorzystywania przez DNA polimeraz
nowo dosyntetyzowanych nici jako matryc w dalszej czci reakcji. Umoliwio to
wprowadzenie miejsca restrykcyjnego dla SpeI, a co za tym idzie ligacj poprzez tzw. lepkie
koce insertu FIBPs z wektorem pET25b(+).
5.11
Reakcja ligacji
Standardowo ligacj, czyli reakcj czenia fragmentw DNA (insertu z wektorem),

przeprowadza si w mieszaninie zawierajcej insert do wektora w stosunku molowym 10:1 i
zawartoci DNA wektorowego ok. 20 - 40 ng na 10 l mieszaniny. Dodatkowo przeprowadza
si rwnoczenie reakcj autoligacji (mieszanina nie zawierajca insertu). Celem jest
METODY
- 43 -
Sekwencjonowanie
sprawdzenie w jakim stopniu poddany restrykcji wektor bdzie tworzy w obecnoci T4 DNA
ligazy polimeryczne formy lub podlega rekombinacjom, prowadzcym do powstania nie
interesujcych nas, a transformujacych si do bakterii i dalej replikujacych si plazmidw.
Reakcj ligacji kadorazawo prowadzano przez noc w 16C. Powsta na skutek ligacji
kolist form DNA plazmidowego wytrcano za pomoc n-butanolu. Do mieszaniny
ligacyjnej i autoligacyjnej dodawano po 1ml n-butanolu, wymieszano intensywnie do
zniknicia rozgraniczenia faz, inkubowano 2 godziny w -20C i wirowano 30 min. przy 13000
obr./min. w temp. 4C. Osad przepukano 0.5 ml 70% etanolu i wirowano 10 min. w
warunkach takich jak poprzednio. Po usuniciu supernatantu wysuszono osad i zawieszono w
10l sterylnej wody.
Po reakcji ligacji mieszanin ligacyjn i autoligacyjn wprowadza si do komrek
bakteryjnych zwykle na drodze elektroporacji (podrozdzia 5.3), ze wzgldu na wysz
wydajno tej metody w porwnaniu do transformacji metod szoku cieplnego. Po
namnoeniu stransformowanych komrek w poywce SOC wysiano je na pytki z poywk
selekcyjn. Pojedyncze klony plazmidw powstae po ligacji izolowano z komrek
bakteryjnych za pomoc metody QIAGEN tip-20 opisanej szczegowo w podrozdziale 5.7.
5.12
Sekwencjonowanie
W celu sprawdzenia prawidowoci przeprowadzonego klonowania przeprowadzono

reakcj sekwencjonowania przy uyciu zestawu do sekwencjonowania firmy United States
Biochemical, opart na metodzie Sangera (Sanger i wsp., 1997). Polega ona na
kontrolowanym przerywaniu enzymatycznej replikacji sekwencjonowanej nici DNA w
wyniku
wczenia
do
nowo
powstajcej
nici
dideoksy
analogu
odpowiedniego
dezoksyrybonukleotydu (2, 3-didezoksyrybonukleotyd). Reakcja przeprowadzana jest przez

genetycznie zmodyfikowan DNA polimeraz faga T7 (SequenaseTM ver. 2.0) pozbawion
aktywnoci 3-5 egzonukleazowej, posiadajc natomiast zdolno wczania do nici DNA
analogw nukleotydw stosowanych w tej metodzie. Reakcj przeprowadzano w czterech
osobnych probwkach, gdzie kada z nich zawieraa dezoksrybonukleotydy (dNTP), z
ktrych jeden - dATP znakowany by
35
S, oraz jeden didezoksyrybonukleotyd (ddNTP) w
kadej probwce inny, na ktrym zatrzyma si replikacja nici. Analiz sekwencji

przeprowadzano poprzez elektroforetyczny rozdzia powstajcych fragmentw DNA w
denaturujcym elu poliakrylamidowym. Wizualizacji obrazu dokonywano poprzez
METODY
- 44 -
Sekwencjonowanie
zaczernienie kliszy fotograficznej, wywoanego promieniowaniem pochodzcym z 35SdATP wbudowanego do fragmentw DNA w trakcie reakcji sekwencjonowania.
Rysunek 14 przedstawia schematyczn ide sekwencjonowania.
Rysunek 14. Schemat przedstawiajcy metod sekwencjonowania z uyciem dideoksy analogw

rybonukleotydowych.
METODY
- 45 -
Sekwencjonowanie
5.12.1 Przygotowanie plazmidowej matrycy do

sekwencjonowania
Matryc do sekwencjonowania stanowi jednoniciowe DNA, ktre otrzymuje si z
dwuniciowego kwasu dezoksyrybonukleinowego poddanego zasadowej denaturacji, a
nastpnie zagszczeniu i odsoleniu. Odpowiedni ilo wodnego roztworu DNA (po izolacji
metod Qiagen-tip 20), zawierajc okoo 1.5 g DNA plazmidowego, inkubowano 10 min.
w 37C z 0.25 objtoci 2N NaOH. Nastpnie roztwr neutralizowano przez dodanie 0.375
pocztkowej objtoci 3M octanu sodu pH 4.5 i rozcieczono za pomoc 0.875 pocztkowej
objtoci wod. Zdenaturowan matryc strcono z roztworu przez dodanie 100% etanolu
(9.4 objtoci wyjciowej), inkubacj 30 min. w -70C, a nastpnie zwirowanie przy 13000
obr./min. przez 15 min. w 4C. Po przepukaniu za pomoc 0.5 ml 70% etanolu, zwirowaniu
przez 10 min. w warunkach jak poprzednio i wysuszeniu, DNA zawieszono w 7 l wody.
5.12.2 Przyczenie startera

Przyczenie (ang. annealing) startera do jednoniciowego DNA zachodzi podczas
dwuminutowej inkubacji w 65C, a nastpnie powolnego schadzania poniej 35C
mieszaniny zawierajcej: 7 l zdenaturowanej matrycy, 1 l primera (5 pm) oraz 2 l
Sequenase Reaction Buffer (Tabela 10 zawiera skady wszystkich roztworw z zestawu do

sekwencjonowania). Gotow do sekwencjonowania matryc trzymano na lodzie do waciwej
reakcji sekwencjonowania.
5.12.3 Znakowanie radioizotopem i sekwencjonowanie

Do schodzonej mieszaniny po annealingu dodano 1 l 100mM DTT, 2 l 5x
rozcieczonego Labelling Mix, 0.5 l izotopu 35S-dATP oraz 2 l 8x rozcieczonej
polimerazy Sequenase. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej rozporcjowano po
3.5 l powyszej mieszaniny do czterech probwek z rozpipetowanymi uprzednio 2.5 l
odpowiednich ddNTP (Termination Mix). Po 5 minutach inkubacji w 37C do wszystkich
czterech probwek dodano po 4 l buforu przerywajcego reakcj Stop Solution. Tak
przygotowane prbki przechowywano si w -20C.
METODY
- 46 -
Sekwencjonowanie
5.12.4 Przygotowanie elu i warunki przeprowadzenia

elektroforezy
el do sekwencjonowania sporzdza si od 2 do 20 godzin przed waciw reakcj
elekroforezy w celu zapewnienia jego cakowitej polimeryzacji. W skad elu do
sekwencjonowania wchodzi: 42 g mocznika, 10 ml 10x rozcieczonego buforu TBE, 15 ml
mieszaniny arylamid/bisakrylamid (5.7 g akrylamidu + 0.3 g bisakrylamidu), woda do 100
ml, 1ml 10% nadsiarczanu amonu, 100 l TEMED. Reakcj elektroforezy prowadzono w
buforze 1x TBE przy napiciu rzdu 2kV i nateniu 25 do 40 mA. Przed naniesieniem
prbek el rwnowaono godzin w powyszych warunkach. Podgrzanie przez 2 min. w
temp. 70 - 80C prbki naniesiono na el w iloci 2.5 - 3 l na ciek.
Po wycigniciu elu z aparatu mocznik odpukano 10% kwasem octowym, a nastpnie
wod i natychmiast przeniesiono na bibu Whatmana. Po wysuszeniu el umieszczono w
kasecie z bon fotograficzn na 12 - 36 godzin, po czym klisz wywoywano si w ciemni.
Tabela 10. Skad roztworw z zestawu do sekwencjonowania (wg Step-by-step protocols for DNA
sequencing).
Nazwa roztworu
Skad
5x Sequenase Reaction Buffer
20mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 250mM NaCl2, pH 7.5
5x Labelling Mix
7.5M dGTP, 7.5M dTTP, 7.5M dCTP
ddG Termination Mix
80M dGTP, 80M dATP, 80M dCTP, 80M dTTP, 8M

ddGTP, 50mM NaCl
ddC Termination Mix

ddCTP, 50mM NaCl
ddT Termination Mix

ddTTP, 50mM NaCl
ddA Termination Mix

ddATP, 50mM NaCl
Bufor dla Sequenase ver 2.0
20mM KH2PO4, 1mM DTT, 0.1mM EDTA,

50% glicerol, pH 7.4
Stop Solution
95% formamid, 20mM EDTA, 0.05% bkit

bromofenolowy, 0.05% cyjanoksylen FF
METODY
- 47 -
Ekspresja FIBP w systemie pMal-c2 jako biako fuzyjne z MBP
5.13
Ekspresja FIBP w systemie pMal-c2 jako biako
fuzyjne z MBP
Proces ekspresji obydwu form FIBP (FIBPs i FIBPf) w systemie pMal-c2
przeprowadzano
identycznych
warunkach
stosujc
stransformowane
uprzednio
odpowiednim plazmidem kompetentne komrki bakteryjne (szczep DH5 lub BL). Schemat
oraz map miejsc restrykcyjnych wektora plazmidowy pMal-c2 przedstawiono w
podrozdziale 3.7.
Otrzymanymi, po wysianiu na stae podoe selekcyjne, pojedynczymi koloniami
bakteryjnymi zaszczepiono 10 ml pynne poywki selekcyjne. Tak przygotowane prehodowle
hodowano w 37C w wytrzsarce (200 obr./min.) przez noc. Na drugi dzie prehodowlami
zaszczepiono wczeniej przygotowane sterylne 1l pynne poywki selekcyjne. Waciw
hodowl ekspresyjn prowadzono w identycznych warunkach jak dla prehodowli, tj. w 37C,
200 obr./min., do otrzymania wartoci gstoci optycznej OD przy 600 nm rwnej 0.6 0.8.
Transkrypcj genomu bakteryjnego indukowano przez dodatek IPTG (w stosunku 1:1000). Po
indukcji hodowl kontynuowano przez 3 godziny. W celu oddzielenia komrek bakteryjnych
od poywki hodowle odwirowano w warunkach: 6000 obr./min., 4C, 10 minut. Otrzymane
osady zawieszono w 50 ml buforu kolumnowego o skadzie: 20mM Tris, 1mM EDTA, 1mM
DTT, 0.2M NaCl, a nastpnie pozostawiono w -70C na godzin (lub ewentualnie na noc w
-20C). Po upywie godziny roztwory rozmroono na lodzie i sonikowano (~10 x po 15
sekund) w celu rozbicia komrek bakteryjnych i uwolnienia zmagazynowanych w ciakach
inkluzyjnych
produktw
biakowych.
Otrzymany
supernatant,
zawierajcy
biako
rekombinowane, rozcieczono piciokrotnie w buforze kolumnowym i nanoszono na

zrwnowaon tym samym buforem kolumn ze zoem z immobilizowan amyloz.
5.13.1 Oczyszczanie biaka fuzyjnego MBP-FIBP na kolumnie z

immobilizowan amyloz
Oczyszczanie wyekspresjonowanego w systemie pMal-c2 biaka fuzyjnego FIBP-MBP
wykonywano metod chromatografii powinowactwa, wykorzystujc naturalne oddziaywanie
biaka MBP z maltoz, dwucukrem redukujcym zbudowanym z czsteczek -D-glukozy
poczonych wizaniem -14 glikozydowym. Biako fuzyjne wie si ze zoem z
immobilizowan amyloz, ktra jest wielocukrem zbudowanym podobnie jak maltoza z
czsteczek -D-glukozy poczonych wizaniem -14 glikozydowym, poprzez MBP.
METODY
- 48 -
Ekspresja aFGF w systemie pET-3c
Preparat biakowy piciokrotnie rozcieczony w buforze reakcyjnym nanoszono na

zrwnowaon kolumn chromatograficzn przy przepywie 1ml/min. Po naniesieniu caego
preparatu biakowego kolumn dodatkowo przemyto dwunastoma objtociami buforu
rakcyjnego, po czym przystpiono do zwalniania biaka fuzyjnego ze zoa. Jako czynnika
zwalniajcego uyto 10mM maltozy dodanej do buforu reakcyjnego, ktra wypiera ze zoa
biako MBP z podczonym FIBP. Podczas zwalniania FIBP-MBP zbierano frakcje o
objtoci 3 ml, w ktrych oznaczono biako przy dugoci fali 280 nm. Frakcje o najwyszej
wartoci absorpcji zlano razem i w caoci oznaczono warto A280 w celu wyznaczenia
stenia wyekspresjonowanego FIBP oraz wydajnoci ekspresji.
Przed
kolejnym
oczyszczaniem
biaka
fuzujnego
regenerowano
zoe
immobilizowan amyloz przemywajc je kolejno trzema objtociami wody, trzema

objtociami 0.1% SDS, jedn objtoci wody i trzema objtociami buforu kolumnowego.
5.14
Ekspresja aFGF w systemie pET-3c
Litrow hodowl bakterii DH5, po ich wczeniejszym stransformowaniu plazmidem

pET-3c zawirajcym sekwencj kodujc aFGF, prowadzono analogicznie jak w przypadku
ekspresji FIBP (podrozdzia 5.13). Identyczne byy take warunki hodowli. Stymulacj
ekspresji aFGF poprzez dodanie IPTG rozpoczto po osigniciu przez hodowl wartoci
OD600nm=1. Po indukcji hodowl kontynuowano przez 3 godziny. Nastpnie hodowl
odwirowano w warunkach: 6000 obr./min., 4C, 10 minut. Otrzymane osady zawieszono w 40
ml zimnego buforu PBS o skadzie: 10mM fosforan pH 7.4, 20mM NaCl, a nastpnie
wirowano jak poprzednio. Osady zawieszono w 50 ml buforu kolumnowego o skadzie
20mM Tris pH 7.4, 1mM EDTA, 1mM DTT,0.1mM PMSF, 0.5M NaCl i pozostawiono na
noc w -20C. Roztwory po zamroeniu sonikowano (~10 x po 15 sekund) w celu rozbicia
komrek bakteryjnych i uwolnienia produktw biakowych. Biaka oddzielono poprzez
wirowanie przy 12000 obr./min. w 4C przez 10 minut. Otrzymany supernatant, zawierajcy
produkty biakowe, rozcieczono piciokrotnie w buforze kolumnowym i naniesiono na
zrwnowaon tym samym buforem kolumn ze zoem z immobilizowan heparyn.
METODY
- 49 -
Elektroforeza biakowa w warunkach denaturujcych (ang. SDS-PAGE)
5.14.1 Oczyszczanie aFGF na kolumnie z immobilizowan

heparyn
Oczyszczanie wyekspresjonowanego w systemie pET-3c aFGF wykonuje si metod
chromatografii powinowactwa, wykorzystujc naturalne oddziaywanie aFGF z heparyn.
Piciokrotnie rozcieczony w buforze reakcyjnym preparat biakowy nanoszono przy
przepywie 1ml/min. Po naniesieniu caego preparatu kolumn dodatkowo przemyto 300 ml
buforu reakcyjnego z 0.5M NaCl, a nastpnie tym samym buforem zawierajcym zwikszone
stenie NaCl do 0.7M. aFGF zwalniano ze zoa za pomoc buforu reakcyjnego z 2M NaCl.
Podczas zwalniania zbierano frakcje o objtoci 3 ml i oznaczono w nich biako przy dugoci
fali 280 nm. Frakcje o najwyszej wartoci absorpcji zlano razem i w caoci oznaczono
warto A280 w celu wyznaczenia stenia aFGF oraz wydajnoci ekspresji.
W analogiczny sposb prowadzono ekspresj oraz oczyszczanie mutantw aFGF z
wstawionymi wewntrzczsteczkowymi mostkami disiarczkowymi (mutant Cys11-Cys59 i
Cys43-Cys149).
5.15
Elektroforeza biakowa w warunkach
denaturujcych (ang. SDS-PAGE)

Rozdzia elektroforetyczny biaek w warunkach denaturujcych odbywa si w
obecnoci dodecylosiarczanu sodu (SDS), ktry jest anionowym detergentem niszczcym
oddziaywania niekowalencyjne w natywnych biakach. Aniony SDS wi si z acuchami
gwnymi biaek w stosunku jeden anion na dwie reszty aminokwasowe, nadajc powstaemu
kompleksowi ujemny adunek wypadkowy proporcjonalny w przyblieniu do masy
czsteczkowej biaka. Ruchliwo wikszoci acuchw polipeptydowych jest liniowo
odwrotnie proporcjonalna do logarytmu ich masy czsteczkowej. Wyjtkiem s niektre
biaka bogate w wglowodany i biaka bonowe, ktre migruj w elu poliakrylamidowym
nietypowo. Metoda SDS-PAGE jest metod szybk, czu i o bardzo duej rozdzielczoci. Po
wybarwieniu elu bkitem Coomassie 0.1 g (~ 2 pm) biaka daje wyrany prek. W SDS-
PAGE mona rozdzieli biaka rnice si mas czsteczkow o okoo 2%, co odpowiada
dziesiciu resztom aminokwasowym (Stryer L. Biochemia, PWN).
el poliakrylamidowy, w ktrym przeprowadza si rozdzia biaek skada si z dwch
warstw: warstwy zagszczajcej oraz rozdzielajcej. Naniesiona prbka pod wpywem prdu
przesuwa si wzdu elu przechodzc najpierw przez krtsz warstw zagszczajac (el
METODY
- 50 -
Elektroforeza biakowa w warunkach denaturujcych (ang. SDS-PAGE)
grny), a nastpnie przez dusz rozdzielajc (el dolny). O ile zagszczajca warstwa elu
jest zawsze taka sama dla wszystkich biaek, to rozdzielajca warstwa elu dobierana jest w
zalenoci
od
tego,
jakiej
wielkoci
fragmenty
chcemy
rozdzieli.
Czynnikami
odpowiedzialnymi za polimeryzacj elu poliakrylamidowego s APS oraz TEMED. W ich

obecnoci nastpuje sieciowanie akrylamidu metylenobisakrylamidem, tworzcym wizania
poprzeczne midzy czsteczkami akrylamidu. Skad poszczeglnych warstw elu
poliakrylamidowego oraz buforw uywanych w technice SDS-PAGE i ich proporcje
przedstawiono w tabelach poniej:
Tabela 11. Skad buforw uywanych w elektroforezie w warunkach
denaturujcych.
Bufory uywane w
SKAD
elektroforezie z SDS
Bufor 1
0.75M Tris pH 8.8, 0.2% SDS
Bufor 2
30% akrylamid, 0.8% bisakrylamid
Bufor 3
0.75M Tris pH 6.8, 0.2% SDS

0.125M Tris, 0.96M glicyna, 0.5%
Bufor reakcyjny
SDS (na 1 litr)

Tabela 12. Skad elu rozdzielajcego w zalenoci od procentowoci.
EL ROZDZIELAJCY
(DOLNY)
SKAD
13.5%
12%
10%
7.5%
Bufor 1
12 ml
12 ml
17 ml
19.7 ml
Bufor 2
10 ml
8 ml
9 ml
6.3 ml
APS 10%
200 l
500 l
500 l
500 l
TEMED
50 l
50 l
50 l
50 l
Tabela 13. Skad elu zagszczajcego.
EL ZAGSZCZAJCY
(GRNY)
SKAD
Bufor 2
0.8 ml
Bufor 3
2.5 ml
2 ml
woda destylowana
METODY
APS 10%
125 l
TEMED
25 l
- 51 -
Techniki spektroskopowe
Prbki nanoszone na el poliakrylamidowy przygotowywano zwykle wedug

poniszego schematu:
x l roztworu biaka (zwykle 5-25 l od 0.1 do 10 g biaka)
+ 5 l buforu (6x stony 0.28M 4xTris-HCL pH6.8, 30% glicerol,
1%SDS, 0.5M DTT, 1.2 mg bkitu bromofenolowego)
+ woda do 30 l
Marker masy nanoszono zwykle w iloci 10l. Przed samym nanoszeniem na el prbki
podgrzewano w 90C przez 5 min.
Elektroforez biakow prowadzono w pooeniu wertykalnym przy nateniu
zmiennym, pocztkowo wynoszcym ~80V (podczas wchodzenia prbek w el
zagszczajcy), a nastpnie ~180V. Po zakoczonej elektroforezie el poliakrylamidowy
barwiono w bkicie Coomasie (~2 godz.), a nastpnie odbarwiano w 5% kwasie octowym,
7% metanolu (pozostawiajc zwykle na noc lub duej).
5.16
5.16.1 Fluorymetria
Metod fluorymerii wykorzystywano do pomiarw stabilnoci aFGF w nastpujcych
warunkach:
wzbudzenia: 270 nm
emisji: 280 - 400 nm
szeroko szczeliny: 1 mm
ilo zbieranych widm: 7
5.16.2 Dichroizm koowy

Dichroizm koowy (CD ang. circular dichroism) jest technik dowiadczaln
stosowan w badaniach konformacji biaek bdc wyrazem aktywnoci optycznej. Widmo
CD biaka w obszarze dalekiego nadfioletu (UV) dostarcza dokadnych informacji o
konformacji gwnego acucha polipeptydowego. Pomiary CD przeprowadzano w zakresie
200 300 nm w funkcji pH. Do pomiarw uywano 5M stenie biaka w 20mM buforze
METODY
- 52 -
HEPES. Krzywe denaturacji pod wpywem pH sporzdzane byy dla biaek o steniu
rwnym 5M w 0.3M KCl. Obnienie pH nastpowao przez dodanie minimalnych objtoci
HCl o trzech rnych steniach: 10-3, 10-2, 10-1.
METODY
- 53 -
Klonowanie FIBPs do wektora pMal-c2
6 WYNIKI
6.1 Klonowanie FIBPs do wektora pMal-c2

Jednym z celw pracy byo przeklonowanie do wektora pMal-c2 z plazmidu pBSNFIBPf fragmentu DNA kodujcego FIBPs. Umoliwio to ekspresj biaka FIBPs w systemie
ekspresyjnym pMal-c2. Rysunek 15 przedstawia schematycznie kolejne etapy procesu
klonowania.
6.1.1 Oznaczenie ste uywanych plazmidw

Stenia
plazmidw
pMal-c2
oraz
pBSN-FIBPf
wyznaczone
byy
spektrofotometrycznie, wg metody opisanej w podrozdziale 5.6 i wynosiy:
dla pMal-c2
402.5 g/ml
dla pBSN-FIBPf
240 g/ml
pBSNFIBPf
restrykcja EcoRI
restrykcja NcoI
5' ATC GAG GGA AGG ATT TCA GAA TTC GGA TCC 3'
3' TAG CTC CCT TCC TAA AGT CTT AAG CCT AGG 5'
ACC ATG GAC ...

GGA TCC
FIBPf ...
CCT AGG
TGG TAC CTG
tworzenie tpych kocw
tworzenie tpych kocw

5' ATC GAG GGA AGG ATT TCA G AA TT
3' TAG CTC CCT TCC TAA AGT CTT AA
ACC ATG
TGG TAC
AA TTC GGA TCC

TT AAG CCT AGG
restrykcja BamH1
(tworzenie lepkich kocw)
restrykcja BamH1
(tworzenie lepkich kocw)
5' ATC GAG GGA AGG ATT TCA G AA TT
3' TAG CTC CCT TCC TAA AGT CTT AA
C ATG GAC ... FIBPf ... GGA TCC

CCT AGG
G TAC CTG
ACC ATG
TGG TAC
AA TTC GGA TCC

TT AAG CCT AGG
GGA TCC
C ATG GAC ...
FIBPf ...
CCT AGG
G TAC CTG
izolacja insertu
izolacja wektora
elektroforeza preparatywna
+ Qiaex II
LIGACJA
5' ATC GAG GGA AGG ATT TCA G AA TTC ATG GAC
...
3' TAG CTC CCT TCC TAA AGT CTT AA G TAC CTG
FIBPs
... GGA TCC ...

CCT AGG
pMalc2 - FIBPs
Rysunek 15. Schemat kolejnych etapw procesu klonowania fragmentu DNA kodujcego FIBPs z
plazmidu pBSN-FIBPf do wektora pMal-c2.
WYNIKI
- 54 -
6.1.2 Trawienie restrykcyjne

Trawienie restrykcjne plazmidw przeprowadzone w celu uzyskania insertu oraz
przygotowania wektora do klonowania opisano dokadnie w punktach 5.9.1 i 5.9.2
Skad uytych mieszanin restrykcyjnych:
dla pMal-c2:
36 l DNA
4 l buforu H dla EcoRI
2 l enzymu EcoRI (20U)
objto kocowa:
dla pBSN-FIBPf :
42 l
36 l DNA
4 l buforu H dla NcoI
2 l enzymu NcoI (20U)
objto kocowa:
42 l
Na otrzymanych po restrykcji NcoI liniowych formach plazmidw przeprowadzono

reakcj tworzenia tzw. tpych kocw za pomoc T4 DNA polimerazy. Kolejnym krokiem
bya izolacja liniowych form DNA z mieszanin restrykcyjnych metod ekstrakcji fenolem
(podpunkt 5.8.1.2), a nastpnie poddanie ich trawieniu restrykcyjnemu przez godzin w 37C
enzymem BamHI.
Mieszanina restrykcyjna w obydwu przypadkach zawieraa:

osad DNA zawieszony w 9 l sterylnej wody
1 l buforu B dla BamHI
1 l enzymu BamHI (10U)
objto kocowa:
WYNIKI
- 55 -
11 l
6.1.3 Elektroforeza preparatywna trawionych plazmidw

W celu wyizolowania z mieszanin restrykcyjnych insertu oraz wektora rozdziaowi
elektroforetycznemu w 1.5% elu agarozowym w buforze TAE (punkt 5.12.4) poddano
nastpujce prbki:
11 l trawionego plazmidu pMal-c2 + 2 l buforu 6xBP
11 l trawionego plazmidu pBSN-FIBPf + 2 l buforu 6xBP
5 l nietrawionego plazmidu pMal-c2 + 5 l wody + 2 l buforu 6xBP
5 l nietrawionego plazmidu pBSN-FIBPf + 5 l wody + 2 l buforu 6xBP
2 l markera + 8 l wody + 2 l buforu dla 6xBP
Rozdzia prowadzono przy nateniu 50V a nastpnie el przeniesiono na lamp do

analizy eli agarozowych i przy nawietleniu przy 312 nm wycito fragmenty elu,
zawierajce FIBPs oraz strawiony pMal-c2. Wycite fragmenty przeniesiono do zwaonych
wczeniej probwek eppendorfa i zwaono ponownie w celu ustalenia masy wycitego
fragmentu.
6.1.4 Izolacja insertu i wektora z elu agarozowego

Izolacj FIBPs oraz strawionego pMal-c2 z elu agarozowego przeprowadzono metod
Qiaex II opisan szczegowo w podrozdziale 5.5.
6.1.5 Elektroforeza analityczna

W celu oznaczenia ste wyizolowanego insertu oraz wektora przeprowadzono
elektroforez analityczn w 1.2% elu agarozowym w buforze TBE (podrozdzia 5.4).
Stenia wyznaczono poprzez porwnanie intensywnoci wiecenia prkw przy 312nm w
elu agarozowym z prkami pochodzcymi od markera masy RPL43A/EcoRI o steniu 150
ng/l. W skad tego markera, otrzymanego przez restrykcj plazmidu RPL43A enzymem
EcoRI, wchodz trzy fragmenty DNA o rnej wielkoci i steniu: 580 bp (11 ng), 1190 bp
(22 ng), 6117 bp (116 ng). Znajomo ste insertu i wektora niezbdna jest do ustalenia
zawartoci mieszaniny ligacyjnej. Reakcj ligacji przeprowadzano w stosunku molowym
insert : wektor rwnym 10 : 1. Rozdziaowi elektroforetycznemu poddano nastpujce prby:
WYNIKI
- 56 -
1.
5 l trawionego plazmidu pMal-c2 + 5 l wody + 2 l buforu 6xBP
2.
5 l FIBPs + 5 l wody + 2 l buforu 6xBP
3.
1 l 20 x rozc. markera + 9 l wody + 2 l buforu 6xBP
4.
5.
6.
7.
Rozdzia prowadzono przy nateniu 50V przez okoo 1.5 godz., a nastpnie el
przeniesiono na lamp do analizy eli agarozowych i okrelono stenia FIBPs i pMal-c2.
Rysunek 16 przedstawia otrzymany wynik.
Rysunek 16. Wynik elekroforezy analitycznej - okrelanie

stenia insertu FIBPs oraz wektora pMal-c2.
Stenia wynosiy:
dla FIBPs ~ 16.5 ng/l
dla pMal-c2 ~ 5.8 ng/l
Wiedzc, e 1 mol pary zasad ma mas okoo 660g policzono stenia molowe
wypreparowanego insertu oraz wektora:
dla FIBPs
stenie 1 ng insertu (1000 bp) = 1.6 x 10-3 pm
czyli 16.5 ng/l ma stenie 2.64 x 10-2 pm/l
dla pMal-c2
stenie 1 ng wektora (6700 bp) = 2.3 x 10-4 pm
czyli 5.8 ng/l ma stenie 1.33 x 10-3 pm/l
WYNIKI
- 57 -
6.1.6 Ligacja
Z wyznaczonych ste wynikao, e aby zachowa w mieszaninie ligacyjnej stosunek
molowy insertu do wektora rwny 10 : 1 na kady 1 l wektora powinno przypada 0.5 l
insertu. Wiedzc dodatkowo, e na kade 10 l mieszaniny reakcyjnej powinno przypada 20
40 ng wektora sporzdzono mieszanin ligacyjn i autoligacyjn, ktre zawieray:
mieszanina ligacyjna
wektor
15 l
insert
7.5 l
ligaza T4
2 l
bufor dla ligazy
3 l
woda
2.5 l
objto kocowa:
30 l
mieszanina autoligacyjna
wektor
15 l
insert
brak
ligaza T4
2 l
bufor dla ligazy
3 l
woda
10 l
objto kocowa:
30 l
Obydwie mieszaniny pozostawiono na noc w 16C. Nastpnego dnia DNA strcono nbutanolem. Kolejnym krokiem bya transformacja kompetentnych komrek bakteryjnych
szczepu DH5 oraz dodatkowo, zapewniajca wysz wydajno, elektroporacja bakterii
elektrokompetentnych XL1-blue, ale tylko mieszanin ligacyjn (podrozdzia 5.3).
Po wysianiu na pytki z odpowiednim podoem selekcyjnym, stransformowanych oraz
poddanych elektroporacji komrek bakteryjnych otrzymano nastpujce wyniki:
transformacja
ligacja
WYNIKI
pytka z 200 l hodowli
- 58 -
7 kolonii
autoligacja
elektroporacja
ligacja
0 kolonii
3 kolonie
0 kolonii
pytki z rozcieczeniem hodowli 10-2
14 kolonii
122 kolonii
540 kolonii
pytki z hodowl zagszczon
5600 kolonii
w sumie: ~ 24000 kolonii
Pojedynczymi koloniami bakteryjnymi uzyskanymi po elektroporacji zaszczepiono 123

mililitrowych hodowli pynnych (LB + ampicylina + tetracyklina) i hodowano w 37C w
wytrzsarce przy 220 obr./min. przez noc. Plazmidowe DNA wyizolowano z tych hodowli
metod QIAGEN-tip-20, opisan szczegowo w podrozdziale 5.7
6.1.7 Selekcja wyizolowanego DNA poprzez trawienie

restrykcyjne i analiz w elu agarozowym
W celu odnalezienia wrd prbek z wyizolowanym DNA takich, ktre zawieray
prawidowo przeklonowany fragment DNA kodujcy FIBPs do wektora pMal-c2,
przeprowadzono na szeciu losowo wybranych prbkach trawienie restrykcyjne za pomoc
enzymw BamHI i EcoRI.
Przygotowano mieszanin restrykcyjn o skadzie:
1 l enzymu BamHI
1 l enzymu EcoRI
7 l buforu B
54 l wody
i rozporcjowano po 9 l do eppendorfek. Do rozporcjowanej mieszaniny dodano po 1 l DNA

z odpowiedniej prby. Po okoo godzinnej inkubacji w 37C do prbek dodano po 2 l buforu
6xBP i naniesiono na 1.5 % el agarozowy (cieki nieparzyste). Oprcz trawionych prbek
naniesiono rwnie na el ich odpowiedniki zawierajce DNA plazmidowe nietrawione
(cieki parzyste) oraz marker masy (cieka nr 13). Rozdzia elektroforetyczny prowadzono
przy nateniu 100V przez okoo godzin, a nastpnie przeprowadzono analiz wynikw
nawietlajc el promieniowaniem UV 312 nm.
WYNIKI
- 59 -
Spord analizowanych prbek poprawnie wklonowan sekwencj kodujc FIBPs

zawieray cztery prby (Rysunek 17, cieka: 1, 3, 5 i 11).
1000 bp
Rysunek 17. Wynik elektroforezy analitycznej - selekcja wyizolowanego DNA poprzez

trawienie restrykcyjne.
Opis cieek podano w tekcie.
6.1.8 Sprawdzenie poprawnoci klonowania poprzez

sekwencjonowanie
W prbkach, ktre zawieray plazmid pMal-c2-FIBPs poprawno przeprowadzonego
klonowania sprawdzono poprzez sekwencjonowanie metod Sangera. Metoda ta zostaa
szczegowo opisana w podrozdziale 5.11.
Rysunek 18 przedstawia wynik sekwencjonowania.
G A T C
WYNIKI
- 60 -
Sekwencja kodujca FIBPs
ATC GAG GGA AGG ATT TCA GAA TTC ATG GAC...
Sekwencja rozpoznawana przez

czynnik Xa
Rysunek 18. Autoradiogram z sekwencjonowania plazmidu pMalc2-FIBPs.
W celu namnoenia plazmidu pMal-c2-FIBPs prb zawierajc

prawidowy konstrukt stransformowano kompetentne komrki bakteryjne
szczepu DH5 i wyizolowano z nich DNA metod QIAGEN-tip-20 na skal
midi
(podrozdzia
5.7).
Wyznaczone
spektrofotometrycznie
stenie
otrzymanego plazmidu pMal-c2-FIBPs wynosio 500 ng/l.
6.2 Ekspresja FIBP w systemie pMal-c2 jako
biako fuzyjne z MBP

Proces ekspresji zarwno formy penej, jak i krtkiej FIBP w systemie pMal-c2
przeprowadzano w identycznych warunkach stosujc do transformacji kompetentnych
bakterii DH5 (lub BL21) wektorw plazmidowych, zawierajcych sekwencj kodujc
odpowiedni form FIBP. Warunki hodowli opisano dokadnie w podrozdziale 5.13.
Podczas wszystkich przeprowadzanych hodowli pobierano 1 ml prbki przed i po
stymulacji IPTG, ktre nastpnie analizowano metod elektroforezy w warunkach
denaturujcych w elu poliakrylamidowym (podrozdzia 5.15). Rozdziay elektroforetyczne
prowadzono przy pocztkowym nateniu 80V, a po wejciu prbek w el rozdzielajcy
natenie zwikszano do wartoci 180V. Po elektroforezie el kadorazowo barwiono w
bkicie Coomasie (~ 2 godz.), a nastpnie odbarwiano w 5% kwasie octowym z dodatkiem
WYNIKI
- 61 -
7% metanolu - zwykle przez noc. Odbarwiony el przeniesiono na bibu 3MM i suszono ~2

godzin na prniowej suszarce firmy SLG. Rysunek 19 przedstawia przykadowy wynik
rozdziau elektroforetycznego.
WYNIKI
- 62 -
kDa
175
83
62
47.5
32.5
25
Rysunek 19. Wynik elektroforezy w warunkach denaturujcych.

cieka: 1 biakowy marker masy; 2 standard MBP; 3 FIBPf MBP po
trawieniu czynnikiem X (rozpuszczony osad); 4 - FIBPf MBP po trawieniu
czynnikiem X (supernantant); 5 - FIBPf MBP nietrawione; 6 i 8 hodowla po
stymulacji IPTG; 7 hodowla przed stymulacj IPTG.
6.2.1 Oczyszczanie wyekspresjonowanego biaka fuzyjnego

MBP-FIBP metod chromatografii powinowactwa na
kolumnie z immobilizowan amyloz
W przypadku pozytywnego wyniku indukcji ekspresji MBP-FIBP przeprowadzano
oczyszczanie wyekspresjonowanego biaka fuzyjnego. Komrki bakteryjne odzielono od
poywki poprzez wirowanie (6000 obr./min., 4C, 10 minut). Biako fuzyjne oczyszczano
wedug metody opisanej w punkcie 5.13.1. Podczas zwalniania FIBP-MBP zebrano okoo
trzydziestu frakcji o objtoci 3 ml, w ktrych oznaczono biako przy dugoci fali 280 nm.
Frakcje o najwyszej wartoci absorpcji zlano razem i w caoci oznaczono warto A280. W
zwizku ze stosunkowo nisk wydajnoci ekspresji formy FIBPf proces ten powtarzano
kilkakrotnie. Tabela 14 zestawia otrzymane wyniki.
WYNIKI
- 63 -
Tabela 14. Bilans przeprowadzonych ekspresji biaka fuzyjnego MBPFIBPf .

(ilo biaka wyliczono wiedzac, e 1 mg MBP posiada
absorpcj 1.13)
Objto zlanych
frakcji
zawierajcych
biako fuzyjne
MBP-FIBPf
50 ml
30 ml
42.5 ml
Objto
hodowli
1l
1l
1l
A280
Ilo biaka
fuzyjnego
MBP-FIBPf
0.1638
0.4115
0.226
7.25 mg
10.92 mg
8.5 mg
Ekspresj FIBPs przeprowadzono jednokrotnie w 2l hodowli. Ilo otrzymanego biaka

fuzyjnego FIBPs-MBP wynosia 30 mg. Rysunek 20 przedstawia profil elucyjny otrzymany
A280 nm
podczas oczyszczania FIBPs-MBP na kolumnie z immobilizowan amyloz.

3
2,8
2,6
2,4
2,2
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
2
10
12
14
16
numer frakcji
Rysunek 20. Profil elucyjny kolumny z immobilizowan amyloz

oczyszczanie biaka fuzyjnego MBP-FIBPs.
6.2.2 Proteolityczne odcicie FIBP z biaka fuzyjnego za pomoc

czynnika Xa
FIBP odcinano od MBP za pomoc czynnika Xa, specyficznie rozpoznajcego
sekwencj Ile-Glu-Gly-Arg. Stosunek wagowy czynnik Xa : MBP-FIBP w mieszaninie
wynosi 1:50. Pocztkowo przeprowadzono cicie analityczne na ma skal (objto
kocowa 1 ml) w dwch wariantach: pozostawiajc mieszanin na 18 godzin w 4C i w 25C.
WYNIKI
- 64 -
Po tym czasie prby analizowano metod SDS-PAGE (podrozdzia 5.15). Rysunek 21

przedstawia wynik rozdziau elektroforetycznego trawionych prb zawierajcych MBPFIBPf.
kDa
175
83
62
47.5
32.5
Rysunek 21. Wynik SDS-PAGE - cicie FIBP-MBP czynnikiem Xa.

cieka: 1 - FIBP-MBP nietrawione; 2 - FIBP-MBP
trawione przez 18 godz. w 4oC; 3 - FIBP-MBP
nietrawione, 4oC; 4 - FIBP-MBP trawione prze 18 godz
w 25oC; 5 - FIBP-MBP nietrawione, 25oC; 6 - biakowy
marker masy.
Jak wida na rysunku czynnik Xa efektywnie przecina biako fuzyjne zarwno w 4C,
jak i w 25C. Intensywno prka, odpowiadajca MBP-FIBPf maleje w prbach z dodanym
czynnikiem Xa, natomiast pojawiaj si prki odpowiadajce masom molowym dwch
biaek: MBP i FIBPf. Cicie byo jednak niekompletne. W zwizku z tym eksperyment
powtrzono pozostawiajc mieszaniny na 48 godzin w 4C. Rysunek 22 przedstawia
otrzymany wynik po poddaniu mieszanin rozdziaowi elektroforetycznemu.
Rysunek 22. Wynik SDS-PAGE - cicie FIBP-MBP

czynnikiem Xa przez 48 godz.
cieka: 1 - w 4oC; 2 w 25oC;
3 standard MBP.
WYNIKI
- 65 -
Klonowanie FIBPs do wektora pET-25b(+)
Z powyszego rysunku wida, e nawet po 48 godzinach trawienia biaka fuzyjnego

czynnikiem Xa cicie nie jest kompletne. Dodatkowo przypuszcza si, e w tym czasie
nastpia degradacja FIBPf. Wskazuje na to obecno prkw (Rysunek 22, cieka 1 i 2)
odpowiadajcych, otrzymanym po ciciu czynnikiem Xa, biakom lejszym od MBP (cieka
3). Prawidowo powinien to by jeden prek wdrujcy w elu wolniej ze wzgldu na
wysz mas FIBPf (43 434 Da) w porwnaniu do MBP (42 240 Da).
W analogicznych warunkach przeprowadzono cicie na skal preparatywn. Niestety
podczas trawienia nastpia nieodwracalna precypitacja biaka, co prawdopodobnie byo
zwizane z nieprawidowym zwiniciem FIBPf.
W przypadku formy FIBPs precypitacj zaobserwowano ju po oczyszczeniu biaka
metod chromatografii powinowactwa. Ze wzgldu na powysze trudnoci postanowiono
zmieni system ekspresyjny dla FIBP z pMal-c2 na pET-25b(+).
6.3 Klonowanie FIBPs do wektora pET-25b(+)

W zwizku z trudnociami z odcinaniem biaka MBP zarwno od krtkiej, jak i dugiej
formy FIBP oraz niezbyt du wydajnoci ekspresji (zwaszcza formy dugiej) w systemie
pMalc2, podjto prb przeklonowania sekwencji kodujcej FIBPs do innego systemu
ekspresyjnego. Wybrano system wykorzystujcy wektor pET-25b(+) zawierajcy sekwencj
sygnaln pelB, dziki ktrej biako, bdce produktem transkrypcji, kierowane jest do
peryplazmy. Zapewnia to prawidowe zwinicie ekspresjonowanego biaka. Oczyszczanie
biaka przeprowadza si metod chromatografii na kolumnie z immobilizowanymi jonami
niklu. Umoliwia to sekwencja His-Tag kodujca 6 reszt histydynowych, ktre koordynuj
jony niklu immobilizowane na zou. Zalet tego systemu ekspresyjnego jest fakt, e reszt
histydynowych na C kocu biaka nie trzeba usuwa, gdy nie przeszkadzaj one w
krystalizacji oraz badaniu waciwoci biaka. Rysunek 23 przedstawia schematycznie kolejne
etapy klonowania FIBPs do wektora pET-25b(+).
WYNIKI
- 66 -
Rysunek 23. Schemat kolejnych etapw procesu klonowania fragmentu DNA

kodujcego FIBPs z plazmidu pMal-c2 do wektora pET25b(+).
6.3.1 Ukierunkowana mutageneza

Technik mutagenezy ukierunkowanej wykorzystano do wprowadzenia, naturalnie nie
wystpujcego, miejsca restrykcyjnego dla enzymu SpeI na wektorowym DNA pET-25b(+).
Nie wystpowao ono rwnie na wczeniej skonstruowanym plazmidzie pMalc2-FIBPs,
ktry posuy w reakcji PCR (podrozdzia 5.10) jako matryca do uzyskania insertu FIBPs.
Wprowadzenie miejsc restrykcyjnych dla enzymu SpeI a nastpnie jego uycie zapewnio
selektywno przeprowadzanych trawie, a przez to zwikszyo prawdopodobiestwo
poprawnej konstrukcji plazmidu pET-25b(+)-FIBPs.
Szegowy opis postpowania na poszczeglnych etapach mutagenezy zamieszczono w
podrozdziale 5.8
6.3.1.1 Preparacja jednoniciowej formy wektora pET-25b(+)
Preparacj jednoniciowej formy matrycy pET-25b(+) przeprowadzono z udziaem
wkienkowych fagw pomocniczych M13. Fagi pomocnicze namnoono na bakteriach
szczepu CJ236 o genotypie dut-, ung-, zapewniajcym obecno reszt uracylu zamiast reszt
tyminy, stransformowanych wczeniej plazmidem pET-25b(+). Jednoniciowe DNA (ssDNA
ang. single strand DNA) izolowano z komrek fagowych za pomoc ekstrakcji fenolem i
chloroformem, a nastpnie poddano analizie elektroforetycznej w elu agarozowym.
WYNIKI
- 67 -
Rysunek 24 przedstawia otrzymany wynik rozdziau elektroforetycznego.
Rysunek 24. Wynik analizy elektroforetycznej prb

zawierajcych plazmid pET-25b(+) w
formie ssDNA (cieka nr 1,2,3);
cieka 4 - marker ssDNA.
6.3.1.2 Waciwa reakcja mutagenezy in vitro

Kolejnym krokiem byo doklejenie do matrycowego ssDNA mutagennego startera (ang.
primer), zawierajacego sekwencj rozpoznawan przez enzym SpeI. Obecno startera jest
niezbdna dla T4 DNA polimerazy odtwarzajcej komplementarnie drug ni matrycy. Przed
przyczeniem starterowego oligonukleotydu do matrycy przeprowadzono jego fosforylacj
na kocu 5 za pomoc T4 kinazy polinukleotydowej. Grupa fosforanowa na kocu 5 startera
jest niezbdna dla T4 DNA ligazy przeprowadzajcej nastpnie zamknicie dosyntetyzowanej
przez polimeraz drugiej nici matrycy.
Reakcj fosforylowania przeprowadzono na 400 pm oligonukleotydu, o oznaczonym
spektrofotometrycznie steniu wyjciowym 16.83 pm/l, co odpowiada 23.7 l. Dalsze
postpowanie opisano szczegowo w podpunkcie 5.8.2.2.
6.3.1.3 Namnoenie zmutowanej formy plazmidu pET-25b(+)
W kolejnym etapie 50 l mieszaniny otrzymanej po mutagenezie stransformowano dwie
porcje kompetentnych komrek bakteryjnych szczepu MM metod szoku cieplnego
(podrozdzia 5.2) i wysiano na pytki z poywk LB i ampicylin. Po nocnej hodowli w 37C
otrzymano nastpujace wyniki:
WYNIKI
pytki z 100 l hodowli
18 kolonii
pytki z 200 l hodowli
62 kolonii
pytki z zagszczona hodowl
162 kolonii
kontrola
0 kolonii
- 68 -
Pojedynczymi koloniami bakteryjnymi, uzyskanymi na pytkach po transformacji,

zaszczepiono dziesi 3 ml hodowli pynnych (LB + ampicylina) i hodowano w 37C w
wytrzsarce przy 220 obr./min. przez noc. Z hodowli tych, DNA plazmidowe, wyizolowano
metod QIAGEN-tip-20, opisan szczegowo w podrozdziale 5.7.
6.3.1.4 Sprawdzenie poprawnoci mutagenezy trawienie wyizolowanego
DNA enzymem SpeI
W celu odnalezienia wrd 10 prb prawidowo zmutowanego plazmidu pET-25b(+)
przeprowadzono restrykcj enzymatyczn za pomoc SpeI na wszystkich posiadanych
prbach.
Przygotowano mieszanin restrykcyjn o skadzie:
1 l enzymu SpeI (10U)
11 l buforu H
89 l wody
i rozporcjowano po 9 l do eppendorfek. Do rozporcjowanej mieszaniny dodano po 1 l DNA
z odpowiedniej prby. Po okoo godzinnej inkubacji w 37C do prbek dodano po 2 l buforu
6xBP i naniesiono na 1% el agarozowy (Rysunek 25, cieka nr 1,3,5). Naniesiono
dodatkowo dla kadej prby kontrol, zawierajc nietrawiony zmutowany plazmid (scieka
nr 2,4,6). Jako markera masy uyto form plazmidu pET-25b(+) bez wprowadzonej mutacji
(cieka nr 7). Rozdzia elektroforetyczny prowadzono przy nateniu 50V przez okoo
godzin, a nastpnie przeprowadzono analiz wynikw nawietlajc el promieniowaniem
UV 312 nm.
Rysunek 25. Analiza elektoforetyczna zmutowanych

form plazmidu pET-25b(+) poddanych
trawienu restrykcyjnemu enzymem SpeI.
Opis cieek zamieszczony w tekcie.
WYNIKI
- 69 -
6.3.2 Trawienie restrykcyjne zmutowanego plazmidu pET-25b(+)

przygotowanie wektora do klonowania
Restrykcj zmutowanej formy plazmidu pET-25b(+) zaprojektowano w taki sposb,
aby enzymami NcoI oraz SpeI wyci z wektora fragment od sekwencji pelB do His-Tag,
kodujcej 6 reszt histydynowych (podrozdzia 5.9.3)
W zwizku z niezbyt du iloci zmutowanej formy plazmidu pET-25b(+) (Rysunek
25) trawieniu restrykcyjnemu poddano cao wypreparowanego DNA.
Mieszanina restrykcyjna zawieraa:

0.5 l enzymu NcoI (5U)
0.5 l enzymu SpeI (5U)
4.5 l buforu H
38 l DNA
objto kocowa:
43.5 l
6.3.3 Elektroforeza preparatywna i izolacja wektora pET-25b(+)

metod Qiaex II
W
celu
wyizolowania
mieszaniny
restrykcyjnej
wektora,
rozdziaowi
elektroforetycznemu w 1% elu agarozowym, w buforze TAE (podrozdzia 5.5) poddano

nastpujce prbki:
1 l markera XVII + 9 l wody + 2 l buforu 6xBP
1 l nietrawionego i niemutowanego pET-25b(+) + 9 l wody + 2 l buforu

6xBP
cao mieszaniny po trawieniu + 9 l buforu 6xBP (do trzech dokw)
Rozdzia prowadzono przy nateniu 50V a nastpnie po przeniesieniu elu na lamp do

analizy eli agarozowych wycito fragmenty zawierajce strawiona form wektora pET25b(+). Wycite fragmenty przeniesiono do zwaonych wczeniej probwek eppendorfa i
zwaono ponownie w celu ustalenia masy wycitych fragmentw. Izolacj wektora z elu
agarozowego przeprowadzono metod Qiaex II opisan szczegowo w rozdziale 4.9.
Wypreparowane DNA przechowywano do momentu reakcji ligacji w - 20C.
WYNIKI
- 70 -
6.3.4 Reakcja PCR w celu uzyskania sekwencji kodujcej FIBPs

Sekwencj kodujc FIBPs uzyskano przez reakcj PCR (ang. Polymerase Chain
Reaction) przeprowadzon na skonstruowanym wczeniej plazmidzie pMalc2-FIBPs

(podrozdzia 6.1) o steniu wyjciowym 500 ng/l.
6.3.4.1 Oznaczenie ste uywanych oligonukleotydw
Stenia oligonukleotydowych starterw prNcoI (FIBP, 5) oraz prSpeI (FIBP, 3)
wyznaczono spektrofotometrycznie, wedug metody opisanej w podrozdziale 5.6 i wynosiy:
dla prNcoI (FIBP, 5)
38.98 pm/l
dla prSpeI (FIBP, 3)
71.655 pm/l
6.3.4.2 Reakcja PCR

W celu ustalenia najbardziej optymalnych warunkw dla reakcji PCR przeprowadzono
wstpn reakcj w trzech kombinacjach (rne iloci matrycy i starterw w mieszaninie
reakcyjnej) na prbach o objtoci kocowej 20 l. Tabela 15 zawiera skad poszczeglnych
mieszanin.
Tabela 15. Skad mieszanin wstpnej reakcji PCR.
Steenia
skadnikw
Skad mieszaniny
Kombinacja 1
Kombinacja 2
Kombinacja 3
Kontrola
0.5 ng/l
matryca
1 ng (2 l)
1 ng (2 l)
4 ng (8 l)
7.1655 pm/l
starter prSpeI
4 pm (0.5 l)
8 pm (1 l)
8 pm (1 l)
8 pm (1 l)
7.796 pm/l
starter prNcoI
4 pm (0.55 l)
8 pm (1.1 l)
8 pm (1.1 l)
8 pm (1.1 l)
bufor do PCR
2 l
2 l
2 l
2 l
100 mM
MgSO4
0.8 l
0.8 l
0.8 l
0.8 l
10 mM
dNTP
0.8 l
0.8 l
0.8 l
0.8 l
woda (do 19 l)
12.34 l
11.27 l
5.27 l
17.4 l
10-ciokrotnie
DNA polimeraza
rozcieczona
Vent
0.5 l
0.5 l
0.5 l
0.5 l
Po obliczeniu temperatur przyczenia starterw (Tm) do matrycowego DNA

(podrozdzia 5.10) przystpiono do wprowadzenia do aparatu do PCR firmy MJ RESEARCH
programu reakcji PCR:
10 x ThermoPol Reaction Buffer
WYNIKI
- 71 -
1. 95C, 5 minut tzw. gorcy start

2. 4C pauza na dodanie DNA polimerazy Vent
3. 95C, 15 sekund denaturacja matrycy
4. 50C, 1 minuta przyjte nisze Tm dla obu starterw
5. 75C, 1 minuta polimeryzacja (okoo 400 nukleotydw/min.)
6. powrt do kroku nr 3 przez 29 cykli
7. 75C, 2 minuty
8. 4C przez cay czas do momentu zatrzymania programu
9. koniec
2642 bp
1000 bp
500 bp
Rysunek 26. Analiza elektroforetyczna wstpnej reakcji PCR.

cieka: 1,2,3,4 - kolejne warianty reakcji; 5 marker
masy DNA XIV.
Po zanalizowaniu produktw wstpnej reakcji PCR w 1% elu agarozowym (Rysunek

26) wybrano wariant numer 3 jako optymalny i stosujc ten sam program powtrzono reakcj
PCR na objtoci 100 l na mieszaninie o nastepujcym skadzie:
WYNIKI
- 72 -
matryca
20 ng (40 l)
starter NcoI
40 pm (5.13 l)
starter SpeI
40 pm (5.58 l)
bufor do PCR
10 l
MgSO4
4 l
dNTP
4 l
woda (do 99.5 l)
30.79 l
DNA polimeraza Vent
0.5 l
objto kocowa:
100 l
6.3.4.3 Izolacja produktu PCR z mieszaniny reakcyjnej

W
celu
wyizolowania
produktu
reakcji
PCR
przeprowadzono
elektroforez
preparatywn w 1% elu agarozowym przy nateniu 50V. Na el naniesiono cao

mieszaniny po PCR (do 4 dokw) oraz 1 l markera masy XIV. Po zakoczeniu rozdziau
elektroforetycznego z elu wycito fragmenty zawierajce produkt PCR, a nastpnie
izolowano z elu agarozowego metod Qiaex II opisan szczegowo w podrozdziale 5.5.
6.3.4.4 Elektroforeza analityczna - wyznaczenie stenia produktu PCR
zawierajcego insert oraz trawionego wektora pET-25b(+)
Stenie wyizolowanego wektora pET-25b(+) trawionego enzymami NcoI i SpeI (punkt
6.3.2) oraz produktu reakcji PCR, zawierajcego insert (sekwencj kodujc FIBPs)
wyznaczono poddajc rozdziaowi elekroforetycznemu nastpujce prby:
1. 5 l wektora + 5 l wody + 2 l buforu 6xBP
2. 10 l produktu PCR + 2 l buforu 6xBP
3. 1 l markera masy XVII + 9 l wody + 2 l buforu 6xBP
Rozdzia elektroforetyczny prowadzono przy nateniu 50V przez okoo 1 godz., a
nastpnie el przeniesiono na lamp do analizy eli agarozowych i okrelono stenia
wypreparowanych fragmentw DNA. Wynosiy one:
WYNIKI
- 73 -
dla trawionego wektora pET-25b(+)
6 ng/l
dla produktu PCR zawierajcego insert
14 ng/l
Rysunek 27 przedstawia wynik rozdziau elektroforetycznego.
5000 bp
1000 bp
Rysunek 27. Wyznaczanie stenia wypreparowanego

wektora i produktu reakcji PCR.
6.3.4.5 Restrykcja enzymatyczna produktu PCR w celu uzyskania insertu

Sekwencj kodujc FIBPs wycito z produktu PCR za pomoc enzymw
restrykcyjnych NcoI i SpeI. Tymi samymi enzymami przeprowadzono restrykcj wektora
pET-25b(+), co umoliwi pniejsz ligacj insertu z wektorem poprzez tzw. lepkie koce.
Restrykcj prowadzono w 37C przez 16 godzin. W zwizku z wydueniem czasu
trawienia produktu PCR zmniejszono ilo wymaganych jednostek enzymw restrykcyjnych
(okoo 18U - wyliczone ze wzoru w podrozdziale 5.9) do strawienia produktu PCR.
Mieszanina restrykcyjna zawieraa:

enzym SpeI
1 l (10U)
enzym NcoI
1 l (10U)
produkt PCR
~ 90 l
bufor H
10 l
objto kocowa
100 l
6.3.4.6 Elektroforeza preparatywna i analityczna w celu izolacji oraz

wyznaczenia stenia insertu
Po upywie 16 godzin cao mieszaniny restrykcyjnej poddano rozdziaowi
elektroforetycznemu (w buforze TAE, natenie 50V). Jako markera masy uyto markera
XVII. Po wyciciu z elu fragmentw zawierajcych insert przeprowadzono izolacj insertu
metod Qiaex II opisan szczegowo w podrozdziale 5.5.
WYNIKI
- 74 -
W celu oznaczenia stenia wyizolowanego insertu przeprowadzono elektroforez

analityczn w 1% elu agarozowym w buforze TBE. Stenie wyznaczono poprzez
porwnywanie intensywnoci wiecenia prkw zawierajcych insert przy 312 nm z
prkami pochodzcymi od markera masy XVII.
Rozdziaowi elektroforetycznemu poddano nastpujce prby:
1. 1 l insertu + 9 l wody + 2 l buforu 6xBP
2. 5 l insertu + 5 l wody + 2 l buforu 6xBP
3. 1 l markera XVII + 9 l wody + 2 l buforu 6xBP
Rysunek 28 przedstawia otrzymany wynik.
1000 bp
Rysunek 28. Wynik elekroforezy analitycznej przeprowadzonej w celu

ustalenia stenia fragmentu DNA kodujcego FIBPs.
Po porwnaniu intensywnoci wiecenia prkw przyjto, e stenie DNA w prbie

zawierajcej 5 l insertu odpowiada steniu DNA znajdujcemu si w 4 l markera i wynosi
okoo 17 ng/l.
6.3.5 Ligacja
W celu ustalenia skadu mieszaniny ligacyjnej oraz autoligacyjnej przeliczono stenia
wypreparowanego wektora (6 ng/l) i insertu (17 ng/l) na molowe (podobnie jak w punkcie
6.1.6). Wynosiy one odpowiednio:
dla pET-25b(+)
1.67 x 10-3 pm/l
dla insertu kodujcego FIBPs
2.72 x 10-2 pm/l
WYNIKI
- 75 -
Z wyznaczonych ste wynikao, e aby zachowa w mieszaninie ligacyjnej stosunek

molowy insertu do wektora rwny 10 : 1 na kady 1 l wektora powinno przypada okoo 0.5
l insertu. Wiedzc dodatkowo, e na kade 10 l mieszaniny reakcyjnej powinno przypada
20 40 ng wektora sporzdzono mieszanin ligacyjn i autoligacyjn, ktre zawieray:
mieszanina ligacyjna
wektor
15 l
insert
7.5 l
ligaza T4
1 l
bufor dla ligazy
3 l
woda
3.5 l
30 l
objto kocowa:
mieszanina autoligacyjna
wektor
15 l
insert
brak
ligaza T4
1 l
bufor dla ligazy
3 l
woda
11 l
objto kocowa:
30 l
Obydwie mieszaniny pozostawiono na noc w 16C. Nastpnego dnia DNA strcono nbutanolem. Kolejnym krokiem bya, zapewniajca wysok wydajno, elektroporacja bakterii
elektrokompetentnych XL1-blue mieszanin ligacyjn i autoligacyjn (podrozdzia 5.3)
Po wysianiu na pytki (LB + ampicylina + tetracyklina) poddanych elektroporacji
komrek bakteryjnych otrzymano nastpujce wyniki:
ligacja
45 kolonii
400 kolonii
1000 kolonii
WYNIKI
- 76 -
autoligacja
69 kolonii
560 kolonii
800 kolonii

Pojedynczymi koloniami bakteryjnymi uzyskanymi na pytkach zaszczepiono dziesi
hodowli pynnych o objtoci 3 ml (LB + ampicylina + tetracyklina) i hodowano w 37C w
wytrzsarce przy 220 obr./min. przez noc. DNA plazmidowe z hodowli wyizolowano metod
QIAGEN-tip-20, opisan szczegowo w podrozdziale 5.7
6.3.6 Trawienie wyizolowanego DNA enzymem SpeI i NcoI

W celu odnalezienia wrd wypreparowanego DNA prawidowego konstruktu pET25b(+)-FIBPs przeprowadzono restrykcj enzymatyczn za pomoc SpeI i NcoI na wszystkich
posiadanych prbach. W prawidowo skonstruowanym plazmidzie powinny si bowiem przez
ligacj odtworzy miejsca restrykcyjne dla tych enzymw.
Przygotowano mieszanin restrykcyjn o nastpujcym skadzie:
1 l enzymu SpeI (10U)
1 l enzymu NcoI (10U)
11 l buforu H
87 l wody
i rozporcjowano po 9 l do eppendorfek. Do rozporcjowanej mieszaniny dodano po 1 l
DNA z odpowiedniej prby. Po okoo godzinnej inkubacji w 37C do prbek dodano po 2 l
buforu 6xBP i naniesiono na 1% el agarozowy. Dodatkowo naniesiono take prby z
odpowiednim nietrawionym DNA. Jako markera masy uyto plazmidu pET-25b(+) oraz
markera XVII. Prawidowo skonstruowany, nie poddany restrykcji plazmid powinien by
ciszy od plazmidu pET25b(+). Rozdzia elektroforetyczny prowadzono przy nateniu
~100V, a nastpnie przeprowadzono analiz wynikw nawietlajc el promieniowaniem UV
312 nm.
W zwizku z niezbyt duymi ilociami wypreparowanego plazmidu pET25b(+)-FIBPs
przeprowadzono dodatkowe namnoenie plazmidu w bakteriach szczepu MM. Podobnie jak
poprzednio wypreparowane z komrek bakteryjnych metod Qiagen-tip-20 DNA poddano
WYNIKI
- 77 -
Ekspresja FIBPs w bakteriach szczepu BL
restrykcji enzymatycznej i analizowano metod elektroforezy w celu sprawdzenia

poprawnoci konstruktu. Rysunek 29 przedstawia otrzymane wyniki.
bp
4000
2000
1000
500
4000
2000
1000
500
Rysunek 29. Wynik elektroforezy analitycznej - trawienie plazmidu pET-25b(+)-FIBPs
enzymem SpeI i NcoI.
cieki nieparzyste 1 - 9 i 13 - 21 - DNA trawione; parzyste 2 - 6 i 14 22 - DNA nietrawione; 11 i 23 - plazmid pET-25b(+); 12 i 24 - marker
XVII.
6.4 Ekspresja FIBPs w bakteriach szczepu BL

Prawidow
form
pET25b(+)-FIBPs
stransformowano
kompetentne
bakteryjne szczepu BL, a nastpnie przeprowadzono ekspresj FIBPs
komrki
dodatkowymi
szecioma resztami His na ma skal (100 ml hodowla) w analogicznych warunkach jak przy
ekspresji FIBPs w systemie pMal-c2 (punkt 5.9.2). W trakcie ekspresji pobrano 1 ml prby
hodowli przed i po stymulacji IPTG, ktre nastpnie po sonikacji poddano analizie metod
SDS-PAGE w 12% elu poliakrylamidowym (podrozdzia 5.15). Rysunek 30 przedstawia

otrzymany wynik.
WYNIKI
- 78 -
Wyznaczenie masy produktu ekspresji
kDa
175
83
62
47.5
32.5
25
16
Rysunek 30. Wynik elektroforezy w warunkach denaturujcych.

cieka: 1 biakowy marker masy; 2,4 hodowla
po stymulacji IPTG; 3,5 hodowla przed
stymulacj IPTG. Biaymi strzakami zaznaczono
produkt ekspresji.
6.5 Wyznaczenie masy produktu ekspresji

Mas produktu ekspresji wyznaczono korzystajc z zalenoci, e wzgldna ruchliwo
elektroforetyczna (Vf) biaek w elu poliakrylamidowym z SDS jest odwrotnie
proporcjonalna do logarytmu ich masy (lnMW). W tym celu zmierzono Vf dla biaek
wchodzcych w skad markera masy (Tabela 16) i przy pomocy komputera wyznaczono
zaleno Vf od lnMW (Rysunek 31) oraz rwnanie otrzymanej prostej.
WYNIKI
- 79 -
Wyznaczenie masy produktu ekspresji
Tabela 16. Ruchliwoci elektroforetyczne oraz logarytmy mas

skadnikw biakowego markera masy (Wide range
MW).
MW standard [kDa]
Vf [mm]
lnMW
175
5.16
83
20
4.42
62
29
4.13
47.5
38
3.85
32.5
54
3.43
25
72
3.21
16
98
2.77
100
Vf [mm]
80
60
40
20
0
2.8
3.2 3.4 3.6 3.8
4.2 4.4 4.6
ln MW
Rysunek
31.
Wykres zalenoci ruchliwoci elektroforetycznej

skadnikw biakowego markera masy (Wide range
MW) w 12% elu poliakrylamidowym od logarytmu ich
mas.
Rwnanie prostej: y = 38,35 x + 194,02
Po zmierzeniu wartoci Vf dla produktu ekspresji, ktra wynosia ~50 mm i

podstawieniu jej do powyszego rwnania wyznaczono mas FIBPs z dodatkowymi
szecioma restami His. Wynosia ona 36.5 kDa. Rnia si wic nieznacznie od oczekiwanej
(37.3 kDa). Biorc pod uwag moliwo popenienia bdu przy pomiarze Vf dla skadnikw
WYNIKI
- 80 -
Ekspresja dzikiego typu aFGF oraz jego mutantw w systemie pET-3c
markera masy oraz analizowanego produktu ekspresji, uznano wyznaczon mas za

prawidow.
6.6 Ekspresja dzikiego typu aFGF oraz jego mutantw w

systemie pET-3c
Ekspresj aFGF oraz mutantw z wstawionymi mostkami disiarczkowymi (Cys11Cys59, Cys43-Cys139) przeprowadzono w komrkach bakteryjnych szczepu DH5 wedug
metody opisanej w podrozdziale 5.14. W trakcie ekspresji pobrano 1 ml prby hodowli przed
i po stymulacji IPTG, ktre nastpnie po sonikacji poddano analizie elektroforetycznej w
warunkach denaturujcych (podrozdzia 5.15).
6.6.1 Oczyszczanie aFGF i jego mutantw na kolumnie z

immobolizowan heparyn
Oczyszczanie wyekspresjonowanego aFGF oraz jego mutantw wykonano metod
chromatografii powinowactwa na kolumnie z immobilizowan heparyn wedug metody
opisanej w punkcie 5.14.1. Rysunek 32 przedstawia przykadowy profil elucyjny
oczyszczania dzikiego typu aFGF.
0,8
A280nm
0,6
0,4
0,2
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
numer frakcji
Rysunek 32. Profil elucyjny kolumny z immobilizowan heparyn oczyszanie dzikiego typu aFGF.
WYNIKI
- 81 -
Badanie stabilnoci aFGF metodami fluorymetrii i dichroizmu koowego
Tabela 17 zestawia rezultaty oczyszczania produktw ekspresji.

Tabela 17. Bilans przeprowadzonych ekspresji dzikiego typu aFGF i jego mutantw.
(ilo biaka wyliczono wiedzc, e 1mg aFGF posiada absorpcj rwn 1)
Objto
hodowli
l
Objto zlanych frakcji

zawierajcych biako
ml
A280
nm
aFGF wt
~30
0.56
Ilo
wyekspresjonowanego
biaka
mg
16.8
Cys11-Cys59
~30
0.0826
2.5
Cys43-Cys139
~25
0.0852
2.11
Forma aFGF
6.7 Badanie stabilnoci aFGF metodami fluorymetrii i

dichroizmu koowego
Wpyw wartoci pH oraz obecnoci heparyny na struktur aFGF monitorowano
metodami fluorymertii i dichroizmu koowego. Dodatkowych danych dostarczyy badania
przeprowadzone na mutantach aFGF, zawierajcych nienaturalne wewntrzczsteczkowe
mostki disiarczkowe. Skupiono si na dwch mutantach, z ktrych pierwszy posiada
mutacje: Pro11Cys i Thr59Cys, a drugi: Glu43Cys oraz Val139Cys. Mutanty te
zostay tak wymodelowane komputerowo, aby wstawione reszty cysteinowe utworzyy
midzy sob mostki disiarczkowe.
6.7.1 Fluorymetria
Do bada fluorymetrycznych wykorzystano fakt, e widmo fluorescencji natywnej
formy aFGF jest wyjtkiem od reguy Tealesa, wedug ktrej w biakach zawierajcych
zarwno reszty Trp i Tyr dominujcym maksimum fluorescencji jest szczyt pochodzcy od
reszty Trp. Natywna forma aFGF zawiera bowiem pojedyncz reszt Trp w pozycji 107,
ktrej fluorescencja jest wygaszana przez otaczajce j dodatnie adunki pochodzce z
ssiednich reszt tj. His 102, Thr 69, Lys 105, Pro 121. Konsekwencj tego jest ksztat widma
fluorescencji natywnego aFGF z maksimum emisji dla Tyr przy 306 nm. Gdy struktura biaka
zostaje zakcona pod wpywem czynnikw denaturujcych na widmie fluorescencji pojawia
si dominujcy szczyt przy 340 nm, odpowiadajcy fluorescencji Trp (Pineda-Lucena i wsp.,
1994).
WYNIKI
- 82 -
Wykazano denaturujcy wpyw niskich wartoci pH na aFGF. Zakwaszenie rodowiska

do wartoci pH 4.0 indukuje wzrost wartoci fluorescencji reszty Trp, ktrej fluorescencja
podczas rozfadowania acucha biakowego nie jest ju wygaszana przez w/w reszty
(Rysunek 34 ).
Dodanie do aFGF heparyny przy wartoci pH > 5.0 nie wywouje zmian strukturalnych
biaka, podczas gdy dodatek heparyny w niszym pH powoduje wzrost wartoci fluorescencji
dla Trp (Rysunek 33, Rysunek 34) Takie widmo charakterystyczne jest dla czciowo
zdenaturowanych biaek w tzw. stanie MG (ang. molten globule), ktrych oddziaywania
trzeciorzdowe ulegy zniszczeniu (Copeland i wsp., 1991).
WYNIKI
- 83 -
intensywno
fluorescencji przy wzbudzeniu

270nm
aFGF wt bez heparyny
60
aFGF z heparyn
40
20
0
280
300
320
340
360
380
400
d ugo c fali emisji [nm]
fluorescencji przy wzbudzeniu 270nm
Rysunek 33. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF w pH 5.0 bez

120
100
80
60
40
intensywno
20
aFGF wt z heparyn
0
280
300
320
d ugo
340
360
380
400
fali emisji [nm]
dodatku i z dodatkiem heparyny.

Rysunek 34. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF w pH 4.0 bez dodatku i
z dodatkiem heparyny.
Wspomniana wczeniej reszta Trp107 w przypadku mutanta aFGF, zawierajcego

mostek disiarczkowy Cys11-Cys59 nie naley do obszaru 48 aminokwasw z N-koca aFGF
znajdujcego si pomidzy dwoma resztami Cys tworzcymi mostek. Dlatego te widmo
fluorescencji dla tego mutanta jest prawie identyczne jak dla typu dzikiego biaka zarwno
WYNIKI
- 84 -
reszta Tyr jak i Trp w pH 4.0 wystawione s do rozpuszczalnika dajc dwa pozytywne
szczyty na widmie, odpowiednio przy 306 i 340 nm (Rysunek 35).
W przypadku mutanta z mostkiem disiarczkowym utworzonym midzy Cys43 i
Cys139, obejmujcym reszt Trp107, obserwujemy obecno tylko jednego szczytu na
widmie fluorescencji przy dugoci fali 340 nm (Rysunek 35). Zauwaono rwnie, e ksztat
widma tego mutanta pokrywa si z widmem kompleksu aFGF-heparyna przy wartociach pH
intensywno
fluorescencji przy wzbudzeniu 270 nm
rwnych 4.0 (Rysunek 36).
80
60
40
aFGF wt pH 4.0
aFGF Cys11-Cys59 pH 4.0
20
aFGF Cys43-Cys139 pH 4.0
0
280
300
320
340
d ugo
360
380
400
fali emisji [nm]
Rysunek 35. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF i jego mutantw w pH 4.0.
WYNIKI
- 85 -
intensywno fluorescencji przy wzbudzeniu

270nm
120
100
80
60
40
aFGF wt z heparyn
20
aFGF Cys43-Cys139 bez heparyny
0
280
300
320
340
360
380
400
dugo fali emisji [nm]

Rysunek 36. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF w obecnoci
heparyny oraz mutanta Cys43-Cys139 bez dodatku
heparyny w pH 4.0.
6.7.2 CD
Widmo CD w dalekim UV natywnego aFGF (pH > 5.0) charakteryzuje si negatywnym
szczytem przy dugoci fali 204 nm i wyranym pozytywnym sygnaem przy okoo 225 nm,
bdcym czciowo wynikiem obecnoci grup aromatycznych w acuchach bocznych
aminokwasw. Zaobserwowano, e obnienie wartoci pH rodowiska powoduje spadek
wartoci sygnau przy 225 nm, co mona wytumaczy zniszczeniem struktury
trzeciorzdowej aFGF w rodowisku kwanym (Rysunek 37).
WYNIKI
- 86 -
skr calno
molowa x 1000 [deg cm2dmol-1]
200
pH 6.5
100
pH 5.5
pH 4.5
pH 4.0
pH 3.5
-100
pH 3.0
-200
pH 2.5
pH 2.0
-300
200
220
240
260
280
300
lambda
Rysunek 37. Widma CD dzikiego typu aFGF w funkcji pH.
Wykazano, e dodatek heparyny w rodowisku kwanym powoduje znaczne

zmniejszenie spadku sygnau przy 225 nm mieci si on pomidzy wartociami dla
natywnej i zdenaturowanej formy biaka (Rysunek 38). Otrzymane w powyszych warunkach
widmo charakterystyczne jest dla biaek w stanie MG.
skr calno
molowa [deg cm2dmol-1]
1e+006
8e+005
pH 4.0 - hep
6e+005
4e+005
pH 4.0 + hep
2e+005
pH 2.2 - hep
0
-2e+005
pH 2.2 + hep
-4e+005
pH 5.8 - hep
-6e+005
-8e+005
pH 5.8 + hep
-1e+006
200
220
240
260
280
300
320
340
360
lambda
Rysunek 38. Widma CD dzikiego typu aFGF w funkcji pH w obecnoci i bez

dodatku heparyny.
WYNIKI
- 87 -
Analogicznych pomiarw dokonano na mutantach aFGF ze wstawionymi mostkami

disiarczkowymi. W przypadku mutanta z mostkiem disiarczkowym Cys11-Cys59 w pH > 5.0
nie zaobserwowano znacznych zmian w widmie CD w porwnaniu z widmem dla typu
dzikiego. Podobnie jak dla aFGF, przejcie ze stanu natywnego do zdenaturowanego tego
mutanta nastpuje przy niskich wartociach pH, a dodatek heparyny chroni przed cakowit
denaturacj w rodowisku kwanym. Rysunek 39 przedstawia krzyw denaturacji w funkcji
pH mutanta Cys11-Cys59 w porwnaniu do typu dzikiego. Jako wyznacznik procentu formy
natywnej przyjto warto sygnau skrcalnoci optycznej przy 228 nm. Z wykresu mona
wywnioskowa, e obserwowana denaturacja jest procesem cakowicie kooperatywnym z
punktem przejcia denaturacyjnego (MP, ang. midpoint) w pH 4.15 i 4.4 odpowiednio dla
typu dzikiego i mutanta Cys11-Cys59. Wstawienie mostka disiarczkowego w przypadku
mutanta Cys11-Cys59 nie ma jak wida stabilizujcego efektu, ktrego si spodziewano. Ju
w pH 4.4 obsewuje si jego denaturacj, podczas gdy w przypadku typu dzikiego wymaga to
zakwaszenia rodowiska do pH 4.15.
skr calno
2e+005
-2e+005
-4e+005
aFGF Cys11-Cys59 bez heparyny
6
pH
Rysunek 39. Krzywe denaturacyjne w funkcji pH dla dzikiego typu aFGF oraz mutanta
Cys11-Cys59.
W porwnaniu do typu dzikiego i mutanta Cys11-Cys59, mutant aFGF z mostkiem

disiarczkowym Cys43-Cys139 charakteryzuje si innymi cechami widm CD w niskich
wartociach pH. W rodowisku kwanym bez dodatku heparyny nie jest on cakowicie
WYNIKI
- 88 -
zdenaturowany (Rysunek 40). Warto MP dla tego mutanta w powyszych warunkach jest
porwnywalna z wartoci dla typu dzikiego (MP = 4.12). Jednoczenie warto molowej
skrcalnoci optycznej przy 228 nm w rodowisku kwanym jest okoo dwa razy wysza w
porwnaniu z typem dzikim i mutantem Cys11-Cys59, i porwnywalna z ich wartociami
osiganymi w obecnoci heparyny, co sugeruje stabilizujcy wpyw wprowadzonego mostka.
Obecno heparyny dodatkowo podnosi efekt stabilizujcy (MP = 3.89 i 228 nm = - 5 x 10-4
deg cm2dmol-1) (Rysunek 41)
skr calno
8e+005
6e+005
Cys11-Cys59 pH 5.0 - hep.
4e+005
Cys11-Cys59 pH 5.0 + hep.
2e+005
0
-2e+005
-4e+005
-6e+005
-8e+005
-1e+006
-1.2e+006
200
220
240
260
280
300
lambda
Rysunek 40. Widma CD obu mutantw aFGF w pH 2.0 i 5.0 w obecnoci i bez dodatku
heparyny.
WYNIKI
- 89 -
skr calno
molowa przy 228nm [deg

cm2dmol-1]
2e+005
Cys11-Cys59 - hep., MP=4.40
Cys11-Cys59 + hep., MP=4.14
-2e+005
Cys43-Cys139 - hep., MP=4.12
Cys43-Cys139 + hep., MP=3.89
-4e+005
2
pH
Rysunek 41. Krzywe denaturacyjne w funkcji pH obu mutantw aFGF w obecnoci i bez
dodatku heparyny.
WYNIKI
- 90 -
Ekspresja i oczyszczanie obu form FIBP w systemie pMal-c2
7 Dyskusja
aFGF jest polipeptydowym czynnikiem wzrostu posiadajcym unikatyczny mechanizm
przekazywania sygnau do komrek docelowych, ktry udowodniony zosta przez grup
naukowcw z Oslo (Widocha i wsp., 1994). Wykazali oni, e oprcz zdolnoci
oddziaywania ze specyficznym receptorem transmembranowym oraz powierzchniowymi
heparanami, obecno mitogennego aFGF w jdrze komrkowym jest niezbdna do
prawidowego przekazywania sygnau (podrozdzia 1.4). Dokadny mechanizm transportu
aFGF do wntrza komrki i jdra nie zosta dotychczas poznany, jakkolwiek podjte zostay
prby znalezienia biaek, ktre mog bra w nim udzia. Metod two-hybrid system
zidentyfikowane zostao wewntrzkomrkowe biako FIBP oddziaujce z aFGF (Kolpakova i
wsp., 1998). Nie zostaa jednak poznana jeszcze rola FIBP w komrce.
Gwnym zaoeniem niniejszej pracy byo wyekspresjonowanie zarwno aFGF, jak i
FIBP w genetycznie zmodyfikowanych organizmach bakteryjnych szczepu Escherichia coli,
a nastpnie prba scharakteryzowania ich wzajemnego oddziaywania. Podjto rwnie prb
udowodnienia stabilizujcego wpywu heparyny na aFGF oraz zbadania stabilnoci aFGF
metodami fluorymetrii i dichroizmu koowego.
7.1 Ekspresja i oczyszczanie obu form FIBP w systemie

pMal-c2
Wstpnym etapem, prowadzcym do ekspresji formy FIBPs w postaci biaka fuzyjnego
z MBP, bya konstrukcja wektora pMal-c2 z wklonowan sekwencj kodujc FIBPs
(podrozdzia 6.1). Poprawno otrzymanego konstruktu sprawdzona zostaa przez
sekwencjonowanie metod Sangera (autoradiogram Rysunek 17). Ekspresja FIBPs-MBP
bya procesem stosunkowo wydajnym, o czym wiadczy ilo otrzymanego biaka fuzyjnego
po oczyszczaniu na kolumnie z immobilizowan amyloz 30 mg z 2 litrw hodowli (profil
elucyjny Rysunek 20). W identycznych warunkach przeprowadzono ekspresj i
oczyszczanie penej formy FIBP. W tym przypadku wydajno bya jednak nisza.
Najwiksz iloci biaka FIBPf-MBP, jak otrzymano byo 10 mg z litrowej hodowli (Tabela
14).
Dyskusja
- 91 -
Ekspresja i oczyszczanie obu form FIBP w systemie pMal-c2
Kolejnym etapem, prowadzcym do otrzymania czystego preparatu obu form FIBP,

byo odcicie sfuzjowanego MBP za pomoc czynnika Xa proteazy rozpoznajcej
specyficznie sekwencj aminokwasow Ile-Glu-Gly-Arg. W celu ustalenia warunkw reakcji
przeprowadzono cicie analityczne na ma skal (objto kocowa 1 ml) w 4o i 25oC przez
18 godzin. W obydwu przypadkach cicie zachodzio wydajnie (Rysunek 21), dlatego te
dalsze eksperymenty prowadzono w 4oC. Ze wzgldu na niekompletn proteoliz reakcj
prowadzono przez kolejne 30 godzin. Po 48 godzinach w roztworze istniaa cigle
niestrawiona
forma
FIBPf-MBP.
Dodatkowo
zaobserwowano
obecno
produktw
biakowych o nieprawidowej wielkoci (Rysunek 22). Przypuszczalnie powstay one na

skutek degradacji FIBPf podczas 48 godzinnego trawienia czynnikiem Xa. Pomimo
powyszych trudnoci podjto prb preparatywnego cicia obu form wyekspresjonowanego
FIBP. Podczas trawienia FIBPf zauwaono nieodwracaln precypitacj biaka. Analiza
elektroforetyczna w warunkach denaturujcych dowioda obecnoci FIBPf-MBP w osadzie
(Rysunek 19, cieka 3). Stosowany system ekspresji w systemie pMal-c2 jest z zaoenia
systemem cytoplazmatycznym, tzn. powstajce rekombinowane biaka s magazynowane w
cytoplamie jako formy zdenaturowane w postaci tzw. ciaek inkluzyjnych. Dlatego te
mona przypuszcza, e powodem precypitacji biaka byo nieprawidowe zwiniecie FIBPf.
W przypadku formy FIBPs nie przeprowadzono ciecia na skal preparatywn, gdy ju w
pozostawionym w 4oC roztworze, zawierajcym oczyszczone na kolumnie FIBPs-MBP,
nastpia precypitacja biaka. Ze wzgldu na zupeny brak informacji dotyczcych struktury
FIBP, nie wiadomo jaka jest funkcja 54 aminokwasowego fragmentu N-kocowego, ktry
jest nieobecny w formie FIBPs. Ze wzgldu na zaobserwowan znacznie szybsz precypitacj
biaka fuzyjnego FIBPs-MBP by moe fragment ten odgrywa rol w procesie natywnego
zwijania si czsteczki FIBP. Hipoteza ta wymaga jednak dokadniejszych bada.
Biorc pod uwag powysze trudnoci, zwizane prawdopodobnie z nieprawidow
konformacj obu form biaek fuzyjnych, postanowiono zmieni system ekspresyjny z
cytoplazmatycznego na peryplazmatyczny, ktry umoliwia prawidowe zwijanie si
rekombinowanych biaek w peryplamie komrek E. coli.
Dyskusja
- 92 -
Ekspresja i oczyszczanie FIBPs w systemie pET-25b(+)
7.2 Ekspresja i oczyszczanie FIBPs w systemie pET25b(+)

Do ekspresji FIBPs w systemie peryplazmatycznym wybrano wektor pET-25b(+)
zawierajcy sekwencj sygnaln pelB. Jej obecno zapewnia kierowanie produktu
biakowego
do
peryplazmy,
tym
samym
jego
prawidowe
zwinicie.
Biako
ekspresjonowane w tym systemie zawiera dodatkowo sze C-kocowych reszt His,

umoliwiajcych dalsze jego oczyszczanie na zou z immobilizowanymi jonami niklu.
Otrzymanie
ukierunkowanej,
konstruktu
majca
na
pET-25b(+)-FIBPs
celu
wprowadzenie
poprzedzia
do
wektora
reakcja
mutagenezy
unikalnego
miejsca
restrykcyjnego dla enzymu SpeI (punkt 6.3.1). Sekwencj kodujc FIBPs namnoono w
reakcji PCR, stosujc jako matryc wczeniej skonstruowany plazmid pMal-c2- FIBPs. Uyte
do tej reakcji primery zaprojektowano tak, aby z otrzymanego produktu reakcji PCR wyci
sekwencj kodujc FIBPs przy pomocy enzymw restrykcyjnych SpeI i NcoI (punkt 6.3.4).
Wprowadzenie unikalnych miejsc restrykcyjnych dla enzymu SpeI zapewnio selektywno
pniejszych restrykcji, a przez to zwikszyo prawdopodobiestwo poprawnoci konstruktu.
Po otrzymaniu ze skutkiem pozytywnym konstruktu pET-25b(+)-FIBPs (analiza
restrykcyjna Rysunek 29) przeprowadzono pilotow ekspresj FIBPs (100 ml hodowla).
Analiza elektroforetyczna w warunkach denaturujcych wykazaa obecno biaka w
komrkach bakteryjnych poddanych stymulacji IPTG o zblionej masie czsteczkowej do
oczekiwanej (Rysunek 29). Masa FIBPs z dodatkowymi szecioma resztami His powinna
wynosi okoo 37300 Da. Dla pewnoci wyznaczono mas produktu ekspresji korzystajc z
zalenoci ruchliwoci wzgldnej biaek w elu poliakrylamidowym od logarytmu ich masy
(podrozdzia 6.5).
Analityczna prba ekspresji FIBPs w systemie peryplazmatycznym nie umoliwia
porwnania wydajnoci ekspresji z systemem pMal-c2. Dane literaturowe pokazuj jednak, e
systemy peryplazmatyczne s znacznie mniej wydajne w porwnaniu do cytoplazmatycznych,
oferuj jednak uzyskanie natywnego, aktywnego biaka bez koniecznoci jego powtrnego
zwijania in vitro.
Dyskusja
- 93 -
Badanie stabilnoci aFGF
7.3 Badanie stabilnoci aFGF

Ludzki kwany fibroblastyczny czynnik wzrostu jest biakiem o niskiej stabilnoci, co
prawdopodobnie ma zwizek z jego rol biologiczn (jak np.: zdolno przechodzenia przez
bon Widocha i wsp., 1992). Naturalnym liganolem oddziaujcym z aFGF i chronicym
jednoczenie przed jego denaturacj jest heparyna (Burges i wsp., 1989; Dabora i wsp., 1991).
Jednym z celw niniejszej pracy byo udowodnienie stabilizujcego wpywu heparyny
w kwanym pH, w ktrym aFGF wystpuje w formie zdenaturowanej. Monitorujc metodami
fluorymetrii i dichroizmu koowego zmiany w strukturze aFGF pod wpywem pH, wykazano
jedynie czciow denaturacj aFGF skompleksowanego z heparyn. Najprawdopodobniej
aFGF wystpuje w tych warunkach w stanie stopionej globuli MG (podrozdzia 6.7), w
ktrym zniszczone zostay oddziaywania trzeciorzdowe, natomiast drugorzdowe s
obecne. Stan MG charakteryzuje take wysoki stopie ekspozycji reszt hydrofobowych do
rozpuszczalnika, dlatego te przypuszcza si, e wanie w formie MG biaka przechodz
przez bon (Bychkova i wsp., 1998).
Identycznymi metodami, jak w przypadku dzikiego typu aFGF, dokonano rwnie
pomiarw
stabilnoci
mutantw
aFGF
wstawionym
mostkiem
disiarczkowym
(Cys43-Cys139, Cys11-Cys59). Przypuszczano, e obecno mostkw disiarczkowych w

czsteczce aFGF spowoduje zwikszenie jej stabilnoci.
Powysze zaoenie sprawdzio si jedynie w przypadku mutanta Cys43-Cys139.
Biorc pod uwag fakt, e widmo fluorescencji, otrzymane dla tego mutanta w pH 4.0 bez
dodatku heparyny, pokrywa si z widmem dla typu dzikiego w obecnoci heparyny,
wywnioskowano, i prawdopodobnie mutant ten stabilizuje stan MG aFGF. Efekt tej
stabilizacji jest porwnywalny z wpywem heparyny (Rysunek 36).
Stabilizujcy wpyw mostka Cys43-Cys139 na struktur aFGF wykazano rwnie
metod CD. W rodowisku kwanym bez dodatku heparyny mutant Cys43-Cys139 nie
denaturuje cakowicie (Rysunek 41). Jednoczenie warto molowej skrcalnoci optycznej
przy 228 nm jest okoo 2 razy wysza w stosunku do wartoci dla typu dzikiego i
porwnywalna z wartociami osiganymi w obecnoci heparyny. Obecno heparyny w
przypadku mutanta podnosi dodatkowo efekt stabilizujcy (MP = 3.89 i 228 = - 5 x 10-4 deg
cm2dmol-1).
Analogicznych wynikw spodziewano si w przypadku mutanta Cys11-Cys59. Okaza
si jednak, e w tym przypadku wstawienie mostka nie pociga za sob stabilizujcego
Dyskusja
- 94 -
Badanie stabilnoci aFGF
efektu. Dowodzi tego warto MP rwna 4.4, podczas gdy dla typu dzikiego aFGF wynosi
ona 4.15 (Rysunek 39 i Rysunek 41).
Dalsze planowane badania nad stabilnoci aFGF bd dotyczyy rearanacji w rdzeniu
hydrofobowym czsteczki i przede wszystkim wypenienia destabilizujcej jamki. Mimo, e
hipoteza rozwijania si acucha biakowego podczas przechodzenia przez bonie nie zostaa
dotychczas udowodniona w przypadku aFGF, to zagadnienie podwyszenia stabilnoci moe
by korzystne rwnie z medycznego punktu widzenia. Jednym z celw inynierii biaka jest
bowiem generowanie lekw biakowych o przeduonym okresie dziaania. W przypadku
aFGF, ktry ma ogromne znaczenie terapeutyczne, podwyszona stabilno moe by
dodatkowym atutem aFGF jako leku.
Dyskusja
- 95 -
8 Literatura
Blaber M., DiSalvo J., Thomas K. A. 1996. X-ray structure of human fibroblast growth factor.
Biochemistry 35, 2086-2094.
Burgess W. H., Maciag T. 1989. The heparin - binding (fibroblast) growth factor family of
proteins. Annu. Rev. Biochem. 58, 575-606.
Burke C. J., Volkin D. B., Mach H., Middaugh C. R. 1993. Effect of polyanions on the
unfolding of acidic fibroblast growth factor. Biochemistry 32, 6419-6426.
Bychkova V. E., Pain R. H., Ptitsyn O. B. 1988. The molten globule state is involved in the
translocation of proteins accros membranes? FEBS Lett. 288, No. 2, 231-234.
Chien Cheng-Ting, Bartel P. L., Sternglanz R., Fields S. 1991. The two-hybrid system: a
method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 9578-9582.
Copeland R. A., Ji H., Halfpenny A. J., Williams R. W., Thompson K. C., Herber W. K.,
Thomas K. A., Bruner M. W., Ryan J. A., Marquis-Omer D., sanyal G., Sitrin R. D.,
Yamazaki S., Middaugh c. R. 1991. The structure of human acidic fibroblast growth factor
and its interaction with heparin. Arch. Bioch. Bioph. 289, No. 1, 53-61.
Dabora J. M., Sanyal G., Middaugh C. R. 1991. Effect of polyanions on the refolding of
human acidic fibroblast growth factor. J. Biol. Chem. 266, 23637-23640.
Galzie Z., Kinsella A. R., Smith J. A. 1997. Fibroblast growth factors and their receptors.
Biochem. Cell Biol. 75, 669-685.
Habazettl, J., Gondol, D., Wiltscheck, R., Otlewski, J., Schleicher, M. &Holak, T. A. (1991).
Structure of Hisactophilin is Similar to Interleukin-1 and Fibroblast Growth Factor. Nature,
359, 855-858.
Immamura T., Engleka K. A., Zhan X., Tokita Y., Forough R., Roeder D., Maciag T., Jackson
A., Maier J. A., Hla T., Maciag T. 1990. Recovery of mitogenic activity of growth factor
mutant with nuclear translocation sequence. Science 249, 1567-1570.
Jackson A., Friedman S., Zhan X., Engleka K. A., Forough R., Maciag T. 1992. Heat shock
induces the release of fibroblast growth factor 1 from NIH 3T3 cells. Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 89, 10691-10695.
Johnson D. E., Williams L. T. 1993. Structural and functional diversity in the FGF receptor
multigene family. Adv. Cancer Res. 60, 1-40.
Literatura
- 96 -
Klingenberg O. 1999. Translocation of acidic fibroblast growth factor from the cell surface to
the cytosol and nucleus. Praca doktorska. Deparatment of Biochemistry Institute for Cancer
Research, The Norwegian Radium Hospital and The Norwegian Cancer Society. Oslo.
Klingenberg O., Widocha A., Rapak A., Muoz R., Falnes P. ., Olsnes S. 1998. Inability
of acidic fibroblast growth factor mutant K132E to stimulate DNA synthesis after
translocation into cells. J. Biol. Chem. 273, No. 18, 11164-11172.
Kolpakova A., Widocha A., Stenmark H., Klingenberg O., Falnes P. ., Olsnes S. 1998.
Cloning of an intracellular protein that binds selectively to mitogenic acidic fibroblast growth
factor. Biochem. J. 336, 213-222.
Pineda-Lucena A., Nez de Castro I., Lozano R. M., Muoz-Willery I., Zazo M., GimnezGallego G. 1994. Effect of low pH and heparin on the structure of acidic fibroblast growth
factor. Eur. J. Biochem. 222, 425-431.
Ren J., Kachel K., Kim H., Malenbaum S. E., Collier R. J., London E. 1999. Interaction of
diphteria toxin T domain with molten globule-like protein and its implications for
translocation. Science 284, 955-957.
Spivak-Kroizman T., Lemmon M. A., Dikic I., Ladbury J. E., Pinchasi D., Huang J., Jaye M.,
Crumley G., Schlessinger J., Lax I. 1994. Heparin-induced oligomerization of FGF molecules
is responsible for FGF receptor dimerization, activation, and cell proliferation. Cell 79, 10151024.
Widocha A. 1996. Toksyna bonicza jako molekularne narzdzie w badaniach mechanizmu
przekazywania sygnau indukowanego przez kwany fibroblastyczny czynnik wzrostowy.
Rozprawa habilitacyjna. Inst. immunol. i Terapii Dow. PAN. Wrocaw.
Widocha A., Falnes P. ., Madshus I. H., Sandvig K., Olsnes S. 1994. Dual mode of signal
transduction by externally added acidic fibroblast growth factor. Cell 76, 1039-1051.
Widocha A., Falnes P. ., Rapak A., Klingenberg O., Muoz R., Olsnes S. 1995.
Translocation to cytosol of exogenous, CAAX-tagged acidic fibroblast growth factor. J. Biol.
Chem. 270, No. 51, 30680-30685.
Zhan X., Hu X., Friedman S., Maciag T. 1992. Analysis of endogenous and exogenous
nuclear translocation of fibroblast growth factor-1 in NIH 3T3 cells. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 188, 982-991.
Zhan X., Hu X., Friesel R., Maciag T. 1993. Long term growth factor exposure and
differential tyrosine phosphorylation are required for DNA synthesis in BALB/c 3T3 cells. J.
Biol. Chem. 268, 9611-9620.
Zhu X., Komija H., Chirino A., Faham S., Fox G. M., Arakawa T., Hsu B. T., Rees D. C.
1990. Three - dimensional structures of acidic and basic fibroblast growth factors. Science
251, 90-93.
Literatura
- 97 -

Praca Magisterska Agaty PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Praca Magisterska Agaty PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIWERSYSTET WROCAWSKI

WYDZIA NAUK PRZYRODNICZYCH

KWANY FIBROBLASTYCZNY CZYNNIK WZROSTU

Praca magisterska wykonana

Skadam serdeczne podzikowania profesorowi

1.1 Oglna charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych

1.2 Struktura aFGF i oddziaywanie z heparyn

1.3 Funkcja aFGF w komrce

1.4 Aktywno jdrowa aFGF

Mutant aFGF K132E

FIBP - biako wewntrzkomrkowe wice aFGF

3.3 Markery masy

3.4 Odczynniki do sekwencjonowania

3.5 Antybiotyki i skadniki poywek

3.6 Szczepy bakteryjne i fagowe

Oporno na antybiotyki poszczeglnych szczepw bakteryjnych

3.7 Plazmidy i ich mapy restrykcyjne

5.1 Preparacja bakterii kompetentnych

5.2 Transformacja bakterii kompetentnych

5.4 Elektroforeza w elu agarozowym

Okrelanie stenia DNA na elu agarozowym

Elektroforeza preparatywna w elu agarozowym

5.5 Izolacja DNA z elu agarozowego metoda QIAEX II

5.6 Spektrofotometryczne oznaczanie stenia biaek i kwasw nukleinowych

5.7 Izolacja plazmidowego DNA za pomoc metody QIAGEN-tip-20

5.8 Ukierunkowana mutageneza

Preparacja matrycy zaznaczonej uracylem

Przygotowanie oligonukleotydu do wprowadzenia mutacji

Waciwa reakcja mutagenezy in vitro

Transformacja mieszaniny reakcyjnej do bakterii kompetentnych szczepu MM 294

5.9 Trawienie restrykcyjne

Trawienie restrykcyjne plazmidu pBSN-FIBPf

Trawienie restrykcyjne plazmidu pMal-c2

Trawienie restrykcyjne zmutowanego plazmidu pET-25b(+)

5.10 Reacja PCR

5.11 Reakcja ligacji

5.12.1 Przygotowanie plazmidowej matrycy do sekwencjonowania

5.12.2 Przyczenie startera

5.12.3 Znakowanie radioizotopem i sekwencjonowanie

5.12.4 Przygotowanie elu i warunki przeprowadzenia elektroforezy

5.13 Ekspresja FIBP w systemie pMal-c2 jako biako fuzyjne z MBP

5.14.1 Oczyszczanie aFGF na kolumnie z immobilizowan heparyn

5.15 Elektroforeza biakowa w warunkach denaturujcych (ang. SDS-PAGE)

5.16 Techniki spektroskopowe

5.16.2 Dichroizm koowy

6.1 Klonowanie FIBPs do wektora pMal-c2

Oznaczenie ste uywanych plazmidw

Elektroforeza preparatywna trawionych plazmidw

Izolacja insertu i wektora z elu agarozowego

Selekcja wyizolowanego DNA poprzez trawienie restrykcyjne i analiz w elu agarozowym 59

Sprawdzenie poprawnoci klonowania poprzez sekwencjonowanie

6.2 Ekspresja FIBP w systemie pMal-c2 jako biako fuzyjne z MBP

Oczyszczanie wyekspresjonowanego biaka fuzyjnego MBP-FIBP metod chromatografii

Rozcicie FIBP od MBP za pomoc fXa

6.3 Klonowanie FIBPs do wektora pET-25b(+)

Trawienie restrykcyjne zmutowanego plazmidu pET-25b(+) przygotowanie wektora do

Elektroforeza preparatywna i izolacja wektora pET-25b(+) metod Qiaex II

Reakcja PCR w celu uzyskania sekwencji kodujcej FIBPs

Trawienie wyizolowanego DNA enzymem SpeI i NcoI

6.4 Ekspresja FIBPs w bakteriach szczepu BL

6.5 Wyznaczenie masy produktu ekspresji

Oczyszczanie aFGF i jego mutantw na kolumnie z immobolizowan heparyn

6.7 Badanie stabilnoci aFGF metodami fluorymetrii i dichroizmu koowego