Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC

Resolucin de Problemas en
HPLC:Troubleshooting
Tcnicas, Consejos , y Trucos

Agilent Technologies

Page 1

Pasos en la Resolucin de Problemas

Una vez que has detectado que hay un problema!
Cmo lo solucionas?
1st Fall el sistema o la calibracin de la muestra?
Hacer Blancos
2
2ndd Revisar
R i
ell cumplimiento
li i
del
d l mtodo
d
Se ha seguido el procedimiento adecuadamente?
Son correctos los parmetros en el instrumento?

3rd Hgase ms preguntas!

Cundo funcion correctamente el sistema por ltima vez?
Se ha cambiado alguna cosa?

4th Revise TODOS los parmetros!

Lo obvio no es siempre la causa

Hubo ms de un cambio?
Page 2

Componentes del Sistema HPLC

Bomba
Inyector
yecto /Automuestreador
/ uto uest eado
Columna
Detector
Sistema de datos/Integrador

Los p
problemas p
pueden estar relacionados con todos los
componentes del sistema

Page 3

Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas

Column Problem

Percentage of Respondents

Alta presin, fritas obstruidas

24%

Pobre reproducibilidad (formas de

pico, retencin)

16%

Recuperacin de muestra

14%

Perdida de resolucin

13%

Inestabilidad

11%

Volumenes muertos

8.1%

Fugas, conexiones

4.8%

Rango de pH

2.0%
%

Bajo numero de platos

2.0%

Saturacin de la columna

2 0%
2.0%

Cost

1.7%

Miscellaneous

15%
Page 4

Tipos de problemas del Sistema y la Columna

A. Presin
B. Forma del Pico
C. Retencin

Page 5

Problemas de Presin
Sintomas de la columna

Posibles causas

Alta

- Frita obstruida
- Contaminacin de la

columna
- Obstruccin en el
empaquetamiento
Baja presin

- Fuga
- Flujo incorrecto

Page 6

Correccin de la sobrepresin
Determinacin de la causa y correccin de una presin alta
Muchos problemas de presin estn relacionados con obstrucciones en el sistema
sistema.
Comprobar la presin del sistema con y sin columna.
Si la presin con columna es alta:
Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro)
Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)

Lavar la columna
Eliminar la contaminacin en la column y limpiar el empaquetado bloqueado
Retirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular
Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampn

Page 7

Obstruccin del empaquetado

Tamao de
partcula

Area
(um2)

5.0

2.7

0.9

2.0

3.5

1.3

0.6

2.0

30
3.0

10
1.0

06
0.6

20
2.0

2.7

0.7

0.5

2.0

1.8

04
0.4

0.4

05
0.5

1.7

0.3

0.3

0.5

Diam intersticial Porosidad de

medio (um)
la frita(um)

Cuidado
C
id d con las
l fases
f
mviles
il tamponadas
t
d
Los tampones contienen material insoluble filtrar
La solubilidad del tampn decrece con el aumento del %
de orgnico* - evitar 100%B con tampones salinos
*Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)
Page 8

Solubilidad del tampn

La
a Tabla
ab a I p
presenta
ese ta u
una
a est
estimacin
ac de la
a co
concentration
ce t at o
soluble del tampn menos soluble (fosfato potsico a pH 7.0)
en tres solventes orgnicos
Page 9

Solubilidad de 5 tampones en mezclas con

(a) metanol
metanol, (b) acetonitrilo
acetonitrilo, y (c) tetrahidrofurano

metanol
acetonitrilo

THF

El trazo representa acetato amnico a pH 5.0, representa fosfato amnico

a pH 3
3.0,
0 --- representa fosfato potsico a pH 3
3.0,
0 representa fosfato
amnico a pH 7.0, y representa fosfato potsico a pH 7.0.

Page 10

Cambiar la frita puede no ser buena idea

Puede que no sea posible con columnas de nueva generacin
Puede daar columnas de alto rendimiento
Column
Inlet Frit

Compression
Ferrule
Wear gloves
Do not allow bed to dry
y
Do not touch the column body heat will extrude packing

Column Body

Do not overtighten

Female End Fitting

Male End Fitting
g

Consejo: Prevenir es mucho mejor!

Page 11

El Truco:
Tecnicas de Prevencin- La mejor eleccin!
Usar proteccin de la columna
- Filtros en linea
- Salva columnas

Fcil

Filtrar las muestras

Filtrar fases mviles tamponadas
Extraccin de la muestra(i.e. SPE)
Lavado apropiado de la columna

Page 12

No tan fcil

Limpieza de la columna
Limpiar con solventes ms fuertes que la fase
mvil
Opciones de Solventes de Fase Reversa
en orden de fuerza creciente

Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analticas

Esto lleva tiempo,

amenudo se realiza
Offline

Fase Mvil sin sales de tampn

p
100% Metanol
100% Acetonitrilo
75% Acetonitrilo:25% Isopropanol
100% Isopropanol
100% Cloruro de Metileno*
100% Hexano*
Hexano

Debe
revertirse para
Re-Equilibrar

*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna con
Isopropanol antes de volver a la fase mvil de fase reversa.
reversa
Page 13

Li i
Limpieza
de
d lla columna
l
f
fase
normall
Use al menos 50mL o 2030
20 30 volumenes de columna para las columnas analticas
Opciones tpicas de solventes en Fase Normal en orden de fuerza creciente:

Solvent

Composition

Methanol:Chloroform

50:50%

Ethyl Acetate

100%

Page 14

Cules son los problemas ms comunes

de la forma de pico?

1.

Picos dividos

2. Colas en los picos (simetra <1 )

3 Picos anchos (mala resolucin.
3.
resolucin Rs<2)
Muchos problemas de formas de pico son combinacionescombinaciones i.e.
ie
ensanchamniento y colas o colas al incrementarse la retencin.
Los Sntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el
cromtograma.
Cada
C d uno d
de estos
t problemas
bl
pueden
d ttener mltiples
lti l causas.
Page 15

Picos dobles por perturbacion en el flujo

Perturbacin en el flujo por un volumen muerto
La
L muestra
t fluye
fl
por diferentes
dif
t vias
i a travs
t
de
d
la columna
Pobre empaquetamiento
p q
de las partculas
p
El pH alto disuelva la Silice

Normal

Picos
dobles

Picos dobles o partidos

Consejo: Un efecto similar se produce con una frita

parcialmente obstruida
Page 16

Picos divididos por efectos del solvente

de inyeccin
Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 m
Fase mvil: 82% H2O : 18% ACN
Volumen de inyeccin: 30 L
Muestra: 1. Cafeina 2. Salicilamida
1

A Solvente de inyeccin
A.
100% Acetonitrilo

B Solvente de inyeccin
B.
Fase Mvil
2

2
1

10
Time (min)

10
Time (min)

Consejo: Inyectar un solvente ms fuerte que la fase mvil puede provocar problemas
en los picos tales como picos divididos o ensanchamiento
Truco: Mantener la concentracin de orgnico en el solvente de muestra < Fase mvil

Page 17

Colas,
C
l
ensanchamiento
h i t
y perdida de eficacia
Pueden ser causadas por:
Interacciones secundarias en
la Columna
Contaminacin en la Columna
Envejecimiento
E
j i i t d
de lla columna
l
Saturacin de la columna
Efectos extra columna

Page 18

Forma del pico: Colas en los picos

Causas

Simetra > 1.2

Algunos picos con cola:

Interacciones secundarias Efectos de
Retencin
Interacciones con silanoles residuales
residuales.
Pico pequeo eluyendo en la cola de un pico
mayor.
Normal

Cola

Todos los picos con colas:

Efectos extra-columna.
Acumulacin de contaminacin en la
entrada de la columna.
Metales pesados.
Mala columna.
Normal

Page 19

Colas

Colas en los picos- Contaminacin en la

Columna
Consejo: Test Rpido para Determinar si la Columna est Sucia o est Daada
Truco: Revetir la columna y analizarSi hay mejora, una limpieza puede
ayudar-No
ayudar
No hay mejora-Columna
mejora Columna Daada y necesita ser reemplazada

Test QC direccin
correcta
Platos
1.
2
2.
3.
4

7629
12043
13727
13355

TF

Test Q
QC direccin inversa

2.08
1 64
1.64
1.69
1.32

Platos
1.
2.
3.
4

7906
12443
17999
17098

Test QC despues lavado

100% IPA,
IPA 35C
35 C
Platos

TF

1.
2
2.
3.
4

1.43
1.21
1.19
1.25

2.5
Time (min)

1.06
1 21
1.21
1.11
1.17

4
4

0.0

7448
12237
15366
19067

TF

5.0

0.0

2.5
Time (min)

5.0

0.0

2.5
Time (min)

Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5m

Fase Mvil: 20% H2O : 80% MeOH
Flujo: 1.0 mL/min
Temperatura: R.T.
Deteccin: UV 254 nm
Muestra: 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cloronitrobenzeno 4. Tolueno

Page 20

5.0

Forma de Picos: Picos con Frente (Fronting)

mAU

2000

1500

1000

500

0
0

10

15
Ti
Tiempo(min)
( i )

Normal

Fronting
Simetra < 0.9

Causas:
Saturacin de columna

Page 21

20

25

Colas en los picos/Ensanchamiento

Efectos de carga de muestra
Columnas: 4.6 x 150 mm, 5m
Fase Mvil: 40% 25 mM Na2HPO4 pH 7.0 : 60% ACN
Flujo: 1.5 mL/min
Temperatura:
T
t
40C
M
Muestra:
t
1
1. D
Desipramina
i
i
2
2. N
Nortriptilina
t i tili
3
3. D
Doxepina
i
4
4. IImipramina
i
i
5
5. A
Amitriptilina
it i tili
6
6. T
Trimipramina
i i
i

Factor de Cola
Eclipse XDB-C8
USP TF (5%) i

1.
2.
3.
4.
5.
6.

A
1.60
2.00
1.56
2.13
2.15
1.25

B
1.70
1.90
1.56
1.70
1.86
1.25

Alta Carga
g
x10

A.

Ensanchamiento
Platos de una C8

C
C.

5
Time (min)

B
B.

10

Baja Carga

D.

5
Time (min)

5
Time (min)

10

1.
2.
3.
4.
5.
6.

850
815
2776
2539
2735
5189

5
Time (min)

Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada

Page 22

D
5941
7842
6231
8359
10022
10725

Forma de Picos: Picos Anchos

Todos los picos ensanchan:
Prdida de Eficacia de la columna.
Volumen muerto.
Gran Volumen de Inyeccin.
Inyeccin

Algunos picos ensanchan:

Elucin tarda de una muestra previa
(Pico fantasma)
fantasma).
Alto Peso Molecular.
Muestra - Proteina o Polmero.

Page 23

Dispersin Extra-Columna

Aumentando el Volumen Extra-Columna

Page 24

Use tubos cortos de pequeo dimetro interno entre el inyector y

la columna y entre la columna y el detector.
Asegrese de que todas las conexiones de los tubos estn
hechas con los fittings adecuados.

Use una celda de detector de bajo volumen.

Inyecte pequeos volumenes de muestra.

Consejo: Malas Conexiones en el HPLC

pueden
d Causar
C
Ensanchamiento
E
h i t de
d Picos
Pi
El Sistema se ha optimizado y :
Todas las longitudes de los Tubos son Mnimas
Se
S us
ell di
diametro
t ms
pequeo
d
de ttubo
b
Una celda de flujo de volumen adecuado

Los Sntomas parecen mostrar que todava hay demasiado

Volumen Extra-Columna
Qu
Q est
t mal?
l?
ha hecho las conexiones adecuadamente?

Page 25

Conectores de Columna Usados en HPLC

Troubleshooting LC Fittings
Fittings, Part II
II. J.
J W
W. Dolan and P.
P Upchurch.
Upchurch LC/GC Magazine 6:788 (1988)

Waters

Swagelok
g

0.130
in.

0.090
in.

Rheodyne

Parker

0.170
in.

0.090
in.

Valco

Uptight
0.080
in.

Page 26

0.090
in.

Qu Ocurre si las conexiones no son correctas?

Incorrecto demasiado largo
La Frrula no asienta adecuadamente

Incorrecto demasiado corto

X

Cmara de mezcla

Si la distancia X es muy larga, habr fuga

X
Si la distancia X es demasiado corta, se
generar un volumen muerto o cmara de
mezcla

Page 27

Los cambio en Retencin puedes ser Qumicos o

Fsicos
P d estar
Pueden
t causados
d por:
Envejecimiento
j
de la columna
Contaminacin de la columna
Equilibracin insuficiente
Pobre combinacin columna/fase mvil
Cambio en la fase mvil
Cambio en el flujo.
Diferentes volumenes de retraso del gradiente

Page 28

Envejecimiento
j
de la fase mvil/Equilibracin
q
Causan Cambios en la Retencin/Selectividad
C l
Columna
1 Dia
Di siguiente
i i t

Columna 1 - Inicial

5
9
Time (min)

12

Columna 1 Tras lavado con

1% H3PO4 /Equilibracin

15

5
9
Time (min)

12

15

El analito primario era sensible al envejecimiento de la fase

movil/
o / acondicionamiento
aco d c o a e to de la
a co
columna
u a
La forma de pico fue un asunto secundario (compuesto
quelante de metal) resuelto por des-activacin de la
contaminacin activa del metal
Page 29

Los compuestos sensibles a los metales

pueden
d Quelarse
Q l
:

Pista: Busca un par solitario de Electrones en

C

OH

M +2

Salicilaldehido

: :

OH

8-hidroxiquinolina
Complejo Anillo de 5miembros

Page 30

M +2

O
H

Complejo Anillo de 6-miembros

M +2

N:

C
C

: : :

: : : :

:O: o N que pueda formar anillos de 5 or 6

miembros con un Metal

O
N

M +2
OH

a-benzoinoxomina
Complejo Anillo de 5miembros

Un lavado Acido puede mejorar la forma de

pico
i
Despus del lavado cido
50 100 mLs
L 1% H3PO4

Antes del lavado

acido
id
HO

1.

OH

OH

2.

M+2

OH

HO

1.

Columnas: ZORBAX SB-Phenyl

4.6 x 150 mm
Fase Mvil: 75% 25 mM tampn
fosfato amnico / 25% CAN

Flujo:
Temperatura:
Tamao muestra:

Tf: 3.7

OH

OH

2.

OH

1.0 mL/min.
RT
5 mL

Tf: 1.2

Se us una solucin del 1% H3PO4 en columnas SB; en columnas desactivadas puede usarse
un 0.5 % .
Page 31

pH de la Fase Mvil y pH de tampones

Porqu son tan importantes en HPLC?
El pH afecta la Ionizacin
Superficie de la Silica de la Columna
Componentes de Inters de Muestra

Tampones
Resisten Cambios de pH y Mantienen la Retencin
Mejoran la Forma de Pico de los Compuestos Ionizables

Efectos en el tiempo de Vida de la Columna

p
pHs
s bajos liberan
be a las
as cade
cadenas
as a
alquilicas
qu cas de la
a Fase
ase es
estacionaria
ac o a a
pHs altos Disuelven la Silica
Los cambios de pH tienen un gran efecto en la forma de pico, la retencin y la reproducibilidad lote a lote

Page 32

Porqu preocuparse del pH?

pH pKa y cidos Dbiles
pH,

RCOOH

RCOO- +

H+

COOH

[[RCOO-][H+]
Ka =

[RCOOH]

COO

H+

Ka = 6.4 x 10-5
pKa = 4.2

A pH 4.2 la muestra contiene cido benzoico e in benzoato en proporcin

de 1:1. La forma de Pico puede ser pobre
A pH 5.2 el 91% de la muestra es in benzoato. La retencion RP disminuye.
A pH 3.2 el 91% de la muestra es cido benzoico. La retencion RP aumenta.

Page 33

Efecto del pH en la Forma de Pico

a o cerca del pKa de la Muestra
Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Mvil: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACN
Flujo: 1.0 mL/min.
/
Temperatura: RT
CH3CHCOOH

pH 4
4.4
4

pH 3
3.0
0
CH2CH(CH3)2

Ibuprofeno
pKa = 4.4

4
5
6
Time (min)

10

4
5
6
Time (min)

10

Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto
debe evitarse.
evitarse

Page 34

Porqu preocuparse del pH?

pH, pKa y Bases Dbiles

R3NH+

R3N

H+

[R3N][H+]
Ka =

+
H

CH

CHOCH CH N
2

CH

CHOCH CH N

CH

CH

H+

[R3NH+]

Ka = 1 x 10-99
pKa = 9

A pH 9 la muestra contiene difenhidraminas protonadas y desprotonadas

en relacin 1:1. La forma de pico puede ser pobre
A pH
H 10 91% de
d la
l muestra
t es difenhidramina
dif hid
i desprotonada.
d
t
d
A pH 8 91% de la muestra es difenhidramina protonada.

Page 35

pH vs. Selectivdad para Acidos y Bases

Columna: Nucleosil-C18
Fase Mvil: 45% ACN/55% tampn fostato
Muestra: Acidos Biliares
40
1.5

SCD

Columna: mBondapak-C18
Fase Mvil: 60% 25 mM tampn fostato
40% Metanol
5
1 cido Saliclico
1.
2. Fenobarbital
3. Fenacetin
4. Nicotina
5. Metamfetamina

30

1.0

0.5

Retentioon

logg k

UDC

5
4 SOC
3 C
2 + 12-OC +
1

J.C. 111(1975) 149

7,12 - OC

0.0

20

J.C. 268(1983) 1

10

10

1
2

+
-0.5

8 pH

ELUENT pH

La Retencin y la selectividad puede cambiar dramticamente cuando se cambia el pH.

pH
Page 36

Importancia del pH y los Tampones

Un Ejemplo Prctico

Por qu la Muestra impone las condiciones de uso

Qu pasa cuando el tampn se usa con efectividad
Qu
Q pasa cuando
d se iignora ell ttampn
o se usa
inadecuadamente

Page 37

Tampones ms usados en Fase Reversa HPLC

Buffer
Phosphate

pKa
Buffer Range
2.1
1.1-3.1
7.2
6.2-8.2
12.3
11.3-13.3
Formic acid*
3.8
2.8-4.8
Acetic acid*
4.8
3.8-5.8
Citrate
3.1
2.1-4.1
4.7
3.7-5.7
5.4
4.4-6.4
Tris
8.3
7.3-9.3
Triethylamine*
11.0
10.0-12.0
Pyrrolidine
11.3
10.3-12.3
* Volatile buffers for LC/MS applications

UV Cutoff (nm)
200

210
210
230

205
200
200

La capacidad de tamponamiento ptima se d a un pH igual al pKa del tampon. La mayora de

l tampones tienen
los
i
una capacidad
id d adecuada
d
d de
d tamponamiento
i
para controlar
l ell pH
Hd
de lla ffase
movil solo en 1 unidades de su pKa

Page 38

Importancia del pH y Tampones - Un Ejemplo Prctico

Condiciones Isocrticas Optimizadas para Frmacos Cardacos

Columna:
StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Mvil: 45% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0
3 0 (1.1-3.1)
(1 1-3 1)
55% MeOH
Flujo:
2.0 mL/min.
Temperatura: 35C
Deteccin: UV 254 nm
Muestra:
Frmacos Cardacos
1. Diltiazem
2. Dipyridamol
3. Nifedipina
4 Lidoflazina
4.
5. Flunarizina
5

3
4

Page 39

6
7
Time (min)

10

11

12

13

14

No Tengo Tiempo de Hacer Tampones o Ajustar el

pH
Columna:

StableBond SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Mvil: A: 20% H2O
B: 80% MeOH
Flujo:
1.0 mL/min.
Temperatura: 35C
Deteccin UV:254 nm
Muestra:
Frmacos Cardacos

Fuertes
interacciones
secundarias
d lla muestra
de
t
(aminas) con
la superficie de
la columna

Incluso a muyy alto % MeOH La mayra

y
de
componentes fuertemente retenidos muestran
pobre forma de pico debido al IEX en la
superficie

10

15

20

25

Time (min)

Los Tampones son crticos para una buena retencin y forma de pico en muchas separaciones.
separaciones
Page 40

Qu pasa si trabajas fuera del rango del tampn?

2

Columna:

Se aadi
t
tampn,

pero no
controla el
pH a 4.8

Forma de Pico

StableBond SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Mvil: A: 30% 25 mM NaH2PO4, pH 4.8 no tamponado
B: 70% MeOH
Flujo:
1 0 mL/min
1.0
mL/min.
Temperatura: 35C
Deteccin UV:254 nm
Muestra:
Frmacos Cardacos
1 Diltiazem
1.
2. Dipyridamol
3. Nifedipina
Inadecuada
4. Lidoflazina
5. Flunarizina
5

10

15
Time (min)

Page 41

20

25

No olvidar- Elegir la columna adecuada al pH de la

Fase Mvil para el Mximo Tiempo de Vida
pH Alto y Temperatura Ambiente (pH 11 RT)
Fase Mvil: 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA
(~ pH 11, disolucin de la slica)
Inicial

Despus de 30 inyecciones

Consejo: Usar las columnas diseadas para el pH elegido

Page 42

Efecto del Tiempo de Respuesta del Detector

El Sistema est operando bien- los ajustes se hicieron mal!
Bajas Velocidades de Adquisicin Pueden Dificultar la Deteccin de Impurezas y
Reducir la Sensibilidad
Tiempo de Respuesta
0.1 seg
1er pico = 1.2 seg
A 20 pts/seg = 24 pts

Agilent 1100 DAD

Agilent 1100 WPS with ADVR

0.2 seg

Columna:

1er p
pico = 1.2 seg
g
A 5 pts/seg = 6 pts

0.5 seg

Fase Mvil:
A: 95% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA
B: 5% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA

1 0 seg
1.0

Flujo:

2.0 seg
0.1

0.2

0.3

0.4

0.5
Time (min)

0.6

0.7

0.8

2 mL/min

Temperatura: 70C
Detector:

Poroshell 300SB-C18
2 1 x 75 mm
2.1
mm, 5 um

0.9

1.0

UV 215 nm

Embolada de Piston :

20

Muestra:
1. Neurotensina
2. RNasaA

3. Lisozima
4. Mioglobina

Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor deteccin de picos.
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Conclusiones
Los problemas en Columnas HPLC ms comunes son:
Alta Presin ((Prevenir mejor
j q
que curar))
Malas Formas de Pico
Cambio en la Retencin/Selectividad

A menudo estos problemas no estn asociados con la columna y pueden

ser causados por el instrumento o por problemas qumicos:
pH de la Fase Mvil
Conexiones del Instrumento
Parmetros del Detector
Contaminacin por Metales

Comenzar con las pregunta correctas

Encontrar las resp
respuesta
esta
Las respuestas conducirn a soluciones

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