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Describa a detalle los fundamentos de la PCR, qPCR, RT-PCR y

compare cada paso de las reacciones con los procesos in vivo de la


clula. Adems, describa que es un anlisis del transcriptoma y su
importancia biolgica (20 puntos).

PCR
La PCR se basa en el uso de la DNA polimerasa para copiar un molde de
DNA en ciclos repetidos de replicacin. La polimerasa es guiada hasta la
secuencia a ser copiada por cortos oligonucletidos cebadores que son
hibridados al molde de DNA al comienzo y al final de la secuencia de
DNA deseada. Estos oligonucletidos los disea el investigador de modo
que proporcionan un cebador (primer) para la replicacin de DNA sobre
cada cadena de la doble cadena de DNA original. Existen varias
aplicaciones de PCR especialmente tiles. En primer lugar, la PCR es el
mtodo de eleccin para clonar fragmentos de DNA relativamente cortos
a partir de una clula. El molde original para la reaccin puede ser DNA o

RNA, de modo que la PCR puede emplearse para obtener una copia
genmica completa o una copia de cDNA del gen.

qPCR

La PCR cuantitativa o PCR en tiempo real es una variante de la reaccin en cadena de


la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultneamente cuantificar de forma
absoluta el producto de la amplificacin de cido desoxirribonucleico (ADN). Para ello
emplea, del mismo modo que la PCR convencional (punto final), un molde de ADN, al
menos un par de cebadores especficos, dNTPs, un tampn de reaccin adecuado, y
una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia
marcada con un fluorforo que, en un termociclador que albergue sensores para
medir fluorescencia tras excitar el fluorforo a la longitud de onda apropiada, permita
medir la tasa de generacin de uno o ms productos especficos. 1 Dicha medicin, se
realiza luego de cada ciclo de amplificacin y es por esto que tambin se le denomina
PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultnea).
La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir
sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de
detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es
un aparato con capacidad para calentar y enfriar rpidamente las muestras, de
modo que se aprovechen las cualidades fisicoqumicas de los cidos nucleicos y
las enzimticas del ADN polimerasa.

RT- PCR
Reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa es una variante de
PCR, una tcnica de laboratorio comnmente usada en biologa molecular para
generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso llamado "amplificacin". En
la RT-PCR, sin embargo, una hebra de ARN es retrotranscrita en ADN
complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa inversa, y el
resultado, se amplifica en una PCR tradicional.

Una de las caractersticas ms importantes es que en el proceso de RT-PCR, el


ADNc generado ya no lleva los intrones que s tendra el ADN original. De este
modo, al expresar el ADNc producto de la RT-PCR, se generar un ARNm formado
exclusivamente por exones. Esto ha permitido darle a esta tcnica uno de sus
usos ms importantes: insertar genes eucariotas en organismos procariotas.

Comparacin con el proceso in vivo de la clula


En la primera etapa, que se utiliza el calentamiento para poder separar las
cadenas, en el PCR, esto lo llevara a cabo la enzima helicasa, que es la
encargada de separar.
Posteriormente se deben introducir los primers, que esta sera la funcin de la
primasa en el proceso in vivo de la clula.
Y finalmente, se aade una DNA polimerasa que acta de la misma manera que
en el proceso natural de replicacin del DNA.

Anlisis de Transcriptoma
Los anlisis de transcriptoma sirven para evaluar la expresin de genes y
as poder llevar a cabo un anlisis comparativo. Esto se puede llevar a cabo
con un microarreglo.
El microarreglo consiste en una coleccin de molculas de DNA dispuestas
sobre un soporte slido como una matriz de filas y columnas. Lo que se
realiza es lo siguiente:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Se aisla mRNA de una muestra biolgica


Se convierte el mRNA en cDNA utilizando la transcriptasa reversa.
En la placa se colocan probes
Posteriormente se marca el cDNA con nucletidos fluorescentes.
Se hibrida el cDNA marcado en el microarreglo
Deteccin y cuantificacin de la fluorescencia que significa que el
gen est expresado en ese DNA.
La hibridacin se lleva a cabo cuando las bases nitrogenadas del
probe colocado en la placa se unen a sus bases complementarias
otorgadas por el cDNA.