Słodki świat enzymów

Takao Ishikawa, Anna Karnkowska,

Joanna Lilpop, Jakub Urbański

Opracowanie merytoryczne treści zestawu:

Takao Ishikawa, Anna Karnkowska, Joanna Lilpop, Jakub Urbański

Ilustracje:
Anna Lea Chojnacka

Korekta:
Michał Mlącki

Zestaw opracowany w ramach projektu „Science of Modern Biology –

Exploratory Resources for Biology Teachers and Students” finansowanego
przez UNESCO.
Autorzy pragną serdecznie podziękować wszystkim osobom, które
przyczyniły się do powstania zestawu, w szczególności współpracownikom
Szkoły Festiwalu Nauki, Fundacji BioEdukacji oraz instytucjom
założycielskim Szkoły Festiwalu Nauki: Międzynarodowemu Instytutowi
Biologii Molekularnej i Komórkowej, Instytutowi Biochemii i Biofizyki PAN,
Instytutowi Biologii Doświadczalnej PAN, Szkole Głównej Gospodarstwa
Wiejskiego.
Osobne podziękowania należą się dyrektorowi MIBMiK, panu Profesorowi
Jackowi Kuźnickiemu.
Część pomysłów i procedur zamieszczonych w zestawie pochodzi od National
Centre for Biotechnology Education w Reading (www.ncbe.reading.ac.uk),
którym serdecznie dziękujemy za nieocenioną pomoc i wsparcie.

Niniejsze materiały podlegają licencji Creative Commons:

Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne-Bez utworów zależnych 2.5 Polska.

1 4 3
Niniejsze materiały wolno kopiować i rozpowszechniać wyłącznie niekomercyjnie w celach edukacyjnych,
pod warunkiem umieszczenia na kopiach logo Funacji BioEdukacji i Szkoły Festiwalu Nauki oraz informacji
o autorach. Nie zezwala się na zmiany ani przekształcenia niniejszego skryptu. W przypadku innych
zastosowań lub zmian materiałów niezbędna jest zgoda Fundacji BioEdukacji (www.bioedukacja.org.pl).


 Szkoła Festiwalu Nauki

Enzymy
Enzymy pełnią w komórkach wszystkich organizmów żywych niezwykle istotną funkcję
- działają jako biokatalizatory. Pośredniczą we wszystkich szlakach anabolicznych i katabo-
licznych, obniżając energię aktywacji reakcji biochemicznych. Większość znanych enzymów
jest białkami, lecz odkryto również cząsteczki RNA wykazujące aktywność katalityczną,
tak zwane rybozymy.
Jako katalizator enzym nie zmienia stanu równowagi reakcji chemicznej, tylko przyspie-
sza jego osiągnięcie. Reakcja przemiany substratu S w produkt P przechodzi przez stan
przejściowy. Wartość energii swobodnej stanu przejściowego jest zdecydowanie wyższa niż
energia swobodna substratu i produktu. W warunkach fizjologicznych energia wewnętrz-
na układu jest na tyle niska, że nie wystarcza na pokonanie progu energetycznego stanu
przejścia. Enzym, jako katalizator obniża znacznie energię aktywacji – energię swobodną
Gibbsa oznaczaną jako ∆G. Enzymy mają niezwykle dużą siłę katalityczną - w obecności
enzymu reakcja zachodzi o kilka rzędów wielkości szybciej. Anhydraza węglanowa kata-
lizująca reakcję przeniesienia dwutlenku węgla z tkanek do krwi przyspiesza reakcję 107
razy!!! Cząsteczka tego enzymu jest w stanie uwodnić 105 cząsteczek dwutlenku węgla na
sekundę!!!

Budowa enzymów
Wiele enzymów białkowych ma bardzo złożoną strukturę. Oprócz części białkowej
- apoenzymu zbudowanego z jednego lub kilku łańcuchów polipeptydowych, występuje
w nich również niebiałkowa, trwale związana z cząsteczką enzymu grupa prostetyczna
(np. jon metalu) lub nietrwale związany koenzym (np. witamina). Cały tego typu kompleks
nazywany jest holoenzymem. Centrum aktywne enzymu, a więc rejon odpowiedzialny za
katalizowanie reakcji stanowi z reguły niewielki rejon cząsteczki enzymu.

Specyficzność substratowa
Niezwykle istotną właściwością enzymów jest ich specyficzność substratowa. Już pod
koniec XIX wieku, dla opisania specyficzności enzymów Emil Fischer zaproponował model
zamka i klucza. Zgodnie z założeniami tego modelu trójwymiarowa struktura substratu
odpowiada dokładnie trójwymiarowej strukturze wnętrza centrum aktywnego enzymu.
W późniejszych latach wykazano jednak, że tego typu, niezwykle precyzyjne dopasowa-
nie obydwu cząsteczek uniemożliwiałoby wydajne obniżenie energii aktywacji. W związku
z tym zaproponowano model indukcyjnego dopasowania, zgodnie z którym struktury
trójwymiarowe centrum aktywnego enzymu oraz substratu wykazują powinowactwo, nie
są jednak idealnie dopasowane.
Podczas łączenia się cząsteczki substratu (lub cząsteczek substratów) z centrum aktyw-
nym dochodzi do nieznacznych zmian konformacji cząsteczek, w efekcie czego powstają
naprężenia wiązań w obrębie cząsteczki, przez co obniża się energia reakcji katalitycznej.
Często porównuje się dopasowywanie struktury substratu do centrum aktywnego do
dopasowywania się kształtu rękawiczki do dłoni.
Enzymy różnią się stopniem specyficzności. Jeżeli rozpatrzymy specyficzność rozkłada-
jących wiązania peptydowe enzymów proteolitycznych zauważymy, że mimo iż enzymy
te przeprowadzają dokładnie ten sam typ reakcji, wykorzystują różne substraty. Trypsyna
hydrolizuje tylko wiązania peptydowe po karboksylowej stronie reszty lizyny lub argininy.
Trombina, jeden z enzymów odpowiedzialnych za krzepnięcie krwi, hydrolizuje tylko wiąza-
nia między resztami argniny i glicyny, podczas gdy bakteryjna subtilopeptydaza hydrolizuje
wiązania peptydowe bez względu na to, między jakimi aminokwasami występują.

Ryc. 1. Schemat Regulacja reakcji enzymatycznych

indukcyjnego dopasowania
Oprócz miejsca wiązania substratu – centrum aktywnego – wiele enzymów ma również
centrum allosteryczne, czyli miejsce regulatorowe, do którego wiązać mogą się cząsteczki

www.sfn.edu.pl 
 Słodki świat enzymów

inhibitorów lub aktywatorów, odpowiednio hamujących, bądź indukujących aktywność

enzymu. W enzymach wchodzących w skład złożonych szlaków metabolicznych inhibitorami,
na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego, bardzo często są produkty szlaku metabolicz-
nego – nadmiar produktu danego szlaku, powoduje zahamowanie enzymów tego szlaku.
Z reguły ostateczny produkt szlaku jest inhibitorem dla enzymu katalizującego pierwszy
etap danego szlaku – dzięki temu minimalizowana jest utrata energii na syntezę pośrednich
produktów szlaku. Przykładem może być tutaj szlak syntezy izoleucyny, którego ostateczny
produkt - izoleuzyna działa jako inhibitor pierwszego enzymu szlaku – dehydratazy treoni-
nowej. Spadek stężenia izoleucyny powoduje ponowne uruchomienie reakcji.
Inhibicja enzymu może mieć charakter kompetycyjny. O tego typu oddziaływaniu
mówimy wówczas, gdy inhibitor oddziałuje z centrum aktywnym enzymu i konkuruje z
substratem. Cząsteczka inhibitora wykazuje podobieństwo struktury przestrzennej do
struktury przestrzennej substratu, wzajemny stosunek stężeń obydwu cząsteczek wpływa
na ogólne tempo przeprowadzania reakcji.
Inhibitory mogą wiązać się z cząsteczkami enzymów nieodwracalnie, prowadząc do
całkowitego ich unieczynnienia. W ten sposób działa wiele antybiotyków, między innymi
antybiotyki betalaktamowe, takie jak penicylina hamująca biosyntezę peptydoglikanu
wchodzącego w skład ściany komórkowej bakterii.

Właściwości środowiska mają wpływ na aktywność enzymów

Aktywność enzymów zależy od parametrów środowiska, takich jak temperatura, pH i
osmolarność, czyli stężenie soli. Każdy z enzymów ma optymalną temperaturę działania – dla
większości enzymów mieści się ona w granicach 35-45oC. Wyższe temperatury powodują z
reguły trwałe unieczynnienie enzymu poprzez denaturację jego struktury – wyjątkiem są
tu enzymy niektórych archeonów i bakterii zasiedlających środowiska ekstremalne, których
enzymy osiągają optymalną aktywność w temperaturach 80-90o. Stężenie soli i pH są na
ogół stałe w komórkach, bądź ich określonych przedziałach. Większość enzymów działa
optymalnie w pH bliskim obojętnego, chociaż na przykład niektóre enzymy trawienne
wydzielane w soku żołądkowym, lub enzymy obecne w lizosomach katalizują reakcje przy
silnie kwasowym pH rzędu 2-3.

Kinetyka reakcji enzymatycznych

Kinetykę reakcji enzymatycznych katalizowanych przez enzymy nieallosteryczne opisuje
model Michaelisa-Menten zaproponowany w 1913 roku przez Leonor Michaelis i Maud
Menten. Model ten opiera się na założeniu, że niezbędnym etapem pośrednim procesu
katalitycznego jest powstanie kompleksu enzym-substrat:
Równanie Michaelisa-Menten przedstawia się następująco:
[S]
V = Vmax ------------
[S]+Km
gdzie:
V – prędkość katalizowanej reakcji
Vmax – maksymalna prędkość katalizowanej reakcji (w warunkach optymal
nych)
[S] – stężenie substratu
Km – stała Michaelisa - oznacza stały dla danego enzymu stosunek szybkości
reakcji (k2+k3)/k1 (patrz Ryc.2.)

Przy bardzo dużych stężeniach substratu Km można pominąć, co pozwala na uproszcze-

nie równania do formy V=Vmax. W takich warunkach wszystkie cząsteczki enzymu będą
wysycone substratem i będą pracować z pełną wydajnością.

 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

Ryc. 2. Schemat reakcji

enzymatycznej

Jeżeli stężenie substratu będzie równe Km, prędkość reakcji będzie równa połowie
prędkości maksymalnej zgodnie z równaniem:
[S]
V = Vmax ------------
[S]+[S]
A więc stała Michaelisa wyznacza stężenie substratu, przy którym prędkość reakcji jest
równa połowie prędkości maksymalnej.
Zmieniając stężenie substratu przy zachowaniu pozostałych warunków reakcji można
wyznaczyć eksperymentalnie Vmax i Km.
Z aktywnością enzymów związane jest pojęcie liczby obrotów enzymu – jest to liczba
reakcji, jaką cząsteczka enzymu jest w stanie katalizować w ciągu jednej sekundy, przy
maksymalnej prędkości.

Podział enzymów
Enzymy dzieli się na sześć klas. Podstawą klasyfikacji jest rodzaj katalizowanej reakcji
i rodzaj substratów.
Oksydoreduktazy – katalizują reakcje typu redoks (np. peroksydaza katalizująca rozkład
wody utlenionej).
Transferazy - katalizują przenoszenie grup funkcyjnych między cząsteczkami lub w
obrębie jednej cząsteczki (np. metylaza przenosząca grupę metylową –CH3)
Hydrolazy – katalizują reakcje rozpadu z udziałem wody – hydrolizę (np. amylaza hy-
drolizująca wiązania w cząsteczkach skrobii).
Liazy – katalizują reakcje rozpadu bez udziału wody (np. dekarboksylaza pirogronianowa
katalizująca rozpad pirogronianu do dwutlenku węgla i aldehydu octowego).
Ligazy – katalizują reakcje syntezy (np. ligaza faga T4 – katalizuje łączenie cząsteczek
dwuniciowego DNA)
Izomerazy – katalizują reakcje izomeryzacji (np. izomeraza fosfofruktozy, przekształca
fosfofruktozę w fosfoglukozę).
Wedle nomenklatury ustalonej przez Komisję Enzymów, każdemu scharakteryzowanemu
enzymowi nadaje się specyficzny numer katalogujący go do odpowiedniej klasy. Litery E.C.
umieszczone przed numerem enzymu oznaczają skrót Enzyme Catalogue. Na przykład
omawiane w tym zestawie doświadczalnym hydrolazy mają numer E.C. 3.2.1.N, gdzie N
jest numerem danego enzymu.

Enzymy w biotechnologii i przemyśle

Na długo zanim uczonym udało się dociec jakie cząsteczki biologiczne odpowiedzialne
są za katalizę, nie mówiąc już o wyizolowaniu ich i oczyszczeniu, ludzie wykorzystywali

www.sfn.edu.pl 
 Słodki świat enzymów

w życiu codziennym enzymy naturalnego pochodzenia. Wspomnieć wystarczy o produkcji

alkoholu (dehydrogenaza alkoholowa z drożdży), czy serów podpuszczkowych (podpuszczka
z żołądków bydlęcych).
Jednak dzięki dynamicznemu rozwojowi biotechnologii, w ciągu ostatnich kilkudziesięciu
lat naukowcy opanowali nie tylko metody izolacji i oczyszczania białek enzymatycznych,
ale również ich modyfikowania i otrzymywania na skalę przemysłową.
Na masową skalę enzymy otrzymywane są z bakterii, po uprzednim wprowadzeniu genu
kodującego pożądany enzym do ich komórek. Hodowla bakterii jest prowadzona w tzw.
chemostacie, w którym panują stałe warunki hodowli umożliwiające ciągłe otrzymywanie
bakterii o takich samych własnościach. Zazwyczaj wprowadzany do bakterii gen kodujący
enzym jest dodatkowo opatrzony w odpowiedni promotor, znacznie zwiększający ekspre-
sję tego genu, co umożliwia nadprodukcję pożądanego enzymu. Jest to niezwykle istotne,
ponieważ dzięki takiemu zabiegowi produkowany enzym występuje w bardzo dużej prze-
wadze liczbowej w stosunku do innych białek występujących w komórce bakterii.
Każde laboratorium genetyczne korzysta z enzymów otrzymywanych na skalę prze-
mysłową – począwszy od wirusowych enzymów służących do syntezy RNA i DNA, przez
bakteryjne enzymy restrykcyjne, fosfatazy sklonowane z genomu krewetek i innych orga-
nizmów morskich, aż po zmodyfikowaną peroksydazę pochodzącą z chrzanu.
Oczywiście rekombinowane enzymy wykorzystuje się nie tylko w laboratoriach – stykamy
się z nimi na codzień: w skład proszków do prania wchodzą zmodyfikowane bakteryjne
enzymy proteolityczne i lipolityczne, w przemyśle serowarskim stosuje się produkowaną
przez bakterie podpuszczkę cielęcą (w wielu krajach, w tym Polsce znakomita większość
serów podpuszczkowych produkowana jest przy użyciu takiej podpuszczki), a diabetycy
korzystają z produkowanej przez bakterie ludzkiej insuliny. To zaledwie kilka przykładów,
kolejne można by mnożyć niemal w nieskończoność... Enzymy są wokół nas i nie jesteśmy
świadomi, jak wiele produktów, których używamy na co dzień, zawiera je lub powstało
właśnie dzięki nim.
W proponowanych doświadczeniach przedstawiamy trzy enzymy z klasy hydrolaz, zaan-
gażowane w metabolizm cukrowców – amylazę, laktazę i izomerazę. Są one podstawowymi
enzymami trawiennymi w przewodach pokarmowych ludzi, ale także ich odpowiedniki
przemysłowe są istotnymi narzędziami w przemyśle spożywczym.

WĘGLOWODANY
Węglowodany to jedna z czterech najważniejszych klas cząsteczek biologicznych. Wę-
glowodany, zwane też cukrowcami są związkami organicznymi składającymi się z węgla,
wodoru i tlenu. Cukrowce są to wielowodorotlenowe aldehydy bądź ketony oraz ich po-
chodne. Występują jako cukry proste oraz ich polimery: oligosacharydy i polisacharydy.
W wielu strukturach komórkowych węglowodany występują jako fragmenty cukrowe o
różnej budowie i wielkości, często w połączeniu z białkami (glikoproteiny) i lipidami (gli-
kolipidy).
Cukrowce stanowią materiał zapasowy i główne źródło energii w komórkach istot żywych,
wchodzą w skład szkieletu struktury RNA i DNA, jako elementy strukturalne budują ściany
komórkowe bakterii, roślin, grzybów oraz szkielety zewnętrzne stawonogów.

Rola cukrów w organizmie człowieka

Najważniejszą funkcją węglowodanów w organizmie człowieka jest dostarczanie ener-
gii. Po strawieniu i wchłonięciu, węglowodany w postaci glukozy są rozprowadzane przy
udziale krwi do tkanek. Tam zachodzi oddychanie, czyli utlenienie glukozy do CO2 i H2O
z wytworzeniem energii, którą organizm wykorzystuje zgodnie z aktualnymi potrzebami
energetycznymi.
Niezmiernie ważne jest utrzymywanie stałego poziomu glukozy we krwi, gdyż istnieje
ciągła potrzeba zaopatrywania w glukozę wszystkich komórek ciała, zwłaszcza czerwonych
krwinek i mózgu, które nie mogą korzystać z innych źródeł energii. Poziom glukozy we krwi
ma także ścisły związek z metabolizmem tłuszczów i białek, gdyż glukoza wykorzystywana
jest również do syntezy struktur komórkowych (np. podczas ciąży i w okresie wzrostu) oraz

 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

do syntezy laktozy w czasie laktacji.

Energia pochodząca z węglowodanów jest także w niewielkim stopniu magazynowana w
postaci glikogenu w wątrobie i mięśniach. W sytuacji niewystarczającego poziomu glukozy
we krwi, w wątrobie uruchamiany zostaje proces glikogenolizy i glikogen rozkładany jest do
glukozy. W przeciwieństwie do glikogenu wątroby glikogen zmagazynowany w mięśniach
jest zużywany jedynie dla ich własnych potrzeb energetycznych.
Przy przeciętnym i niezbyt wysokim spożyciu węglowodanów zasadniczą drogą ich
metabolizowania jest utlenianie. Ze wzrostem spożycia węglowodanów rośnie tempo ich
utleniania, a także intensywność odkładania glikogenu. Gdy potrzeby energetyczne or-
ganizmu zostaną zaspokojone, nadmiar węglowodanów wykorzystywany jest do syntezy
triglicerydów odkładanych w tkance tłuszczowej.

Podział węglowodanów:
MONOSACHARYDY (cukry proste) są najprostszymi cukrowcami, ich klasyfikacja opiera
się na liczbie atomów węgla w cząsteczce.
TRIOZY (zawierają 3 atomy węgla) – najprostsze cukry proste: aldehyd glicerynowy i
dihydroksyaceton.
PENTOZY (zawierają 5 atomów węgla). Najistotniejsze to: dezoksyryboza – budulec DNA
i ryboza, budulec RNA, ATP i ryboflawiny. U roślin natomiast istotną rolę odgrywa arabi-
noza występująca w większej ilości w gumach roślinnych i ksyloza, tzw. cukier drzewny.
Przeważnie występują one jako związki spolimeryzowane w formie pentozanów.
HEKSOZY (zawierają 6 atomów węgla). W układzie fizjologicznym występują jedynie czte-
ry heksozy - fruktoza, galaktoza, glukoza i mannoza. W naturze w formie wolnej występują
tylko fruktoza i glukoza. Galaktoza wchodzi w skład laktozy i rafinozy oraz polisacharydu
galaktanu, zaś mannoza w skład polisacharydu mannanu. Pentozy i heksozy w roztworach
występują głównie w postaci pierścieniowej
Glukoza (cukier gronowy) – jest cukrem prostym o sześciu atomach węgla w cząsteczce.
Chemicznie jest alkoholem polihydroksylowym o pierścieniowej budowie cząsteczki. Ist-
nienie życia na ziemi wiąże się nierozerwalnie z syntezą, przemianami i spalaniem glukozy.
Glukoza produkowana jest min. w procesie fotosyntezy i to na ogromną skalę, bo aż sto
miliardów ton rocznie w skali całego globu. Glukoza w smaku jest słodka.
OLIGOSACHARYDY zawierają 2-10 cukrów prostych. Dwucukry (disacharydy) są związ-
kami składającymi się z dwóch cukrów prostych, połączonych wiązaniem O-glikozydowym.
Najbardziej istotne w żywieniu ludzi spośród dwucukrów są laktoza - cukier mleczny,
sacharoza - dawniej nazywana cukrem trzcinowym lub buraczanym, a dziś po prostu
cukrem, oraz maltoza. Melezytoza, rafinoza i stachioza występują w roślinach, lecz nie są
trawione przez układ enzymatyczny człowieka. Dwa ostatnie, zawarte w nasionach roślin
strączkowych (np. grochu i fasoli), są przyczyną wzdęć i powstawania gazów będących
skutkiem wykorzystywania tych cukrów przez mikroflorę jelitową.
Laktoza (cukier mleczny) – składa się z połączonych cząsteczek dwóch cukrów – glukozy
i galaktozy. Laktoza naturalnie występuje tylko w mleku ssaków. Krowie, owcze i kozie
mleko zawiera około 5% laktozy, a ludzkie – 7%. Laktoza ma istotne znaczenie pokarmowe
dla młodych ssaków, będąc podstawowym źródłem cukrów prostych dla rozwijającego się
organizmu. Laktoza jest zdecydowanie mniej słodka od produktów jej rozkładu – glukozy
i galaktozy.
Sacharoza (cukier buraczany, cukier trzcinowy) – jest zbudowana z połączonych ze sobą
wiązaniem glikozydowym cząsteczek glukozy i fruktozy.
Występuje u wielu roślin i jest najdogodniejszą formą transportu cukrów z liści do
korzeni. Gromadzi się w dużych ilościach szczególnie w korzeniach buraka cukrowego
(20%) i źdźbłach trzciny cukrowej (13 – 20%), skąd pozyskuje się ją do produkcji cukru
rafinowanego.
POLISACHARYDY są wielkocząsteczkowymi polimerami cukrów prostych. W organi-
zmach roślin i zwierząt spełniają rolę strukturalną lub są formą zmagazynowania energii.
Głównymi polimerami zbudowanymi z glukozy są celuloza, glikogen i skrobia. Niestrawnym
polimerem fruktozy jest inulina, która w żywieniu człowieka nie odgrywa istotnej roli, będąc
węglowodanem zapasowym roślin niejadalnych.

www.sfn.edu.pl 
 Słodki świat enzymów

Skrobia – jest polimerem glukozy. Składa się z rozgałęzionych nici amylopektyny i nie
rozgałęzionych – amylozy. Można ją znaleźć w wielu roślinach, które magazynują skrobię,
jako substancję zapasową (zboża, ziemniaki, banany). Dlatego też stanowi ponad połowę
węglowodanów spożywanych przez ludzi. Skrobia, w odróżnieniu od cukrów prostych i
disacharydów nie jest słodka w smaku. Pod wpływem gorącej wody polimeryzuje, przy-
bierając konsystencję gęstego żelu. Możemy to obserwować podczas robienia kisielu lub
krochmalu.

Jak słodki jest cukier, czyli ile jest cukru w cukrze?

Ważną rolą węglowodanów jest oddziaływanie na zmysły, gdyż o akceptacji lub odrzuce-
niu pożywienia, a także o preferencjach konsumenckich decydują przede wszystkim cechy
organoleptyczne produktów spożywczych. Węglowodany mają swój udział w tworzeniu ich
smaku, barwy, konsystencji i struktury. Smak cukrów jest rozpoznawany przez zlokalizowane
na języku kubki smakowe jako słodki, a sacharoza uchodzi za standard smaku słodkiego,
dlatego inne środki słodzące, naturalne lub sztuczne, są charakteryzowane najczęściej
przez porównywanie ich siły słodzącej do słodkości sacharozy.

Względna siła słodzenia wybranych węglowodanów:

Węglowodany Względna siła słodzenia

Laktoza 16
Ksyloza 40
Ksylitol 40
Sorbitol 70
Glukoza 70
Sacharoza 100
Cukier inwertowany 130
Fruktoza 115-170

Inne słodkie związki, a nie cukry

Ze smakiem słodkim zazwyczaj kojarzymy związki chemiczne będące węglowodanami.
Jest znanych jednak kilka gatunków roślin, które są słodkie dzięki słodkim białkom, a nie
związkom cukrowym. Najbardziej znanym białkiem z tej grupy jest taumatyna, która izolowa-
na jest z rośliny tropikalnej Thaumatococcus daniellii. Uważa się, że taumatyna jest 3000 razy
słodsza od sacharozy. Jest to całkowicie bezpieczny związek słodzący, gdyż w organizmie
człowieka, podobnie jak inne białka, jest rozkładany do pojedynczych aminokwasów.

 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

Enzymy wykorzystane w doświadczeniach zestawu

Amylaza (E.C. 3.2.1.1 )

Enzym katalizujący reakcję rozkładu skrobi. W zależności od katalizowanej reakcji, amy-

lazy można podzielić na podklasy, choć zawsze wspólną ich cechą jest zdolność hydrolizy
skrobi. Alfa-amylaza odpowiedzialna jest za hydrolizę wiązań alfa-1,4-glikozydowych, co
powoduje skrócenie łańcuchów polisacharydowych budujących skrobię. Powstają dwu-
cukry i triozy.
Alfa-amylaza jest enzymem trawiennym, występuje w ślinie (przeprowadza jeden z pierw-
Ryc. 3. Struktura szych etapów trawienia) oraz w trzustce. Kiedy długo trzymamy kawałek pieczywa w ustach,
przestrzenna amylazy. Na po pewnym czasie zaczynamy wyraźnie czuć słodki smak. Dzieje się tak za sprawą właśnie
żółto zaznaczone są beta- amylazy rozkładającej skrobię z mąki na dwucukry, które odczuwamy jako słodkie.
W zestawie doświadczalnym znajduje się alfa-amylaza spożywcza, czyli Termamyl.
kartki, na różowo alfa-
Enzym ten stosowany jest w przemyśle spożywczym do upłynniania skrobi, np. podczas
helisy [1amy.pdb] produkcji syropu.

Laktaza (E.C. 3.2.1.108)

Laktaza (beta-fruktofuranozydaza) jest enzymem hydrolitycznym rozkładającym czą-

steczkę laktozy na galaktozę i glukozę. Wiadomo jednak, że zdolność hydrolizy wiązania
glikozydowego zachowuje również przy innych związkach tej grupy. Można stwierdzić więc,
że laktaza nie wykazuje dużej specyficzności względem substratu.
Laktaza występuje w układzie pokarmowym niemowląt ssaków. Umożliwia rozkład
zawartej w mleku matki laktozy, do pożywnych cukrów prostych. Jednak z czasem u do-
rosłych osobników dochodzi do zahamowania syntezy tego enzymu, tak jest na przykład
u dorosłych kotów.
Blisko 75% dorosłych ludzi na świecie nie jest w stanie trawić laktozy, a ich organizm
reaguje na mleko dolegliwościami gastrycznymi. Jest to stan naturalny, nie tylko ze wzglę-
du na powszechność występowania w populacji ludzkiej, ale i powszechność w świecie
dorosłych ssaków, którym laktaza nie jest potrzebna, gdy przestają pić mleko matki.
Jednak pozostałe 25% dorosłych ludzi na świecie może pić mleko bez najmniejszych
dolegliwości. Co więcej, procent ludzi zdolnych do trawienia laktozy w wieku dorosłym
jest bardzo zróżnicowany pomiędzy różnymi populacjami i rasami ludzi. Na przykład u
rasy białej w Europie (ludy zamieszkujące Skandynawię, ale także Polacy) aż 75% doro-
słych zachowuje zdolność trawienia laktozy, ponieważ ich organizmy wytwarzają przez
Ryc. 4. Struktura całe życie laktazę. Natomiast rasa czarna zazwyczaj nie posiada tej zdolności. Zjawisko to
przestrzenna beta- jest bardzo ciekawym przykładem ewolucji cechy zbieżnej z ewolucją kulturową. Zdolność
ekspresji genu laktazy przez całe życie pojawiła się w związku z udomowieniem przed ok.
fruktofuranozydazy 8 tys. lat bydła i korzystaniem z mleka jako ważnego składnika pokarmowego także po
[1uwq.pdb] okresie niemowlęctwa.

www.sfn.edu.pl 
 Słodki świat enzymów

Z myślą o ludziach, którzy nie tolerują laktozy, w wielu krajach zaczęto na etapie
produkcyjnym poddawać mleko działaniu laktazy. Takie mleko jest słodsze od zwykłego,
ponieważ glukoza i galaktoza, które powstają w wyniku hydrolizy laktozy, są słodsze od
tego dwucukru.

Inwertaza (E.C. 3.2.1.26)

Inwertaza jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy do fruktozy i glukozy.

Inwertaza jest wytwarzana przez komórki drożdży, pozwala rozłożyć sacharozę do łatwo
przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza. U ludzi inwertaza, podobnie
jak laktaza, występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito
cienkie. Inwertaza występuje też w ślinie pszczół i bierze udział w przetwarzaniu cukru z
nektaru kwiatowego do cukrów prostych.
W przemyśle spożywczym inwertaza jest wykorzystywana np. podczas produkcji cze-
koladek nadziewanych półpłynnym nadzieniem. Podczas produkcji nadzienie w postaci
stałej (głównym składnikiem jest sacharoza) pokrywane jest czekoladą, a następnie w
ciągu kilkutygodniowego „dojrzewania“ czekoladek w wyniku działania inwertazy dodanej
w procesie produkcji, sacharoza rozkładana jest do fruktozy i glukozy, które chłonąc wilgoć
ze środowiska powodują w efekcie upłynnienie nadzienia.
Ryc. 5. Struktura
przestrzenna beta-
Zasada wykrywania glukozy na pasku diagnostycznym laktamazy (inwertazy)
[1uyp.pdb]
Paski diagnostyczne służące do wykrywania glukozy w rozworze używane są między
innymi przez diabetyków do pomiaru stężenia glukozy w moczu. Na pasku diagnostycznym
pod wpływem glukozy oraz tlenu zachodzą dwie reakcje enzymatyczne, w wyniku których
pojawia się barwny produkt. Reakcje zachodzą tylko, gdy w środowisku wodnym (paski
zawsze zanurzamy w roztworze wodnym) i przy obecności tlenu z powietrza, obecna będzie
glukoza – substrat dla pierwszego enzymu. Zapoczątkowany wtedy zostaje ciąg reakcji
prowadzący do powstania barwnego produktu.
Bibułka na pasku nasączona jest dwoma enzymami: oksydazą glukozy oraz peroksydazą
chrzanową, a także jodkiem potasu.

I etap katalizowany przez oksydazę glukozy:

beta-D-glukoza + tlen + woda -> nadtlenek wodoru + kwas glukuronowy

II etap katalizowany przez peroksydazę chrzanową:

jodek potasu + nadtlenek wodoru -> jod + woda.

Jod ma intensywnie brązowy kolor, który obserwujemy na pasku.

Ryc. 6. Skala barwna paska

diagnostycznego

 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

Amylaza
Cel doświadczenia: Wykrywanie aktywności enzymatycznej amylazy w
ślinie
Czas wykonania doświadczenia: jedna jednostka lekcyjna

Wstęp
Aktywność amylazy można bardzo łatwo wykryć, dodając tego enzymu do krochmalu,
który jest gęstym roztworem skrobi. Działanie amylazy powoduje rozkład skrobi na
mniejsze cząsteczki, w wyniku czego krochmal wyraźnie zmienia konsystencję i staje się
płynny. Rozkład skrobi można stosunkowo łatwo obserwować wykorzystując specyficzną
reakcję barwną, w której wykorzystuje się jodynę. Związek ten wiąże się ze skrobią, dając
intensywnie granatowe zabarwienie. W miarę rozkładu skrobi intensywność zabarwienia
wyraźnie maleje.

W zestawie jest:

• 5 płytek plastikowych z 24 dołkami 

• 10 pipet pasterowskich o objętości 1 ml 
• 1 pusta probówka o poj. 50 ml z podziałką 
• 5 naważek skrobi po 2 g 
• 5 mieszadełek 
• 1 butelka o poj. 125 ml na roztwór jodyny 
• 1 butelka jodyny 
• 1 probówka o poj. 15 ml zawierająca 0,25 ml roztworu amylazy Termamyl 
. Należy przechowywać w lodówce
• 5 kubeczków plastikowych

Dodatkowo potrzebne będzie:

• 5 słoików odpornych na ciepło (mogą być zlewki lub szklanki) o 
pojemności 200 ml
• gorąca woda 
• 200 ml wody destylowanej (wodę destylowaną można kupić na stacji 
benzynowej)
• zegarek z funkcją stopera 

Przygotowania wstępne
Ponieważ przygotowanie krochmalu w warunkach szkolnych może nastręczyć nieco kłopo-
tów, radzimy przygotować go dzień wcześniej. Skróci to czas potrzebny do przeprowadzenia
doświadczenia.

1. Przygotowanie krochmalu dla każdej z pięciu grup:

a. Wsyp porcję skrobi (2 g) do słoika o poj. 200 ml, a następnie rozrób w jak najmniej-
szej objętości zimnej wody (nie więcej niż 5 ml). Najlepiej posłużyć się łyżeczką do
herbaty.
b. Zagotuj w czajniku wodę. Odmierz 50 ml wrzątku przy pomocy probówki z podział-
ką.
c. Zawiesinę skrobi zalej gorącą wodą. Zalanie wrzącą wodą jest kluczowe, w przeciwnym
razie może nie powstać krochmal!

www.sfn.edu.pl 10
 Słodki świat enzymów

d. Zamieszaj bardzo energicznie, by nie powstały grudki skrobi. Dokładne mieszanie

pozwoli uzyskać krochmal idealnie nadający się do przeprowadzenia doświadczenia.
Przygotowany krochmal można przechowywać przez 24 godziny w lodówce. Na
minimum godzinę przed wykonaniem eksperymentu należy wyjąć go z lodówki, by
osiągnął temperaturę pokojową. Jeżeli przygotowujemy krochmal w trakcie lekcji,
należy pamiętać o ostudzeniu go do temperatury pokojowej.

Pkt. 1a Pkt. 1c Pkt. 1d

2. Przygotowanie roztworu jodyny

Roztwór jodyny do wykrywania skrobi należy przygotować bezpośrednio przed lekcją.
Uwaga! Odczynnik plami ubrania.
a. Napełnij wodą destylowaną plastikową buteleczkę objętości 125 ml.
b. Za pomocą pipetki dodaj do butelki z wodą 0,5 ml jodyny.
c. Zakręć i dokładnie wymieszaj.
d. Przygotowany odczynnik rozlej po ok. 25 ml do 5 kubeczków, po jednym dla każdej
grupy.

Pkt. 2a Pkt. 2b Pkt. 2d

3. Przygotowanie enzymu
Roztwór enzymu Termamyl (alfa-amylaza spożywcza) należy przygotować tuż przed
lekcją. Probówkę zawierającą 0,25 ml enzymu Termamyl dopełnij wodą destylowaną
do 15 ml i wymieszaj. Jeden zespół uczniów powinien otrzymać tę probówkę i użyć jej
zawartość jako kontroli zamiast śliny. Zaleca się użycie w tym celu 2-3 ml rozcieńczo-
nego enzymu Termamyl na 50 ml przygotowanego krochmalu.

11 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

Każdy z pięciu zespołów uczniów powinien otrzymać:

• płytkę z 24 dołkami
• naczynie z krochmalem
• 2 pipetki pasterowskie
• mieszadełko
• kubek z przygotowanym roztworem jodyny
• kubek z wodą do płukania pipetek
• kserokopię przepisu wykonania doświadczenia

Podział zadań w klasie:

Wszystkie próby są przeprowadzane w tych samych warunkach, z tego samego roztworu
skrobi, w tej samej temperaturze, kolejne próbki są pobierane zawsze po tym samym czasie
i takiej samej objętości.

Kontrolą pozytywną, którą wykonują wszystkie zespoły, jest pierwsza próbka – kropla
krochmalu bez śliny dodana do roztworu jodyny. Dzięki niej udowadniamy, że roztwór
jodyny zabarwia się na granatowo pod wpływem skrobi, a nie na przykład substancji
zawartych w ślinie.

Grupa A – wariant doświadczalny A (kontrola +)

Pozytywną kontrolą w tym doświadczeniu jest roztwór komercyjnej amylazy wykorzysty-
wanej w przemyśle spożywczym. Enzym ten nosi nazwę „Termamyl”.

Grupa B – wariant doświadczalny B (właściwa próba)

Do roztworu skrobi dodawana jest ślina uczestników doświadczenia i badana aktywność
amylazy zawartej w ślinie.

Grupa C – wariant doświadczalny B (kontrola -)

Do roztworu skrobi nie dodawany jest żaden enzym, tylko woda i badana jest zmiana za-
barwienia jodyny z próbkami roztworu skrobi w czasie. Kontrola ma na celu sprawdzenie
czy skrobia samoistnie nie zmienia swoich właściwości w czasie.

Opis doświadczenia
1. Przygotuj zegarek, najlepiej z funkcją stopera.
2. Dodaj przy pomocy pipetki pasterowskiej po 1 ml roztworu jodyny do wszystkich
dołków na płytce z 24 dołkami.
3. Do pierwszego dołka dodaj przy pomocy czystej pipety pasterowskiej jedną kroplę
krochmalu, zamieszaj. Obserwuj barwę mieszaniny.

Pkt. 2 Pkt. 6 Pkt. 8

www.sfn.edu.pl 12
 Słodki świat enzymów

4. Dodaj do słoika z krochmalem kilka mililitrów śliny (objętość około 1 łyżkii). (UWAGA!
W wariancie A zamiast śliny dodawany jest 2-3 ml otrzymanego od prowadzącego
roztworu enzymu Termamyl, natomiast w wariancie C zamiast śliny dodawane są 2
ml wody). Bardzo ważne jest mieszanie, aby enzym był rozprowadzony równomiernie
w krochmalu.
5. Dokładnie wymieszaj krochmal i od razu dodaj jedną kroplę do drugiego dołka. Uru-
chom stoper lub zanotuj dokładną godzinę.
6. Po upływie jednej minuty, czystą pipetą pobierz próbkę krochmalu i dodaj jedną
kroplę do trzeciego dołka, mieszając jego zawartość końcówką pipety. Cały czas
mieszaj krochmal.
7. Czynność opisaną w pkt. 6 powtarzaj co minutę, dodając krochmal do kolejnych dołków,
za każdym razem odnotowując w tabeli zmianę barwy.
Zaleca się płukanie w czystej wodzie pipetki po każdym pobraniu krochmalu, gdyż
pozostający w niej krochmal może wpływać na wiarygodność wyniku.
8. Możesz zakończyć doświadczenie, gdy odczynnik przestanie zmieniać barwę.

Oczekiwane wyniki:
Wariant Dodany enzym Pomiar 0 Pomiar 1... Pomiar 20
A termamyl granatowy granatowy brak zmiany koloru
B amylaza ze śliny granatowy granatowy brak zmiany koloru
C woda granatowy granatowy granatowy

Rozwiązywanie problemów:
1. Nawet w próbkach pobieranych po 23 minutach nie widać zmiany zabarwienia:
Aktywność amylazy w próbce jest zbyt niska. Należy dodać więcej enzymu z probówki
„Termamyl” lub więcej śliny. Doświadczenie wychodzi zdecydowanie lepiej, jeżeli osoba
„plująca” do próbki żuła wcześniej gumę lub jadła pieczywo.
Krochmal przygotowywany był tuż przed doświadczeniem i był za gorący w momencie,
kiedy dodano do niego próbkę śliny. Wysoka temperatura spowodowała dezaktywację
enzymu.
Przegotowany poprzedniego dnia krochmal nie został wyjęty z lodówki odpowiednio
wcześniej. Jeżeli temperatura krochmalu jest zbyt niska, amylaza działa z bardzo małą
wydajnością. Krochmal powinien mieć temperaturę pokojową.
2. R o z t w ó r o d b a r w i a s i ę n i e m a l o d r a z u :
Enzym zawarty w próbce ma bardzo wysoką aktywność, lub objętość dodanego
enzymu była zbyt duża. Należy powtórzyć doświadcznie zmniejszając objętość do-
dawanej śliny
3. Próba kontrolna w p ost aci roz t wor u enz y mu Termamyl nie działa:
Można zwiększyć objętość próbki enzymu oraz delikatnie podgrzać słoik z krochmalem
(np. wstawić go do naczynia z ciepłą wodą). Amylaza Termamyl wykazuje aktywność w
temperaturze pokojowej, ale optymalną temperaturą dla jej działania jest 50-60oC.

Uwagi:
• Roztwory po eksperymencie można wylać do zlewu
• Płytka po opłukaniu i umyciu detergentem nadaje się do powtórnego użytku
• Jodynę i jej roztwory należy chronić przed światłem, np. zakrywając cały pojemnik folią
aluminiową

13 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

Pytania kontrolne:
• Jak zmienił się kolor odczynnika, w której minucie nastąpiła zmiana barwy, o czym może
świadczyć zmiana barwy odczynnika?
• Jak zmieniła sie konsystencja krochmalu, w której minucie nastąpiła zmiana i o czym
to świadczy?
• Jak można porównać aktywność enzymu amylazy pochodzącego od różnych osób?
• Czy zmienia sie aktywność enzymu jeśli ktoś wcześniej spożył posiłek (bogaty w
węglowdany)?

www.sfn.edu.pl 14
 Słodki świat enzymów

Laktaza
Cel doświadczenia: Wykrywanie aktywności enzymatycznej laktazy
Czas wykonania doświadczenia: jedna jednostka lekcyjna

Wstęp
Jednym ze sposobów wykrycia aktywności enzymatycznej laktazy jest wykrycie produktu
katalizowanej przez ten enzym reakcji, w tym wypadku wykrycie glukozy. W proponowanym
doświadczeniu do wykrywania obecności glukozy posłużą stosowane przez diabetyków
paski diagnostyczne.
W pierwszym etapie enzym zostanie unieruchomiony w złożu alginianowym, przez które
uczniowie przesączać będą mleko. W miarę przesączania mleka przez złoże, obecny w nim
enzym laktaza będzie rozkładać laktozę do glukozy i galaktozy. Tempo przepływu przez żel
ma kluczowe znaczenie dla doświadczenia. Jeżeli mleko będzie przepływać zbyt szybko,
to enzym nie zdąży związać się z cząsteczkami laktozy i nie będzie w stanie katalizować
reakcji. Jeśli mleko będzie się sączyć zbyt wolno, dojdzie do tzw. inhibicji allosterycznej
enzymu. Galaktoza, produkt katalizowanej przez laktazę reakcji, działa jako inhibitor laktazy
– jest to typowy przykład regulacji aktywności enzymu na zasadzie ujemnego sprzężenia
zwrotnego. Przy odpowiednio dobranym tempie przepływu mleka w przesączu z kolumny
obecne jest około 2,5 % glukozy, co można wykryć przy pomocy paska diagnostycznego.
Pasek nie powinien wykazywać natomiast obecności glukozy w mleku przed nałożeniem
na kolumnę.
Laktoza w mleku przesączonym przez kolumnę bez enzymu nie ulega rozkładowi, toteż
pasek diagnostyczny nie wykaże obecności glukozy u wylotu kolumny.

W zestawie jest:

• 1 probówka z enzymem laktaza w proszku (1 g). Należy 

przechowywać w lodówce
• 1 butelka z alginianem sodu (1 g) 
• 1 pudełeczko z chlorkiem wapnia (7,5 g) 
• 5 strzykawek o pojemności 10 ml 
• 5 plastikowych kubków 
• 5 pipetek pasterowskich o pojemności 1 ml 
• 1 pudełko glukozy w proszku (1 g) 
• 1 pudełko laktozy w proszku (5 g) 
• 5 sitek 
• wata bawełniana 
• 5 kieliszków 
• 10 pasków diagnostycznych 
• 5 mieszadełek 
• 1 pusta probówka 50 ml z podziałką 

Dodatkowo potrzebne będzie:

• 15 kubeczków (mogą być słoiki lub zlewki) 
• około 200 ml mleka (może być UHT, ale nie może być to mleko z obniżoną 
zawartością laktozy). Mleko powinno mieć temperaturę pokojową.
• 100 ml wody destylowanej (wodę destylowaną można kupić na stacji 
benzynowej)

15 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

Przygotowania wstępne
1. Dzień przed doświadczeniem przygotuj roztwór alginianu sodu: do butelki z 1 g alginia-
nu sodu dolej 50 ml wody destylowanej (do odmierzenia użyj probówki z podziałką).
Intensywnie zamieszaj rozbijając grudki. Uwaga! Alginian rozpuszcza się bardzo ciężko
i powoli. Po kilkunastu godzinach w cieple (najlepiej powyżej temperatury pokojowej)
Pkt. 2 powinien powstać jednorodny, gęsty 2% roztwór alginianu.
2. Znajdujący się w zestawie chlorek wapnia (7,5 g) rozpuść w 500 ml wody destylo-
wanej (na przykład w butelce po wodzie mineralnej) – w ten sposób otrzymasz 500
ml roztworu chlorku wapnia o stężeniu ok. 1,5%. Roztwór można przechowywać w
szczelnie zamkniętej butelce przez praktycznie nieograniczony czas. Na zajęcia nale-
ży przygotować pięć naczynek, np. szklanek zawierających ok. 50 ml 1,5% roztworu
chlorku wapnia.
3. Do pojemniczka z naważką glukozy (1 g) wlej 25 ml wody destylowanej. Do odmie-
rzania użyj 50 mililitrowej probówki z podziałką. Po wymieszaniu otrzymasz ok. 4%
roztwór glukozy.
4. Laktozę (5 g) wsyp do szklanki i rozpuść w 100 ml wody destylowanej. Otrzymasz
ok. 5% roztwór.
5. Do probówki z enzymem laktazą w proszku dolej wody destylowanej do poziomu 10
ml i wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia proszku.

Każdy z pięciu zespołów uczniów powinien otrzymać:

• naczynko z roztworem chlorku wapnia – ok. 50 ml do stworzenia kulek z alginianu
• zwitek waty bawełnianej do uszczelnienia kolumny
• strzykawkę
• pipetkę pasteurowską o poj. 1 ml
• 2 paski diagnostyczne do wykrywania glukozy (paski można przeciąć wzdłuż na pół)
• 2 ml enzymu laktaza (lub wody dla grupy B)
• sitko do odcedzenia kulek alginianu
• 2 puste kubeczki lub szklanki – jeden na roztwór alginianu, drugi do zbierania płynu
wyciekającego przez kolumnę
• 1 plastikowy kieliszek do zbierania właściwej frakcji płynu wyciekającego przez
kolumnę
• mieszadełko
• ok. 20 ml mleka (grupy B i C), lub roztworu laktozy (grupa A), lub wody (grupa D) jako
substraty reakcji
• kserokopię przepisu wykonania doświadczenia (wariant A, B, C lub D)

Organizacja pracy w klasie:

Wszystkie próby są przeprowadzane w tych samych warunkach, z tego samego alginianu
sodu, w tej samej temperaturze, przez złoże jest przepuszczana zawsze ta sama objętość
i pobierana próbka do pomiaru glukozy po jednakowej objętości, która zeszła z kolumny.
Kontrolę pozytywną wykonuje nauczyciel jako pokaz dla całej klasy. Aby udowodnić, że
pasek diagnostyczny faktycznie wykrywa glukozę, należy zanurzyć go w gotowym roz-
tworze glukozy.
Wszystkie grupy sprawdzają na wstępie zawartość glukozy w badanym roztworze (A
- laktozy, B i C – mleka, D - wody) przed przepuszczeniem przez kolumnę. Zakładając, że
jest to świeże mleko, w temperaturze pokojowej, nie poddane wcześniejszemu działaniu
laktazy, powinno być całkowicie wolne od glukozy. Woda i roztwór laktozy również nie
powinny zawierać glukozy. Próba ta ma na celu wykluczenie możliwości obecności glukozy
w nakładanym roztworze.

Grupa A – wariant doświadczalny A (kontrola +)

Przez złoże z enzymem przepuszczamy roztwór laktozy (5%) i wykrywamy glukozę
Kontrola ta ma na celu udowodnienie, że glukoza spływająca z kolumny rzeczywiście
pochodzi z rozkładu laktozy.
www.sfn.edu.pl 16
 Słodki świat enzymów

Grupa B - Wariant B (kontrola -)

Przez złoże BEZ ENZYMU przepuszczamy mleko i wykrywamy glukozę.
Aby wykluczyć możliwość, że laktoza zawarta w mleku ulega rozkładowi za sprawą samego
kontaktu z żelem alginianowym, należy przesączyć mleko przez złoże nie zawierające en-
zymu. Najlepiej to zrobić w ten sposób, że jeden z zespołów przygotuje kolumnę, w której
do roztworu algininianu sodu zamiast roztworu laktazy doda 2 ml wody destylowanej.

Grupa C - Wariant C (właściwa próba) (może go wykonać kilka zespołów)

Przez złoże z enzymem przepuszczamy mleko, w spływającym z kolumny mleku powinna
być wykrywalna glukoza.

Dodatkowy wariant: grupa D – wariant D (kontrola -)

Przez przygotowane złoże z enzymem przepuszczona zostaje woda (w objętości takiej samej
jak badany roztwór w pozostałych wariantach) i po przejściu przez kolumnę wykrywana
jest w niej glukoza. Jest to dodatkowa kontrola negatywna, która udowodni, że glukoza
nie spływa z przygotowanego złoża.

Opis doświadczenia
1. Przy pomocy otrzymanego paska diagnostycznego sprawdź zawartość glukozy w
roztworze twojego substratu – odpowiednio mleku, laktozie lub wodzie:
a. Zanurz pasek w roztworze na 3 sekundy
b. Wyjmij i poczekaj 30 sekund
c. Odczytaj stężenie glukozy porównując kolor paska z kolorem wzorca. Podobnie po-
stępuj przy następnych pomiarach glukozy

Pkt. 1a Pkt. 1b Pkt. 1c

2. Nabierz za pomocą strzykawki 8 ml 2% roztworu alginianu sodu (znajdującego się w

butelce o poj. 125 ml) i wlej do pustego kubeczka.
3. Dodaj za pomocą pipety pasterowskiej 2 ml enzymu laktazy do tego samego naczynka
z 8 ml alginianu. Dobrze wymieszaj roztwór przy pomocy mieszadełka. (UWAGA! W
przypadku Wariantu B należy dodać 2 ml wody zamiast enzymu.)
4. Nabierz przy pomocy strzykawki 10 ml mieszaniny alginianu sodu z laktazą i dodawaj
ostrożnie, dokładnie po kropli, do zlewki z roztworem chlorku wapnia. Pozwól powsta-
łym kulkom stężeć przez ok. 4 minuty. W tym czasie możesz wykonać punkt 5.
5. Wyjmij tłoczek ze strzykawki i umieść w środku zwitek waty bawełnianej. Porządnie go
ubij tłoczkiem, na dnie kolumny powinno być około 1 cm zbitej waty. Wyjmij tłoczek.
6. Odcedź powstałe kulki alginianu na sitku i umieść je w strzykawce. Tak przygotowana
strzykawka posłuży jako kolumna ze złożem.

17 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

7. Do kolumny wlewaj powoli mleko (UWAGA! W wariancie A zamiast mleka wlewany bę-
dzie roztwór laktozy, w wariancie D – woda. Dalej postępuj analogicznie). Zwróć uwagę,
by podczas trwania eksperymentu kolumna ZAWSZE była wypełniona roztworem.
8. Wyciekający z kolumny roztwór zbieraj do czystego kubeczka. Pierwszą frakcję wycieka-
jącą z kolumny, do momentu, gdy poziom zbieranej cieczy pokryje dno kieliszka, należy
wylać. Następnie podstaw, pod wylot kolumny nowy, czysty, plastikowy kieliszek.
9. Zbieraj właściwą frakcję przez około 5 - 10 minut, aż kieliszek zostanie napełniony.
10. Sprawdź zawartość glukozy w zebranym roztworze paskiem diagnostycznym.

Pkt. 4 Pkt. 6 Pkt. 7

Oczekiwane wyniki:
Wa- Substrat reakcji Obecność Obecność glukozy przed Obecność glukozy po
riant enzymu wlaniem badanego roz- przepuszczeniu badanego
w złożu tworu na kolumnę roztworu przez kolumnę
A roztwór laktozy + - +
B mleko - - -
C mleko + - +
D woda + - -

Rozwiązywanie problemów:
1. W m l e k u n i e p o j a w i ł a s i ę g l u k o z a :
Mogło zostać użyte mleko, które ma obniżoną zawartość laktozy, albo mleko, które
było zbyt zimne (powinno mieć temperaturę pokojową). Możliwe jest też, że mleko
przesączało się przez kolumnę zbyt szybko i wtedy laktoza nie zdążyła się związać z
enzymem i nie uległa rozkładowi. Można przesączyć to samo mleko jeszcze raz przez
kolumnę. Gdy zaś mleko sączyło się zbyt wolno, powstająca w wyniku rozpadu laktozy
galaktoza, mogła zahamować aktywność laktazy. Należy kolumnę przemyć wodą.
2. W y n i k i w r ó ż n y c h g r u p a c h s ą r ó ż n e :
Warstwa waty nie była równa we wszystkich grupach – grubość i stopień ubicia war-
stwy waty ma wpływ na tempo przepływu mleka.
Kolumna nie była przez cały czas w pozycji pionowej, co mogło spowodować nierów-
nomierne spływanie mleka.
Kolumna nie była przez cały czas wypełniona mlekiem, w efekcie część mleka krócej
reagowała z enzymem.
Zebrano złą frakcję mleka, to znaczy nie tylko tę, która faktycznie przeszła przez cała
kolumnę. Badanie poziomu glukozy należy przeprowadzić dopiero w mleku zbieranym
do drugiego naczynka.

www.sfn.edu.pl 18
 Słodki świat enzymów

Propozycje dodatkowego wykorzystania zestawu:

Na rynku dostępne jest mleko o obniżonej zawartości laktozy, warto również takie mleko
wykorzystać do eksperymentu i sprawdzić, czy dane producenta sa zgodne z rzeczywi-
stością.

Uwagi:
• Zużyte złoże, watę i paski diagnostyczne można wyrzucić do pojemnika na zwykłe
śmieci.
• Strzykawki po dokładnym umyciu wodą z detergentem i wypłukaniu nadają się do
powtórnego użycia.
• Resztki roztworu chlorku wapnia można wylać do zlewu.
• Kulki alginianu sodu z immobilizowanym na nich enzymem można wyrzucić do pojemnika
na zwykłe śmieci.

19 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

Inwertaza
Cel doświadczenia: Wykrywanie aktywności enzymatycznej inwertazy
drożdżowej
Czas wykonania doświadczenia: jedna jednostka lekcyjna

Wstęp
Komórki drożdży wytwarzają inwertazę. Wykrycie aktywności enzymatycznej tego enzymu
w proponowanym doświadczeniu nastąpi pośrednio, przez wykrycie jednego z produktów
reakcji – glukozy.
Do zawiesiny świeżych drożdży piekarniczych dodamy substratu reakcji – 5% roztwór sa-
charozy. Do wykrycia obecności glukozy po przeprowadzonej reakcji, posłużą stosowane
przez diabetyków paski diagnostyczne. Pasek diagnostyczny nie powinien wykazywać
obecności glukozy w zawiesinie drożdży przed reakcją.
Inwertazę drożdżową można również w łatwy sposób wyizolować z drożdży. Poniżej po-
dajemy przepis, jak w warunkach domowych wyizolować enzym.

IZOLACJA INWERTAZY Z DROŻDZY PIEKARSKICH

Do 3 g świeżych drożdży (lub 10 g suszonych) dodaj 30 ml 0,1 M roztworu węglanu sodu
(sody oczyszczonej). Inkubuj przez 24 h w temperaturze 40°C. Po tym czasie pozostaw
mieszaninę w lodówce na kolejne 24 h. Utworzą się dwie warstwy. Zbierz przezroczystą
górną warstwę i zbadaj w niej aktywność inwertazy. Tak otrzymaną inwertazę można
przetrzymywać w temperaturze 4°C. Preparat ten jest podatny na zakażenia, jeśli zaobser-
wujemy zmętnienie roztworu należy go wylać. Przed użyciem inwertazę można rozcieńczyć
wodą destylowaną.

W zestawie jest:

• 1 probówka z roztworem inwertazy (12 ml). Należy przechowywać w 

lodówce
• 5 płytek 24 dołkowych 
• 10 pipetek pasterowskich o objętości 1 ml

• glukoza w proszku (1 g) 
• sacharoza w proszku ( 2,5 g w probówce 50 ml) 
• 27 pasków diagnostycznych do wykrywania glukozy 
• 5 mieszadełek 

Dodatkowo potrzebne będzie:

• 12 kubeczków (mogą być słoiki lub zlewki) 
• świeże drożdże piekarskie (5g) 
• 50 ml wody destylowanej (wodę destylowaną można kupić na stacji 
benzynowej)
• ciepła woda 
• flamastry 

www.sfn.edu.pl 20
 Słodki świat enzymów

Przygotowania wstępne
1. Przygotowanie roztworu sacharozy: probówkę z sacharozą (2,5 g) dopełnij do 50 ml
wodą mineralną lub destylowaną. Rozlej tak przygotowany 5% roztwór do 5 zlewek
lub kubków po ok. 10 ml.
2. Do pojemniczka z naważką glukozy (1 g) wlej 25 ml wody destylowanej. Wymieszaj.
Otrzymasz ok. 4% roztwór glukozy.
3. Drożdże rozdziel na 1 gramowe fragmenty (objętość ok. łyżeczki do kawy), każdy
umieść w osobnym kubeczku

Każdy z pięciu zespołów uczniów powinien otrzymać:

• zlewkę lub kubek z ok. 10 ml 5% roztworu sacharozy
• 1 pytkę 24 dołkową
• 2 pipetki pasterowskie o obj. 1 ml
• mieszadełko
• 6 pasków do wykrywania glukozy (paski można przeciąć wzdłuż na pół)
• 1 g drożdży w kubeczku
• enzym inwertazę (2 ml)
• ciepłą wodę
• flamaster
• kserokopię przepisu wykonania doświadczenia

Organizacja pracy w klasie:

Wszystkie próby są robione w tych samych warunkach, z tego samego roztworu sacha-
rozy i tych samych drożdży, w tej samej temperaturze, pomiar glukozy następuje po tym
samym czasie.
Kontrolę pozytywną nr „O” wykonuje nauczyciel jako pokaz dla całej klasy. Aby udowodnić,
że pasek diagnostyczny faktycznie wykrywa glukozę, należy zanurzyć go w gotowym roz-
tworze glukozy. Nauczyciel powinien także wykonać kontrolę negatywną nr „O” sprawdzając
zawartość glukozy w roztworze sacharozy przed rozdaniem jej uczniom.
Każdy z zespołów uczniów wykonuje wszystkie podane niżej próby:

Próba A – (kontrola +)
Do roztworu sacharozy dodajemy komercyjną inwertazę spożywczą i wykrywamy obecność
glukozy po przeprowadzonej reakcji. Jest to kontrola pozytywna, mająca na celu udowod-
nienie, że reakcja hydrolizy sacharozy katalizowana jest rzeczywiście przez inwertazę, nie
jakiś inny składnik komórek drożdży.

Próba B - (kontrola -)
Zamiast sacharozy podajemy wodę – katalizatorem jest komercyjna inwertaza spożywcza.
Kontrola ma na celu sprawdzenie czy roztwór enzymu nie zawiera glukozy.

Próba C – (właściwa próba)

Substratem reakcji jest sacharoza, a źródłem enzymu mają być komórki drożdży. Po reakcji,
w mieszaninie wykrywamy poziom glukozy.

Próba D – (kontrola -)
Zamiast substratu reakcji podajemy wodę, źródłem enzymu są komórki drożdży. Kontrola
ma na celu udowodnienie, że w zawiesinie drożdży nie ma glukozy.

Dodatkowy wariant E i F (kontrola -)

Aby potwierdzić specyficzność działania inwertazy można wykonać dodatkowo kontrole
używając jako substratu innego cukru. Może to być na przykład skrobia lub roztwór disa-
charydów powstały po rozkładzie skrobi przez amylazę lub laktoza. Substrat należy poddać
działaniu zarówno inwertazy komercyjnej (wariant E), jak i zawiesinie drożdży (wariant F).
W obu przypadkach nie powinna się pojawić glukoza.

21 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

Opis doświadczenia
1. 1 g świeżych drożdży w kubeczku zalej 6 ml ciepłej wody. Zamieszaj.
2. Podpisz sześć kolejnych dołków na płytce cyframi od 1 do 6.
3. Do dołków w 24-dołkowej płytce rozlej za pomocą pipetki pasterowskiej po 2 ml
roztworów substratów:
• Do dołków nr 2 i 4 wlej wody
• Do dołków 1 oraz 3 wlej roztworu sacharozy.
• *(dla chętnych) do dołków 5 i 6 wlej drugą pipetką po 2 ml roztworu innego cukru (np.
laktozy)
4. Opłucz dokładnie pipetki w czystej wodzie
5. Do dołków nr 1 i nr 2 dodaj za pomocą pipetki pasterowskiej po 1 ml komercyjnego
enzymu inwertazy, zamieszaj.

Pkt. 1 Pkt. 3 Pkt. 6

6. Po 5 minutach dokonaj pomiaru zawartości glukozy w badanej mieszaninie, przy

pomocy paska diagnostycznego.
a. Zanurz pasek w roztworze na ok. 3 sekundy.
b. Wyjmij i poczekaj 30 sekund
c. Odczytaj stężenie glukozy porównując kolor paska z kolorem wzorca, zapisz wynik.
7. Powtórz kroki piąty i szósty dodając do dołków nr 3 i 4 po 1 ml przygotowanej za-
wiesiny drożdży.
8. Następnie powtórz kroki piąty i szósty dodając do dołka nr 5 1 ml enzymu inwertazy,
a do dołka nr 4 1 ml drożdży. Pamiętaj, aby za każdym razem myć lub wymieniać
pipetkę!

Schemat doświadczenia:
Nr dołka 1 2 3 4 *5 *6
substrat sacharoza woda sacharoza woda Inny cukier Inny cukier
enzym inwertaza inwertaza drożdże drożdże inwertaza drożdże

www.sfn.edu.pl 22
 Słodki świat enzymów

Oczekiwane wyniki:
Substrat reakcji Katalizator Obecność glukozy Obecność glukozy Rola warian-
w roztworze sub- po przeprowadzo- tu (kontrola czy
stratu przed doda- nej reakcji właściwy ekspe-
niem katalizatora ryment)
A roztwór sacharozy (5%) inwertaza - + K+
B woda inwertaza - - K-
C roztwór sacharozy (5%) drożdże - + właściwa próba
D woda drożdże - - K-
E roztwór innego cukru inwertaza - - K-
F roztwór innego cukru drożdże - - K-

Rozwiązywanie problemów:
1. W kontroli pozytywnej nie pojawiła się glukoza:
Najprawdopodobniej trzeba wydłużyć czas reakcji, np. dlatego że enzym lub substrat
były zimne.
Jeśli nawet po dłuższym czasie nie pojawiła się glukoza, enzym prawdopodobnie
stracił aktywność na skutek nieprawidłowego przechowywania - w transporcie lub
w szkole.
2. W próbach właściwych nie pojawiła się glukoza:
Drożdże mogą być stare lub należy je bardziej podgrzać. Wydłużenie czasu reakcji
powinno pomóc lub należy wymienić drożdże.
3. W s z ę d z i e p o j a w i a s i ę g l u k o z a :
Próby zostały zanieczyszczone, np. podczas doświadczenia nie była wymieniana ani
myta pipetka.

Propozycje dodatkowego wykorzystania zestawu:

• Inwertazę a także drożdże można unieruchamiać (immobilizować) na złożu alginianowym,
w identyczny sposób, jak pokazano w doświadczeniu z laktazą. Uformowane w ten
sposób złoże może ułatwić badanie aktywności enzymu.
• Badania związanie z pomiarem aktywności enzymu, np.: wpływu stężenia enzymu,
stężenia substratu, czasu reakcji, obecności aktywatorów i inhibitorów na szybkość
reakcji, wyznaczenie optymalnych parametrów działania (pH, temperatura) i określenie
stabilności tych enzymów w różnych warunkach pH, temperatury.
• Na immobilizowanych drożdżach można pokazać także działanie ich innych enzymów
– np. dehydrogenazy alkoholowej.
• Wykonanie doświadczenia z użyciem inwertazy wyizolowanej uprzednio z drożdży, wg
przepisu podanego na początku rozdziału.

Uwagi:
• Wykorzystane roztwory oraz drożdże można wylać do zlewu.
• Płytki po dokładnym umyciu wodą z detergentem i wypłukaniu nadają się do powtórnego
użycia.
• Paski diagnostyczne są jednorazowe, po użyciu można wyrzucić je do pojemnika na
zwykłe śmieci.

23 Copyright © :
 Szkoła Festiwalu Nauki

W zestawie znajdują się:

• przewodnik dla nauczyciela
• płyta CD
• karty pracy dla uczniów
• 1 probówka zawierająca 12o µl enzymu amylazy Termamyl
• 1 probówka z enzymem laktaza w proszku (1 g)
• 1 próbowka z roztworem enzymu inwertaza (12 ml)
• 5 pudełek skrobi (5 x 2 g)
• 2 pudełka glukozy w proszku (2 x 1 g)
• 1 pudełko laktozy w proszku (5 g)
• 1 naważka sacharozy 2,5 g w probówce 50 ml
• 1 butelka jodyny
• 1 butelka z 1 g alginianu sodu
• 1 pudełko z chlorkiem wapnia (7,5 g)
• 50 pasków diagnostycznych do wykrywania glukozy
• 5 płytek plastikowych z 24 dołkami
• 10 pipet pasterowskich o pojemności 1 ml
• 5 strzykawek o pojemności 10 ml
• 1 pusta probówka o poj. 50 ml z podziałką do odmierzania objętości
• 1 pusta butelka o poj. 125 ml na roztwór jodyny
• 5 plastikowych kubeczków
• 5 plastikowych kieliszków
• 5 sitek
• wata bawełniana
• 5 mieszadełek

UWAGA: Po rozpakowaniu zestawu próbki enzymów należy przechowywać

w lodówce (od +4oC).

www.sfn.edu.pl 24