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Prueba de sensibilidad a antibiticos.

Difusin en agar (Kirby-Bauer). Dilucin en


caldo. Determinacin de la concentracin
inhibitoria mnima (CIM) y de la
concentracin bactericida mnima (CBM).

Dr. Cecilia Villa

Temas a desarrollar

Introduccin terica

Definicin
Clasificacin
Mecanismos de accin
Mecanismos de resistencia
Nuevos antimicrobianos
Descripcin terica de Mtodos de Antibiogramas
(Difusin en agar, Dilucin en caldo, Microdilucin en caldo, E-test)

Explicacin prctica
Difusin en agar
Dilucin en caldo

Introduccin terica del tema

ANTIMICROBIANOS (ATM)
Sustancias capaces de inhibir el crecimiento e incluso destruir determinadas
especies microbianas de forma especfica, a bajas concentraciones y sin
toxicidad, o muy baja, para el organismo humano.

Estos compuestos pueden estar producidos por microorganismos vivos


(antibiticos) o por sntesis qumica (quimioterpicos).
Fig. 1.- Fleming y la penicilina. En
1928, realizaba varios experimentos
en su laboratorio, y el dia 22 cuando
observaba sus cultivos antes de
descartarlos, not que la colonia de
un hongo haba crecido
espontneamente, como
contaminante en una de las Placas de
Petri sembradas con Staphylococcus
aureus . Fleming observ mas tarde
las placas y comprob que las colonias
bacterianas que se encontraban
alrededor del hongo (mas tarde
identificado como Penicillium
notatum) eran transparentes debido a
una lisis bacteriana. Penicillium
produce penicilina, la cual posee
efectos antibacterianos.

Caractersticas de un
antimicrobiano
1.- Especificidad

Se refiere al espectro de la actividad


antimicrobiana, definida por su capacidad de
unin a un sitio especfico de la bacteria.

2.- Eficacia in vivo

Debe ser bacteriosttico o bactericida in vivo,


es decir, su accin no debe ser revertida en el
interior del organismo.

3.- Toxicidad selectiva


Debe ser txico para el microorganismo, pero
ser inocuo para el husped. Esto es
indispensable para la utilizacin del
antimicrobiano en clnica.

CLASIFICACIN

Por
Por
Por
Por
Por

su origen
su espectro de accin
la forma de accin
su estructura
su mecanismo de accin

Por

su origen

Biolgicos producidos por microorganismos


Hongos filamentosos (especialmente Penicillium) que
producen antibiticos como la penicilina y la griseofulvina.
Bacterias (del gnero Bacillus) de las que se obtienen
antibiticos como la bacitracina y la polimixina.
Actinomycetos (del gnero Streptomyces) que producen
antibiticos como la estreptomicina, cloranfenicol, tetraciclina y
eritromicina.

Semisintticos ptan un ncleo bsico biolgico con radicales


obtenidos por sntesis como cefalosporinas
Sintticos obtenidos por sntesis qumica como nitrofuranos,
sulfamidas

Por

su espectro de accin

Amplio espectro; G+ y Gcloranfenicol


tetraciclinas
penicilinas de amplio espectro

Espectro intermedio; G+
penicilinas
macrlidos

Corto espectro; Cocos G+


y bacilos Gpolimixinas

Por

la forma de accin
Bacteriostticos

sint. de protenas
met. intermedios

Bactericidas

sint. de protenas
sint. cidos nucleicos

Bacteriolticos

sint. pared celular


integridad de la membrana

Por su estructura
- lactmicos: penicilina y cefalosporinas

Tetraciclinas
Polipptidos
(ej. valinomicina)

Aminoglicsidos
(ej. amikacina)

Macrlidos

Cloranfenicol

Por

su mecanismo de accin

Resistencia a los antimicrobianos


Una cepa bacteriana es resistente a un ATM determinado cuando para
inhibirse necesita concentraciones de frmacos superiores a la concentracin
que el agente ATM puede alcanzar en el sitio de la infeccin.
Incremento de la CIM

Tipos de resistencia
El microorganismo puede carecer de la estructura sobre la que
acta el Ab, puede inactivarlo, puede ser impermeable, puede
modificar la diana del Ab, puede bloquearlo por medio de una via
metablica alterada, puede bombearlo hacia afuera.

Resistencia natural

Resistencia adquirida

RESISTENCIA ADQUIRIDA
Capacidad adquirida de un microorganismo para resistir los efectos de un
antimicrobiano al que es habitualmente sensible.

Bases genticas
La resistencia adquirida a un antimicrobiano se debe a cambios en la carga
gentica de la bacteria.
Cromosmica. Alteracin estructural del DNA cromosmico MUTACIN
Plasmdica. Adquisicin de DNA extracromosmico
Plsmidos de resistencia conjugativos R
Resistencia a varias drogas a la vez
Conjugacin

Plsmidos de resistencia no conjugativos r


Falta de transferibilidad conjugativa .
Transformacin / Transduccin
Espectro de resistencia menor (rara vez resistencia mltiple).
Son de tamao menor a R.

Resistencia a antimicrobianos: Mecanismos bioqumicos


Disminucin de la permeabilidad
hacia el antibitico . Ej.Tetraciclina

Inactivacin enzimtica del


antibitico. Ej. Penicilina
Eliminacin de
antibitico mediante
Bomba de Eflujo.

Desarrollo de vias
metablicas
alternativas. Sntesis de
una enzima resistente.
Capacidad para usar cido
flico preformado no
requieren PABA (c.
paraminobenzoico). El cual
desplaza sulfonamida desde
dihidropteroato sintetasa.
Ej. Sulfonamidas

Modificacin qumica de la
diana sobre la que acta el
antibitico. Alteracin de la
protenas P10 ribosomal. Ej.
Estreptomicina

Peleg, A. Y. et al (2010) Hospital-acquired infections due to gram-negative bacteria. The New England Journal of Medicine, Volume

362:1804-1813, May 13 2010

El antibitico no crea resistencia, pero selecciona las bacterias resistentes


eliminando las sensibles. Es lo que se conoce con el nombre de presin de
seleccin.

El aumento de la frecuencia de las cepas resistentes va unido casi siempre


al uso intensivo del antibitico en cuestin.
Prescripcin formal o libre de medicamentos para uso teraputico en humanos o animales.
Utilizacin generalizada de antimicrobianos en pacientes inmunocomprometidos y en la
unidad de cuidados intensivos.
Uso de dosis o duracin inadecuada de la terapia antimicrobiana.
Desconocimiento de los perfiles de sensibilidad a los diferentes microorganismos.

Nuevos antimicrobianos
Nuevos anlogos de los antimicrobianos existentes
Realizando sustituciones qumicas que le otorga ventajas como mayor solubilidad,
afinidad o menor reconocimiento por los factores de resistencia
Productos naturales. Pptidos antimicrobianos ( de plantas y animales), por ej.:
-Magainina, pptido catinico que acta como agente protector. Se encuentra en la piel
de ciertas ranas. Forma canales en la membrana citoplasmtica.
-Platensimicina , descubierto recientemente de Streptomyces platensis, inhibe la sntesis
de lpidos en bacterias. Frmaco especialmente activo contra bacterias gram-positivas
multiresistentes.
Diseo de medicamentos por ordenador. Saquinavir, inhibidor de proteasa, HIV

Genes antisense DNA complementario que se une a genes de virulencia del


patgeno y previenen la transcripcin Ej: fornivirsen

Debido a la resistencia a antibiticos, debe determinarse la


sensibilidad a antibiticos de las bacterias aisladas de muestras
clnicas.
Antibiogramas
Tcnica que permite demostrar la sensibilidad o resistencia de
un microorganismo a la accin de distintos antimicrobianos.

Los principales mtodos para aerobios y anaerobios


facultativos son:
Difusin en agar (Kirby-Bauer)
Dilucin en caldo
Tcnica del Epsilmetro (E-test)

Mtodo de difusin en agar (Kirby-Bauer)


El principio del mtodo involucra el uso de una cantidad constante de
antimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicados sobre la
superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en
cuestin.
Es

el recomendado por CLSI (Clinical and Laboratory Standars


Institute)(Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing) y es el
mtodo descrito de manera ms completa para el cual se han desarrollado tablas
de interpretacin que estn respaldadas por datos clnicos y de laboratorio.

Es ms accesible y de uso comn en los laboratorios de diagnstico clnico.

Ha sido estandarizado para patgenos de rpido desarrollo:Staphylococcus spp.,


Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., Enterobacteriaceae

Y ha sido modificado para probar algunos microorganismos nutricionalmente


exigentes como Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus
pneumoniae, estreptococos hemolticos y del grupo vridans y Micobacterias.

Estandarizacin del mtodo


Para que los resultados sean confiables los procedimientos debern ser
controlados y estandarizados.
El medio de cultivo: Agar Meller Hinton (4 mm de alto; pH 7,2 - 7,4 ).
Presenta

buena reproducibilidad de resultados de lote a lote.


Es pobre en contenido de timina o timidina (compiten con sulfonamidas,
trimetroprimas y tetraciclinas), lo que dara falsas resistencias.
Es adecuado para el desarrollo de la mayora de las bacterias patgenas.
Existen suficientes datos que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad
realizadas en este medio.
El inculo: cultivo joven, densidad de microorganismos (1x108 UFC/ml),
preparacin reciente.
La colocacin de los discos: tiempo de colocacin luego de la siembra (3 5
min), distancia entre discos (22 mm) y nmero por placa (3 -5).

Temperatura y tiempo de incubacin: 35 a 37C durante 18 a 24 horas.

Eleccin del antimicrobiano


Existen tablas sugeridas por CLSI, con las recomendaciones de los antimicrobianos
a estudiar para cada grupo bacteriano, que se basan en factores microbiolgicos,
clnicos y farmacolgicos.
Todos

los antibiticos debern usarse por su nombre genrico.

En

general, deber incluirse slo un representante de cada grupo de drogas


relacionadas con actividad casi idntica y para las cuales la interpretacin podra ser
la misma.
Rara

vez se realizan pruebas de sensibilidad para microorganismos sensibles a una


droga altamente eficaz, por ejemplo Streptococcus pyogenes y Neisseria
meningitidis que han mantenido invariable su sensibilidad a la penicilina.

Mtodo de dilucin en caldo


Para cuantificar la actividad antimicrobiana se puede medir la sensibilidad de un
cultivo por la tcnica de dilucin en caldo.
Es uno de los primeros que se llev a cabo y an hoy sirve como mtodo de referencia
porque permite la determinacin cuantitativa de la sensibilidad al antibitico, pero es
laborioso y costoso, por lo tanto se limita su uso a casos especiales.

En el mtodo de dilucin en caldo se colocan concentraciones decrecientes del


agente antimicrobiano, generalmente diluciones al medio (1:2) en tubos con un caldo
de cultivo que sostendr el desarrollo de los microorganismos. El caldo ms
comnmente usado es el de Mueller-Hinton. Adems se realizan un C + y C -.
Inculo estndar del microorganismo: 1 x 106 organismos/ml.
Se incuba de 18-24 h a 35C y se observa la turbidez de los tubos que indicar
desarrollo bacteriano. El microorganismo crecer en el tubo control positivo y en todos
los otros que no contengan suficiente antimicrobiano.
Se determina la CIM Y CBM.

CIM

Concentracin inhibitoria
mnima (CIM)

Corresponde a la menor concentracin de


antimicrobiano que inhibe el crecimiento
bacteriano luego de 18 a 24 horas de
incubacin.
CIM

Concentracin bactericida
mnima (CBM)
Corresponde a la menor concentracin
de antimicrobiano capaz de matar un
99,9% de la poblacin bacteriana.

CBM

Mtodo de microdilucin en caldo


Es una adaptacin de la prueba de dilucin en caldo a policubetas para microdilucin.

Estas microplacas de 96 pocillos se pueden adquirir en el comercio y tienen la ventaja de haber


sido preparadas bajo estndares de control de calidad muy estrictos que aseguran resultados
consistentes.
Empleo de autoanalizador (mediciones por turbidez o fluorescencia) o, simple lectura ptica.
Otra ventaja es que se pueden estudiar varias cepas al mismo tiempo y con varios
antimicrobianos

Mtodo del Epsilmetro (E-Test)


Consiste en una tira plstica estril no porosa de 6 cm de largo por 5 mm de ancho
que incorpora de un lado un gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a
15 diluciones, y del otro lado presenta una escala de lectura e interpretacin.
La inoculacin y el cultivo se realiza igual que en la tcnica de Kirby-Bauer.
Para leer el resultado se valora la zona de inhibicin, de forma elptica, alrededor de
cada tira. La CIM se lee directamente observando el punto ms bajo de la elipse que
presente crecimiento.
Caractersticas

Permite estudiar una cepa individual frente a diferentes agentes.

Una de sus grandes ventajas, dadas sus caractersticas, es que resulta un mtodo
ideal para estudiar cualquier tipo de microorganismo, aerobio o anaerobio,
incluyendo aquellos llamados "fastidiosos" o los que tengan requerimientos
especiales para crecer.

En la fotografa inferior de la izquierda


se muestra una vista general de una
placa con crecimiento bacteriano y con
dos tiras de E-test. Las elipses ms
oscuras que rodean la parte superior de
las tiras E-test marcan las zonas en que
los respectivos antibiticos han inhibido,
con mayor o menor eficacia, el
crecimiento del microorganismo en
estudio.
En la foto inferior de la derecha se
aprecia como el pico de la zona ms
estrecha de la elipse en la tira de MZ
coincide, en la escala graduada, con la
franja entre las marcas de 1.5 y 2, lo
que nos indicara que la CIM de este
antibitico
(MZ)
para
este
microorganismo sera de 2 g/ml.

En el Trabajo Prctico de Laboratorio

Explicacin mtodo de
difusin en agar
(Kirby-Bauer)
Da 1

MATERIALES
Mecheros
Ansa en anillo
Tubos con solucin fisiolgica estril
Placas estriles
Hisopos estriles
Medio de cultivo agar Meller Hinton
Pinzas metlicas
Reglas
Discos con antimicrobianos
Microorganismos de ensayo
Patrn de turbidez (escala de Mc Farland)

Preparacin de las placas con el medio de cultivo

Se vierten 25 a 30 ml de agar Meller Hinton fundido en placas


estriles de 100 mm de dimetro, para obtener una altura de 4
mm. Para eliminar la humedad se colocan las placas de 15 a 30
min. en estufa de cultivo a 37C.

Preparacin del inculo

Se toman 4 o 5 colonias bien aisladas y de igual morfologa de


la placa de cultivo de 18 a 24 horas de incubacin, con un
ansa y se introducen en 5 ml de caldo triptena soja. Si la
turbidez obtenida es la adecuada, no es necesario una
incubacin posterior, caso contrario, se incuba a 37C hasta
lograr la turbidez del testigo, la que termina de ajustarse
agregando solucin fisiolgica si es necesario. El testigo a usar
corresponde al 0,5 de la escala de Mc Farland.

Siembra de las placas

Se sumerge un hisopo de algodn estril en el


inculo, oprimiendo el algodn contra las paredes
internas del tubo para descartar el exceso de
lquido. Se aplica el hisopo sobre la superficie de
las placas estriando uniformemente y rotando la
placa cada 60.

Colocacin de los discos

Esperar entre 3 a 5 minutos y no ms de 15 minutos


antes de aplicar los discos, para que el exceso de
humedad superficial sea absorbido. Colocar los discos
con una pinza estril cuidando que tengan un buen
contacto con la superficie del agar haciendo una ligera
presin. (22mm y 15 mm)

Incubacin de las placas

Incubar las placas invertidas, en grupos no superiores a 5


placas, a 35C en atmsfera aerbica antes de que transcurran
15 minutos durante 18 a 24 horas.

Da 2

Medicin de las zonas de inhibicin

Con una regla o


calibre, se mide el
dimetro de los
halos incluyendo el
disco de 6 mm.

Dimetro
la cantidad de antimicrobiano aadido
al disco
la solubilidad del agente
el coeficiente de difusin
la eficacia del ATM

Resultados
Estndares de interpretacin de
zonas de dimetro.
Existen tablas especficas CLSI
periodicamente publicadas que indican
los criterios para interpretar los
dimetros de zonas para categorizar
exactamente los niveles de
susceptibilidad de los microorganismos
a diferentes agentes antimicrobianos.
Categoras Interpretativas.
Sensible Una infeccin debido a una cepa puede ser apropiadamente tratada con la dosis de
agente antimicrobiano recomendado para ese tipo de infeccin y especie infectante.
Intermedio Implica eficacia clnica en sitios del cuerpo donde la droga es fisiolgicamente
concentrada (por ej. quinolonas y -lactmicos en orina) o cuando una dosis mayor que lo
normal de una droga puede ser usada (por ej. -lactmicos).

Resistente Las cepas resistentes no son inhibidas por la concentracin sistmica usualmente
alcanzable de un agente cuando los esquemas de dosificacin normal son usados.

Resultados errneos

Explicacin mtodo de
dilucin en caldo (tubo)

MATERIALES
Tubos con el microorganismo desarrollado
Tubos para estandarizar el inculo
Tubos con 1 ml de concentraciones decrecientes del antibitico en
caldo Meller-Hinton
Tubos con 1 ml de caldo Meller-Hinton
Placas con agar para recuento

Estandarizar el inculo: Se obtiene realizando diluciones de una


suspensin bacteriana comparando con el tubo nmero 1 de la
escala de Mc Farland (1 x 106 UFC/ml), preparar 10 ml.

Da 1

Colocar 1 ml del inculo a cada uno de


los tubos que contienen 1ml de caldo
con el antibitico en las concentraciones
indicadas (g/ml) y al control sin
antimicrobiano (C +), dejar un tubo sin
inocular (C -).

Los agentes
antimicrobianos
se preparan en
soluciones
concentradas y
luego se diluyen
en caldo.

Los tubos contienen ahora 2ml con 5 x


105 UFC/ml y el antibitico en las
concentraciones indicadas (g/ml)
Tomar 100 l del control negativo e
inocularlo en agar

Incubar 24 h a 37C .

Se observa turbidez a simple vista.


0,1 ml de los caldos no turbios se subcultiva en
agar.

Da 2

CIM: Menor concentracin


de antimicrobiano que
inhibe el crecimiento
bacteriano.

Da 3

CBM: Menor concentracin de


antimicrobiano capaz de matar un
99,9% de la poblacin bacteriana.

Se determinan las UFC en el tubo


control por recuento de colonias
(500 UFC= 5 x 105/ml inculo
original)

Dado que incluso las drogas bactericidas no siempre esterilizan


totalmente una poblacin bacteriana, para medir la capacidad de un
antimicrobiano de matar a un microorganismo se debe realizar la
prueba de actividad bactericida.
Se determinan las UFC en los subcultivos
de los caldos no turbios.
7 UFC = 70 UFC/ml en el tubo que
contiene 8 g/ml de antibitico.
7 UFC/ml < 0,1% de 5 x 105/ml que
contena el inculo original.

Bibliografa

Calvo, J., Martnez-Martnez, L. 2009. Mecanismos de accin de los antimicrobianos. Enferm. Infecc.
Microbiol. Clin. 27:4452.
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos Generales. Segunda edicin.
Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.
Clinical and Laboratory Standars Institute. 2012. Performance Standars for Antimicrobial Susceptibility
Testing; Twenty-Second Informational Supplement. Vol. 32 N 3 M100-S22. On line.
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. Bailey & Scott. 2009. Diagnstico microbiolgico. Ed. Mdica Panamericana.
12 Edicin. Buenos Aires, Argentina.
Madigan, Martinko, Parker. Brock, Biologa de los Microorganismos. 12a Edicin. Pearson Prentice Hall.
Manual de procedimientos Para la determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos en bacterias
aisladas de humanos. 2001. Ministerio de Salud. Subsecretara de Investigacin y Tecnologa . Instituto
Nacional de Enfermedades Infecciosas Dr. Carlos G. Malbrn . Departamento Bacteriologa . Servicio
Antimicrobianos . Buenos Aires, Argentina .
Murray P, Rosenthal K, Pfaller M. 2009. Microbiologa mdica. Ed. Elsevier-Mosby. 6 Edicin. Barcelona,
Espaa.
Palavecino Rosales E. 1997. Boletn Escuela de Medicina. Pontificia Universidad Catlica de
Chile.1997;26:156-160
Peleg, A. Y., M.B., B.S., M.P.H., and David C. Hooper, M.D. 2010. Hospital-acquired infections due to gramnegative bacteria. N. Engl. J. Med. 362:1804-1813
Tablas CLSI. 2009. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Nineteenth Informational
Supplement. M100-S19.Vol 29 N 3.
Taroco R, Seija V, Vignoli R. 2008. Mtodos de estudio de la sensibilidad antimicrobiana. Colombia Rev.
Bacteriol. 663-670 pp.
Tortora, Funke, Case, Introduccin a la Microbiologa. 9a Edicin. Editorial Mdica Panamericana.
http://www.britanialab.com.ar/k07_04.html
http://www.odon.uba.ar/uacad/Pagina%20Microbiologia/micro%202013/guias%20tp/trabajos%20practicos
%208.pdf
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Antibiograma.pdf
http://antimicrobianos.com.ar/ATB/wp-content/uploads/2012/11/M100S22E.pdf
http://www.uv.mx/evargas/Bioetica/Boletin/Articulos/Octubre03/Editorial.html

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