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Programo de Doctorado:
Ecologa y Gestin de
105
/J
Departamento de Biologa
Departamento de Biologa
D. JOS MANUEL VERGARA MARTN, SECRETARIO DEL
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA DE LA UNIVERSIDAD DE
LAS PALMAS DE GRAN CANARIA,
CERTIFICA,
Que el Consejo de Doctores del Departamento en su sesin de
fecha hoy tom el acuerdo de dar el consentimiento para su
tramitacin , a la tesis doctoral titulada "Caracterizacin
biolgica y qumica de Kappaphycus alvarezii de Panam ~
presentada por la doctoranda Da. Claudia Massiel Prez
Gonzlez y dirigida por el Dr. Rafael Robaina Romero y la Dra.
Pilar Garca Jimnez.
Programa de Doctorado
Ecologa y Gestin de los Recursos Vivos Marinos
Departamento de Biologa
El Director
La Directora
La Docto randa
! '-"
DE GRAN CANARIA
TESIS DOCTORAL
Agradecimientos
Primero te quiero d,H las gracias Diosito , por darme la vida y
permitirme alcanzar uno de mis propsitos. Gracias Seor por
poner en mi camino a dos personas maravillosas como tutores
de esta tesis, gracias al Profe Rafa quien me brind la
oportunidad de realizar este doctorado y ha sido un gran apoyo
en todo momento . A Pili, a quien le debo que este objetivo hoy
sea una realidad, gracias por todo Pili!, no hay palabras
suficientes
que
expresen
mi
entera
gratitud,
aprecio
Agradecimientos
concedida para realizar los estudios de doctorado durante el
periodo 2008-2012.
Qumico-Fsico
para
el
Desarrollo
de
la
Agradecimientos
que a los compaeros de grupos vecinos, Unai, Eli, Caro,
Migue, Javi, Edna y Andrea, muchas gracias a todos.
a toda
gracias por su
Isabel,
Adolfina
Norma
por
su
cario
amistad
Agradecimientos
A la 1ra . Comunidad de Santa Mara La Antigua , por sus
oraciones especialmente a Loyda y Jos, gracias por estar alli
se les quiere mucho .
Formacin
y Participacin cientfica
de
2008/2010. La
doctoranda ha
participado
en
los
RR
Kappaphycus
(2009)
a/varezi
Batista VG ,
Cultivos
Ecosostenibles
en
costas
las
del
de
Caribe
Aplicaciones.
Universidad
de
Formacin
y Participacin cientfica
identification
and
characterization
of
chemical
properties
of
carrageenan
from
ndice General
Introduccin General: Cultivo de algas como recurso
ecosostenible ....... ................. ................................................... 1
Las algas marinas o macroalgas como fuente importante
de alimento y otros usos .... ....... ....................................... 1
Por sus caractersticas, propiedades y sus diferentes
usos, las algas marinas poseen un gran valor comercial
e industrial .......................................................................3
Explotacin de poblaciones o fuentes naturales de
algas ............................... ...................................... .4
Mtodos de cultivo intensivo (alta densidad) de
algas marinas de importancia comercial .... ........... 5
Establecimiento de los cultivos de algas marinas en
Panam como recurso ecosostenible ............................ 12
Consideraciones del cultivo de la especie comercial
"cottonii" a nivel mundia 1 ................................................ 19
La plasticidad un problema en la identificacin del
gnero Kappaphycus y Eucheuma ................................ 25
El mantenimiento de la calidad y mejora del cultivo
depende de la investigacin a nivel molecular .............. 32
ndice General
La caracterizacin gentica de un cultivar depende de
marcadores moleculares para detectar diferencias
genticas dentro de poblacionales ..................... .. ........ .48
La tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa ha
permitido incrementar la disponibilidad de marcadores
moleculares ... ........................... ............. .. ........... .. ......... 57
La tcnica de AFLP ha sido ampliamente empleada en la
caracterizacin de cultivares ......................................... 69
Restriccin-Ligacin .................... ............. .. ... ..... . 74
Pre-amplificacin o PCR Selectiva ..... .. ........ ... ... 77
Amplificacin Selectiva .. .................................... . 79
Objetivos ........................................ ................................ 81
Material y Mtodos Captulo 1. ................. ............ .. ............ ....... 83
Material Vegetal ....... .. ...... ..... .. ... ... ...... ... .. .. ...... ... .. .. ...... .83
Identificacin molecular de la especie mediante
marcadores gnicos ...................................................... 84
Diseo de primers para la amplificacin selectiva del
marcador molecular ...... ................................................. 88
Anlisis de identificacin molecular mediante software de
anlisis filogentico .. ............. .. ... ......... ... .......... ... .... ... ... .95
Caracterizacin molecular mediante AFLP ...... .. ........... 99
Comprobacin de idoneidad del ADN ................ " .... ... 101
Restriccin-Ligacin .......................................... 102
Pre-amplificacin. ...... ...... ....... ............. .............. 105
Amplificacin. ............ ...... .. ..... .. ..... ...... .. ..... ....... 106
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
ndice General
Identificacin de los especmenes cultivados en Panam
...................................... ............................................... 100
Caracterizacin de Kappaphycus y Eucheuma de otros
cultivares ...................................................................... 111
Anlisis in si/ico ............................................................ 112
Clonacin y secuenciacin de fragmentos de AFLP.
Bsqueda de un marcador gnico de inters .............. 114
Tai/ing ................................................................ 115
Ligacin ............................................................. 116
Transformacin. ............................................... . 117
Seleccin de transformantes .... ... ............. ........ . 120
Bsqueda de un marcador gnico de inters. .. 128
Resultados Capitulo l ............................................. ................ 131
Caracterizacin molecular media nte rbcL .......... .. .. ... ..131
Caracterizacin molecular de Kappaphycus alvarezii de
Panam mediante la tcnica de AFLP ........................ 135
Comparacin del perfil de AFLP de la especie de
Pana m con fas de otros sitios .. .................................. 139
Bsqueda de un marcador gnico de inters ..... ......... 147
Discusin Captulo I ............................. .. .......... .. ........... .. .. ..... 151
Identificacin molecular. La especie cultivada en
Pana m es Kappaphycus alvarezii.. ............................ 151
Caracterizacin molecular de los cultivares de Panam
mediante AFLP nos permite distinguir diferencias sutiles
.... ................................................................................. 159
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez .- - - - - - -
ndice General
Identificacin de los especimenes cultivados en Panam
y de otros sitios ............. .............................................. .167
ndice General
conducentes a la obtencin de hidro coloides con
propiedades gelificantes ................................... 176
Las algas marinas tambin producen gomas o
hidrocoloides. El cido algnico, el agar y el carragenano
son los de mayor importancia comercial ..................... 178
El carragenano es otro hidrocoloide parecido al agar,
que genera mayor volumen de ventas ........................ 182
Caractersticas del carragenano del gnero
Kappaphycus ............................................................... 189
Diferentes mtodos de anlisis estructurales de los
ficocoloides nos permiten conocer en detalle sus
propiedades de pureza, cantidad y calidad tales como
los colorimtricos, cromatogrficos, espectro mtricos y
espectroscpicos ....................... .. ....................... .. ....... 191
La tcnica de espectroscopia infrarroja (IR) ha sido una
herramienta muy til para el anlisis de ficocoloides en la
industria ..................................... .. ................................ 196
Objetivos ......................................................................201
Material y Mtodos Captulo 11. ............ ..... .. ........... .. ............... 203
Material Vegetal ........... ............. ... ................................ 203
Extraccin y cuantificacin del carragenano ............... 203
Mtodo de Fostier et al. (1992) (alcalino y natural)
ndice General
Mtodo de Freile-Pelegrn et al. (2006)
(modificado) ....... ............................................... 207
Mtodo combinado de Fostier & Freile-Pelegrn
......................................................................... 2W
Valoracin cualitativa del carragenano ....... ....... .......... 209
Resultados Captulo 11 ............ ............. ... .......... .. ........... .. ....... 213
Extraccin y cuantificacin del carragenano ...... .. ...... 213
Valoracin cualitativa de carragenano ......................... 214
Discusin Captulo 11 . .......................... ................................... 219
Factores que influyen en la productividad y calidad de
los ficoloides ................................................................219
Valoracin cualitativa del carragenano mediante
espectrometra infraroja ...............................................239
Conclusiones ............... ......... .. .. ... ....... ... .. .... .. .. ... .. ..... ..245
Conclusiones ..................................................... .. ................. 247
Bibligrafa ................ .. ... .. ..... .. ..... .. .... .. ..... .. .... .. ..... .. .... .. ......... 249
Anexos ....... .. ........... .. ...................................... .. ......... .. .. ....... 289
Gua de uso rpido para el GeneMarker .......... ...........289
Gua de uso rpido para el GenAlex ................ .. ......... 295
ndice de Tablas
1.11
Componentes de
la
mezcla de
reaccin
de
ndice de Tablas
1.15
Componentes
de
la
reaccin
de
taiJing,
1.19
Reactivos,
soluciones
madres
volmenes
de soluciones para
la
ndice de Tablas
11.2
Detalles
de
los
mtodos
de
extraccin
de
dependiendo
de
los
diferentes
tipos
de
ndice de Figuras
Fig.
1 Produccin
Panam . A) Articulo tomado de la pgina web del MIDA, 1801-2011. B) Artculo publicado en prensa online por el diario
Panam Amrica fecha 3-4-2009 ........................................ 17
Fig. 4 Cultivos de "cottonii" en la poblacin indgena Ngobe
Bugle de Tierra Oscura, Bocas del Toro , Panam ... ....... .... 18
Fig.
5 Diferentes variedades de
Kappaphycus cultivadas
C)
Mtodo
hanging long fine, D) Mtodo multiple-raft long ..... ... .... ....... 21
Fig. 1.1 Evolucin de los marcadores moleculares ............. ..... 50
Fig. 1.2 El anlisis de RAPDs ...................................... .., .......... 59
Fig. 1.3 La reaccin de restriccin-ligacin ....... ............. .... ...... .76
Fig. 1.4 La pre-amplificacin de los fragmentos de ADN .......... 78
Fig. 1.5 La amplificacin selectiva ........................................ .... 80
Fig. 1.6 Secuencia Consenso, generada mediante Geneious
ndice de Figuras
Fig. 1.7 Esquema de' amplificacin del gen rbcL .................. .... 93
Fig. 1.8 Modelo de formato Nexus para introducir los datos en el
1.14
Condiciones
de
PCR
establecidas
para
la
de Kappaphycus alvarezii de
ndice de Figuras
refinidados.
Fuente:
eargill
Texturizing
Solutions ............................................................................189
e)
Espectrofotometro
FTIR
modelo
RS/1
cultivos
de
Kappaphycus
a/varezi
mediante
los
en
las
cuales,
han
encontrado
aplicaciones,
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - alimentos. Adems, los productos de las algas son utilizados
en la industria textil y de pinturas, para mejorar la consistencia
de los colorantes, pinturas y tintes (Bixler & Porse 2011).
Muchas compaas producen una gran variedad de productos
de talasoterapia basados en algas, los cuales incluyen sales y
burbujas de bao, champ , geles, jabones, exfoliantes faciales,
mascarillas corporales e hidratantes (Turan & Neori 2010).
Tambin son utilizadas en el tratamiento de aguas residuales
por su capacidad de absorber nutrientes, metales, pesados
tales como el zinc y el cadmio (Gellenbeck 2011). En dcadas
recientes se han utilizado las algas como biocombustibles en la
produccin de biogs y bioetanol (Notoya 2010, Yanagisawa et
al. 2011). Yen medicina, se han reportado especies de algas
con actividad antileishmaniasis (Freile-Pelegrn et al. 2008) y
tambin presentan actividad anticoagulante (Farias et al. 2000),
antioxidante (Souza et al. 2012) y antiviral (Wang et al. 2007).
Sin
descontrolada,
embargo,
condujo
la
a una
explotacin
cada
intensiva
significativa
de
y
las
estructural estables
naturales.
Teniendo
en
cuenta
estas
estas
poblaciones
naturales
sin
que
se
afecte
su
ecosistema .
Las algas son ampliamente cosechadas a partir de
mantos o bancos-beds- de fuentes naturales que a menudo
son comunidades monodominantes. Por ejemplo, Ahnfeltia
cu~ivo
Gracilaria,
Porphyra,
Eucheuma/Kappaphycus,
Gigartina,
Hypnea,
Sargassum,
Cystoseira,
el
establecimiento
de
granjas
productivas,
la
las
de
la
pesca
artesanal
como
medio
de
cu~ivan
cu~ivo
en tanques
- - - - - - - - - Introducc in Gene ra l
ti
~
.-""....,.,
..........,.-
, ---, ----
..
_w_-_..
--
.,.,.......-.,.....;;.
r_ _.
_ _
~.
---
""..........
ZOlO
Macrocystis
encuentran
pyrifera ,
Gelidium
robustum ,
filiformis,
Halymenia
floresii,
Eucheuma
isiforme
Dentro
de
las
encuentran
Gracilaria
tenuifrons,
Hypnea
especies
cornea,
explotadas
G.
caudata,
musciformis,
Porphyra
en
Brasil,
se
Gracilariopsis
spiralis,
P.
de
la
especie
carragenofita
nativa
Hypnea
crispata,
Mazzaella
laminarioides,
Gigartina
skoffsbergi,
Callophyllis
variegata,
Mastocarpus papilltus
Chondrus
11
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
12
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - -
MarC8nbe
,~
a:
"
8"
'.
[ OOcano Pacifico
....
"...
e tivare Qe a
Por su
13
- - - - - - - Claudia Massief Prez Gonz/ez - - - - - - -
importancia
en
el
Caribe
uno
en
el
Pacfico ,
para
posteriormente
para
la
construccin
del
interocenico
canal
francs,
en
el
Caribe
panameo,
son
los
parmetros
experimentales
de
algas,
los
cuales
fueron
Introduccin General - - - - - - - - como resultado una alta productividad en la zona del Caribe
panameo.
Adems
de
parmetros
ptimos
para
establecer
que
el
las
cultivo
condiciones
mantenga
y
una
Panam,
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - - -
20
toneladas
Eo
OE
e_. c-.
"1"II' ~E N .U!No:IllEII~~
~ l"""""""AS
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - -
no
ha
tenido
la materia prima
tanto
xito
octubre-2011-volu.shtml ).
18
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonz/ez - - - - - - -
del
cultivo
de
la
especie
comercial
Eucheuma
que
denticulatum,
conocida
como
por
ao.
Los
principales
paises
productores
de
000, 38%),
(1
100
ton,
0.7"/0),
India
(400
ton,
0.2%),
19
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
Introduccin General - - - - - - - - -
K.
20
Claudia Massiel Prez Gonz/ez - - - - - - -
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - -
21
tanto
la
calidad y
cantidad
de carragenano
estn
son
inmediatamente vendidas
con
contenidos
de
22
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
se
presenta
normalmente
cuando
el
cultivo
23
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
Hawaii,
pertenecientes a K.
forma
un
grupo
separado
alvarezi de Venezuela,
de
las
Tanzania y
24
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
autores
como
Titlyanov
&
Titlyanova
(2010)
no es si la
La
principal
bio-invasin es causada
por
25
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
un
rendimiento
fotosinttico
inversamente
(descritas
como
alpha,
beta,
gamma,
iota,
27
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - -
E.
sect. Eucheuma
(Tipo:
Eucheuma
denticulatum
Seccin
Seccin
Seccin
Eucheuma
Anaxiferae
Gelatiformia
Cot!oniformia
(iota)
(iota)
(kappa)
(kappa)
E. gelatinae
E. alvarezi
E. denticulatum E. arnoldi
E isiforme
E. striatum
E. uncinatum
28
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
con
ramas
determinadas
por el crecimiento
laterales como
espinas, y comprende:
Indonesia,
Sabah,
Filipinas,
Nueva
Caledonia.
Introduccin General - - - - - - - - -
Introduccin General - - - - - - - -
K.
procrusteanum
(Kraft)
Doty
(Basinimo:
E.
alvarezi varo
alvarezi con
31
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
Introduccin General - - - - - - - - -
Eucheumatoides,
objetivos:
i)
generar
carragenano , ii)
se
centran
alta
adems
en
principalmente
productividad
de
altas tasas
y
de
calidad
dos
de
crecimiento
32
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
alvarezi var
tambalang.
sostener
los
propgulos,
para
proveer
ii) un
mejora
garantizar,
un
de
futuro
las cepas,
brillante
de
para
esta
la
manera
industria
se
del
33
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
las
cuales
han
permitido
en
clarificado
las cuales,
la
los
34
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
35
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
INTRODUCCiN
--------~~--------CAPTULO I
marcadores
moleculares
pueden
ayudar
en
la
tanto
en
la
identificacin de especies.
Los
marcadores
moleculares
son
tiles
por
marcador,
las
pruebas
de
paternidad,
la
que
pueden
localizarse
en
una
regin
vez
cada
mas,
los
estudios
filogenticos
de los
la
alta
taza
de
substitucin,
permitiendo
el
taxonmicos
marcador
entre
las
SSU
para
especies
resolver
Eucheuma
problemas
denticulatum,
IJm
(multicelulares) . Se
en
algunos
considera
que
animales
la
metazoarios
mayora
del
ADN
mitocondrial en
(Alcntara
2007) .
Dentro
de
los
marcadores
especialmente
filo geogrficas
importantes
de
estructura
trazar
historias
poblacional
gentica
para
demogrficos
de
dispersin
entre
especies
(Alcntara 2007).
plantas superiores.
Cada
cioroplasto
contiene
varias
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - ADN . Por ejemplo, el alga verde unicelular Euglena puede
contener de 40 a 50 cloroplastos, por lo que la clula entera
puede contener ms de 500 copias del genoma del cloroplasto.
La enzima mayoritaria presente en estos orgnulos es la
Rubisco (ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa/oxigenasa) que
facilita el paso de la fijacin primaria del CO 2 en la fotosntesis.
Basndose en las caractersticas estructurales de esta enzima,
se puede dividir en dos formas distintas, conocidas como la
forma I y forma 11. La forma I consiste en ocho subunidades
grandes y ocho subunidades pequeas, las cuales podemos
encontrar en las plantas superiores, la mayora de las algas,
cianobacterias, y en la mayora de bacterias fotosintticas.
Mientras que la forma 11, solo consiste en subunidades grandes
las cuales podemos encontrar en algunos dinoflagelados y
algunas bacterias fotosintticas. En esta estructura cuaternaria
de la enzima, se encuentran los marcadores moleculares de la
subunidad grande
la determinacin filogentica
entre especies y en la
entre
varias de
las
reportados,
en
las
de
estos
especies
podemos
mencionar
Chlamydomonas
los
reinhardtii,
que
lo
hace
un
buen
marcado r:
es
totalmente
aislados
reproductiva mente
o/y
especies
identificar o
1400 pares de
proveen
muchos
todas
las
especies.
En
este
sentido
Provan
44
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - cuales, los primers universales por ejemplo utilizados en las
plantas no son vlidos en las algas:
i)
altos niveles de
en
las
divisiones
Chlorophyta
R hodo phyta.
ii)
tener
intergnicolintron
particularmente
bajos
porcentajes
en
genomas
en
los
genomas
de
ADN
algales,
cloro plsticos
cloroplstico
disponible
han
sido
de
45
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
Introduccin Captulo I
Tabla 1.1 Resumen de marcadores moleculares con sus
respectivas regiones de amplificacin en algas ,
Marcador
Especie
Secuencia
Referencia
Algas
Sherwood
eucarioti
AA 3')
& Presting
casy
2007
cianoba
AG3")
Molecular
23 s rDNA
cterias
Espacia-
Relacia
cox2 F (5'
Zuccarell o
dar cox2-3
nes
GTACC~CTTTDRGRRKDAAATGTGATGC
et al. 1999b
intra-
3')
especffi
cox3R (5'
eas en
GGATCTACWAGATGRAAWGGATGTC3')
algas
rojas
Espacia-
Kappa-
Zuccarello
dor
phycus
et al . 2006 .
Rubisco y
al. 1999a.
Mitocon-
Eucheu
driaJ cox
ma
2-3
Espacia-
Algas
dar Rubis-
rojas
co
Zuccarello
CTTCT ACAGACACAGCTGA3')
et al. 1999a
(rbcR2-M2)
(S'ATTTCACACAGGAAACAGCTATGACATGT
CAAATAATGGTAGTCCCCA 3' )
(2) F (5' TGTGGACCTCTACAAACAGC 3 ')
R (5' CCCCATAGTTCCCAAT 3') (Maggs el
al. 1992)
46
Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - - -
Introduccin Captulo I
Marcador
Especie
Secuencia
Referencia
Molecular
Espacia-
Algas
Kamiya et
dor
rojas.
al. 1998.
Ceramia-
Rubisco
les
EJ ultimo primer
Algas
Robba et al.
cox
rojas
2006.
3' y
GazR1 5'
ACTTCTGGATGTCCAAAAAAYCA 3' .
La regin espaciadora de Rubisco fue
amplificada utilizando:
RUB5 5' TGTGGACCTCTACAAACAGC .3' ,
Maggs et al. 1992.
47
Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - - -
moleculares
para
detectar
diferencias
marcadores genticos
poblacionales
bsicamente
se
2004).
Ambos
marcadores
pueden
tambin
ser
1995),
RAPD
"Random
Amplified
Polymorphic
de
estudio,
se
requieren
de
tipos
especificos
de
49
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
i
i
Mirisat"""",
:::1
50
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzfez - - - - - - -
aloenzimas (Alcntara
selectivamente
hereditarios,
neutras
para
se
cuantificar
2007) . En
su
utilizan
como
las
mayora son
frecuencias
marcadores
allicas
1966, cuantificando
la
variacin
gentica
en
las
52
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
para
determinar
la
diferenciacin
gentica
en
las
tcnica
tambin
detecta
polimorfismos
entre
segn
su
y luego se
movilidad
hibridan
electrofortica ,
con
sondas
una
especficas
de
las
secuencias
de
inters.
Adems
el
estudiada,
generalmente
bajos
niveles
de
55
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
(/)
'"
'"
'"
"O
(/)
..Q
(/)
Q)
Ti
:n'o"
a.
~
'"
.!,1
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0
~
Q)
'" E
a...c
Eo
01-
Oo(j
N",
..Q
"'::2:
:n~
'" eQ)
1-
ro
ro
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - En algas son muy pocos los estudios que se han
realizado de RFLP, Teasdale y colaboradores (2002) utilizaron
en su estudio patrones RFLP del gen rbcL, en especies del
gnero
Porphyra,
del
Noroeste
Atlntico,
como
mtodo
la
variacin
gentica
comparado
con
los
otros
58
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
,.",,,
" l . .. "
~ .. --~ <
'
~t!!".,!t
._.... _,
l''''''
o
',"">
'.
Vi"",""I:I<i" ""
! ~ fU'.P!l> por
Fig
1.2 El
anli~s
1.2) .
Los estudios de RAPOs en algas han sido exitosamente
utilizados
para
la
identificacin
de
especies,
estudios
variacin
gentica
entre
las poblaciones
de
Gelidum
considerable
de
diferenciacin
gentica
entre
las
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - Por otro lado, se han realizado estudios en algas pardas
como el de Billot y colaboradores (1999), en Laminaria digitata
en donde esta tcnica result ser til en los anlisis de
parentesco.
marcadores
codominantes,
como
por
ejemplo
los
microsatlites.
En
algas
verdes,
Prasad
colaboradores
(2009)
Las
secuencias
sencillas
repetidas,
SSRs
muchas
veces.
Los
microsatlites
tienden
dentro
de
regiones
codificadoras
no
microsatlites son
relativamente
repeticiones.
En
general,
los
microsatlites
ms
polimorfismo,
aunque
se
ha
detectado
consecuencia,
amplificados .
Esta
por el tamao de
tcnica
permite
los
detectar
62
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - Los SSRs tienen ventaja sobre los RAPDs debido a que
son codominantes, abundantes, con alto polimorfismo, y es
factible su semiautomatizacin, pudiendo ser identificados en
bases de datos. Sin embargo, los SSR requieren de mucho
trabajo, debido a que se puede analizar solo un locus a la vez,
al ser un marcador especifico de secuencia y requieren un
conocimiento previo, de las secuencias de ADN que flanquean
al segmento de inters. Para el diseo de primers, esta
condicin supone al mismo tiempo, una ventaja y desventaja,
puesto que Incrementa su especificidad, pero tambin su coste.
La aplicacin de esta tcnica en algas no es muy comn,
puesto que, se necesita conocimiento previo de la secuencia
del genoma, y en algas an hay mucho por determinar en este
tema. Sin embargo, en las que poseen gran inters comercial si
se han realizado algunos trabajos. Tal fue el caso de Gracilaria
el
colaboradores
alga
(2007)
desarrollaron
18
Shi
y sus
marcadores
de
64
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
gnica,
la
determinacin
de
secuencias y el
1.2) .
En
algas
marcadores,
por
se
han
ejemplo,
realizado
en
estudios
especies
con
como
estos
Porphyra
Otro
tipo
de
marcadores
son
los
STS
o STMS
definidos
como
sitios
etiquetados
por
la
"Sequence
Characterized
Amplified
Region" , son
metilacin,
MSAP
"methylation-sensitive
amplification
Despus,
los
fragmentos
son
ligados
los
extremos,
segmentos
de
ADN
por ltimo,
con
ocurre
amplificacin
primers especificas
de
diseados,
en
geles
de
poliacrilamida
software
como
simu~neamente
la
nucletidos
(lo
que
incrementa
significativamente
la
tcnica
ha
servido
tambin
para
el
diagnstico
de
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - et
al.
2004).
Otros
desaciertos
que
pueden
prevalecer
que
generan
perfiles
claramente
legibles
mediante
tcnica
y
se
ha
variacin
utilizado
para
somaclonal,
determinar
en
plantas
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - verdes, tales como Caulerpa taxifolia (Murphy & Schaffelke
2003) y Chlamydomonas reinhardtii (Werner et al. 2001). En la
primera, se llevaron a cabo estudios de relaciones genticas
entre localidades del Mediterrneo y de Australia. En la
segunda, se generaron marcadores de AFLP del locus mating
type de Chamydomonas.
En algas pardas, en el gnero Laminaria se han
realizado estudios con AFLP, para principalmente, estudios de
mapeo gentico (Yan et al. 2009, Liu et al. 2009, 2010). Otros
estudios realizados con AFLP en Laminara japonica (Yi et al.
2010) Saccharina japonica (Shan et al. 2011) Y Po/ste/sia
palmaeformis
(Kusumo
et
al.
2004)
se
realizaron
para
73
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
Restriccin-Ligacin
El
ADN
genmico
endonucleasas
es
incubado
enzimas
de
en
presencia
restriccin
que
de
dos
producen
Msel
son
altamente
especficas
aseguran
la
74
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
de
la
enzima
utilizada
pa ra
la
digestin,
Estos fragmentos,
por tanto,
no son
75
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
- - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - -
"two
steps".
El
protocolo
de
Applied
1.3.
A. El ADN
genm~o
fo fcoRI
re~tri(cin
EwRI
MsloI
::coRI
EcoRl
enz
ext
y para Msel:
5'GATGAGTeeTGAG TAA NNN3'
core
enz ext
La extensin
NNN
selectivos.
Pre-amplificacin o PCR-Selectiva
de
esta
base favorece
un
cierto
nmero
de
---------Introduccin Captulo I - - - - - - - -
Ad~p!.dorH
Coro Mili
Pr~-.ml>h~<UI'"
78
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
usando
ahora
primers
con
nucletidos
posteriormente en el secuenciador.
El producto de pre-amplificacin puede diluirse entre 10
Y 100 veces para evaluar la mejor dilucin en AFLP+3, esta
estrategia permite la reduccin considerable del smear y
obtener amplificaciones discretas de bandas . En definitiva, lo
que se consigue al amplificar solo aquellos fragmentos con la
secuencia extra definida (condiciones astringentes) es la
selectividad y reproducibilidad al mtodo.
Los productos amplificados son separados en
gel y el
--------Introduccin Captulo
1-------
Le /1.6
.
r61C
1
TGT '
"c.tI.-
80
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
cloroplsticos
mitocondriales
para
la
de
reproduccin
vegetativa,
de
clones
de
81
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
82
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez
------~
MATERIAL y MTODOS
--------~~--------CAPTULO I
83
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
molecular
de
la
especie
mediante
marcadores gnicos
apicales
de
las
muestras
frescas
con
de nitrgeno
tampn
CTAS
es
el
procedimiento
del
i3
84
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Tabla 1.3. Reactivos para la preparacin del bufferCTAS.
Soluciones
Contenido
CTAS
13 mercaptoetanol
continuacin,
se
aadi
el
mismo
volumen
de
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - otro volumen de CIA; se mezcl por inversin y se centrifug
bajo las mismas condiciones anteriormente descritas. Este
proceso se repiti
se
Finalmente,
el
Contenido
Tampn TE
10 mM Tris HCL
0.1 mM EDTA
(pH 8)
La
concentracin
de
ADN
fue
valorada
en
un
86
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - 260 Y 280 que permita, al tiempo, valorar la pureza del cido
nucleico. La integridad de la molcula fue tambin observada
en gel de agarosa (1 %) en tampn TAE 1 % Y 65 V. Las
muestras de ADN se almacenaron en el frigorfico a 4 C hasta
su posterior utilizacin.
Contenido
242g TRIS
57.1 mL AcOH glacial
100 mL EDTA pH 8 (0.5 M)
Agua Milli Q (enrazar hasta 1 L)
87
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Diseo de los primers para la amplificacin selectiva del
marcador molecular.
Dado
que
los
cebadores
reportados
concernian
identificaban
como
K.
a/varezi (AF481498,
(AF099695,
AF481499),
otra
como
K.
saco/
gnero
Eucheuma , E.
arno/di (AF099690),
E.
serra
- - - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Tabla 1.6, Cebadores o primers utilizados para la especie
cultivada en Panam ,
Marcador
Primer
Secuencia
Referencia
5'tatacttctacagacacagctga 3'
Kam ya et al .
molecular
Rubisco
rbcF1 '
rbc4*
1998
Subunidad
grande
Kamiya et al.
1998
(modificado)
MaggsF1 '
Maggs
~t
al.
~t
al.
1992
Maggs
1992
F2
5'ccacaaccaggtgttgatcc 3'
Iyer
et
al.
2005
R753
R 5'gctctttcatacatatcttcc 3'
Freshwater &
Rueness 1994
F7
pequea
RrbcS
R 5'gttctttgtgttaatctcac 3'
Freshwater &
Mitocondrial
cox2
5'gtaccwtctttdrgrrkdaaatgtgatgc
Zuccarello
3'
al. 1999b
Rubisco
5'aactctgtagaacgnacaag 3'
Gavio
&
Fredn cq 2 002
Subunidad '
Rueness 1994
cox3
R 5'ggatctacwagatgraaawggatgtc
3'
Zuccarello
et
et
al. 1999b)
89
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez
------~
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - Tabla 1.7. Secuencias tomadas de la base de datos del NCBI
para obtener la secuencia consenso.
Nmero de Acceso
GenBank
Especie
AF099690
AF099692
AF099693
AF481500
AF099696
AF099695
AF481499
AF481498
AF489871
AF099694
AF489870
AF489872
90
- - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - -
y Geneious
91
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
"
"
JO
,..,
''''
..,
' ''''
'"
!lO
'!lO
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IDO
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92
Claudia Massiel Prez Gonzlez
los
total
se
dispuso
en
las
microcolumnas
700
j..IL de Membrane
diluido
con
etanol
Wash
al
95%
Solution,
(segn
el
94
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
para
su
secuencia ci n
en
un
secuenciador
Using Parsimony;
95
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Swofford 2002), comparando las secuencias del gen rbcL
tomadas de la base de datos NCBI con nuestra secuencia
obtenida.
PAUP es un programa para anlisis filogentico que
implementa mtodos de parsimonia, mxima verosimilitud y
distancias, comparando secuencias, enraizndolas y evaluando
hiptesis. Para ello es necesario introducir secuencias similares
a la problema y secuencias externas o outgroups que permiten
comparar los taxones y enraizar lo rboles. Las secuencias
seleccionadas fueron Kappaphycus coffoni (Weber-van Bosse)
Doty ex P.C. Silva (AF099695, AF481499), Kappaphycus
alvarezi
var.
tambalang
(Doty)
(AF099694,
AF489872,
uncinatum
Setchell
&
Gardner
(AF099693)
Eucheuma
serra
Agardh)
J.
Agardh
(AF099692,
(J.
97
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
-- . ... -
.
......
_._
..
,,- ..
..-.
.....
....
. .
~ -~
_ .
I'\I~
__
.
._.
,
taxas
, ~
'''-
..
_.,. ",
0_ ... ...
-"
Listado de taxas
.. .
-.,.,-
E
~
"
._.
f lg I 8 MlXlelO de forrn ll Nexus paralrtrodlXlr los IlllOS en el
programa PAUP
""
100
a los fragmentos de
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - por ltimo, la amplificacin del producto preamplificado con los
primers selectivos. Finalmente
(Promega, WI USA) y
Sitio de corte
EcoRI
G' AATT
Tipo
C TTAA .. G
Msel
T"TA A
Corte frecuente
A AT .. T
100
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
digestiones
individuales
con
sus
tampones
~L
Msel
EcoRI
MsellEcoRI
MsellEco
(Buffer Eco RI
reaccin
(Buffer
RI)
Msel)
Msel
0.5
EcoRl
0.5
ADN
Buffer
BSA
0.2
H20DD
14.8-
16.3
Vol. Final
20
101
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
resultado
de
las
reacciones
de
digestin
se
Restriccin-Ligacin
Se
hizo
necesario
el
acondicionamiento
previo
de
los
y Msel tenan
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - El ADN fue digerido en presencia de las dos enzimas de
restriccin (EcoRI y Msel) y ligado con la enzima T4 ligasa
atendiendo a las indicaciones del fabricante con la adicin extra
de ATP a una concentracin final de 1mM .
Para soslayar los problemas de pipeteo , se prepar un cctel
previo o mastermixpor muestra a tratar (tabla 1.10) .
Solucin
0.1
0.2
0.1
0.05
0.2
0.1
0.2
0.05
1
103
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
Volumen de reaccin
AFLP
(Il L)
Mezcla de
Reaccin de
(10x)
adaptadores
NaCI (0.5M)
BSA (1 m9mL-1)
0.5
Msel adaptador
EcoRI adaptador
dATP (5mM)
2.2
Mezcla
de
reaccin
enzimas
ADN en H2 0
3.3
Volumen Total
11
104
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
Pre-amplificacin
han ligado
y otra 1: 8. La dilucin se
realiz con tampn TE (0.1 M). El resto de la solucin de preamplificacin puede ser almacenada a -20 oC si no se utiliza .
Se mezclaron cuatro
ligacin-restriccin con
~L
~L
~L
105
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
Primer
Msel-3 bases
TG/CAA
TG/CTA
TG/CTC
ACT/CAA
ACT/CTA
ACT/CTC
TG/CAG
ACT/CAG
ACT/CAT
10
ACA/CAC
11
TG/CAT
12
TG/CAC
13
TG/Cn
14
ACT/CAC
15
ACT/CTT
16
ACA/CAA
17
ACA/CTA
18
ACA/CTC
19
ACA/CAG
20
ACA/CAT
21
ACA/Cn
107
~L
~L
~L
a 1200 g. A continuacin se
hibridacin
elongacin.
La
108
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Este ADN fue cortado y ligado, pre-amplificado a una ratio 1/18
y amplificado en las condiciones ya descritas.
La ta bla 1.13 indica las muestras empleadas con su
acrnimo, su almacenaje y las combinaciones de primer
empleadas.
Tipo(*)
N de juego de Primer
B1
1,2,3,4,5,6
G1
7,8,9,10
G2
11,12,13,14,15,16
B2
17,18,19,20,21
F1
1,2,3,4,5,6
F2
7,8,9,10
F3
11 ,12,13,14,15,16
F4
17,18,19,20,21
Acrnimo
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - veces que se repite las mismas bandas en una misma muestra.
Consideramos fragmentos para nuestro anlisis a partir de 120
pb,
Y con
intensidad
de
banda
>
100
RFU
(Relative
Fluorescence Units).
Caracterizacin de Kappaphycus
y Eucheuma de otros
cultivares.
111
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
1.14.
Muestras
de
posibles
especmenes
de
Muestras
Tanzania
K. alvarezi
1,3,4,5,6
Filipinas
K. alvarezi
11 ,14,15,16
Indonesia
K. alvarezi
11 ,14,15,16
Filipinas
E. espinosum
11 ,14,15,16
Filipinas
E. cottoni
1,3,4,5,6
Mxico
K. alvarezi (Verde)
1,3,4,5,6
Mxico
K. alvarezi (Parda)
1,3,4,5,6
Anlisis in slco
posteriormente
analizada
mediante
coordenadas
113
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
Corporati on,
Madison
WI
USA), se
optimiz
------------ '
Tamao de l vector (Kb)
Madison
1M
USA)
pero
con
algunas
modificaciones.
114
- - - - - - Claudia Massiel Prez Gonz/ez - - - - - -
Tailing
El cctel de amplificacin procedente de la AFLP se
precipit
Tabla
1.15.
Componentes
de
la
reaccin
de
tailing,
Fragmentos precipitados
0.5
Agua
4.5
Volumen Final
10
115
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
ACT/CTT,
debido
que
eran
las
116
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
(~L)
Soluciones
Volumen
Reactivos
mezcla de
en
reaccin
2x Rapid ligation buffer 5
pGem-TEasy
Amplicn (tailing)
T 4 ONA ligase
H20 DD
Volumen final
10
a 2
2 minutos en hielo.
~L
Finalizado este
Contenido
Medio Soc
2.0 g Bacto-Tryptone
0.5 g de Bacto- Extracto de Levadura
1 mL 1M NaCI
0.25 mL 1M KCI
1 mL Soln. Mg'+
1 mL Soln. Glucosa
soluciones de Mg
y glucosa 2M fueron
preparadas y
se
prepar
con
Bacto-Tryptona
(Sigma),
Bacto-
Contenido
Medio LB lquido
10 g. Bacto-Tryptona (Sigma)
5 g. Bacto-Extracto de Levadura
5 g. NaCI
pH 7 (ajustado con NaOH)
Agua Milli Q (enrazar 1 litro)
Medio LB slido
15g. agar
119
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
se
se extendi
Seleccin de Transformantes
120
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
el
gen
JacZ
plasmdico
impide
la
complementacin .
del
cctel
de
nucletidos.
Los
primers
utilizados
121
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
e durante 3
122
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonz/ez - - - - - - -
1.19.
Reactivos,
soluciones
madres
volmenes
Solucin
volumen
Stock
en mezcla
reaccin(.JL)
Buffer
5x
5.0
MgCI 2
25mM
1.5
Cctel de nucletidos
10 mM c/u
0.5
M13 F
10.JgmL,1
0.25
M13 R
10.JgmL,1
0.25
100 U
0.125
17.0
Volumen final
24
2 mL. A continuacin
se
123
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
destilada y estril.
La reaccin de
124
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Tabla 1.20. Reaccin de restriccin con la enzima EcoRI para el
plsmido transformado. Mezcla de soluciones para la digestin
del plsmido purificado con la EcoR 1.
Soluciones
14.3
2.0
BSA 10 mgmL- 1
0.2
Plsmido transformado
3.0
0.5
Volumen final
20
Primer Secuencia
Sp6
T7
M13F
Fragmentos
de AFLP
'V'-"
Insercin (Llgarion)
Tailfng
-~
I GEN
Transformacin bacteria
BACTERIA
E, coli
BACTERIA
E. co/ ..
PLSMIDO
- O
PLSMIDO
Crecimiento bacteria
+ GEN
Lisis Bacteria
OO ~
~
aquellos
fragmentos
de
tamao
Estos
fragmentos
amplicones
fueron
se
tBLASTn)
Para la bsqueda en
resu~ados
sus
respectivas
secuencias
(tabla
1.22),
se
128
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
"
A TC
,~
1 ~
C TAT TC AT
""
'le
l~
Jm
""
,m
,~
TT A TCC
m
J~
A A TTTT
T C CT A '
~,
"0
""
,~
T TCAAATT
CC CACTTTCCC TTCC
TCCACCATAC A
T A TTCC A TACT
,~
TTCCT
A CATAA A TT
CA CT AA C'I'
,~
AT CTT ATTTTTA
TCATA CT
J~
C '1'
CA CC T CA TTTTT AAATA
I~
,.,
,~
C TT
"0
,~
I~
' A A CTT ~ C A T
,~
TCCTTC A TA T
TTCT A
~o~'
P1
P2
P3
P4
F4
5'ccctttctgatcgtccttca 3'
R1
F1
5'tttctcctcgactgttctaggg 3'
R2
F2
5'tgaaaccaacctcgaatacaaa 3'
R3
F3
R4
129
Claudia Massiel Prez Gonz/ez
RESULTADOS
--------~~--------CAPTULO I
_ _ _ _ _ _ _ __ Resullaoos CaphJO I - - - - - - - -
g,ande
clo,opl\s~n
loa BSIIedmSMIi.
ollgol de la IlUbunidad
,~v el
un fragmento de aproXImadamente
c ~ . nd o
(N CB ~
rbcL Escalera
_______
'"
CS'daM~IAlrvlG"'lalll -------
grande
citocromo
oxidasa
y
de
pequea
la
c1oroplstica
regin
como
mitocondrial
de
(cox)
la
no
amplificaron.
su
prediciendo
que
132
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
- - - - - - - - - Resultados Captulo I - - - - - - - -
del
NCBI
como
Ribulosa
1,5
bifosfato
descarboxilasa
- - - - - - - - Resultados Capitulo I - - - - - - - -
~A n
~8.1QtL
BN.
t A3;1"
J;.."t* -...:a1'TTbTAIA
,~
r:
'.
E&%
Wi_
OJO
I,A! C1A,!
...
...
. .,
a.L.:.:; IbMIA..;b.K..rM
'"
Los
restantes
parejas
de
primers
presentaron
una
Analizando el
electroferograma
generado
por cada
136
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
Resultados Captulo I
Tabla 1.23. Test reproducibilidad de las 21 combinaciones de
primers de AFLP en Kappaphycus alvarezi de Panam.
Primer Combinacin N' de %
EcoRl/Msel
Alelas
Re~roducibilidad
TG/CAA
19
100
TG/CTA
31
50
TG/CTC
21
88
ACT/CAA
19
100
ACT/CTA
19
100
ACTlCTC
20
100
TG/CAG
16
100
ACT/CAG
17
97
ACT/CAT
17
100
10
ACAtCAC
20
100
11
TG/CAT
22
86
12
TG/CAC
30
50
13
TG/CAC
31
50
14
ACT/CAC
19
100
15
ACTlCn
19
100
16
ACAtCAA
19
100
17
ACAtCTA
31
49
18
ACAtCTC
25
65
19
ACAtCAG
20
85
20
ACAtCAT
19
89
21
ACAtCn
17
100
Rango
de ~b
%
Polimorfismo
119565
119568
119568
120568
120568
119568
120546
120552
119562
119562
120571
119573
120573
120570
120570
121565
120566
119560
119560
119562
119560
13.7
9..8
11.7
6.3
15.3
18.3
13.9
12.3
17.5
18.3
13.7
15.0
12.0
12.6
10.9
22.7
16.4
13.4
18.0
13.1
17.2
137
Claudia Massiel Prez Gonzlez
Resultados Captulo I
Tabla 1.24. Alelas generados a partir de las 16 combinaciones de primers.
f'li me'
Combina C1 n
EcaRIMsel
t-f'deAleos
IG/CM
19
119" 121 , 124 , 127 , lJ9, 162 , 12.5 , n i, 2'1J, 239, 277, 323 ,375 , 4i3., el, A/4, 520, 558, 5')5.
TGrCTC
"
119, 122, 125, 12E, 139, t&3, 185,221, 23J, 240 ,- 278 , 324,370, 414, 425 , 475, 521,523,593,566,588
""<:AA
18
ACT.cTA
'9
119 , 122,125,128,1 39 , 163, 185 , 222, 231,240 , 271l , 324, 377 ,414 , 425 , 47'6 , 522,559, 5ffi
ACTKTC
'"
119,121 , 124 , 126,128, lE, 163, 185, 222, 231 , 240 ,278,325,377,41&, 426,477,523, 56, 56B
TG/CAG
'fr
ACT,\)AG
-1,
1:J] , 122, 134 , 157 , 178 ,214,223,231, 269 ,3 14, 3>5,, 402 , 4 12,462, 507 , 544,552 .
ACliCAT
"
119,122,134,157,1 Ta, 223, 232, 270, 315, R, 403 , 4 14, 454, W , 540 , 553, 552..
f9
ACMe N:;
'"
119,121,123,134,157,1 78 ,214,223,232,269" 314, :E5, 402 , 41 0 , 413, 463, al, 545, 553, 552
"
TGiCAT
"
"
ACTrI':AC
19
1::!J , 122, 125, 128, 139, 102, H)4, n1 , 23] ,D3, 278 , 324, 377,415,428 , 478,524, 562, 571J
ACTKTT
f9
~ 1 n'3,~m'R,.m ro rumllim.mmm~_
"
ACA/CM
f8
121,125 , 128 ,140,153.. 185 ,221,225,231,239,27'8,325,378 , 401 , 415 , 428 , 478, 525, 563
18
ACMCM:;
"
119,122,1 34 ,155,179,214 , 223,233,271, 3 16,3'.'l, 4(J), 410, 468, 512 , 514 , 550, 552 , 557 ,.559
'"
ACNCAT
1,<
"
ACAiCTT
"
119,122,134,157,178 ,214, 223, 233,271,317 ,::69,407 ,41 7 ,469 , 514 , 552, 5130
138
Claudia Massiel Prez Gonzlez
Kappahycus y
139
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
Resultados Captulo I _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __
Tabla 1.25 Alelas o bandas generados en las distintas muestras de Kappaphycus y Eucheuma.
N de
primer
Poblacin
N de
Alelas
Mxico
Parda
18
Mxico
verde
17
Tanzania
19
E. cottonii
20
Mxico
Parda
17
Mxico
verde
17
120.123.133.156.177. 213. 221. 230. 267. 312. 362. 399. 409. 458. 503. 539. 546.
Tanzania
20
E. cottonii
20
140
- - - - - - - - - - - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - - - - - - - - - - -
Resultados Captulo I _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __
N de
Primer
Poblacin
Mxico
Parda
Mxico
verde
17
Tanzania
21
123,126,128,130,133,136,147,172, 194,232,241,250,289,335,390,428,440,493,
540, 580, 588.
E. cottonii
19
Mxico
parda
17
Mxico
verde
17
Tanzania
20
E. cottonii
19
N de
Alelas
141
- - - - - - - - - - - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - - - - - - - - - - -
Resultados Captulo I
Nde
Primer
Poblacin
Nde
Alelas
Mxico
parda
19
120,123,134,156,177, 213, 222, 230, 268, 312, 364, 401, 411, 465, 505, 542, 549, 550,
555.
Mxico
17
120,123,133,156,177, 213, 221, 230, 267, 312, 363, 400, 410, 460, 505, 541, 549.
Tanzania
21
E. cottonii
19
E. spinosum
21
Indonesia
21
120, 122, 124, 128, 131, 141, 166, 188, 223, 232, 242, 280, 325, 378, 416, 426, 477, 524,
562, 568, 570.
Filipinas
21
E. spinosum
20
120, 122, 124, 127, 130, 141, 165, 187, 223, 232, 241, 280, 325, 378, 416, 426, 478, 524,
563,570.
Verde
11
14
142
- - - - - - - - - - - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - - - - - - - - - - -
Resultados Captulo I
N de
Primer
15
16
Poblacin
N de
Alelas
Indonesia
20
Filipinas
21
E. spinosum
20
Indonesia
22
Filipinas
22
E. spinosum
19
Indonesia
20
119, 122, 124, 127, 130, 140, 164, 186, 222, 231, 240, 278, 323, 376, 413, 423, 475, 521,
559,567.
Filipinas
20
121, 123, 125, 128, 131, 141, 166, 188, 223, 232, 242, 280, 325, 377, 415, 426, 477. 523,
562,569.
143
- - - - - - - - - - - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - - - - - - - - - - -
de
las
muestras de
Kappaphycus
de
Panam,
especies
muestras,
determinndose
que
la
Eucheuma
de
otras
procedencias.
Los
tambin
se
clasifican
en
dos
agrupaciones,
144
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
146
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez
------~
0.5:
(inserto :
vector) .
Entre
los
hndicaps
aquellas
148
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
- - - - - - - - Resultados Captulo I - - - - - - - Tabla 1.26. Genes propuestos por el BLAST por su similitud a la
secuencia introducida. Dicha secuencia es el
resu~ado
del
149
- - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - -
DISCUSiN
--------~~--------CAPTULO I
muchas
se
conocian
por
su
notable
variacin
el
costo
de
asumir
las
diversas
formas
esta
plasticidad
unida
las
tcnicas
de
morfolgico,
entre
como
la
electroforesis.
151
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
aplicacin
de
estudios
moleculares
en
la
------~
As ,
Pareek
sus
colaboradores
(2010)
ms
apropiados,
debido
que
ambos
son
de
conservacin,
la
resolucin
de
los
arboles
Otros
autores
consideran
la
regin
espaciadora
este
sentido,
Kurihara
colaboradores
(2010)
155
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - utilizaron secuencias del gen SSU y LSU rRNA en un estudio
de evolucin de las algas rojas parsitas (Ceramiales), y
encontraron una baja tasa de evolucin en ambas secuencias ,
por lo que concluyeron, lo difcil que es distinguir especies
cercanamente relacionadas, con este marcador.
en
el
anlisis
del
rbcL
gen
para
la
familia
colaboradores
(2003),
utilizando
el
gen
rbcL ,
cottonii,
eran
caractersticas
idnticas
morfolgicas
pesar
de
hbitat
que
presentan
completamente
156
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
Otros
autores
como
Baamonde-Lpez
cu~ivos
de algas
157
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
Esta
identificacin
molecular de
los
cultivares
de
158
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
~g
El
anlisis se
realizaria
fundamentalmente
disponibilidad
sobre
muestras secas
la
considerando
accesibilidad
al
mayor
material
seco
de
trasladar este
material
al
lugar de
- - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - 2010) donde realizaron diferentes mtodos para extraer ADN
de calidad de material seco. En nuestro caso, con el mtodo de
CTAS obtuvimos un buen ADN, al igual que Kusumo et al.
(2004); Yang et al. (2009) en Laminariales, y Murphy &
Schaffelke (2003) en algas verdes.
Si bien es cierto, la mayoria de los autores que han
utilizado AFLP en algas, han partido de material fresco. Sin
embargo, en estudios de AFLP en plantas superiores, utilizan
muestras
de
material
seco
(hojas)
en
especies
como
material
seco
puede
estar
asociado
ADN
obtuvieron
buenos
identificacin filogentica
resultados
en
de esas especies.
la
correcta
Por lo que
en
los
perfiles
de
AFLP.
Por
ejemplo,
la
EcoRllTrul
Para
diferenciar
los
perfiles
generados
por
una
(Msel),
ii)
las
caracteristicas
genmicas
del
organismo en estudio.
El genoma de los vertebrados es rico en secuencias no
codificadoras compuestas mayoritariamente por nucletidos A
162
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez
------~ .
algo
menor, generando
fragmentos
con
una
permite
requieren
sitios
de
alineamientos
menos
nuestro
caso,
utilizamos
primers selectivos
de
tres
para
llevar
cabo
el
estudio.
Si
bien
no
existen
Por ejemplo
se
expresa
para
estudios
de
solo
en
individuos
(Bonin
et
al.
2007).
En
225
especies
Saccharina japnica
de
para
Grateloupia
determinar
solo
lanceola.
la
Con
diversidad
por lo general,
nmero de
166
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
respecto a
superiores .
secuenciacin
masiva
Las
se
nuevas
espera
tecnologas
que
ofrezca
como
mejores
169
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
la
especie
cultivada
como
Kappaphycus
3.
4. El
anlisis
gnico
mediante
GenAlex
revela
sutiles
170
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -