Ao de la Diversificacin Productiva y del

Fortalecimiento de la Educacin
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
CIENCIAS AGROPECUARIAS
INGIENERIA AGROINDUSTRIAL

Curso: Biotecnologa de los Productos Agroindustriales

Ciclo: IX

GUADALUPE-PERU
2015

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

DETERMINACION DE BIOMASA
I.

INTRODUCCION

La biomasa es la cantidad de materia viva producida en un rea

determinada de la superficie terrestre, o por organismos de un tipo
especfico, en este caso los microorganismos, siendo una variable
ecolgica importante porque representa la cantidad de energa
almacenada en un segmento partculas de una comunidad biolgica.
La determinacin de la biomasa es una de las variables ms
importantes en un bioproceso, porque su determinacin nos lleva a la
comprensin de la eficiencia del mismo. Muy til para establecer las
tazas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los
balances dems de cualquier proceso biolgico.

II.

OBJETIVOS
Determinar la concentracin de clulas por conteo en cmara Neubauer.
Expresndolas en unidades de clulas/mL.
Reconocer la tcnica de contaje en Cmara Neubauer.
Determinar la biomasa de una solucin celular desconocida mediante el
mtodo de turbidimetra.

III.

FUNDAMENTO
Biomasa es un trmino general que se refiere a los microorganismos presentes en
un sistema. A la vez tambin se puede referir como la cantidad de clulas, de
personas o masa de seres vivos. El objetivo de la biomasa es la reproduccin de
clulas.
La determinacin de biomasa es una de las variables ms importantes en un
bioproceso, ya que su determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia
del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de produccin,

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de consumo de nutrientes y el clculo de los balances dems de cualquier proceso
biolgico. Una variedad de anlisis estn disponibles para la determinacin de
Biomasa de muestras biolgicas (en nuestro caso de la levadura Saccharomyces
cerevisiae).
Para determinar la biomasa es necesario calcular el nmero de clulas en una
determinada muestra. Esto es importante en ciertas circunstancias; por ejemplo,
para determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere cuantificar
los microorganismos en esos productos. Los mtodos para estimar el nmero de
microorganismos pueden medir la cantidad de clulas, la masa celular o la
actividad celular. Los mtodos que cuantifican la cantidad de clulas son tiles
principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras
los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los
microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difcil
cuantificar las clulas individuales.
A. Mtodos directos de determinacin de biomasa: Se basan en el nmero de
clulas o en el peso celular, dentro de estos mtodos podemos distinguir a los
siguientes:
1. Mtodos gravimtricos (Peso Seco)
La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en
trminos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como slidos en
suspensin totales (SST) o slidos en suspensin voltiles (SSV). Las clulas se
separan del lquido bien por centrifugacin bien por filtracin. Se expresan en
g.m.s/mL.
La principal desventaja de estas tcnicas es que su determinacin incluye no slo
microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte,
polmeros extracelulares y materia orgnica adsorbida. Adems, no puede
aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los mtodos
gravimtricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco
reproducibles.

2. Mtodos espectrofotomtricos.

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Se basan en la existencia de una relacin directa entre el nmero total de
microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la
determinacin

de

la

turbidez

de

la

suspensin

celular

mediante

espectrofotometra, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin

embargo, antes de utilizar la turbidez como mtodo de recuento, hay que realizar
una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscpicas, por
recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. Esta recta
contiene datos sobre el nmero de clulas, permitiendo la estimacin de tal
parmetro a partir de una sola medida de la turbidez. Se trata de mtodos
rpidos, Pero de baja sensibilidad y que presentan problemas de calibracin (tipo
de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partculas.

3. Mtodos microscpicos de recuento celular en cmaras

Existen diversos tipos de cmaras para el recuento de microorganismos
tales como la cmara de Neubauer. Thoma, Brker, Ttirk, Fuchs-Rosenthal,
Mal assez, Petroff H ttrser, etc. El recuento de microorganismos se realiza
en la cuadrcula central de la cmara y se multiplica por la profundidad,
obtenindose el nmero de microorganismos por unidad de volumen
(nmero de clulas/ml, generalmente).
El recuento de microorganismos en cmaras no es un mtodo muy exacto
debido a las irregularidades en la distribucin de la muestra. Adems,
pueden confundirse las clulas con otras formas orgnicas e inorgnicas
existentes en el medio y no permite distinguir clulas vivas de clulas
muertas.
a. CMARA DE NEUBAUER. Es una cmara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en
la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos
lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L
corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos
est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre
con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el
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volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
milmetro cbico, es decir 0.1 micro litro.
Si contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x clulas
entre las cuatro reas, la concentracin en la suspensin celular ser:
concentracin en la suspensin (clulas / mL) = 10000 (x/4).

Conteo en cmara de Neubauer, Esta cmara se utiliza para conteo celular.

Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, este
debe quedar centrada.
Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en
la distribucin de las clulas. Es recomendable llenarla con micro pipeta
pequea o con una jeringa ya que la cmara se llena con una gota. El
llenado debe ser continuo en un solo intento.
La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas
del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe
inundar, la apariencia en la cmara es de lquido abundante en las
terminaciones del recuadro.

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Figura 1. Conteo por Cmara Neubauer. Representacin de la cuadricula 10 X.

En la figura 1, si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras,
bacterias, etc., debemos ubicarnos en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X.
En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las clulas
presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el
central, lo que garantiza un conteo aleatorio.
B. Mtodo por Turbidimetra
La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de
una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y
experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de
bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma
absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en
soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco,
independientemente del tamao celular del microorganismo.
Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC
(Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas
son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales
o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe
realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de
esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de
microorganismos totales o con UFC.

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Figura 2. Absorbancia en funcin del Peso Seco

C. K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del
peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor
de la absorbancia (1/W0).
D. Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso
seco (g/ml-mg/ml).
La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para
suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una
absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de
Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar
un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.

Figura 3. Absorbancia enFigura

funcin4.del
Absorbancia
Peso Secoen funcin del Nmero
de Microorganismos Totales

IV.

METODOLOGIA
a. Materiales y Equipos
Levadura Saccharomyces cerevisiae
Cmara Neubauer
Jeringa

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Laminilla cubreobjetos
Lmina Portaobjetos
Tubos de ensayo
Microscopio
Espectrofotmetro

b. Metodologa
Mtodo directo (Cmara de Neubauer)
Con una jeringa se tomar una cantidad de la solucin previamente
preparada la cual se encuentra en un tubo de ensayo en dilucin a la 10

-1

se dejar caer unas gotas en la cmara de Neubauer.

Se colocar la laminilla cubreobjetos sobre el portaobjetos en la zona

central, para apreciar una zona cuadriculada.

Con la ayuda de una jeringa se obtendr una pequea muestra del tubo de
ensayo, y se colocar en el borde del cubreobjetos. Se dejar que la
solucin ingrese a la cmara por capilaridad, sin que pase a los canales
laterales.
Una vez que la muestra ingrese por la cmara de Neubauer, se dejar
reposar, y posteriormente, se colocar en el microscopio.
Se realizar la cuantificacin de clulas en las zonas de los cuadrados ms
pequeos de 0.05 mm.

tomando precauciones para evitar contar dos

veces la misma clula u omitir alguna. Se contarn las clulas que estn
dentro de los cuadrados las que se noten bien y las clulas que estn en el
lado superior y lado izquierdo de cada cuadrado de 4 x 4.

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Luego de calcular las clulas en los cuadrados intermedios, extremos y los
determinados al azar, se deber calcular el nmero de clulas/ mL (por
cuadrado), y por medio de la siguiente frmula, se determin el nmero de
clulas por mililitro.
A la vez se deber calcular la desviacin estndar de las 25 celdas. Luego
tomaremos 5 celdas al azar de la cual deberemos calcular su variabilidad
(coeficiente) y su desviacin estndar para luego hacer una comparacin.

Mtodo indirecto
a) Para determinacin de turbidimetra

Se prepar una solucin acuosa con levadura, a partir de la cual se

procedi a preparar diluciones ( 4/5, 3/5, 2/5, 1/10, 1/30, 1/50, 1/100)

De la muestra original se tom 5 ml en dos tubos para determinar la

concentracin en peso seco y peso hmedo.

Para determinar la concentracin por conteo celular se tom una

muestra de la dilucin 1/100.

Con todas las diluciones y muestra original se procedi a colocarlas uno

por uno en celdas para leer la absorbancia en el espectrofotmetro.

Con estos datos se pas a realizar las siguientes graficas absorbancia
vs peso seco, absorbancia vs peso hmedo y absorbancia vs conteo
celular.

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Se prepar una solucin desconocida con la finalidad de determinar el

porcentaje de error (%Error), en la realizacin de la prctica, utilizando
los diferentes mtodos empleados.

Figura 5. Metodologa de Turbidimetra.

V.

RESULTADOS Y DISCUSIONES
a. Resultados de Cmara de NEUBAUER

Tabla 1: Conteo de Clulas en 25 celdas, en Cmara Neubauer

FILAS
1
5
7
9
13
17
19
21
25

NUMERO DE CELULAS EN CADA UNA DE LAS 25 CELDAS

22
33
33
38
39
32

21
34
30

33
33
33
32
27
42
31
24
30

34
37
29
37
36
39
34
35
36

40
33
32
39
32
30
29
42
43

42
36
46
36
51
29
28
38
36

29
35
34
34
38
25
32
35
33

40
32
30
32
31
36
26
32
23

32
39
22
33
33
31
20
31
26

PROME
DIO
34
34.75
32.375
35.125
35.875
33
27.625
33.875
32.125

Tabla 2: Concentracin de las clulas en las 25 celdas, Desviacin estndar y

coeficiente de Variacin

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Concentracin de clulas
=

Desviacin estndar
2.43197379

Coeficiente de variacin

DISCUSIONES
Segn Aquiahuati, (2004); la cmara de Neubauer permite hacer un recuento
superficial de las clulas de levadura, sin embargo no permite distinguir las clulas
viables de las no viables. Esto se puede contrastar en la tabla 1, en donde
observamos que hicimos un conteo de 25 celdas.
Segn Madigan, et al (1998), mediante el mtodo de conteo directo en cmara de
Neubauer se debe utilizar frmulas que expresen la concentracin de clulas,
mostrando diferencia a la utilizada para el recuento de levaduras en laboratorio.
Esto se observa en los datos hallados en la Tabla 2 donde determinamos la
concentracin de clulas, desviacin estndar y coeficiente de variacin en las 25
celdas.
Segn Rodrguez et al, 2005), los mtodos para estimar el nmero de
microorganismos medirn la cantidad de clulas. Los mtodos que cuantifican la
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cantidad de clulas son tiles principalmente para enumerar organismos como
bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden
utilizarse

para

incluidos

los

los que es difcil

individuales. Segn
nuestra
de

prctica

Sacharomyces

la determinacin de

CONCENTRAC
ION
0.01
0.02
0.1
0.2
0.25
0.33
0.5

ABSORBAN
CIA
0.205
0.422
1.503
2.177
2.313
2.48
2.755

todos los microorganismos,

hongos filamentosos, en
cuantificar

las

clulas

lo expuesto por el autor en

hicimos conteo de levadura
cerevisae por mililitro, para
su biomasa utilizando el

mtodo directo por recuento en el microscopio.

Segn Valencia (20019, la desviacin estndar es el promedio con respecto de la
media aritmtica, dice cuanto tienden a alejarse de los valores puntuales del
promedio en una distribucin. El coeficiente de variacin indica un mtodo de
comparacin de datos que tienen medidas de media diferentes o unidades
diferentes. Es as que en la tabla la desviacin estndar de las 25 celdas nos da
obteniendo una desviacin pequea indicando que los datos
estn agrupados cerca de la media.

b. Resultados de Turbidimetra

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Discusiones
Segn Gil (2003), el recuento de clulas por rea presentes en una solucin, su
coeficiente de variacin se encuentra dentro de lo aceptable si no hay mucha
diferencia significativa, ya que dentro de la determinacin de biomasa, su variacin
poda ser significativamente cuando es menor (CV= 12,3 %), indicando que la
exactitud de la determinacin vara con los laboratorios y el personal.

Segn Rodrguez, et al ( 2005), nos seala que para que sean visibles las trazas
de turbidez es necesario ms de un milln de clulas por ml., como para ser
medida por un espectrofotmetro. Por lo que la turbidimetra no es un mtodo til
para medir la contaminacin de lquidos para un nmero relativamente pequeo de
bacterias y o levaduras. Se comprob en la prctica con xito en el experimento ya
que tanto la muestra original analizada como la muestra problema sobrepasaban
dicha cantidad

VI.

CONCLUSIONES

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Se logr determinar la concentracin de clulas de la levadura Sacharomyces
cerevisae en las 25 celdas la que nos dio

clulas /mL gracias

a la cmara Neubauer.
Se pudo determinar el promedio de levaduras (Sacharomyces cerevisae)
contadas en las 25 celdas, por el mtodo de conteo directo, usando la cmara
de Neubauer, que es un mtodo eficaz para el conteo de dichas levaduras.

VII.

RECOMENDACIONES
Se recomienda calibrar bien el microscopio, con la finalidad de poder
observar de manera ms clara las levaduras, de esta forma
facilitaremos el conteo de las clulas.
Se debe agitar la dilucin a emplear (10-1), de manera homognea para
que esta se encuentra debidamente preparada y ser llevada
adecuadamente a la lmina portaobjetos.
Verificar que mediante el uso de la jeringa se pueda hacer un correcto
llenado de la muestra en la cmara de Neubauer.
Miraren el microscopio y contabilizar bien la clulas, las cuales no se
tomarn las clulas que estn la parte derecha del cuadro ni las de la
parte inferior del mismo cuadro, ya que ellas formaran parte del
siguiente cuadro.
Una inadecuada distribucin de la muestra sobre la superficie del
portaobjetos puede ocasionar serios errores.
Para obtener una muestra homognea se debe agitar la muestra antes
de colocarlas en las celdas y de esta manera evitar errores en las
lecturas del espectrofotmetro.
Calibrar el espectofmetro antes de tomar las medidas, ya que este
pudo haber sido utilizado con otras sustancias en experimentos
anteriores. Del mismo modo calibrar la balanza analtica par que
nuestro porcentaje de error sea mnimo.
El llenado en las celdas de la cmara de Neubauer se debe hacer
correctamente para evitar que se pierda parte de la muestra.
El llenado correcto de la muestra en la cmara, se debe realizar de
modo que no se derrame en la lmina cubre objeto la solucin. De esta
manera haremos el conteo.

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VIII.

BIBLIOGRAFIA
AQUIAHUATI
M. (2004), Manual de Prcticas: Laboratorio de
Microbiologa Celular, Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad
Iztapalapa, Departamento de Biotecnologa, 1era Edicin, Pg. 63-68.
ARNIZ,C., ISAC,L. LEBRATO, J. (2000). Determinacin de la biomasa
en procesos biolgicos. Sevilla-Espaa.

GIL, E. (2003). Elementos clave en la uniformidad de distribucin

de abonos. Escuela superior de agricultura de Barcelona.
MADIGAN M. et al (1998). Brock Biologa de los microorganismos
Octava Edicin, Prentice Hall, Espaa, P. 155 156.
Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Departamento de Biotecnologa,
1era Edicin, Pg. 63-68.
RODRGUEZ, E., GAMBOA, M., HERNNDEZ, F. GARCA, J. (2005).
Bacteriologa General: Principios y prcticas de laboratorio. Editorial
Universidad de Costa Rica.
SILVA, C., GARCA, J. (2004). Manual del Tcnico Superior de
Laboratorio de Anlisis Clnicos. Editorial MAD, S.L. Sevilla.
UNAM, (1986); Biologa Celular, Manual de Prcticas. Departamento
de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad autctona de Mxico.
Pg. 20 28.
VALENCIA, H. (2001). Manual de Prcticas de Microbiologa Bsica.
Universidad Nacional de Colombia. 2001

ANEXOS

Las ventajas de este tipo de recuentos de Conteo, son el equipo sencillo y escaso
que se requiere, la rapidez para obtener los resultados y la facilidad para observar la

morfologa de los microorganismos presentes.

Sus desventajas se dan porque no se diferencian los microorganismos vivos de los
muertos, es tedioso y no es til para recuento de poblaciones con baja concentracin
de bacterias.

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No se usa en hifas o mohos.

Figura 1. Representacin de la cuadrcula de la cmara de Neubauer con el ocular de

10X.

Figura 2. Orientacin que se debe seguir para el conteo de microorganismos usando la

cmara de Neubauer

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Figura 3. Orientacin para el conteo de microorganismos usando la cmara de Neubauer.

Figura 4.
Cuadrculas de la cmara Neubauer

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