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INDICE
ndice de figuras
ndice de cuadros
ndice de plantillas
Abstract
Resumen
Pgina
V
IX
XI
XVII
XVIII
I INTRODUCCIN
I.1 El problema
I.2 Hiptesis
II. ANTECEDENTES
2.1 Microorganismos quimiolitotrficos presentes en los procesos de
biolixiviacin
2.2 Microorganismos heterotrficos presentes en los procesos de biolixiviacin
2.3 Sinergismo en bacterias acidoflcas
2.4 Lixiviacin microbiana
2.5 Mecanismos de accin bacteriana
2.6 Sustratos de energa
2.6.1 Pirita (FeS2 )
2.6.2 Hierro
2.6.3 Azufre
III. MATERIALES Y MTODOS
3.1 Localizacin de las determinaciones analticas
3.2 Sitio de muestreo
3.3 Procesamiento de las muestras de suelo
3.4 Procesamiento de las muestras de agua
3.5 Proceso de muestras de jales
3.5.1 Medicin del contenido de humedad
3.6 Determinacin del pH de las muestras
3.7 Medios de cultivo para aislamiento de microorganismos en
condiciones de medio mnimo de crecimiento
3.7.1 Condiciones y adaptacin de los microorganismos en los sustratos
3.7.2 Aislamientos en medios slidos selectivos
3.8 Medicin del crecimiento celular
5
5
9
12
13
15
16
16
17
18
21
21
21
22
24
24
25
25
27
28
30
32
32
34
35
35
35
36
37
38
38
38
40
41
42
43
45
46
48
48
49
49
50
53
53
53
58
59
60
61
62
64
64
66
69
II
93
93
97
102
104
108
108
113
V. DISCUSION
119
VI CONCLUSIONES
127
129
VIII ANEXOS
151
III
ndice de figuras
Pgina
Figura 1.
Diagrama
de
flujo
de
metodologas
experimentos 23
utilizados en el proyecto.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
43
orto-fenantrolina.
Figura 5.
Figura 6.
47
Figura 8.
Figura 9.
Figura 10.
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 21
102
Figura 23
Figura 24
Figura 25
Figura 26
Figura 27
106
Figura 30
Figura 31
Figura 32
de
energa:
(a)
concentracin
de
clulas
en
VIII
ndice de cuadros
Pgina
Cuadro 1.
de
compuestos
de
azufre
inorgnico
19
por
Thiobacillus (Kelly,1988 b)
Cuadro 2.
20
25
26
26
27
28
(Johnson, 1995).
Cuadro 8.
51
(9x3x3=54 matraces).
Cuadro 9.
53
58
de jales.
Cuadro 11.
59
Cuadro 12.
60
los jales.
Cuadro 13.
61
61
IX
Colima.
Cuadro 15.
63
64
Caractersticas
descriptivas
de
microorganismos
78
90
94
101
114
115
116
117
XI
ndice de plantillas
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Plantilla 1.
54
Sitios
de
muestreo
microorganismos
de
suelos
acidoflicos;
para
(a)
aislamiento
escurrimiento
de
55
con
56
57
65
(c)
pruebas
para
crecimiento
de
microorganismos quimiolitotrficos.
Plantilla 6.
71
72
XI
73
74
75
76
77
XII
Plantilla 13.
79
80
81
83
84
85
86
87
88
XIII
89
91
92
151
152
(a)
crecimiento
de
micelio
de
hongos
153
XIV
154
155
jales; (a) tiempo 0 (b) a los cinco das (c) a los diez das (d) a
los quince das (e) a los veinte y cinco das (f) a los treinta
das y (h) treinta das
Plantilla 30.
tratamientos
microorganismos
donde
se
(Thiobacillus
utiliz
sp,
la
mezcla
Penicillium
sp
156
de
y
XV
Pure and mixed bacterial cultures were evaluated in vitro, in terms of their
lixiviation capacity of mineral substratum originated from an iron mine at Minatitln,
Colima. A diverse chemiolitotrophic and heterotrophic microbiota was observed in the
acid mine drainage and soil. pH values as low as 1.2 were registered, favoring the
development of acidophilic microorganisms. The physiological characterization of 13
microbial isolates showed that those identified as Thiobacillus sp., Penicillium sp. and
Rhodotorula sp. were predominant and showed the greater oxidation capacity. The
oxidative capacity of this three isolates was measured in mono and mixed cultures.
To evaluate the oxidative rate of the isolates, measures were recorded each five days
during a period of forty days. The evaluated oxidation parameters were: pH, redox
potential, sulfate ion concentration, dissolved Fe (II) and Fe (III), and total microbial
protein and free cells concentration. Three treatments jales was used as an energy
source in all treatments, in the first treatment jale was the only energy source. The
second treatment ferrous sulphate was added, and in the last one ferrous sulphate
and yeast extract were added. The best results for mixed culture were obtained in the
third treatment, where the oxidation rate of sulfur mineral was of 2.0 mg h-1 Fe (II),
compared with 1.5 mg h-1 Fe (III) for the monoculture.
These results contribute to the knowledge on biodiversity of acid mine
drainage, where deposited sulfur minerals are used (and oxidized) by microorganisms
as an energy source. Also, these results increase our understanding on acid
ecosystems. Where the importance of the heterotrophic, acidophilic microbial activity
has been shown, but until now, poorly considered.
XVII
R E S U M E N
Se evalu el efecto de cultivos puros y mixtos de microorganismos sobre la
biolixiviacin de sustratos minerales con contenidos de sulfuros, procedentes de
depsitos residuales (jales) de una mina de fierro, en Minatitln, Colima. En este
estudio, se encontr una biodiversidad de microorganismos quimiolitotrficos y
heterotrficos acidoflicos, provenientes del DAM (Drenaje cido de Minas), jales y
suelo de la mina. En los sitios bajo estudio, se obtuvieron valores bajos de pH de 1.2,
lo que favorece las condiciones para el desarrollo de los microorganismos
acidoflicos. De acuerdo a la caracterizacin fisiolgica realizada sobre 13 cultivos de
microorganismos acidoflicos, los caracterizados como Thiobacillus sp, Penicillium sp
y Rhodotorula sp fueron los que predominaron y que tuvieron mayor actividad
oxidativa. Para estos tres cultivos de microorganismos, se midi su capacidad
oxidativa; as como para su combinacin, reportada como cultivo mixto. El tiempo
para probar la capacidad y velocidad oxidativa de los microorganismos aislados en
matraces agitados, fue de cuarenta y cinco das con mediciones de los parmetros
indicadores de la reaccin cada cinco das. Los parmetros utilizados como
indicadores de la oxidacin fueron: pH, potencial rdox, acidez, concentracin de
iones sulfato, Fe(II) y Fe(III) disueltos, as como las protenas totales y la
concentracin de microorganismos libres. Para evaluar la capacidad oxidativa de los
distintos cultivos aislados, se utilizaron tres fuentes de energa diferentes, donde los
jales fueron el substrato comn para las tres, usndolo en uno de los tratamientos
como nica fuente de energa. En las dos restantes, adems se adicion sulfato
ferroso como una de las fuentes y sulfato ferroso mas extracto de levadura en la
segunda. Este ltimo substrato como fuente de energa, fue el que mejor result para
los cultivos mixtos. Bajo estas condiciones de fuente de energa, la capacidad y
velocidad de oxidacin de los minerales sulfurosos fue mayor para el cultivo mixto
(2.0 mg.h-1 Fe(II)) en comparacin a los cultivos puros (1.5 mg.h-1).
Estos resultados amplan el conocimiento sobre la biodiversidad que existe en
el drenaje cido de minas, donde son depositados minerales sulfurosos y que son
empleados por los microorganismos durante la oxidacin como fuente de energa.
XVIII
XIX
INTRODUCCION
Desde los aos 40s, fue demostrado que entre los procesos implicados en la
oxidacin de minerales sulfurosos, existen reacciones biolgicas que involucran la
actividad de microorganismos. En particular se ha reconocido a bacterias de la e specie
Thiobacillus ferrooxidans, por su habilidad para acelerar la disolucin oxidativa de
minerales sulfurosos presentes en materiales residuales de minas, lo que incrementa la
generacin de acidez producto de la oxidacin de algunos minerales sulfurosos (Colmer
y Hinfle, 1947; Colmer et al., 1950). Este hallazgo ha sido importante no solo para la
economa industrial (con la aplicacin de los procesos de biolixiviacin), sino tambin
para aminorar los efectos del impacto ambiental controlando la actividad de estos
microorganismos (Matschullat et al., 1999). Por lo que, la biotecnologa se considera en
la actualidad, como una alternativa de solucin a problemas que incluyen al impacto
ambiental (Hall, 1998; Deshayes, 1992; Tiedje, 1997).
El ambiente extremadamente cido, puede ser completamente natural. Sin
embargo, la influencia antropognica (directa y/o indirecta) tambin ha influido en el
incremento de la acidez en diferentes ambientes, ocasionado en parte por los residuos
mineros depositados o arrastrados en los medios circundantes. La mayora de los sitios
extremadamente cidos en el mundo, tiene su origen principalmente en la actividad
humana, adems de las minas de carbn y metales. Una variedad de actividades
microbianas genera acidez, esto incluye a la nitrificacin y la formacin y acumulacin de
cidos orgnicos, debido al proceso de fermentacin como producto del metabolismo
aerobio. Sin embargo, el origen del medio ambiente extremadamente cido y aerobio, se
asocia comnmente a la desigual oxidacin microbiana de especies reducidas de azufre
[azufre elemental (S), azufre sulfuro (S2-), tiosulfato (S 2O32-), etc.)] y de fierro (Fe2+)
(Johnson, 1998; Johnson y Halberg, 2003).
El futuro fsico-qumico del ambiente extremadamente cido es importante.
Mientras que la solubilidad de oxianiones metales (tales como el molibdato) tiende a ser
mas bajo en soluciones cidas que en neutrales, los de metales catinicos (tales como
aluminio y muchos metales pesados) son generalmente mayores. Debido a que las
concentraciones de metales solubles tienden a ser mucho mayor en las reas vecinas de
pH mayores. Los tipos de metales pesados presentes en algunos
ambientes
extremadamente cidos, son dictados por la geoqumica local; una concentracin alta de
los metales se pueden originar directamente en la oxidacin de los minerales sulfurados
o en el desgaste acelerado del mineral, el cul sucede bajo condiciones de extrema
acidez (el aluminio desde el desgaste de los minerales arcillosos). Tambin pueden
encontrarse en medios ambientes extremadamente cidos, elevadas concentraciones de
elementos metaloides solubles, de los cuales el ms importante, desde el punto de vista
ecotoxicolgico, es el arsnico, que se encuentra en varios minerales sulfurados tales
como la arsenopirita (FeAsS) y realgar (AsS) (Tuovinen et al., 1994; Boult et al., 1997;
Bruneel et al., 2003).
La produccin del llamado drenaje cido de minas (DAM) por alteracin meterica
de los residuos de la industria minera, es considerada como uno de los ms grandes
problemas de contaminacin ambiental asociada a las actividades mineras y
metalrgicas (Ferris et al., 1989; Crundwell, 2003). Los procesos qumicos y biolgicos
que se dan en este tipo de medios, pueden ser el detonador de una serie de reacciones
de oxidacin inicialmente especficas del azufre de los minerales sulfurosos, como la
pirita (FeS2). La formacin de cido sulfrico, es el producto terminal de estas reacciones
qumicas y biolgicas (Colmer, 1947).
Los componentes biticos de ambientes extremadamente cidos (pH<3) en la
naturaleza, por ejemplo en algunas zonas geotermales, son predominantemente
microbiolgicos, reconocindose hoy en da microorganismos, acidoflicos obligados, que
no son solo generadores de condiciones de acidez, sino tambin son considerados como
una alternativa para remediar ambientes alterados (Tichy et al, 1998). Debe reconocerse
que aun cuando se han aislado arqueas, bacterias, hongos, levaduras, protozoarios y
algas en sitios con residuos mineros (Garca et al, 2001), las bacterias son los
microorganismos predominantes en sitios cidos a extremadamente cidos (GonzalezToril et al., 2003). Por tanto, la mayora de estas investigaciones se han interesado sobre
bacterias que oxidan el fierro y que favorecen la movilidad (disolucin) de metales txicos
a partir de procesos biolgicos de oxidacin de minerales sulfurosos, lo cual es una de
las causas primarias de la contaminacin por DAM (Johnson et al., 1979; Walton y
Jonson, 1992). Debe subrayarse que aunque los microorganismos acidoflicos que
oxidan al azufre y fierro de minerales sulfurosos, con frecuencia se agrupan sobre la base
de su temperatura ptima de crecimiento (Harrison, 1984), sin embargo tambin se han
clasificado por su capacidad de oxidar de manera especfica a las especies de azufre o
de fierro (Rawlings, 1997).
Las cinticas y los mecanismos de la oxidacin microbiana de minerales
sulfurosos, principalmente la pirita, han sido un foco de atencin, desde hace varias
dcadas, debido a la importancia econmica de la biolixiviacin y los daos al medio
ambiente asociados con la alteracin de los minerales ricos en pirita (Tuovinen, 1972;
Rawlings y Silver, 1995; Brierley, 2001).
1.1 EL PROBLEMA
1.2 Hiptesis
II
ANTECEDENTES
2.1 Microorganismos
quimiolitotrficos
presentes
en
los
procesos
de
biolixiviacin
camino de la A-Co reductiva. Esta coenzima ancestral esta investigada como la inicial
directamente adherida hacia la superficie del mineral pasando de un substrato a otro
(Edwars, 1998).
Las poblaciones microbianas pueden encontrarse en hbitats naturales de
alteracin natural o biolixiviacin industrial, cuando se implica algn proceso de xidoreduccin y/o de disolucin de metales (Bryant et al., 1983; Harrison, 1984: Norris et al.,
1990 Herbert, 1992; Jhonson y Hallberg, 2003). Las actividades de oxidacin de
compuestos reducidos de azufre y fierro, son las ms conocidas, destacndose por ello a
las especies bacterianas de los gneros Thiobacillus y Leptospirillum (Norris et al., 1990).
Aunque la actividad de estos microorganismos puede ser el centro de las reacciones de
disolucin de metales y de produccin de cido en hbitats naturales, la estimacin de
sus niveles de actividad puede ser un medio de prevencin del resultado de la
biolixiviacin (Norris et al., 1990; Bosecker, 1997; Bosecker, 2001; Hallberg y Jhonson,
2003).
Los jales, minerales sulfurosos presentes en los depsitos residuales de procesos
de extraccin en las minas, pueden contener concentraciones menores a traza de una
gran cantidad de metales, tales como Mn, Cu, Ag, Cd, Cr, Ni, Zn, As y Fe. Estos metales
ocurren en su mayora como sulfuros minerales, como pirita FeS2, pirrotita FeS,
arsenopirita FeAsS, calcopirita FeCuS 2 y esfalerita ZnS, por mencionar slo algunos, los
cuales pueden ser lixiviados por procesos qumicos y biolgicos (Rawlings, 2002).
Las bacterias del gnero Thiobacillus son las ms estudiadas en este tpico. Esta
clase de bacterias, pertenecen a la familia Pseudomonadaceae, son Gram negativo,
aerobios (el oxgeno es el receptor final de electrones en la cadena respiratoria),
mesfilos (temperatura ptima de crecimiento 25 a 35C), bacilos cortos no esporulados,
que generalmente se encuentran aislados o en ocasiones en pares. En esta familia de
microorganismos, se reportan tambin bacterias hetertrofas que tienen afinidad por el
fierro y azufre como aceptor de electrones. Tanto en las bacterias quimiolittrofas como
hetertrofas, la aceptacin de electrones, produce molculas de ATP que son
aprovechadas para su metabolismo (Bergeys, 1974; Kelly, 1979).
Las especies del gnero Thiobacillus, toman la energa necesaria para su
crecimiento y desarrollo a partir de la oxidacin de compuestos inorgnicos de hierro y
azufre. En cuanto a carbono, lo toman del dixido de carbono que lo utilizan como sillares
de construccin para sus e structuras celulares (Ingledew, 1982). Thiobacillus thiooxidans,
desempea un papel importante en las reacciones de oxidacin del azufre presente en la
pirita durante la biolixiviacin de compuestos sulfurosos procedentes de minas de fierro
(Torma, 1977). La diferencia fundamental entre las dos bacterias T. ferrooxidans y
T.thiooxidans generalmente es reconocida por la inhabilidad de la segunda para oxidar el
hierro ferroso y sulfuros minerales (Torma, 1985 a).
Apel et al., (1980) y Matin et al., (1982), realizaron estudios con los gradientes
durante la oxidacin del ion ferroso y encontraron que, cuando hay un gradiente en el
medio externo de T. ferrooxidans y T. acidophillus, el medio interno de la clula an es
neutro o cercano de la neutralidad. Esto ha sugerido que el gradiente de pH (4.5) podra
ser usado por las bacterias para realizar la fosforilacin oxidativa (Cox et al., 1977). Por
otro lado, los protones estn asociados con la cadena respiratoria que es la responsable
de aportar H+ y ser consumido en la reaccin de oxidacin (Cox y Brand, 1984).
El sistema de oxidacin del in ferroso en T. ferrooxidans est asociado con el
contenido de lipopolisacridos fuera de la membrana envolvente de la clula (Holts et al.,
1974; Rojas-Chapana y Tributsch, 2001). Esto fue determinado por medio de fijacin
qumica y congelacin a travs de fragmentacin celular (Pereverzev et al.,1981).
Adems, por medio de mecanismos directos de adhesin se midi, la caracterstica
hidrofbica que tiene la pirita con respecto a T, ferrooxidans y T. thiooxidans. En el
trabajo de Ramrez et al., (1997) encontraron mayor capacidad hidrofbica en T.
thiooxidans que T. ferrooxidans. Estos mecanismos, son factores importantes debido a
que se incrementan las posibilidades de adhesin de los microorganismos hacia los
minerales sulfurados.
Por otra parte, Guay y Silver (1975) evidenciaron que T. acidophillus fue capaz de
crecer en ambos medios, hetertrofo y quimioauttrofo. Esta especie se aisl desde un
cultivo de T. ferrooxidans. Tambin Johnson et al., (1992), encontraron bacterias
hetertrofas acidoflicas con capacidad de oxidar el hierro, tales como Sphaerotilus,
Leptothrix spp., ambas hetertrofas obligadas. Las dos modalidades nutricionales en un
mismo hbitat de crecimiento para diferentes microorganismos, garantiza se realicen de
manera armonizada los procesos de oxidacin.
Fe 2 + + 2 SO4 2 + 2 H +
Este proceso permite tambin, que posteriormente inicie el proceso que involucra
la oxidacin tambin biolgica de los iones Fe (II) a iones Fe (III), de acuerdo a la
reaccin:
Fe 2 + + H + + 1 4 O2 bacterias
Fe3 + + 1 2 H 2 O
El ion frrico [Fe(III)] as generado, es entonces responsable de la oxidacin
qumica tanto de la pirita como de los otros sulfuros (Leduc y Ferrony, 1994):
FeS2 + Fe3 + 2Fe 2 + + 2S + e
MeS + Fe3 + Me2 + + Fe2 + + S + e (donde, Me = metal, como Pb, Zn, Cu, Cd, etc.)
2.2 Microorganismos
heterotrficos
presentes
en
los
procesos
de
biolixiviacin
La mayora de los ambientes extremadamente cidos contienen relativamente
bajas concentraciones (< 20 mg l-1) de carbono orgnico disuelto y por lo tanto los
microorganismos pueden ser clasificados como oligotrficos. La produccin primaria en
los sitios en los cuales no recibe luz del sol (ejemplo profundidades abandonadas de
minas) estan basadas exclusivamente sobre tipos de nutricin autotrfico-quimiolitotrfico
y se vincula inexorablemente a la oxidacin de compuestos de azufre reducido y del
hierro ferroso (Johnson, 1998). Se han obtenido por investigaciones continuas
conocimientos importantes dentro del rea de la microbiologa sobre los quimiolitorficos
acidofilicos y se conocen muchos detalles fisiolgicos y bioqumicos de algunos de estos
procariotas. La bacteria ms notable que oxida el azufre y el hierro es Thiobacillus
ferrooxidans (Leduc y Ferroni, 1994).
La mayora de los acidoflicos que oxidan el azufre y el fierro son observados como
autotrficos a travs de su habilidad para asimilar carbono orgnico se ha demostrado
con algunos de estos (ej. Utilizacin de cido frmico por T. ferrooxidans (Pronk et al.,
1991]). Otros procariotas pueden catalizar oxidaciones diferentes al hierro y/o
compuestos de azufre reducido (CsAR) son ya sea mixotrficos o son otro tipo de
heterotrfico obligado. En estos medios ambientes extremadamente cidos que estn
iluminados, la produccin primaria puede estar mediada por medio de acidoflicos
fototrficos. La mayora de estos son microalgas eucariota e incluye formas unicelulares y
filamentosas y diatomeas (Brake et al., 2001).
En las aguas del drenaje de las minas, tambin se han encontrado
microorganismos hetertrofos que tienen la capacidad de oxidar a los minerales de
azufre residual y que resultaron ser eficientes en este proceso (Smith y Hoare, 1977;
Wichlacz y Unz, 1981). Asimismo, Johnson y McGinnes (1991), hallaron bacterias
hetrotrficas acidoflicas que reducen el in frrico a in ferroso. Adems en 1992
(Johnson et al 2001), aislaron y caracterizaron bacterias heterotrficas acidoflicas,
capaces de oxidar el in ferroso y Johnson et al. (2001), demostraron el importante papel
que desempean los cultivos puros y mixtos con microorganismos heterotrofos en la
biolixiviacin, as como la importancia de su biodiversidad (Kennedy y Gewin, 1997;
Konhauser, 1998), por lo que se ha reportado en esos medios ambientes, una
biodiversidad microbiana mesoflica y acidoflica importante para usarlos en los procesos
de biolixiviacin de los minerales sulfurados (Johnson, 1991).
Se han reportado algunos microorganismo mesoflicos, acidoflicos y fototrficos
como Euglena spp., Chlorella spp., Chlamydomonas acidophila, Ulothrix zonata y
10
Klebsormidium fluitans. Sin embargo, Euglena spp., puede crecer en forma heterotrfica
y sin luz y se ha reportado que se encuentra a valores de pH de cero (Mann et al., 1987).
Como tambin, se aislaron algas, en condiciones naturales que tuvieron la capacidad de
absorber uranio (Mann y Fyfe, 1985; Brake et al., 2001) Pueden ser aislados,
microorganismos hetertrofos que viven en medios extremadamente cidos. Estos se
pueden aislar y estar adaptados a basureros y confirmar el alcance mayor o menor del
carbn originado como filtrado o por los productos lticos desde los quimiolitotrficos
acidoflicos. Los acidoflicos hetertrofos incluyen: bacterias, arqueas, hongos levaduras y
protozoarios.
Algunos procariotas hetertrofos acidofilicos tienen un papel directo sobre la oxido
reduccin del fierro (Rimstidt y Vaughan, 2003). Estos incluyen oxidadores del fierro
como Ferromicrobium acidophilus (Johnson y Roberto 1997) los cuales parecen usar la
energa desde la oxidacin del fierro para soportar el crecimiento, y varios
microorganismos parecidos a Acidiphilium los cuales pueden usar el hierro frrico como
aceptor final de electrones. Existen algunas especies de arqueas moderadamente
termoflica como Picrophilus que tienen reportado el pH mas bajo para su crecimiento
(0.7) de todos los microorganismos arquea conocidos (Schleper et al., 1995).
Tambin se han reportado numerosos eucariotas que habitan en medios ambientes
extremadamente cidos. Las Rhodotorulas spp., son levaduras frecuentemente
encontrada y aisladas desde aguas de drenajes cidos de minas y levaduras que
pertenecen a otros gneros Candidas, Cryptococcus, tambin se han aislado y descrito
(Schleper et al., 1995). Se han aislados hongos filamentosos desde este medio cido tan
hostil considerandose a la mayora como hongos acidoflicos. Algunas especies se han
reportado que viven a pH 0 como Aconitum cylatium, Trichosporon cerebriae y una
especie de Cephalosporium sp (Schleper et al., 1995). Tambin se han encontrado
protozoarios en los medios ambientes relacionados con los lixiviados de drenajes cidos
de minas y se ha reportado que a nivel de laboratorio estos organismos oxidan a los
minerales sulfurados. Estos protozoarios son flagelados como EutreptialBodo spp.,
ciliados como Cinetochilium spp. y amibas como Vzhlkampfia sp. (Johnson, 1998).
El potencial redox del acoplamiento hierro frrico/ferroso (+770 mV a pH 2) implica
que para muchos organismos, el hierro ferroso es su nica fuente de energa (cepas de
11
Las
modalidades
nutricionales
son
relevantes
en
la
asociacin
de
12
13
facilita separar a las sustancias insolubles que no tienen valor econmico. Los
microorganismos Thiobacillus ferrooxidans, son los ms estudiados en relacin con la
biolixiviacin de concentrados sulfurosos, dado su predominio en este tipo de sistemas,
aunque Leptospirillum ferrooxidans ha demostrado tambin ser particularmente til
(Lundgren y Silver, 1980).
El proceso de biolixiviacin de la pirita ocurre muy rpido, aproximadamente
500,000 veces ms veloz que la lixiviacin qumica por la presencia del oxgeno (Kelly,
1997), lo que hace evidente la eficiencia del proceso, sobre todo cuando participan
ambos microorganismos (Thiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans) (Pronk
et al., 1991).
La lixiviacin es un proceso til, especialmente para las minas donde se
encuentran los sulfuros de metales base, ya que los sulfatos que se forman ocasionados
por el proceso mencionado, son solubles en agua y los metales pueden recuperarse en
solucin (cobre y cobalto) o bien en forma slida (precipitados de hierro y/o arsnico)
(Wilderman, 1991). La mayor parte de los sulfuros metlicos son oxidados
espontneamente (por la presencia del oxgeno), pero como se mencion arriba, su
velocidad de reaccin es mucho menor que en presencia de los microorganismos.
El proceso de lixiviacin de los metales por oxidacin de minerales con la ayuda
de microorganismos, depende de factores fsicos, qumicos y biolgicos (Bosecker, 1997;
Meruane y Vargas, 2003). Aunque la eficiencia de la reaccin de oxidacin depende de
las condiciones del medio ambiente, tambin es altamente dependiente de la eficiencia
de la actividad microbiana y de la naturaleza cristaloqumica de los minerales portadores
de la fuente de energa (azufre y/o metales). Por ejemplo, de acuerdo al trabajo reportado
por Free et al. (1991), las clulas bacterianas seran adsorbidas sobre la superficie del
mineral, formando un sistema electroqumico en el cual los electrones procedentes de la
superficie catdica del mineral se desplazaran hacia el receptor final de electrones, el
oxgeno atmosfrico.
14
Fe 2 + + 2 SO4 2 + 2H +
Por otra parte, es conocido que la pirita es disuelta por iones frricos, formando
iones ferrosos y que Thiobacillus ferrooxidans cataliza la oxidacin de iones ferrosos
hacia la regeneracin de frricos (mecanismo indirecto). Silverman y Erlich (1964)
propusieron las siguientes reacciones para este mecanismo:
Fe 2 + + H + + 1 4 O2 bacterias
Fe3 + + 1 2 H 2 O
FeS 2 + 14 Fe 3 + + 8 H 2 O 15 Fe 2 + + 2 SO4 2 + 16H +
Ms adelante, Mustin et al., (1992), mostraron que las capas superficiales de la
pirita pueden ser fuertemente modificadas durante la lixiviacin bacteriana. El ion ferroso
es reducido a in frrico sobre la superficie de la pirita, asumiendo que este proceso es
controlado por la acumulacin de Fe (II) y Fe (III), postulando las siguientes reacciones
qumicas:
FeS 2 + 8 H 2 O Fe 3+ + 2 SO4 2 + 16H + + 15e
FeS 2 Fe 2 + + 2S + 2e
O2 + 4 H + 4e + 2 H 2 O
FeS 2 + 14 Fe 3 + + 8 H 2 O 15 Fe 2 + + 2 SO4 2 + 16H +
Aun cuando en este sistema se menciona que los otros sulfuros tambin pueden
ser oxidados va un mecanismo directo, por ejemplo a travs de la reaccin general:
MeS ( s ) + 2O2 bacteria
MeSO4 (a )
15
un metal pesado bivalente (p.e., Pb, Cd, Zn,etc.). En este caso, el mecanismo
indirecto est representado por una disolucin oxidativa va ion frrico (Sand et al., 1995;
Sand et al., 2001):
MeS + 8Fe 3 + + 4 H 2 O Me 2 + + SO4 2 + 8 H + + 8Fe 2 +
o una disolucin cida no oxidativa va los protones:
MeS + 2H + Me 2 + + H 2 S
donde el H2S se oxida va bacteriana a azufre elemental o sulfato.
La funcin indirecta de las bacterias acidoflicas, es entonces producir de manera
continua sulfato frrico (Fe(SO4)3) acuoso, el cual es conocido como un agente
fuertemente oxidante (Dutrizak y Mac Donald, 1974).
Por otra parte, Torma y Sakaguchi (1978), encontraron que la relacin directa
entre la tasa de extraccin del metal (dM2+/dt) y la solubilidad del sulfuro mineral (K sp)
est directamente relacionada, es decir, la tasa de extraccin del metal es ms rpida
cuando el producto de solubilidad del mineral de sulfuro es ms elevado. Esto es:
dM2+/dt= K ps = k [M2+] [S2-]
donde
2.6.1
Pirita (FeS2)
La pirita es un mineral que posee como frmula qumica FeS2, por lo que
tericamente contiene 53.3% de S y 46.7% de Fe; sin embargo, puede contener
concentraciones menores (<1%) a traza (<100ppm) de algunos otros metales, entre los
que destacan Ni, Co, Cu, Zn, Sb, Au y As. La presencia de estos elementos en solucin
slida dentro de la estructura cristaloqumica de la pirita, modifica sus propiedades
semiconductoras, lo que favorece o inhibe sus propiedades de oxidacin. Adems, los
cristales de pirita pueden presentar inclusiones microscpicas a submicroscpicas de
otros sulfuros minerales, tales como calcopirita, galena o arsenopirita, lo cual tambin
puede modificar sus propiedades oxidativas. Debe mencionarse que la pirita es el ms
16
Hierro
Fe3 + + e
O2 + 4 H + 4e + 2 H 2 O
Fe 2 + + H + + 1 4 O2 bacterias
Fe3 + + 1 2 H 2 O
17
2.6.3
Azufre
Los mecanismos del azufre que se llevan a cabo para ser utilizados como fuente
de energa, son variados. Estos compuestos son usados como donadores de electrones,
para el crecimiento quimiolitotrfico y autotrfico aerobio de las bacterias. La mayora de
las reacciones los llevan hacia los sulfatos (Friedrich, 1998). Con relacin a los sulfuros
metlicos como FeS2, MoS2 y WS2 son qumicamente atacados por los iones
hexahidratados de hierro (III), generando tiosulfato y azufre elemental, el cual es oxidado
18
hasta H2SO4. Otros sulfuros metlicos son atacados por iones hierro (III) y por protones
resultando formacin de azufre elemental va polisulfuro como intermediario.
Estas reacciones por lo general son realizadas con T. thiooxidans en los procesos
de biolixiviacin de los sulfuros de metales (Schippers y Sand, 1999). Se acepta que, e n
el camino bioqumico de la oxidacin de azufre, generalmente se llevan a cabo
reacciones complejas con la participacin de especies de Thiobacillus, en los
compuestos de azufre (Kelly, 1988b). En los Cuadros 1 y 2 se dan algunas reacciones
donde participa el azufre y sus enzimas respectivas. El sulfito (SO2-3) representa a un
intermediario central. El tiosulfato es convertido hacia sulfito y polisulfuro o azufre. La
reaccin es mediada por la actividad de la enzima rhodanasa en los Thiobacillus
acidoflicos. Se ha demostrado en estas bacterias que la oxidacin del tiosulfato a
tetrationato (S 4O2-6), fue acoplada hacia la oxidacin fosforilativa (Lundgren et al., 1986).
De acuerdo a Kelly (1988 b; 1989; 1990), no todas las enzimas ni los
componentes del transporte de electrones en los caminos han sido caracterizados y
algunas reacciones quedan en supuestos. En el mismo Cuadro 1, se presentan la mitad
de las reacciones que son frecuentemente usadas como substratos para el crecimiento
de Thiobacillus.
Cuadro 1. Reacciones involucradas en el camino bioqumico de la oxidacin
de compuestos de azufre inorgnico por Thiobacillus (Kelly, 1988 b).
Compuesto
Sulfuro
Azufre
Sulfito
Adenil Sulfato
Reaccin
2-
S + 3H2O
S+O2+H2O
2SO3 +H2O
2-
SO3 + AMP
2-
Tritionato
Azufre oxigenasa
2+
O4 +2H +2e
APS + 2e
APSreductasa
+ ADP
ADPsulfurilasa
+ATP
ATPsulfurilasa
Tiosulfato- azufre transferasa
SO3 +SCN
2-
2S 2O3
(rhodanasa)
Tiosulfato cito c
S4O6 +2e
-
+ 2e
2S3O6 +H2O
2-
2-
S2O3 + CN
2S2O3
SO3 +2H
2SO4
APS +PPi
2-
Sulfito reductasa
2SO4
APS +Pi
Tiosulfato
Enzima
2+
SO3 +6H +6e
2SO3
+S
22SO4 +S2O3
oxidoreductasa
2-
Tiosulfatoreductasa
+
+2H
Tiosulfatohidrolasa
19
Reacciones
2-
2-
2-
Sulfuro
S + 4H2O
SO4 + 8H +8e
Azufre
S + 4H2O
SO4 + 8H + 6e
2-
2SO4 + 10H + 8e
2-
S3O6 + 6H2O
2-
FeS 2 + 8H2O
2SO4 + Fe
Tiosulfato
S2O3 + 5H2O
Tetrationato
S4O6 + 10H2O
Tritionato
Pirita
2-
2-
2-
2-
2+
+ 16H + 14e
20
III
MATERIALES Y MTODOS
21
muestras slidas. El muestreo de suelo y agua fue realizado durante los meses de
marzo, mayo y septiembre de 2001. Se eligieron estos meses con la finalidad de
escoger, entre ellos, la temporada de mayor densidad de poblacin microbiana en
funcin de las condiciones climticas del sitio. Las muestras de pirita se obtuvieron de la
misma mina como concentrado de flotacin rico en pirita.
En la Fig 1 se muestra el diagrama de flujo, que indica los procedimientos
metodologicos que se realizaron, desde la toma de las muestras, hasta llegar a medir y
comprobar la capacidad oxidativa de los microorganismos aislados, tanto con los cultivos
puros como con los mixtos.
22
Muestreo de presas
de jales (suelo, agua y jales)
pH
Medicin en el sitio
de parmetros fisicoqumicos
Potencial rdox
Conductividad
Preparacin de muestras
Jales
Digestin cida
en microondas
Anlisis Qumicos:
Metales
Suelos
Aguas
Sin tratamiento
Acidificado
(HNO3 2:1)
Aislamiento de
microorganismos
Anlisis Qumicos:
Sulfato,
Fe(II), Fe(III)
Anlisis Qumicos:
Metales disueltos
Activacin de los
microorganismos sobre
sustrato estril y no estril
Bioensayos
Medicin de la capacidad de oxidacin
de minerales sulfurosos en jales, con
cultivos puros y mixtos
Comprobacin de la capacidad de
oxidacin de minerales sulfurosos en
jales con cultivos mixtos y puros
23
24
Caractersticas Aparentes
10
11
12
13
14
25
Caractersticas Aparentes
10
11
12
13
14
Suelo color verde con precipitados de azufre y frrico, pica al tocarla, las suelas de zapatos
burbujeaban por el cido
Suelo de rizoosfera color rojo y burbujas en el agua.
Caractersticas
Agua de color amarillo hay muchas gramineas y burbujea en la superficie del agua.
10
11
12
13
14
26
g/L
(NH4)2SO4
3.0
KCL
0.1
K2HPO4
0.5
MgSO4.7H2O
0.5
Ca(NO3)2
0.01
H2O destilada
700mL
Solucin B
FeSO4.7H2O
74.674
H2O destilada
300mL
pH
2.0
27
g/L
(NH4)2SO4
3.5
KCL
0.116
K2HPO4
0.058
MgSO4.7H2O
0.058
Ca(NO3)2
0.00168
H2O destilada
420mL
Solucin B
3.7.1
FeSO4.7H2O
10mM
Extracto de levadura
0.02%(p/v)
H2O destilada
580mL
pH
2.0
Los tubos y matraces seleccionados para esta etapa, fueron los que presentaron
intensa turbidez, cambio de color y disminucin del pH comparado con los controles.
Para lograr la adaptacin de los microorganismos que se aislaron en los medios
28
29
3.7.2
30
31
El conteo directo del nmero de clulas totales, se realiz por medio de la cmara
de Neubauer (Lumycite, Propper, Manufacturing Co Inc. Long Islan, NY). Se tomaron
alcuotas desde las muestras a intervalos de tiempo y realizaron diluciones. Los 100 L
de muestra que se tom de cada alcuota, fueron teidos con safranina acidificado con
32
cido ctrico 0.5 N (Fowler et al., 1999), con la finalidad de realizar el contraste en la
clula y diferenciar los precipitados frricos que se formaron por la oxidacin. Por otro
lado, se regener la produccin de biomasa, cuidando el substrato electroqumico a
travs de la medicin del POR (Magnin et al., 1998).
La tcnica para estimar las poblaciones microbianas que se us para las muestras
del suelo fue la del NMP de acuerdo Alexander (1982), parar determinar el nmero de
microorganismos totales. Se emplearon medios selectivos tanto para microorganismos
hetertrofos como para quimiolitotrficos, ya que sta tcnica tambin se pudo usar para
identificar subespecies de microorganismos quimiolitotrficos y heterotrficos, tal como lo
mencionan Southam y Beverdige (1992). Los medios selectivos para esta estimacin
fueron los mencionados para bacterias, levaduras y hongos nativos.
Para cuantificar a los microorganismos hetertrofos que oxidan al azufre as como
al tiosulfato el procedimiento que se us fuel el de Lawrence y Germida (1988). En este
procedimiento se aplic la tcnica del NMP y empleando indicadores reductores para
detectar el cambio de pH cuando se present el vire, ocasionado por la acumulacin de
protones durante el metabolismo de los microorganismos que utilizaron a los elementos
mencionados como fuente de energa.
La tcnica consisti en adicionar una dilucin de 0.1 mL de la muestra del suelo
en tubos de ensaye con tapn de baquelita con capacidad 10 X100 cm a 2.0 mL de caldo
soya tripticaseina (CST) a una concentracin de 1/10. La turbidez se ley como resultado
positivo. Los microorganismos hetertrofos que oxidaron al S y produjeron tiosulfato se
indic por el cambio de color del substrato al reaccionar el indicador azul de bromocresol
debido al cambio del pH.
Se utiliz como medio bsico CST y 1% (v/v) de Flor de Azufre (FA) como fuente
de energa. La suspensin FA es de color crema-amarillo con un contenido de azufre de
50 a 70% p/v, en partculas de 1-2 m de dimetro (Chemical Co. Inc., Houston). Este
lquido se lav dos veces con agua destilada y se esteriliz en autoclave. Se ajust el pH
del medio de 2.0 a 2.5 para adicionarlo a los tubos. Los tubos control que contenan CST
+ FA sin inocular, se incubaron para detectar resultados falsos positivos (como
produccin de tiosulfato desde los componentes o por oxidacin qumica). Los tubos se
33
incubaron en una agitadora rotatoria (130 rpm) para asegurar su crecimiento aerobio a
302 C durante 5 das.
Para el crecimiento de hongos y levaduras se eligi el medio de cultivo selectivo
agar Czapek Dox y agar Saboraud con 1% de extracto de levadura respectivamente el
pH se ajusto de 3.0 a 3.5 (Germida, 1997). Los medios de cultivo usados fueron Difco.
Para la medicin de la produccin de tiosulfato, se us el mtodo colorimtrico por
la produccin de tiocianato frrico de Nor y Tabatabai (1976). El mtodo consisti en
adicionar 2 gotas de KCN 100 mM y despus de 15 minutos se agregaron 4 gotas de
CuCL2.2H2O 330 mM y 2 gotas de una solucin de Fe (NO3)3.9 H2O 250mM y HNO3
3100mM. La formacin de un color caf indic la presencia de tiosulfato y tetrationato.
Cuando se omiti adicionar CuCL2 2H2O, solamente indic la presencia de tetrationato.
Todos los anlisis se realizaron 3 veces. El conteo se llev a cabo de acuerdo a la tabla
de Cochran (1950) para 10 diluciones y 5 tubos por dilucin. La sensibilidad de esta
tcnica fue de aproximadamente 10 g ml-1 de tiosulfato.
Los tubos que resultaron positivos a las pruebas, se seleccionaron y se utilizaron
para sembrar por estra alcuotas de 500 L, sobre los medios slidos selectivos de la
dilucin respectiva para obtener colonias aisladas nuevamente.
34
3.10
Bioensayos
Las condiciones de pH, tamao de la partcula del jal, agitacin, temperatura, que
se establecieron para probar la reaccin de los microorganismos hacia el substrato (jal)
estril o no esterilizado, fueron las mismas que se usaron en el ensayo 2, donde se us
1.0 gramo de jal en tubos con tapn de baquelita; la determinacin de Fe(ll) se realiz por
el mtodo de o-fenantrolina y se emplearon 72 horas de incubacin. Las alcuotas para
realizar las lecturas del Fe(ll) se hicieron a las 0, 24, 48, 60 y 72 horas. El proceso de
esterilizacin de los ingredientes de MMS y el jal, se realiz por un lado, en autoclave a
15 lb.pul-2 durante 10 minutos y por filtracin el SF a travs de un filtro con 0.45 m el
tamao del poro.
Se utilizaron tres tubos por cada medio y se repiti el experimento dos veces. Los
valores expresados en las grficas son los promedios. El substrato que se emple para
las dos pruebas fue el siguiente: EL =extracto de levadura; SF = sulfato ferroso.
35
fuente de energa presente en 1.0 g de jal (70 m dimetro de partcula) lavado durante
24 horas, utilizando como diluyente 20 mL ya sea agua o con MMS (Medio Mnimos de
Sales). Los tubos con tapn de baquelita de 10X150 cm, se agitaron a 150 rpm durante
36 horas a 30 2 C. Se ajust el pH a 2.0 con H2SO4. 1.0 N.
El inculo de microorganismos fue de 500 L. La concentracin del sulfato ferroso
se midi por el mtodo de dicromatometra o por ortofenantrolina (turbidimetra) de
acuerdo a la concentracin. Las sales del MMS se esterilizaron en autoclave a 15 lb/pul2
y el SF fue filtrado a travs de un filtro millipore con poro de un dimetro de 0.2 m
(Millipore Co. Bedford, MA). Enseguida se mezclaron los substratos que lo requirieron.
Se destinaron tres tubos por cada substrato usado. Adems se repiti dos veces este
ensayo y reportndose las cifras como promedio. Para probar la eficiencia del
crecimiento tanto de los cultivos puros como mixtos, as como las fuentes de energa, se
usaron los substratos siguientes:
Utilizando agua como diluyente:
Muestra No
1
3.10.3 Oxidacin del ion Fe (ll) a Fe(lll) presentes en los jales a travs de los
cultivos puros y mixtos
36
37
3.11 Mediciones
usadas
para
sulfurosos
Se determin la actividad de xido-reduccin por las caractersticas especficas de
los microorganismos durante su crecimiento en los medios de cultivos. Tambin, la
actividad de oxido-reduccin se fue observando de acuerdo a las reacciones qumicas
sobre los substratos en los que se encontraron. Estas se estimaron con las
determinaciones de los parmetros que enseguida se mencionan y que se
correlacionaron con la produccin de biomasa durante el proceso
3.11.1
Determinacin de la acidez
38
Se midi por titulacin con una solucin valorada de NaOH 0.094 2 N libre de CO2
y una solucin de biftalato de potasio (KHC 8H4O4) 0.05N. Se titul un volumen de
muestra que produjo un gasto de la solucin estandarizada de hidrxido de sodio menor
de 25 mL. Se adicion 0.2 mL (equivalente a 5 gotas) de la solucin indicadora de
fenolftalena, y en las muestras sospechosas con presencia de cloro residual se adicion
0,05 mL de solucin de Na 2S203 0,1 N antes de agregar el indicador. Se agit la muestra
en agitador magntico (Vanomag Electronicrher Multipoint HP 6) a 50 rpm. El punto final
de la titulacin se alcanz cuando apareci un ligero color rosa con la adicin de 3 a 4
gotas de fenoftaleina a 5.0 mL de la muestra, a pH de 4,6.
Los clculos se obtuvieron de acuerdo a la siguiente expresin:
Acidez mg de CaCO3/L = A x B x 50 000 mL de la muestra
En donde: A = mililitros de la solucin NaOH gastados
B = normalidad de la solucin de NaOH
Para determinar el vire de las muestras del experimento durante la titulacin, se
opt por obtener el punto de e quilibrio entre el hidrxido de sodio y el sulfato ferroso, para
lo cual se elabor la curva correspondiente (Fig 2).
8
7
6
pH
P.E
4
3
2
1
0
0
0.5 0.8 1
1.5 1.8
2.5
6.6
mL NaOH 0.094N
Este procedimiento se hizo utilizando al NaOH valorado (0.094 N), como solucin
titulante para la muestra y registrando el pH a los diferentes volmenes del hidrxido. De
39
acuerdo a los resultados obtenidos, el punto de equilibrio se di a los 2.5 mL. Al adicionar
este volumen result el vire. Este procedimiento se realiz tres veces.
3.11.2. Determinacin del in sulfato
La tcnica se fundament en que el in SO42- est distribuido ampliamente en la
naturaleza y puede estar presente en aguas naturales en concentraciones que varan de
algunos g/L hasta algunos g/L. Las aguas residuales de la industria minera contribuyen
gradualmente en el aumento del SO42-, debido a la oxidacin de la pirita. Los sulfatos de
sodio y magnesio ejercen una accin catrtica.
El mtodo que se utiliz para esta medicin fue el turbidimtrico de acuerdo a la
ASTM (1999), se bas en la precipitacin del in SO42- en medio cido con BaCl2.2H2O
para formar cristales de sulfato de bario en una suspensin, cuya absorbancia es
proporcional a la concentracin del mismo en la solucin. Esta concentracin se
determin por medio del espectrofotmetro y se compar con una curva de calibracin.
Con esta tcnica se pudieron determinar rangos desde 1 hasta 60 mg/L. Las muestras
que rebasaron estas cifras se diluyeron para estar en condiciones de leerlas y se
multiplicaron por el factor de dilucin.
Los reactivos que se usaron fueron cristales de BaCl2.2H2O de 20 a 30 mallas,
grado analtico. Adems se utiliz la solucin acondicionadora, que consisti en mezclar
50mL de glicerina con una solucin de 30mL de HCl concentrado, 300mL de agua
destilada, 100mL etanol al 95% y 75 g de NaCl. La solucin estndar de sulfatos (SSS)
se prepar con Na 2SO4.anhidro 0.1479 g/L.
Las muestras fueron filtradas cuando se detect turbidez y se mantuvieron a una
temperatura de 30 C. Se tom 1.0 ml de la muestra y se llev a volumen de 100 mL.
Enseguida se pas este volumen a un matraz Erlenmeyer de 250 mL para adicionarle 5.0
mL de la solucin acondicionadora. Se aadi 0.3 g de BaCl2 y agit por 1 minuto de
manera continua hasta la lectura a velocidad constante. Se midi la absorbancia por un
periodo no mayor de 4 minutos. Para el blanco se utiliz el procedimiento anterior, solo
que se sustituy con agua destilada el volumen de muestra. La lectura se realiz con un
40
0.45
Absorbancia (420nm)
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
y = 0.076x + 0.0117
R2 = 0.9953
0.1
0.05
0
0
concentracin (mg/L)
3.11.3
El dicromato de potasio es una sal de alta pureza, lo que permite por pesada
directa preparar soluciones de normalidad conocida sin necesidad de titular
posteriormente. Para su valoracin se utiliza FeSO4(NH4)2SO4.6H2O, comnmente
llamada sal de Morh. Puesto que una solucin normal de dicromato, resulta ser muy
concentrada para usos volumtricos, se usan soluciones decimonormales, como en la
mayora de los mtodos de oxido-reduccin.
El indicador usado para la titulacin de iones ferrosos con dicromato de potasio,
fue la difenilamina. Con este indicador, se espera un producto de oxidacin color azul o
41
42
2+
3(1/3Fe ) +
1,10-fenantrolina
Tris(1,10fenantrolina)hierro(II)
Fig. 4. Formacin del complejo por la reaccin del in ferroso con orto-fenantrolina
43
Se afor a 2.0 mL con agua destilada con agitacin continua y se ley la absorbancia a la
misma longitud de onda
Se implement la curva de calibracin con una solucin patrn de sulfato de
amonio ferroso (NH4)2Fe(SO4)2 6 H2O a la concentracin de 0.1 M (Fig 5). La curva se
realiz por triplicado.
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
R2 = 0.9999
0.2
0.1
0
0.2
0.67
1.12
1.57
2.4
2.9
3.36
3.8
4.25
[Fe2+] (ppm)
Fig. 5. Curva de calibracin del in Fe(ll) realizada para medir la concentracin
por medio del espectrofotmetro con luz visible.
Absorbanci a A 25 dilucin
B
Donde: A = intercepto
B = Pendiente;
A y B se determinan por calibracin
3.11.3.3. Determinacin del Fe total
44
45
o un plato caliente en una campana bien ventilada hasta que el volumen se redujo de 15
a 20 mL asegurndose de que la muestra no llegara a ebullicin.
Se enfriaron y filtraron las muestras a travs de un filtro de textura fina, (se lav el
cido con papel ceniza) dentro de un matraz volumtrico de 100 mL: se lav el papel filtro
dos o tres veces con agua y ajust el volumen.
Se aspiraron cada uno de los filtrados y a la muestra acidificada se le determin
su absorbancia o concentracin a 248.3 nm. Se aspir con HNO3 (1:500) entre cada una
de las muestras. Los clculos para la concentracin de fierro total en las muestras se
dieron en miligramos por litro de fierro de acuerdo a la curva que se prepar y el equipo
automticamente emiti las lecturas de acuerdo a la calibracin.
Para la determinacin del ion Fe (lll) se obtuvo de la diferendia del Fe (Total)
menos Fe (ll)
3.11.4.
46
Absorbancia (595nm)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
R2 = 0.9751
0.1
0
10
15
20
25
30
CONCENTRACION (ug/mL)
Pendiente = 0.019281113
Ley de Beer A= abc
a = absortividad (mL/g cm)
b = tamao de la celda (cm)
c = concentracin (g/mL)
a=
A
bc
donde b = 1cm;
A
= pendiente
c
a= 0.019281113 mL/g cm
c=
A
ab
47
3.12.
3.13.
Determinacin
de
la
concentracin
de
azufre
durante
la
biolixiviacin
48
Condiciones experimentales
Para probar la actividad oxidativa de los microorganismos nativos por medio del
proceso de biolixiviacin se realizaron experimentos en condiciones definidas por los
resultados obtenidos por los bioensayos. El experimento empez el 4 de enero del 2002
y termin el 18 de febrero del mismo ao. La duracin del experimento fue de 46 das. La
medicin inicial se realiz el mismo da y las siguientes mediciones se realizaron cada
cinco das, es decir, un total de 10 determinaciones por ensayo. Las alcuotas que se
tomaron para realizar las mediciones tuvieron un volumen de 25 mL a cada una de las
muestras. El experimento se dise para analizar 18 tratamientos diferentes con tres
repeticiones cada uno, por lo que se tuvieron 54 matraces en total. Las condiciones
49
Diseo experimental
50
Simbolo
Signififcado
TCN1
TCN2
TCN3
M1
M2
M3
CP1
CP2
CP3
10
CP1
11
CP2
12
CP3
13
CP1
14
CP2
15
CP3
16
CMS1
17
CMS2
18
CMS3
Ferroso por titulacin con dicromato de potasio y/o por espectrofotometra con
orto-fenantrolina
51
52
lV. RESULTADOS
4.1
Sitio de muestreo
Elemento
analizado
promedio
Fe total (%)
42
6.6
42.3
28.2
15.7
49.0
27.2
22.4
24.45
S total (%)
0.77
27.84
3.02
11.61
33.16
9.8
20.58
20.2
15.87
SiO2 (%)
29.54
5.63
7.64
15.08
<
14.56
9.75
9.4
13.08
Al2O3 (%)
6.25
1.17
2.20
2.8
<
2.9
3.03
6.4
3.53
CaO (%)
12.54
6.99
5.39
7.82
2.82
1.30
7.49
7.2
6.35
MgO (%)
5.3
7.39
0.07
1.48
5.11
1.87
0.75
0.4
2.79
P total (%)
0.79
0.38
0.004
0.104
0.010
0.131
0.115
0.3
0.19
53
54
55
56
57
Min
Max
3.03
1.40
2.0
6.9
CE (mS cm )
3.15
1.25
0.80.
6.51
Eh (mV/ESC)
544
147
140
780
2602
1458
424
7404
602.5
Variable
Media
pH
-1
2SO4
-1
(mg.L )
-1
Ca (mg.L )
DS
352.6
114.1
50.7
-1
140
70.6
14.6
370
-1
18.2
6.6
4.6
53.2
-1
5.7
2.2
0.7
19.0
-1
13.2
10.4
1.6
54.0
-1
43.00
62.01
<0.05
450.00
-1
Fe (mg.L )
395.50
432.37
<0.01
1592.00
-1
<0.01
1463.00
Mg (mg.L )
Na (mg.L )
K (mg.L )
Si (mg.L )
Al (mg.L )
Fe(II) (mg.L )
327.08
375.75
-1
49.62
30.47
1.30
148.70
-1
3.18
2.95
<0.01
17.00
-1
Ni (mg.L )
2.38
1.42
<0.01
8.60
-1
2.09
1.24
<0.01
6.60
-1
0.33
0.55
<0.01
5.61
-1
16.3
22.1
<0.05
141
-1
2.8
5.2
<0.05
92.3
Mn (mg.L )
Zn (mg.L )
Co (mg.L )
Cu (mg.L )
Cd (mg.L )
Pb (mg.L )
1
58
Humedad (%)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Promedio
0.44
0.33
0.35
0.35
0.35
0.36
0.28
0.31
0.26
0.28
0.26
0.29
0.24
0.30
0.25
0.31
59
P
(%)
S
(%)
Fe
(%)
Al 2O3
(%)
CaO
(%)
MgO
(%)
SiO2
(%)
J-1
0.13
6.94
26.26
4.915
5.186
1.339
17.064
J-2
0.158
5.649
25.56
5.361
5.83
1.663
18.549
J-3
< l.d.
29.877
54.36
0.255
0.133
0.122
0.315
J-4
0.0285
0.003
66.65
0.98
0.655
0.40
2.25
Se midi con 10.0 g de muestra jales. Los valores son el resultado del promedio de tres repeticiones
Adems fue analizada una muestra compsito de jales por metales y oxidos
mayores, con el fin de identificar la presencia de metales potencialmente txicos al
ambiente en los jales (Cuadro 13). Se aprecia que esta muestra contiene
concentraciones cercanas o menores de 100 mg/Kg de Cr, Ni, As, Se y Pb, elementos
txicos considerados en la Norma Oficial Mexicana que controla a los residuos
industriales (NOM-052-ECOL/1993). Sin embargo, se desconoce sobre su potencial
movilidad sobre las condiciones de exposicin al ambiente. Para determinar esto, se
requiere realizar una prueba con el procedimiento establecido por la NOM-053ECOL/1993.
60
Fe
(%)
Al 2O3
(%)
CaO
(%)
MgO
(%)
K2O
(%)
Na 2O
(%)
36.4
20.0
9.74
6.4
1.67
1.2
6.4
Cu
(ppm)
Pb
(ppm)
Zn
(ppm)
Cr
(ppm)
Ni
(ppm)
As
(ppm)
Se
(ppm)
493
18
63
29
103
21
08-Marzo- 18-Mayo2000
2000
13-Sept.2000
5.9
2.3
2.4
2.0
2.5
1.6
3.5
2.0
2.1
3.8
1.2
4.0
3.8
5.7
1.5
6.8
6.7
6.8
4.0
2.0
2.5
4.2
2.4
2.5
7.0
3.0
5.1
6.5
3.1
3.4
6.8
6.9
6.9
2.0
1.2
2.0
1.9
1.2
1.5
6.0-
5.7
5.6
61
62
En las muestras marcadas con los nmeros 2, 7 y 10, expresaron una tendencia
similar en la disminucin del Fe(ll) hasta llegar a cifras cercanas acero, en un perodo de
10 horas. La muestra 1 no mostr una disminucin significativa en la concentracin de
Fe(II) con respecto a la concentracin inicial. El resto de las muestras tuvieron una
tendencia variable en la disminucin de Fe(II) en el rango de 30 a 65% de disminucin.
Por ello, se eligieron las primeras muestras mencionadas para iniciar el proceso de
adaptacin y aislamiento de microorganismos, dada su mayor capacidad de oxidacin
del ion ferroso. Debe mencionarse que la oxidacin qumica del Fe(II) sera mnima en
estas condiciones y en estos perodos de tiempo, por lo que su oxidacin se atribuye a la
oxidacin biolgica.
Cuadro 15 Evolucin de la concentracin de ion ferroso en pruebas con muestras de
suelo y agua para determinar la capacidad oxidativa de microorganismos
quimiolitotrficos
No. muestra
10
14.8
14.0
14.6
14.6
14.0
14.4
5.3
3.0
0.0
0.0
14.8
9.2
9.3
9.0
8.5
14.6
9.8
8.3
8.0
5.0
14.4
10.2
10.0
7.0
6.7
14.4
12.3
12.0
11.2
10.9
14.0
6.0
4.3
3.0
0.2
14.4
11.0
9.0
6.0
5.0
14.4
10.0
10.0
10.0
10.0
10
14.4
9.0
8.3
5.0
2.0
Con relacin a las muestras que adems de sulfato ferroso se les adicion
extracto de levadura, se tuvo una actividad parecida a las anteriores, esto es una
disminucin en la concentracin conforme se incrementa el tiempo de prueba. Por lo que,
tambin se manifest una tendencia al consumo y seguramente oxidacin del Fe(ll), pero
no en la misma proporcin ni en las mismas muestras. Bajo estas condiciones, hubo una
mayor disminuacin para las muestras 1, 5, 6 y 9 (Cuadro 16). Por el contrario, las
muestras 2, 3, 4, 7 y 10 manifestaron tener menor aceptacin del in Fe (ll) como fuente
de energa, en presencia del extracto de levadura. En las figuras de la Plantilla 5, se
63
No.
muestra
10
12
17.2
15.3
13.2
11
7.8
17.8
16.9
15
13.8
13
13
17.7
17
16.1
15
14.6
13.4
17.4
16
16.2
16
15.9
15.7
17.6
10.2
9.2
8.1
6.7
4.1
17.8
10.7
8.1
5.3
2.3
0.9
17.5
16
16
15.4
14.1
12.8
17.5
11
17.2
10
5.2
3.9
1.2
10
17.4
17
16.5
15.5
15
15
clulas /mL,
64
65
1000
m-2
Celulas /mL (X 10 )
100
m-7
10
m-10
0.1
m-4
0.01
0.001
15
20
25
Tiempo (d)
30
40
El resultado para las muestras 4 y 10 en suelos, fue similar que para jales. Por ello, se
seleccionaron los cultivos 2 y 7, los cuales proceden de suelos de mina y agua cida,
respectivamente (Tabla 3).
66
1000
m-7
100
10
m-2
m-10
0.1
m-4
0.01
0.001
15
20
25
30
40
Tiempo (d)
estuvieron detectadas entre los rangos de 1x105 a 1x109 UFC.mL-1 (Figuras 9 a 11).
Como se observa en la Fig 9, la proliferacin de colonias de bacterias fue de 4.5x105 en
el medio MMS (Silverman y Lundgren, 1959). Sin embargo, el crecimiento de hongos y
levaduras en medio de cultivo con fuente de carbono y flor de azufre (Johnson, 1995;
Germida, 1999) fue de 3.5x107 y 3.5x109 UFC.mL-1, respectivamente (Plantillas 25 a 28
en anexo).
67
0.5
0.45
UFC x 10 6
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
Tiempo (d)
3.5
3
UFC x 107
2.5
2
1.5
1
0.5
0
12
24
36
48
60
72
84
96
Tiempo (d)
68
3.5
3
UFC X 109
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
Tiempo (d)
69
sulfato ferroso como nica fuente de energa, a los valores de pH acidos (<2.0) del
sistema en estudio.
Las bacterias que crecieron slo en presencia de tiosulfato de sodio o sulfato
ferroso como nica fuente de energa son consideradas como quimiolitotrficas estrictas,
teniendo la capacidad de oxidar las especies reducidas de azufre y hierro,
respectivamente. En el caso de estas bacterias, las colonias aisladas podran tratarse de
especies del gnero Thiobacillus o Leptospirillum (Rawlings, 1997). A partir de la
caracterizacin fenotpica de las bacterias aisladas en medio slido, se reconoci al
menos el aislamiento de Thiobacillus thiooxidans para colonias creciendo exclusivamente
sobre tiosulfato de sodio (figura c de Plantilla 5 y Fig a de Plantilla 12) y de Thiobacillus
ferrooxidans (Figs a y b de plantilla 10) o Leptospirillum ferrooxidans (Fig b de Plantilla
12) para bacterias creciendo exclusivamente sobre sulfato ferroso como fuente de
energa.
70
71
72
73
74
75
76
77
CEPA 1
CEPA 2
CEPA 3
MORFOLOGA
Clulas pequeas
redondeadas o
bacilos cortos, en
pares, 0.8X2.4 m
Pleomorfos tipo
viroide espirilados
Bacilos cortos
REPRODUCCIN
Divisin binaria
Divisin binaria
Divisin binaria
COLONIA
En medio Fe(II),
esfricas color
naranja, cubiertas con
hidrxido frrico < 1
mm
En medio de Fe(II)
esfricas color
naranja, depsitos de
compuestos frricos >
1mm
En medio con
tiosulfato, bordes
lobulados, redondos
verdes con centro rojo
> 1mm.
MEDIO LQUIDO
En medio con S se
volvi turbio y
polvoriento
TINCIN
Gram negativo
Gram negativo
Gram negativo
NUTRICIN
Auttrofa
Auttrofa
Auttrofa
RELACIN C/OXIGENO
Aerobia
Aerobia
Aerobia
FUENTE DE ENERGA
Fe(II), S, Tiosulfato
pirita
Fe(II), S, Tiosulfato,
pirita
Fe(II), S, Tiosulfato
pirita
FUENTE DE CARBONO
CO2
CO2
CO2
TEMPERATURA, C
29 2 C
29 2 C
29 2 C
pH
2.0 a 2.5
2.0 a 2.5
2.0 a 2.5
FUENTE
AISLAMIENTO
Agua
Agua
Suelo
OLOR MEDIO
SLIDO
H2SO4
H2SO4
H2S y H2SO4
OLOR MEDIO
LIQUIDO
H2SO4
H2SO4
H2SO4
de
precipitados frricos (Plantillas 13 a 15), por lo que el extracto de levadura, debe ser
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
Aspergillus nger
Cryptococcus sp
Mucor racemosus
Penicillium italicum
Rhizopus stolonifer
Rhodotorula sp
90
91
92
4.10.1
Se realizaron pruebas con los cultivos puros (Thiobacillus sp.) y mixtos (mezcla de
Thiobacillus sp., Rhodotorula sp. y Penicillium sp.) en presencia de un medio mnimo de
sales (MMS), en ausencia y presencia de sulfato ferroso y extracto de levadura, utilizando
los jales como sustrato mineral, donde se compar el efecto de la esterilizacin del
sustrato con el fin de diferenciar la capacidad oxidativa de ambos cultivos. Los resultados
de estas pruebas se reportan en el Cuadro 19, donde se observa para los cuatro distintos
bioensayos una mayor oxidacin del ion ferroso en los cultivos con el sustrato estril,
aunque el contenido inicial de sulfato ferroso es superior para las pruebas donde se
adicion extracto de levadura y sulfato ferroso.
Aun cuando se observa que el porcentaje de oxidacin del Fe (II) para casi todos
los cultivos en sustrato no estril es similar al reportado para la prueba control (~26%), lo
cual significara ningn efecto en la oxidacin del ion ferroso por la presencia de los
cultivos puros y mixto en los sustratos no estril, en realidad si existe un efecto positivo
de la presencia de los microorganismos presentes en ambos cultivos (puro y mixto). Se
observ que al comparar la velocidad de oxidacin del ion ferroso (expresada en mg.h-1),
se comprueba que en presencia del MMS la velocidad de oxidacin del Fe(II) se
incrementa de 3 a 20 veces en comparacin a la prueba control, mientras que en
presencia del medio con extracto de levadura y sulfato ferroso, la velocidad de oxidacin
se incrementa de 78 a 260 veces en comparacin a la prueba control (Cuadro 19).
93
Cuadro 19. Valores iniciales y finales del in Fe (ll) en cada tratamiento para las
comparaciones con cultivo mixto y puro con distintas fuentes de energa.
Condiciones
stril
no estril
Estril
no estril
Estril
no estril
Estril
no estril
Estril
No estril
Velocidad de
Oxidacin de Fe(II) oxidacin de
-1
(%)
Fe(II) (mg.h )
Control
-5
0.05
0.037
26
1.8*10
-5
0.05
0.036
28
1.9*10
Cultivo puro (Thiobacillus sp.) en MMS
-4
0.35
0.09
74
3.6*10
-4
0.30
0.18
40
1.7*10
Cultivo mixto en MMS
-4
0.20
0.07
65
1.8*10
-5
0.20
0.16
20
5.5*10
Cultivo puro (Thiobacillus sp.) en MMS con extracto de levadura y sulfato ferroso
-3
3.98
2.60
35
1.9*10
-3
3.60
2.60
28
1.4*10
Cultivo mixto en MMS con extracto de levadura y sulfato ferroso
-3
4.27
0.89
79
4.7*10
-3
4.21
3.10
27
1.5*10
Concentracin
inicial (mg/L)
Concentracin final
(mg/L)
Debe mencionarse que en las pruebas donde no se adicion sulfato ferroso (tanto
bioensayos control como cultivos con MMS), el Fe (II) inicial es aportado por los jales.
Adems, se observ que no existe un mayor aporte del ion ferroso por la esterilizacin
del sustrato. En todos los casos, fueron evidentes las tendencias de disminucin en la
concentracin de Fe (II) en solucin conforme se incrementa el tiempo de reaccin (Fig.
12 a 16), cuando se esteriliz el medio y adems se adicion sulfato ferroso y extracto de
levadura el consumo fue significativamente mayor (Fig. 16). Como tambin se demostr
en el Cuadro 19, se observ una oxidacin similar del ferroso, tanto con los cultivos puros
como con los mixtos (Fig. 13 y 14). Sin embargo, cuando se adicion el sulfato ferroso y
extracto de levadura fue notablemente ms oxidado en presencia d el cultivo mixto (Fig.15
y 16).
94
0.06
Ferroso (mg/L)
0.05
0.04
0.03
0.02
no estril
0.01
estril
0
0
24
48
60
72
Tiempo (h)
0.4
0.35
Ferroso (mg/L)
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
no estril
0.05
estril
0
0
24
48
60
72
Tiempo (h)
Fig. 13. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) con el cultivo puro (Thiobacillus sp.)
en medio mnimo de sales (MMS).
95
0.25
Ferroso mg/L
0.2
0.15
0.1
no estril
0.05
estril
0
0
24
48
60
72
Tiempo (h)
4.5
4
ferroso (mg/L)
3.5
3
2.5
2
1.5
no estril
estril
0.5
0
0
24
48
60
72
Tiempo (h)
96
4.5
4
3.5
ferroso (mg/L)
3
2.5
2
1.5
1
no estril
0.5
estril
0
0
24
48
60
72
Tiempo (h)
Esta serie de bioensayos fue realizado para demostrar el efecto de dos diluyentes
diferentes: agua acidulada y medio 9K, ambos a pH de 2, realizndose para los cultivos
puros y mixtos en presencia de jales. Adems del diluyente, se evalu su efecto en
presencia y ausencia de sulfato ferroso como fuente de energa, con y sin extracto de
levadura.
En la Fig. 17, se presentan los resultados cuando se utiliz agua como diluyente,
con los cultivos puros (Thiobacillus sp.), mixto (mezcla de Thiobacillus sp., Rhodotorula
sp. y Penicillium sp.) y consorcio, sin sulfato ferroso adicionado como fuente de energa
inorgnica. Se observa que no existe una disolucin adicional de ion ferroso a partir de
los jales para las cinco pruebas reportadas. La concentracin inicial de Fe(II) disuelto al
97
poner en contacto los jales con el agua acidulada, disminuye de 2 a casi 1.3 mg/L,
obtenindose el mejor resultado para el consorcio en presencia de extracto de levadura.
2
1.8
1.6
ferroso (mg/L)
1.4
1
1.2
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
12
36
Tiempo (h)
Fig. 17. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) muestra de jales con cultivo mixto
y cultivo puro, empleando agua acidulada como diluyente: (1) control para
el cultivo mixto; (2) con extracto de levadura y cultivo mixto; (3) con
extracto de levadura y consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) con
extracto de levadura y cultivo puro.
98
2.5
ferroso (mg/L)
2
1
1.5
2
3
6
7
0.5
0
0
12
36
Tiempo (h)
99
1800
1600
ferroso (mg/L)
1400
1200
1000
800
600
8
9
400
200
0
0
12
36
Tiempo ( h )
18000
16000
ferroso (mg/mL)
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
0
12
36
Tiempo (h)
100
Por otro lado, en la Fig. 19 se observa que el substrato que contena cultivo mixto,
sulfato ferroso y extracto de levadura en medio 9K, la disminucin de la concentracin de
ion ferroso fue significativamente mayor que el resto de los tratamientos. La disminucin
del in ferroso se aceler rpidamente a partir del quinto da, obtenindose un consumo
del 87 % del total del ferroso al inicio presente.
Si se considera que en las condiciones del sistema en estudio, la disminucin del
ion ferroso es provocada por su oxidacin a ion frrico, el Cuadro 18 reporta las
velocidades de oxidacin para estos 9 tratamientos. Con ello se confirma que la mayor
velocidad de disminucin en la concentracin de Fe(II) disuelto se obtuvo con el cultivo
mixto en presencia del medio 9K (7.6X10+2 mg.h-1), sulfato ferroso y extracto de levadura
(Cuadro 20). Debe sealarse que esta velocidad mxima se obtuvo en los perodos
iniciales de la cintica, mientras que en ausencia del medio 9K, la mxima velocidad de
disminucin de Fe(II) se obtuvo hacia el final de la cintica (6.5*10+1 mg.h-1). Dado que
estos bioensayos demostraron que el cultivo mixto presenta los mejores resultados en la
disminucin de Fe(II), la cual se asocia a su oxidacin en ion frrico, enseguida slo se
realizaron experimentos con este cultivo, haciendo comparacin de eficiencia con el
cultivo puro. Adems, tambin de estas pruebas se propone slo el empleo de medio 9K
como diluyente y extracto de levadura y sulfato ferroso como sustratos energticos.
Cuadro 20. Velocidad mxima de oxidacin del ion ferroso (mg.h-1) en presencia de
jales, para microorganismos, en funcin de la presencia de sulfato
ferroso y extracto de levadura y dos diluyentes distintos.
Tipo de
Microorganismo
Consorcio de
microorganismos
Puro (Thiobacillus
sp.)
Mixto (Thiobacillus
sp. Penicillium sp. y
Rhodotorulla sp.)
7.5E-2
1.9E-1
2.5E-2
2.0E-2
6.1E+1
4.6E+1
5.7E-2
6.2E-2
3.3E+2
3.7E+2
1.5E-2
6.3E-2
8.3E0
6.5E+1
9.7E-2
4E-2
3.0E+2
7.6E+2
101
10000
100000000
9000
10000000
1000000
7000
100000
6000
5000
10000
4000
1000
clulas/mL
Fe en solucin (mg/L)
8000
3000
100
2000
10
1000
0
1
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tiempo (d)
Fe(II) para cultivo mixto
102
12
10
8
6
4
2
0
1
10
11
12
13
14
15
Tiempo (d)
Fe(II)g/l
Fe(III)g/l
Fig. 22. Cintica de la oxidacin de Fe(II) en presencia de jales con cultivo mixto.
103
1000000000
100000000
Clulas /mL
10000000
1000000
100000
10000
1000
1
10
11
12
13
14
15
Tiempo (d)
104
Rhodotorula sp., fue apenas menor de 5 veces la concentracin inicial de clulas (fFigs.
24 a 26). La oxidacin del ion ferroso fue mayor para los cultivos puros de Thiobacillus
sp. y Penicillium sp., quienes promovieron la disminucin de la concentracin de Fe(II) de
8000 mg.L -1 hasta menos de 3000 mg.L -1 en 45 das (Figs. 24 y 25). En cambio, el cultivo
de Rhodotorula sp., present una menor capacidad de oxidacin de Fe (II), de 550 a 300
mg.L -1 (Fig. 26).
1000000
9000
clulas /mL
7000
10000
6000
5000
1000
4000
100
3000
10
microorganismos
1
0
10
15
20
Fe (ll) mg/mL
8000
100000
2000
Velocidad promedio
de
oxidacin
=
1.5
mg/h
1000
[Fe(II)]
0
25
30
35
40
45
Tiempo (d)
10000
celulas/mL
6000
100
4000
Fe(II), mg/L
8000
1000
Velocidad promedio
de oxidacin = 1.5 mg/h 2000
10
microorganismos
Fe(II)
0
1
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tiempo (d)
105
10000
600
500
400
100
300
Velocidad promedio
de oxidacin = 1.5 mg/h 200
10
microorganismos
Fe(II), mg/L
clulas/mL
1000
100
Fe(II)
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tiempo (d)
9000
8000
7000
1.00E+08
6000
5000
1.00E+06
4000
Velocidad
promedio de
1.00E+04
3000
2000
1.00E+02
Microorganismos
Fe(II), mg/L
clulas/mL
1.00E+10
1000
Fe(ll)
1.00E+00
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tiempo (d)
106
1.00E+12
9000
8000
1.00E+10
1.00E+08
6000
5000
1.00E+06
4000
1.00E+04
Fe(II), mg/L
clulas/mL
7000
3000
1.00E+02
2000
Velocidad
Microorganismos
Fe(ll) promedio de
1000
1.00E+00
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tiempo (d)
Fig. 28. Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de Fe(II) para la mezcla de
microorganismos (Thiobacillus sp, Penicillium sp y Rhodotorula sp.), utilizando
sulfato ferroso sin extracto de levadura como fuente de energa.
1.00E+12
Microorganismos
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
Fe(ll)
clulas/mL
1.00E+10
1.00E+08
1.00E+06
1.00E+04
1.00E+02
1.00E+00
0
10
15
20
25
30
35
40
FeII (ppm)
de Fe(ll) disminuy slo de 540 a 350 mg.L -1, al final del tiempo de incubacin (Fig. 29).
45
Tiempo (d)
107
4.11
Biolixiviacin
seleccionadas
4.11.1
de
jales
por
comunidades
microbianas
108
En cuanto al pH, tambin se observ una evolucin similar para todos los
bioensayos, esto es, una disminucin conforme se incrementa el tiempo de la cintica, de
los valores iniciales cercanos de 2 hasta valores de pH ligeramente inferiores de 1 a los
45 das (Figs. 30c, 31c y 32c). Slo en la serie de pruebas con sulfato ferroso como
fuente de energa, se observa una tendencia de la acidez asociada a la evolucin del pH,
esto es, incremento de la acidez con la disminucin del pH (Figs. 30e, 31e y 32e). En
cambio, para las pruebas con jales y jales+sulfato ferroso+extracto de levadura, no se
observa un comportamiento asociado entre el pH y la concentracin de la acidez en la
pulpa. De una manera similar, la evolucin de la concentracin de ion sulfato es irregular
en la mayora de los bioensayos, aunque para los ltimos tres muestreos se observ una
tendencia de incremento (Figs. 30f, 31f y 32f).
El potencial rdox de las pulpas durante las pruebas mostraron una tendencia
normal para los sistemas de oxidacin de minerales sulfurosos, esto es, un incremento
hasta potenciales cercanos de 600 mV/SCE (equivalente a 840 mV/SHE), aunque en los
tres casos, se observ un mayor incremento en el potencial rdox para las pruebas con
el consorcio (Figs. 30d, 31d y 32d).
En el caso del anlisis de Fe total, se observ para los bioensayos donde se
adicion ion ferroso una tendencia a la disminucin en la concentracin de Fe (Figs. 30g
y 31g), en cambio donde no se adicion el Fe (II) y el nico sustrato energtico fueron los
sulfuros de los jales, si se observ una tendencia al incremento en la disolucin de este
metal (Figs. 32g). A diferencia de este comportamiento no esperado del Fe total para los
bioensayos con el Fe(II), la concentracin del ion ferroso si present una tendencia
normal a la esperada, esto es, una disminucin en su concentracin, atribuida a su
oxidacin a ion frrico (Figs. 30h, 31h y 32h).
109
12
Protenas Totales (ug/mL)
1,00E+12
Clulas /mL
1,00E+10
1,00E+08
1,00E+06
1,00E+04
1,00E+02
1,00E+00
10
8
6
4
2
0
10
15
20
25
30
35
40
45
10
15
20
25
30
tiempo (das)
tiempo(das)
CMS
Th
CMS
Th
1000
800
ORP (mV/SCE)
pH
2,5
1,5
1
45
600
400
200
0,5
0
5
10
15
20
25
30
tiempo (das)
CMS
Th
35
40
45
10
15
20
25
30
35
40
45
tiempo (das)
CMS
Th
c
120
3000
100
2500
ion sulfato (mg/L)
Acidez (%)
40
80
60
40
20
2000
1500
1000
500
0
5
10
15
CMS
20
25
30
tiempo (das)
M
Th
35
40
45
10
15
CMS
20
25
30
tiempo (das)
Th
35
R
40
45
e
60000
10000
50000
Fe(ll) mg/L
8000
Fe Total mg/L
35
6000
4000
2000
40000
30000
20000
10000
0
0
5
10
15
CMS
20
25
30
tiempo (das)
Th
35
40
45
10
15
20
25
30
35
40
45
tiempo (das)
R
CMS
Th
1,00E+12
15
Protenas Totales (ug/mL)
Clulas /mL
1,00E+10
1,00E+08
1,00E+06
1,00E+04
1,00E+02
1,00E+00
12
10
15
20
25
30
tiempo (das)
CMS
Th
35
40
45
10
15
20
25
CMS
2,5
40
45
Th
800
ORP (mV/SCE)
pH
1,5
1
0,5
600
400
200
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
10
15
20
25
30
tiempo (das)
tiempo (das)
CMS
Th
CMS
Th
35
40
45
c
3000
1,8
2500
ion Sulfato (mg/L)
1,5
Acidez (%)
35
1,2
0,9
0,6
2000
1500
1000
500
0,3
0
5
10
15
CMS
20
25
tiempo (das)
Th
30
35
40
10
15
20
25
30
35
40
tiempo (das)
CMS
Th
e
10000
50000
8000
40000
Fe (ll) mg/L
Fe total (mg/L)
30
tiempo (das)
6000
4000
30000
20000
10000
2000
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
10
15
20
CMS
Th
25
30
35
40
45
tiempo (das)
Tiempo (d)
P
CMS
Th
1,00E+08
Clulas/mL
1,00E+06
1,00E+04
1,00E+02
1,00E+00
15
12
9
6
3
0
5
10
15
CMS
20
25
30
tiempo (das)
Th
35
40
10
15
20
45
25
30
35
40
45
tiempo (das)
CMS
Th
b
800
4,5
4
3,5
600
ORP (mV/SCE)
pH
3
2,5
2
1,5
1
400
200
0,5
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
10
15
20
tiempo (d)
CMS
Th
CMS
40
R
45
T
1,5
Acidez (%)
Th
35
2000
1,8
1,2
0,9
0,6
0,3
1500
1000
500
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
tiempo (das)
CMS
Th
10
15
CMS
20
25
30
tiempo (das)
M
Th
35
R
40
45
f
250
7000
6000
200
5000
Fe (ll) mg/L
Fe Total (mg/L)
25
30
tiempo (das)
4000
3000
2000
150
100
50
1000
0
10
15
20
25
30
35
40
45
10
15
CMS
Th
20
25
30
35
40
45
tiempo (das)
tiempo(das)
P
CMS
Th
112
113
Grados de
libertad
163
ORP
(mV)
In Sulfato
(mg/L)
Acidez
(%)
pH
Azufre
(mg/L)
90.23***
10.20***
88.50***
249.94***
31.43***
19.38***
721.83***
1469.42***
560.62***
737.42***
8
2
10
40
16
80
322
254.18***
1.17 NS
8.93***
6.40***
4.91***
1.98***
170.53***
0.13 NS
41.10***
66.96***
15.02***
16.53***
485.14***
0.27 NS
14.81***
7.74***
26.87***
3.93***
90.84***
4.73 NS
76.66***
4.85***
8.99***
2.36***
83.08***
0.20 NS
4.74***
9.05***
7.96***
2.18***
2948.915
11.24407
17099.8
13.13519
0.01027700
14.70812
0.0454436
11.65991
521690
18.34778
Fe (ll)
(mg/L)
Fe(lll)
(mg/L)
Grados
de
libertad
Fe Total
(mg/L)
Tratamientos
163
Microorganismos
5
52.48***
179.97***
202.79***
(M)
Fuente de
2
1652.16*** 5182.50*** 1307.48***
energa (C)
Tiempo (T)
8
114.71***
17.58***
85.88***
Repeticin (R)
2
1.10 NS
1.34 NS
0.03 NS
M*C
10
25.00***
135.86***
6.43***
M*T
40
5.95***
8.81***
75.30***
C*T
16
30.82***
49.51***
11.90***
M*C*T
80
4.05***
5.26***
4.83***
Error
322
CME
0.0571378 0.0152755 0.0598543
C.V. (%)
10.61148
3.878380
8.463365
CME = Cuadrado medio del error.
CV =Coeficiente de variacin.
NS =
No significativo
*** Significativo al 1%
Microorganismos
(Clulas/mL)
Protenas
totales
(g/L)
3515.71***
11.05***
455.76***
23.83***
1136.72***
0.95 NS
40.09***
50.78***
17.61***
7.99***
27.67***
1.96 NS
10.42***
6.49***
2.61 NS
3.92***
0.062253
3.487970
0.1438972
40.39052
114
pH
C. M. S.
Mezcla (B, H y L)
Bacterias
(Thiobaciillu sp)
Hongos
(Penicillium sp)
Levaduras
(Rhodototurulla)
Testigo (CN)
Tipo de
microorganismos
Protenas
totales
(g/L)
1
8.0 a
7.8 a
5.0 b
C.M S.
Mezcla (B, H y L)
Bacterias
(Thiobaciillu sp)
1.58 c
1.66 bc
1.72 b
ORP
(mV)
565 a
485 b
493 b
In Sulfato
(mg/L)
1031.2 a
982.8 b
928.3 c
Acidez
(%)
84.19 a
66.58 c
75.10 b
Microorganismos
(clulas/mL)
6.41E+07 b
3.05E+08 a
3.64E+07 c
1.74 b
496 b
1031.0 a
67.75 c
3.98E+07 c
1.66 bc
473 b
958.0 bc
67.80 c
3.92E+07 c
2.58 a
386 c
645.0 d
52.13 d
7.49E+03 d
Fe (ll)
(mg/L)
Fe (lll)
(mg/L)
Fe (Total)
(mg/L)
Azufre
(mg/L)
345.4 d
788.44 c
3278.8 a
1902.2 b
3624.2 a
2690.6 cd
4631.1 a
3770.6 c
987.0 bc
1839.4 b
2928.5 c
3963.0 bc
Hongos
7.0a
1089.0 b
1837.8 b
3299.4 b
4134.8 b
(Penicillium sp)
Levaduras
5.6 b
1467.0 b
1687.8 b
2674.8 d
3859.2 bc
(Rhodototurulla)
Testigo (CN)
1.9 c
1573.0 a
959.0 c
2531.8 d
3261.0 d
1
Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).
C M S = Consorcio de Microorganismos Seleccionados
B H L = Bacterias Hongos Levaduras
CN = Consorcio Natural
115
Sin fuente de
energa
Sulfato ferroso
Sulfato ferroso y
Extracto de
levadura
pH
ORP
(mV)
In Sulfato
(mg/L)
Acidez
(%)
Microorganismos
(clulas/mL)
2.271 a
462 b
677.86 c
34.0 c
4.90E+06 c
1.68 b
498 a
1132 b
81.8 b
1.73E+07 b
1.52 c
488 a
1176 a
91.0 a
3.34E09 a
Fuentes de
Protenas
Fe (ll)
Fe(lll)
Fe (Total)
Azufre
energa
(g/L
(mg/L)
(mg/L)
(mg/L)
(mg/L)
Sin fuente de
1
5.0 c
37.87 c
489.4 c
527.3 c
2163 c
energa
Sulfato ferroso
6.1 b
2304.9 a
2359.5 b
4664.4 a
4950 a
Sulfato ferroso y
8.5 a
782.0 b
2902.0 a
3683.0 b
4780 b
Extracto de
levadura
1
Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).
116
Cuadro 24. Efecto del tiempo de reaccin en la biolixiviacin de los jales con
las tres diferentes fuentes de energa (se consideran los
resultados de todas las pruebas, incluyendo distintas fuentes de
energia y distintos cultivos).
Tiempo de
incubacin
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tiempo de
incubacin
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2.25 a
2.15 a
1.95 b
1.82 c
1.81 c
1.79 cd
1.67 de
1.65 e
1.32 f
ORP
(mV)
272 e
296 e
466 d
522 c
530 c
551 bc
586 a
567 ab
553 bc
In Sulfato
(mg/L)
735.10 e
778.26 de
829.44 d
837.24 d
959.14 c
1046.90 b
1073.69 b
1312.03 a
1388.08 a
Acidez
(mg/L)
27.81 f
27.81 f
46.82 e
55.01 d
77.26 c
86.40 b
91.78 b
9834 a
97.53 a
Microorganismos
(clulas/mL)
5.06E+07 bc
6.04E+07 b
4.74E+07 c
1.21E+09 a
1.15E+09 a
1.02E+09 a
1.80E+06 d
5.24E+05 e
1.25E+04 f
Protenas
(g/L)
1
2.8 c
4.8 b
7.3 ab
11.8 a
11.0 a
8.4 a
7.8 ab
7.6 ab
1.9 c
Fe (ll)
(mg/L)
2.8954 a
2.7144 b
2.4141 c
2.1524 d
2.1180 d
2.0994 de
2.0277def
1.9631 ef
1.8884 f
Fe (lll)
(mg/L)
2.3514 g
2.4859 f
2.7252 e
2.8597 d
3.0211 c
3.0842 bc
3.1455ab
3.1460 ab
3.1974 a
Fe (Total)
(mg/L)
3.2864 a
3.2731 a
3.2185 b
3.2129 bc
3.2053 bc
3.1646 cd
3.1253 cd
3.1041 e
3.0905 e
Azufre
(mg/L)
3703.4 cd
3511.2 e
3134.2 f
3050.1 f
3972.4 cd
5955.6 a
4584.9 b
4070.9 b
3446.9 e
pH
1
Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).
117
DISCUSIN
1.20,
favorecindose
entonces
las
condiciones
para
el
desarrollo
de
FeS2 + 7 2 O2 + H 2 O microorgan
ismos
Fe 2+ + 2SO4 2 + 2H + (1)
Mientras que la presencia de los elementos alcalinotrreos (Ca, Na, etc.),
debe ser precisamente resultado de la disolucin cida de los silito-aluminatos, por
reacciones del tipo (Blowes y Jambor, 1994):
Muscovita:
KAl2 [ AlSi3 O10 ](OH ) 2 + H + + 3 2 H 2 O K + + 3 2 Al2 Si 2 O5 (OH ) 4
(2)
Albita:
NaAlSi 3 O8 + H + + 9 2 H 2 O Na 2 + + 2 H 4 SiO 4 + 1 2 Al2 Si 2 O5 (OH ) 4
(3)
4Fe 2+ + O2 + 4 H + microorgan
ismos
4 Fe3+ + 2H 2 O
Fe 3 + 3H 2 O Fe(OH ) 3 + 3H +
(4)
(5)
(6)
metablica.
Gracias
ello,
se
embargo,
tambin
se
demuestra
aqu
que
la
diversidad
de
sean los ms
abundantes.
Desde el inicio del trabajo, se demostr que los microorganismos hetertrofos
tienen tanta capacidad para aprovechar la oxidacin del ion ferroso, como los
quimiolitotrficos (fig. 6 y 7), de ah que se haya decidido encontrar las mejores
condiciones para mejorar el crecimiento y actividad oxidante por tipo de
microorganismo (bacterias, hongo o levadura) y para el cultivo mixto.
La oxidacin de especies reducidas de hierro y azufre realizada por bacterias,
ya fue demostrada por Blais et al, (1993). En este trabajo se mostr la correlacin
entre el incremento de biomasa y de la concentracin de iones sulfato y Fe(II), as
como un decremento en el pH en los tratamientos donde se adicion cultivo de
microorganismos. Esto se explica por las reacciones (1) y (4), caractersticas de
estos ambientes (Sand et al., 2001).
En este trabajo de tesis, se observ para casi todos los bioensayos realizados
una tendencia general similar de la evolucin de los parmetros indicadores de la
oxidacin del ion ferroso y la produccin de cido, que resultan de las tres reacciones
anteriores: disminucin de la concentracin de Fe(II), disminucin del pH, incremento
de acidez, proliferacin celular, incremento de potencial rdox e incremento de las
concentraciones en solucin de Fe(III) y SO42-.
El descenso del pH de 2.0 a 1.3 y la produccin de sulfato, ocurrieron
simultneamente a travs del tiempo. Al final de los experimentos, virtualmente todo
el Fe(II) ha sido oxidado a la forma Fe(IIl). Esto no se observ en los controles (no
inoculados), durante los 45 das de incubacin, lo que confirma el papel importante
que realizan los microorganismos. En un ambiente cido donde existe la presencia
de microorganismos, el ion ferroso formado durante la oxidacin de la pirita (FeS2)
presente en los jales sulfurosos, posiblemente sea una de las causas que incremente
121
(7)
para
microorganismos
quimiolitotficos
quimiolitotrficos,
reportndose
que
de
esta
forma
son
Fe( OH ) SO4 + 2H 2 O
(8)
124
cuando
lleg
su punto
de
saturacin,
al
incrementarse
126
CONCLUSIONES
travs
del
de
los
129
contenidos nutricionales especficos que puedan estar disponibles para los diferentes
microorganismos nativos de este tipo. Principalmente, para que se desarrollen y
manifiesten sobre un medio slido con mayor eficiencia. Lo que permitira conocerlos
mejor al realizar pruebas ms sensibles metablicamente para identificar su fenotipo
a travs de las observaciones microscpicas.
Sera importante probar al consorcio de microorganismos nativos de la presa
de jales, en la biolixiviacin de sus contenidos sulfurosos a travs de columnas y en
condiciones fsico-qumicas controladas. Tambin este estudio, aporta informacin
relevante sobre la velocidad de oxidacin de los substratos, de acuerdo a los cultivos
de microorganismos en prueba, a la concentracin de lixiviados en los jales as como
a sus diferentes fuentes de energa adicionadas.
130
Vll
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152
c
Plantilla 1. Panormicas de los sitios de muestreo de jales, suelo y agua: (a) presa de
jales; (b) perfil de suelo muestreado y (c) espejo de agua en presa de jales.
54
b
Plantilla 3. Sitios de muestreo de jales, suelo y agua: (a) presa de jales donde se
muestre agua y jales y (b) muestreo de suelo con evidencia de escasa
vegetacin por impacto de la oxidacin de sulfuros.
56
b
Plantilla 4. Detalle de sitios de muestreo de jales y suelo: (a) alteracin de los minerales
sulfurosos en jales y (b) Evidencias de la oxidacin de los minerales
sulfurosos y precipitacin de compuestos de fierro en suelos impactados.
57
c
Plantilla 5. Pruebas en matraces agitados para evaluar la oxidacin del ion ferroso para
muestras de suelo: (a) pruebas en medios de cultivo para adaptacin y
crecimiento de microorganismos nativos; (b) pruebas para crecimiento de
microorganismos heterotrficos y
(c) pruebas para crecimiento de
microorganismos quimiolitotrficos.
65
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Plantilla
Plantilla
Plantilla
Plantilla
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Plantilla 25. Produccin de biomasa usando a los jales, sulfato ferroso, sulfato ferroso
con extracto de levadura y
tiosulfato de sodio como fuente de energa (a y b) tiempo 0 (c y d) despus
de treinta y cinco das
153
Plantilla
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d
Plantilla 25. Produccin de biomasa usando a los jales, sulfato ferroso, sulfato ferroso
con extracto de levadura y
tiosulfato de sodio como fuente de energa (a y b) tiempo 0 (c y d) despus
de treinta y cinco das
153
Plantilla
Plantilla
e
f
Plantilla 18. Colonias de hongos que crecieron sobre sulfato ferroso y extracto de
levadura, procedentes de: (a) - (c) muestras de suelo en presas de jales; y
(d) muestra de jales.
85
b
Plantilla 19. a y b) Colonias de microorganismos a 400 X tipo fngico crecidos sobre
un medio con tiosulfato de sodio como fuente de energa, aislados del
drenaje cido de mina
86
Plantilla 20. Cepas de hongos purificadas, aisladas a partir del consorcio obtenido
de los jales y agua de la presa de jales, ambos con pH cidos (<2).
87
Plantilla 21. (a) Colonia de Saccharomyces sp. que creci sobre un medio con extracto
de levadura y sulfato ferroso, aislada del suelo de la presa; (b) Asociacin de
Saccharomyces sp. y Rhodotorula sp. Durante etapa de aislamiento,
creciendo sobre el medio con sulfato ferroso y extracto de levadura, 60 X y
(c) Colonias de Saccharomyces sp aislada en el mismo medio a 60 X.
88
c
Plantilla 22. (a) Colonia de levaduras Rhodotorula que creci sobre un medio con
extracto de levadura y sulfato ferroso, aislada del suelo de la presa;
(b) Colonia de Rhodotorula resembrada en agar Sabouraud y
extracto de levadura, 60 X y (c) Colonia de Rhodotorula sp sobre
sulfato ferroso con extracto de levadura a 60 X.
89
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91