LA ACTIVACIN Y LA INHIBICIN DE LA POLIFENOL OXIDASA EN LA UVA

1. INTRODUCCIN :
Cursos prcticos de bioqumica pretenden introducir a los estudiantes
las propiedades bsicas de los materiales biolgicos y satisfacer los
deseos de los estudiantes para llevar a cabo investigaciones de
investigacin similar. El estudio de la activacin y la inhibicin de las
enzimas proporcionan un rea de tema nico para lograr este ltimo
propsito. Sin embargo, el nmero de enzimas adecuadas para el
estudio de ambos efectos es limitado debido a los procedimientos de
purificacin sofisticadas ya que implican un equipo que no es
disponible comnmente en el laboratorio prctico.
polifenoles oxidasa de uva es una enzima ideal para estos estudios,
ya que tiene un protocolo de purificacin fcil (menos de tres horas) y
se encuentra como un precursor inactivo (forma latente) que puede
ser activado por varios agentes.
Adems, esta enzima no est muy alejada de la vida cotidiana de los
estudiantes, ya que se relaciona con el proceso de tostado indeseable
de frutas, jugos y verduras. Este pardeamiento es causado
principalmente por la oxidacin de fenoles en el tejido de la planta
por esta protena que contiene cobre multifuncional. Cataliza tanto
orto-hidroxilacin de monofenoles a o-difenoles (actividad cresolasa)
y la posterior oxidacin de o-difenoles a o-quinones (actividad
catecolasa). Este ltimo reacciona con s mismos y tambin con
aminocidos y protenas para dar las caractersticas pigmentos
oscuros que disminuyen el valor comercial de las frutas y verduras.
Este documento ilustra algunos de los inhibidores utilizados para
controlar la actividad de la polifenol oxidasa y algunos de los agentes
capaces de la activacin de la enzima latente, cuyo estudio y el
mecanismo de accin son de gran inters industrial.
2. MATERIALES Y MTODOS
Reactivos bioqumicos eran de Sigma (St Louis, MO), metabisulfito de
sodio de Merck y todos se usaron sin purificacin adicional.
Enzyme purificacin de uva polifenol oxidasa se purific mediante el
uso de Triton X-114 particin de fase. La enzima obtenida de este
modo fue latente, y tuvo que ser activado antes de que pudiera ser
medido.
actividad de la oxidasa de polifenol ensayo enzimtico hacia catecol
terc-butilo (TBC) se determin en un espectrofotmetro de registro a
400 nm. La mezcla de reaccin contena 1,5 ml 50 mM de tampn de
acetato, pH 5,0, 1 ml TBC 5 mM y 0,2 ml de

extracto de enzima. La enzima se diluye normalmente (por lo general

1: 10- 01:50) para que el aumento lineal inicial en A era 0,1 a 0,2 por
min. Una unidad de enzima se define como la cantidad de la enzima
que cataliza la transformacin de 1 mol sustrato / min bajo las
condiciones de ensayo.
La inhibicin de la enzima Los experimentos de inhibicin se
llevaron a cabo con polifenol oxidasa completamente activa. Para ello,
los estudiantes ajustarse la solucin de enzima latente a pH 5,0 con
cido actico 100 mM. Estos experimentos se llevaron a cabo
mediante la adicin de cantidades crecientes de inhibidor al medio de
reaccin estndar. El inhibidor vari desde 0 hasta 600 M, 0-650
M y 0-250 M en el caso del cido cinmico, cido ascrbico y
metabisulfito, respectivamente.
Activacin de la enzima Para estos experimentos, la enzima se
mantuvo latente en el tampn de extraccin (pH 7,3). En los ensayos
de activacin, la muestra se preincub con tripsina (1000 U / ml) o
con detergente (10 mM) durante 5 o 15 minutos, respectivamente,
antes de la adicin al medio de reaccin estndar.

3. LA INHIBICIN POR ANLOGOS ESTRUCTURALES

velocidad de reaccin enzimtica se puede disminuir por un grupo de

sustancias llamadas inhibidores. Desde su estudio, informacin valiosa
que se ha obtenido en el mecanismo de la enzima, especificidad de
sustrato y los grupos qumicos que participan en la catlisis y la
estructura del centro activo. Los tres tipos principales de inhibicin
(competitivos, no competitivos y no competitivos) pueden ser analizadas
en trminos de la ley de velocidad de Michaelis-Menten.

El inhibidor elegido para la polifenol oxidasa fue el cido cinmico, un

anlogo estructural del sustrato, que tiene el grupo hidroxilo en posicin
meta en lugar de en la posicin orto. 4 Esto permite la unin reversible
de la inhibidor competitivo de la enzima y deniega el acceso del sustrato
al sitio activo.

Para analizar este efecto, una representacin de Lineweaver-Burk (1 / v

vs 1 / [S]) de inhibicin competitiva lineal se utiliza (datos no mostrados),
junto con una representacin de Dixon (1 /v vs [I]]) para comprobar si la
inhibicin es una verdadera inhibicin competitiva lineal o no. Si el valor
ordinal del punto donde las lneas se intersectan en la trama Dixon es el
mismo que el 1/ Vmx obtenido en la representacin de LineweaverBurk, el tipo de inhibicin es claramente una inhibicin competitiva
lineal. Esto permite a los estudiantes a distinguir esta inhibicin
competitiva de la inhibicin mixta, ya que en ambos casos las lneas se

cruzan por encima del eje horizontal en la representacin de Dixon. La

Figura 1 muestra el K1 (329 M) obtenido por los estudiantes con la
representacin de Dixon.

La
inhibicin
de la polifenol
oxidasa por el
cido cinmico
con
dos

concentraciones de sustrato (grfica Dixon): (a) 0,83 mM. (B) 1,67

mM.
Inhibicin competitiva
Donde V es la velocidad de reaccin, Km es la constante de MichaelisMenten, Vmax es la velocidad mxima, y [S] es la concentracin de sustrato

LA INHIBICIN POR AGENTES REDUCTORES

Los agentes reductores parecen inhibir la polifenol oxidasa, aunque
en realidad prevenir reacciones no enzimticas posteriores, de tal
manera que no se formen productos coloreados. Los modos de accin
diferentes en funcin del agente reductor utilizado y los experimentos
incluyen dos de los ms importantes de la industria de la comida y el
vino.
El primero es el cido ascrbico, que acta principalmente mediante
la reduccin de la quinona nuevo a la original o-difenol. Una vez que
todo el inhibidor ha reaccionado, el producto de quinona amarillo

comienza a aparecer. Sin embargo, los estudiantes se den cuenta de

que la velocidad enzimtica disminuye a medida que ms cido
ascrbico se aade (Figura 2). Una clara disminucin en la actividad
se muestra cuando el cido ascrbico alcanza 650 M, por encima del
cual el valor de la enzima es completamente inhibida debido a la
inactivacin de auto producido por la reaccin de la naciente oquinona en el sitio activo. El efecto se muestra en la Figura 2 se
utiliza en la industria alimentaria para evitar los pigmentos marrones
desagradables en verduras, mientras que son tratados antes de ser
cocido, envasado o enlatado. Otro ejemplo de un agente reductor es
metabisulfito de sodio, 6 que forma un producto de adicin incoloro
estable con quinonas. En primera este agente parece reaccionar de
una manera similar al cido ascrbico, el perodo de retraso aumenta
con la concentracin de inhibidor en el rango de 0 a 250 M (Figura
3). Sin embargo, la disminucin de la actividad es mayor que con
cido ascrbico para una concentracin de inhibidor dada. Esto
sugiere que metabisulfito tiene un efecto directo sobre la enzima. De
hecho, este agente reductor puede unirse al centro activo de la
enzima, inhibiendo directamente. Ms detalles de su mecanismo de
inhibicin cintica se han publicado recientemente.
A pesar de la potencia inhibidora de metabisulfito de sodio, su uso en
la tecnologa de los alimentos y, especialmente, en la industria del
vino tiende a ser estrictamente controlada y se elimina en lo posible a
causa de la creciente conciencia de su posible efecto perjudicial para
la salud. Es por esta razn que los enlogos tienen que probar este
nivel en cada lote de vino que hacen. Los estudiantes se dan cuenta,
durante la clase de discusin final, que la dosis de disulfito utilizado
depende de las uvas utilizadas para purificar la enzima.
Figura 2 Efecto del
cido
ascrbico
sobre la actividad
de la polifenol
oxidasa.
El
perodo de retardo
es el tiempo entre
el inicio de la
reaccin
enzimtica y el
tiempo
que
la
quinona puede ser
seguido por el

espectrofotmetro. La etiqueta de
concentracin de ascorbato utilizado

cada

lnea

representa

la

LA ACTIVACIN DE LA ENZIMA LATENTE

Uno de los aspectos ms interesantes de la planta de polifenol
oxidasa bioqumica es la presencia de actividad enzimtica latente,
que puede ser activado por una variedad de tratamientos. Los
estudiantes ponen a prueba dos posibles agentes activadores
fisiolgicos que se producen in vivo, probablemente durante dao a
los tejidos de la planta. Estos son el contacto de la enzima latente con
enzimas proteolticas (tales como la tripsina) y con los lpidos de las
membranas subcelulares desorbidos rotos.
El efecto de activacin de la tripsina y los detergentes se muestra en
la Figura 4. La tripsina es el mejor agente de activacin, seguido de la
catinicos y los tensioactivos aninicos, CTAB y SDS, *
respectivamente. El efecto de la tripsina se debe a un ataque
proteoltico en la polifenol oxidasa latente desde tripsina hervida falla
para activar la enzima, cuya activacin completa se alcanz en cinco
minutos utilizando una concentracin de tripsina de 1000 U / ml.
El efecto de detergente (Figura 4) claramente sealado a los cambios
estructurales en la protena, ya que slo los dos agentes tensioactivos
de desnaturalizacin (CTAB y SDS) activa la enzima, mientras que el
tensioactivo no inico, Brij 96, no afecta a la latencia. Estos cambios
estructurales se pueden ver en la figura 4, ya que slo en el caso de
Brij 96 hace la estructura de la enzima latente permanecen sin
modificar lo que permite tripsina para activarlo. Sin embargo, las
modificaciones estructurales causados por los agentes tensioactivos
de desnaturalizacin prevenir el ataque de la tripsina.
Un experimento complementario muestra el parmetro clave en la
accin de los agentes tensioactivos. Se incuba la enzima latente de
10 min en presencia de concentraciones de SDS que van desde 1 mM
a 10 RAM. La curva de activacin obtenido es hiperblica (datos no
mostrados) y se alcanza la actividad mxima despus de la
concentracin de SDS es superior a la concentracin micelar crtica
(CMC = 8,2 mM), que es la concentracin mnima de agente
tensioactivo que produce la auto-asociacin de monmeros para dar
micelas . Esto indica que los monmeros tienen poco efecto sobre la
estructura de la protena, mientras que las micelas mixtas entre SDS
y la protena modifican la estructura 3-D de la protena. Un
comportamiento de activacin similar de tensioactivos se ha visto en
amplio polifenol oxidasa bean.
ORGANIZACIN:
Necesidades y organizacin de los grupos de estudiantes son los
mismos instrumentales que se han descrito anteriormente, y los
experimentos se pueden realizar con el material y el equipo presente
en la mayora de los laboratorios para sus alumnos. Todos los
experimentos descritos en el presente documento se dividen en tres
sesiones de cuatro horas cada una. En el primer perodo los
estudiantes hacen los tampones y reactivos, purificar la enzima y la
almacenan a -20 C. La siguiente sesin comienza por realizar la

etapa de particin de fase de manera que se obtiene la enzima

latente fresco. Esto permite a los estudiantes para observar el efecto
de activacin mxima con tripsina y detergentes. El ltimo da se
dedica a estudiar la inhibicin y para una discusin de clase de una
hora de los resultados. Por otra parte, si se necesita un curso prctico
extendida, los experimentos descritos anteriormente se pueden
continuar con los experimentos de cintica descritos anteriormente
para esta enzima.
CONCLUSIONES
Los experimentos descritos en este documento introducen a los
estudiantes en los procesos de activacin e inhibicin que pueden
ocurrir
in
vivo.
Estos
procedimientos
son
experimentos
complementarios a la caracterizacin bsica de la planta de polifenol
oxidasas, que permite a los estudiantes a entender la compleja
regulacin de estas enzimas generalizadas.

Figura 3 Efecto de metabisulfito en la actividad de la polifenol

oxidasa.
(0) Actividad y (0) perodo de retraso

Figura 4 La activacin de la polifenol

oxidasa latente con tripsina y con
detergentes (ver Materiales y Mtodos)

El dodecilsulfato sdico (SDS o NaDS) (C12H25NaO4S), tambin conocido

como laurilsulfato sdico (SLS)[cita requerida], es un compuesto tensioactivo aninico,
empleado en diversos productos de higiene personal, como pasta de dientes, champ y
jabones de bao. La molcula posee una cola de 12 tomos de carbono, adosada a un
grupo sulfato, dotando a la molcula de las propiedades anfiflicas requeridas para
todo detergente.
El SDS se prepara por sulfonacin de dodecanol (C12H25OH) seguida de neutralizacin
con carbonato sdico. Se emplea en cosmticos caseros e industriales.
Como todos los detergentes tensoactivos, incluidos los jabones, el SDS retira aceites y
grasas de la piel, y causa irritacin en piel y ojos.
El SDS es probablemente el compuesto aninico tensoactivo ms investigado.

El Bromuro de hexadeciltrimetilamonio o Bromuro de

cetiltrimetilamonio ((C16H33)N(CH3)3Br) es una sal de amonio cuaternario, uno de cuyos
grupos alquilo es de gran longitud, con actividad detergente. Se le conoce tambin por las
siglas CTAB, del ingls Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide.
El CTAB es un detergente catinico que tiene la propiedad de precipitar cidos nuclicos y
polisacaridos cidos en soluciones de baja concentracin inica. Bajo estas condiciones
las protenas y los polisacridos neutros permanecen en solucin. En soluciones de alta
concentracin inica el CTAB forma complejos con las protenas y polisacridos pero no
precipita cidos nucleicos. Por esta razn es especialmente til para precipitar ADN
genmico de organismos que producen grandes cantidades de polisacridos como las
plantas y algunas bacterias Gram negativas (incluyendo algunas cepas de E. coli).

tripsina despus de detergente