Comercializadora de Jugos, lcteos

y Derivados S.A. de C.V.

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Ttulo:

Departamento:
Aseguramiento de Calidad
Clave:

Prueba de la Reductasa
No. de Rev.
Fecha de revisin:
Primera

Fecha de elaboracin:
Agosto 2011

PROCEDIMIENTO

1. FUNDAMENTO.Esta tcnica es la determinacin del tiempo necesario para obtener a 38 la decoloracin del azul
de metileno aadido a la leche.
Este dato es una medida aproximada de la carga microbiana contenida en la muestra. El azul de
metileno es un indicador de oxido-reduccin y cuando es adicionado la muestra, indica los cambios en
el potencial de oxido-reduccin producido por los microorganismos.
Algunos microorganismos utilizando el xido disuelto en la leche, son capaces de reducir el
potencial de xido-reduccin, la reduccin es catalizada por la enzima reductasa, que es una enzima
respiratoria vinculada con la oxidacin celular. Una vez que el oxgeno es utilizado, el azul de
metileno cambia de azul a incoloro.
El tiempo requerido para la decoloracin del azul de metileno es inversamente proporcional a la
carga microbiana de la muestra.
2. ALCANCE.Leche fresca
3. MATERIALES Y EQUIPO.

Tubos de ensayo de 16 x 160 mm esterilizados

Pipetas de 20 mL esterilizados
Pipetas graduadas de 1 mL (0.1 mL por divisin) esterilizadas
bao Mara elctrico de control automtico de 38-40 C
incubadora elctrica de control automtico 37-38 C
Tapones de caucho para los tubos de ensayo esterilizados

4. REACTIVOS.

Azul de metileno
Alcohol etlico 96%
Solucin acuosa de azul de metileno (AC.08.PRE.24).

NOTA. Se debe utilizar siempre la solucin prescrita, ya que la concentracin influye en la

duracin de la decoloracin.
Para obtener resultados comparables, es preciso emplear 0.01 mol de azul de metileno por mL de
leche, lo que corresponde a 3.2g de azul de metileno.
Elabor:

Revis:

Autoriz:

Aseguramiento de Calidad

Jefe Aseguramiento de Calidad

Coordinador HACCP

Comercializadora de Jugos, lcteos

y Derivados S.A. de C.V.

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Aseguramiento de Calidad
Clave:

Prueba de la Reductasa
No. de Rev.
Fecha de revisin:
Primera

Fecha de elaboracin:
Agosto 2011

PROCEDIMIENTO

5.1.1.1 PROCEDIMIENTO.5.1 Colocar aspticamente en un tubo de ensayo esterilizado 20 mL de leche.

5.2 Aadir 0.5 mL de la solucin de azul de metileno y cerrar el tubo con un tapn de goma
esterilizado por ebullicin, o bien utilizar tubos de rosca para bacteriologa.
5.3 Voltear lentamente el tubo (2 3 veces) hasta que la leche adquiera un tono uniforme.
5.4 Colocar el tubo en un bao mara a 38 C durante 5 minutos, luego en una incubadora a 38 C
al abrigo de la luz hasta decoloracin de azul de metileno.
5.5 Observar regularmente el proceso de decoloracin en intervalos de 15, 30 y 60 minutos al
inicio y cada hora despus Una muestra se considera decolorada, cuando la leche ha recobrado
su color inicial. Si en el momento de la observacin la decoloracin an no ha empezado,
voltese nuevamente el tubo una vez y pngase de nuevo en la incubadora, evitando que se
enfre.
5.6 Anotar como resultado el tiempo de incubacin necesario para obtener la decoloracin.
5.7 Tambin se puede examinar 10 mL de leche en lugar de 20 mL; en este caso, utilizar 0.25 mL
de solucin de azul de metileno.
5.1.1.2 CALCULOS.Segn los datos obtenidos, la leche se puede clasificar en 4 grupos:
A) Leche de primera calidad
No decolora el azul de metileno en 5 horas y media, lo que corresponde a una leche menor de
500,000 grmenes/mL
B) Leche de calidad mediana
Se mantiene coloreada durante las dos horas, pero se decolora dentro de las 5 horas y media, lo
que corresponde a 500.000 - 4'000.000 de grmenes/mL
C) Leche mala
Se mantiene colorada durante 20 minutos, pero de decolora dentro de 2 horas, lo que corresponde
a 4,000.000 hasta 20,000.000 de grmenes /mL
D) Leche muy mala
Se decolora en menos de 20 minutos, lo que corresponde a ms de 20,000.000 de grmenes/mL
Reportar el tiempo de decoloracin y la categora correspondiente.