Semana 3 Fermentaciones Acido Alcoholicas

UNIVERSIDAD NACIONAL DE UCAYALI
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
CURSO: INGENIERIA DE FERMENTACION Y ENZIMAS
SEMANA3:
TEMA: FERMENTACIONES ACIDO ALCOHOLICAS

Fermentacin Malolctica y las Bacterias Lcticas
"En el transcurso de la elaboracin y maduracin de los vinos, pueden darse
dos procesos biolgicos de descomposicin del cido mlico: uno protagonizado por
levaduras, que fermentan el cido mlico, produciendo alcohol etlico y anhdrido
carbnico, y se denomina fermentacin maloalcohlica; y el otro es provocado por
bacterias lcticas, que transforman el cido mlico, liberando cido L(+)lctico y
anhdrido carbnico, y se lo conoce como fermentacin Malolctica".
Se trata de una fermentacin por bacterias que se desarrolla despus de la principal o
tumultuosa, entrando en el concepto de fermentacin secundaria. Se trata de una fase de
acabado, donde se disminuir la acidez fija y se suavizar.
Durante esta etapa de transformacin qumica, producida por bacterias, el cido mlico
se transformar en cido lctico y cido carbnico. De esta transformacin resulta una
prdida en la acidez fija, ya que el cido mlico contiene dos funciones cidas mientras
que el lctico contiene una sola, en pocas palabras, una parte de la acidez del vino se
transforma en gas carbnico, el cual se desprende y desaparece.
La fermentacin del cido lctico est provocada por el desarrollo de bacterias lcticas,
stas bacterias son mucho ms pequeas que las levaduras. Las bacterias se encuentran
en los hollejos de las uvas maduras, al igual que las levaduras y los mohos.
Mejora Gustativa
En este aspecto, el vino sufre un cambio favorable, este aumento de calidad se debe a
dos causas: disminucin de los ndices de los cidos y sustitucin de un cido de sabor
muy pronunciado, el mlico, por otro cido menos agresivo a las papilas gustativas, el
cido lctico.
Un vino joven pierde as su sabor fuerte y duro para transformarse en uno suave.
El color y el olor tambin se ven modificados en este proceso, deja de tener ese color
rojo vivo, y su olor se aleja del de la uva, se enriquece y se llena de matices.
Influencia del pH
El factor primordial del vino es el pH. El pH ptimo para la proliferacin de las
bacterias se sita entre 4,2 y 4,5, muy por encima del pH de los vinos que va de 3,0 a
4,0. El pH lmite absoluto se encuentra aproximadamente, en 2,9, valor por debajo del
cual, la fermentacin bacteriana no es posible.
Influencia de la Temperatura
La influencia de la temperatura es conocida por todos. La fermentacin del cido mlico
es lenta por debajo de los 15 C, mientras que a 20 C se efecta en slo unos das y a
temperaturas de aproximadamente 10 C se necesitaran semanas o incluso meses a
temperaturas inferiores.
CARACTERISTICAS GENERALES
1.- Introduccin
Ing. James L. Silva Daz

En este captulo vamos a utilizar la produccin de vino como esquema para estudiar
los principios bsicos de la microbiologa industrial y de la biologa de
microorganismos. Ms adelante estudiaremos otros procesos de produccin industrial
con un mayor detalle.
La microbiologa industrial est dedicada a la utilizacin comercial de
microorganismos e incluye procesos que tienen gran importancia econmica, ambiental
y social.
Tradicionalmente se ha utilizado la palabra fermentacin en microbiologa industrial
para describir los procesos de cultivo de microorganismos con propsitos industriales.
Sin embargo, no hay que confundir esta utilizacin del trmico con el proceso
bioqumico de fermentacin consistente en la regeneracin del poder reductor (NADH)
por un procedimiento no oxidativo (estos procesos se estudiarn ms adelante en el
curso). La fermentacin que tiene lugar en la produccin del vino, en este sentido,
comprende ambos significados: por un lado, se trata bioqumicamente de un proceso de
fermentacin (produccin de alcohol a partir de glucosa en condiciones anaerobias) y es
una fermentacin industrial en el sentido de que se trata de un proceso industrial llevado
a cabo por microorganismos.
El desarrollo de una fermentacin industrial incluye dos tipos de procesos
denominados, por sus nombres en ingls, procesos upstream y procesos downstream.
Los procesos upstream comprenden la seleccin y preparacin del microorganismo, la
preparacin del medio de cultivo y de las condiciones de fermentacin (cultivo). Los
procesos downstream incluyen la purificacin del producto y el tratamiento de los
residuos de la fermentacin.
En el proceso de fermentacin del mosto de uva para producir vino, podemos
distinguir los procesos upstream de la seleccin y preparacin de cepas de levadura,
tratamiento del mosto y acondicionamiento de loas condiciones de fermentacin. Los
procesos downstream comprenden, en este caso, el tratamiento del vino para su
clarificacin y el de los residuos del proceso.
Los productos fabricados por fermentaciones industriales pueden agruparse grosso
modo en dos clases:
(1) los productos de gran volumen y bajo valor (en este grupo se incluyen los
productos alimenticios, bebidas, aditivos alimentarios y algunos productos
qumicos producidos por fermentacin) y
(2) los productos de bajo volumen y alto valor (los frmacos, por ejemplo).
Por otro lado, hay que sealar que tienen origen en fermentaciones industriales un
gran nmero de productos de uso cotidiano que pertenecen a diferentes grupos:

(1) alimentos (derivados lcteos y de vegetales fermentados), bebidas (vino,

cerveza, etc.), aditivos alimentarios (vinagre, cido ctrico, carotenos, etc.).
(2) productos farmacuticos: antibiticos -lactmicos (penicilinas y

cefalosporinas), antibiticos aminoglicsidos y tetraciclinas; compuestos
antitumorales y otros frmacos (lovastatina, por ejemplo, utilizada para controlar
la produccin de colesterol).
(3) Enzimas microbianas tales como proteasas, amilasas, etc.

(4) Productos qumicos tales como alcoholes, polisacridos, disolventes
(acetona), lpidos, productos base para la produccin de plsticos, etc.
(5) Productos recombinantes diseados por ingeniera gentica.

Adems de estas utilidades, los microorganismos se usan industrialmente en ciertos
procesos de microbiologa ambiental tales como el tratamiento de residuos slidos y
lquidos y en biorremediacin. Estos aspectos sern tratados ms adelante en este curso.
2.- Produccin de vino
Se trata de una fermentacin para la fabricacin de un producto de gran volumen y
bajo valor aadido. En el proceso, un hongo (Saccharomyces cerevisiae) crece
utilizando el azcar (glucosa) presente en el mosto de uva para producir alcohol. El
proceso puede esquematizarse como sigue:
Vamos a utilizar el estudio de la fermentacin del vino para revisar los factores que
intervienen en un proceso industrial estudiando en los prximos apartados
El microorganismo (hongos)
El crecimiento de microorganismos
El medio de cultivo
El proceso de fermentacin
2.1.- El microorganismo: Saccharomyces cerevisiae. Los hongos

La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto unicelular. Los
hongos son organismos eucariticos (sus clulas tienen una organizacin interna en
orgnulos membranosos) quimiohetertrofos. A continuacin vamos a explicar el
concepto de quimiohetertrofo y a describir los principales grupos de hongos.

Los organismos necesitan carbono y energa para poder crecer. En la naturaleza las
fuentes de energa pueden ser qumicas (energa presente en los enlaces de compuestos
qumicos) o lumnica (energa de la luz que se transforma en energa qumica). Por otra
parte, las reaccines de xido-reduccin que tienen lugar en los seres vivos requieren
donadores de electrones que pueden ser orgnicos o inorgnicos. Por ltimo, el carbono
puede encontrarse de dos formas, como carbono orgnico y como carbono inorgnico
(CO2). La combinacin de estas posibilidades da lugar a las diferentes categoras de
microorganismos en funcin de su nutricin:
Tipo de nutricin
Fuente
Fuente
de Fuente de
de
Ejemplo
electrones
carbono
energa
Quimiotrofos
qumica -
Fototrofo
luz
Organotrofo
comp.orgnico -
Litotrofo
comp.
inorgnico
Auttrofo
inorgnico -
Hetertrofo
orgnico
quimioorgano(hetro)trofo qumica comp.orgnico orgnico
bacterias,
hongos,
animales
quimioliot(auto)trofo
qumica
comp.
inorgnico
inorgnico
fotolito(auto)trofo
luz
comp.
inorgnico
bacterias,
inorgnico plantas,
algas
algunas
bacterias

fotoorgano(hetero)trofo
luz
comp.orgnico orgnico
algunas
bacterias,
algas
Como puede verse, las bacterias presentan una gran versatilidad metablica. Mucho
mayor que la que presentan plantas, animales u hongos. En cualquier caso, los
principales microorganismos de inters aplicado industrial pertenecen al grupo de los
quimiohetertrofos.
El microorganismo responsable de la fermentacin alcohlica de la produccin del
vino es la levadura S. cerevisiae. Las levaduras son hongos unicelulares, a diferencia de
otro tipo de hongos a los que conocemos como filamentosos. Sin embargo,
biolgicamente, ambos tipos de hongos (unicelulares o filamentosos) son similares. Las
levaduras se multiplican en los medios de cultivo como clulas aisladas individuales que
se dividen y, de esta forma, aumentan su nmero. En el caso de los hongos filamentoso,
sin embargo, las clulas se encuentran contenidas dentro de unos tubos formados por la
pared celular. Estos tubos se denominan hifas y van creciendo por sus puntoas
(crecimiento apical) y ramificndose para formar la colonia que denominamos micelio.
Por consiguiente, los hongos filamentosos tienen un crecimiento micelial, mientras que
las levaduras no.
Es importante tener en cuenta que en el crecimiento micelial, slo el borde de la
colonia (las puntas de las hifas) crece. La parte central de una colonia micelial est
formada por clulas viejas mientras que el borde de la colonia est formado por clulas
jvenes. Las clulas jvenes se encuentran en trofofase (fase de alimentacin y
crecimiento), mientras que las clulas viejas se encuentran en idiofase (fase de
diferenciacin). Cuando observamos una colonia micelial (por ejemplo una colonia de
moho sobre una naranja), el crecimiento de la colonia se produce slo por el borde de la
parte mohosa y en la parte central de la colonia se produce la diferenciacin que dar
lugar a la formacin de las esporas y a la aparicin del color verdoso caracterstico.
Las clulas jvenes desarrollan la mayora de la actividad metablica del hongo,
liberando enzimas al medio y absorbiendo los nutrientes. La zona central, por otra parte,
tiene clulas en las que se acumulan las substancias de reserva que pueden ser
necesarias para que el micelio colonice nuevas zonas pobres en nutrientes (por ejemplo,
cuando el moho de una fruta comienza a extenderse por la fuente de plstico en la que
se encuentra) o cuando el hongo se diferencia (por ejemplo, cuando produce esporas o
cuerpos fructferos).
El crecimiento de un hongo como levadura o como hongo filamentoso est, en
algunas ocasiones, regulado por condiciones ambientales, de forma que un mismo
hongo puede crecer en ciertas situaciones como levadura y en otras como hongo
filamentoso (por ejemplo, los hongos patgenos ustilago maydis y Candida albicans).

Otro aspecto importante a tener en cuenta es que la pared celular de los hongos
(levaduras y filamentosos) es diferente de la de las bacterias y de la de las plantas. La
pared celular de bacterias est formada por peptidoglicano, mientras que la de hongos
por quitina y polisacridos (glicanos) y la de las plantas por celulosa.
Por ltimo hay que recordar que como organismos eucariticos que son, los hongos
tienen su ncleo diferenciado en el interior de la clula, tienen varios cromosomas, la
divisin celular se produce por mitosis (proceso que no ocurre en bacterias) y la
produccin de clulas sexuales por meiosis.
La clasificacin de los hongos es muy compleja y aqu vamos a ver slo lo ms
simple para poder seguir el curso. La clasificacin se basa en dos criterios: (1) si las
hifas estn tabicadas (divididas en clulas) o no y (2) dentro de los hongos con hifas
tabicadas, en la organizacin de las esporas sexuales.
Los hongos con hifas no tabicadas se denominan Ficomicetos (esta

nomenclatura y clasificacin, repito, puede encontrarse de forma diferente en
distintos libros). Los ficomicetos son hongos inferiores (en algunos casos se
discute si son hongos o no) y viven en ambientes acuosos. Destacan los
gneros Mucorque participa en la produccin de algunos tipos de alimentos
y Phytophthora alguno de cuyos miembros son patgenos vegetales (P.
infestans, por ejemplo).
Los hongos superiores se pueden agrupar en tres clases

o Ascomicetos. En ellos las esporas sexuales (ascosporas) se encuentran
en el interior de una bolsa o asca. Son ejemplos de ascomicetos la
levadura S. cerevissiae, los hongos filamentosos Neurospora, y hongos
comestibles como las trufas. Son el grupo de hongos ms abundante.
o Basidiomicetos. En ellos las esporas sexuales (basidiosporas) se

encuentran en el exterior de unas estructuras com forma de maza
denominadasbasidios. Pertenecen a este grupo levaduras como el
patgeno humano Cryptococcus neoformans que produce meningitis en
pacientes inmunodeprimidos, el patgeno vegetal Ustilago maydis que
produce tumores en los granos del maz, hongos superiores con cuerpos
fructiferos complejos (setas) tales como el champin (Agaricus
bisporus) y la seta de chopo (Pleurotus ostreatus), etc.
o Deuteromicetos.
Tradicionalmente se conocan como hongos

imperfectos porque en ellos no se haba podido encontrar la forma sexual
y, por consiguiente, no se sabe si producen ascosporas o basidiosporas.
Actualmente y mediante el uso de tcnicas de anlisi del ADN se ha
podido determinar que la mayora de ellos pertenecen al grupo de los
ascomicetos y, por alguna razn, han perdido la posibilidad de realizar la

reproduccin sexual. Alguno de los hongos ms importantes en

microbiologa industrial son deuteromicetos: Penicillium productor de la
penicilina, Aspergillusproductor de cido ctrico y de lovastatina;
tambin se encuentran en este grupo hongos patgenos vegetales
como Trichoderma y Verticillium, y hongos patgenos oportunistas
animales tales como Candida albicans
IMPACTO ACTUAL EN LA TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
2.2.- Crecimiento celular
En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de

microorganismos que crecen aislados. Esta es la forma de crecimiento de la
levadura (hongo unicelular) y de las bacterias.
Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos

porque es necesario poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a
ir consumindose el substrato y cmo se va a ir acumulando el producto de una
fermentacin. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en
un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone,
puesto que no podemos predecir qu va a pasar, cundo va a completarse el
crecimiento, cmo se va a acumular el producto, etc.
Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo

apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor
eficiencia y rapidez que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares
y dividindose en cuanto han podido duplicar su masa y su material gentico. El
tiempo que tarda una clula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos
como tiempo de generacin y puede variar desde unos 20 minutos en
condiciones ptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Cada vez que
transcurre un tiempo de generacin, el nmero de clulas se duplica, siguiendo,
por tanto, un incremento exponencial.
Si llamamos N0 al nmero de clulas
inicial, y g al nmero de generaciones
transcurridas, el nmero de clulas
final (N) ser:
Llamando T al tiempo de generacin
y t al tiempo de cultivo transcurrido,
la
ecuacin
anterior
puede
transformarse en la siguiente:
Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar

grficamente, por ello es mejor transformarlas en algo ms simple,
como puede ser una recta.

Para
transformar
las
ecuaciones anteriores en
una
recta,
tomamos
logaritmos en los dos
trminos y resulta:
Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el

tiempo a razn de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de
generacin T es muy grande, el crecimiento tendr poca pendiente (ser
lento) y si T es pequeo el crecimiento ser rpido.
En un crecimiento equilibrado, todos los parmetros de crecimiento

evolucionan en paralelo. Esto es: el incremento en el nmero de
clulas, en la biomasa de cultivo y en la acumulacin de metabolitos
primarios, protenas, cidos nucleicos etc., es paralelo. Por tanto, en la
ecuacin anterior N puede representar cualquiera de estos factores.
Otra forma de representar la cintica es
considerando el incremento en el nmero
de clulas (dN) en un intervalo corto de
tiempo (dt). En este caso, la ecuacin que
describe la cintica es la siguiente:
esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo
(dt) es proporcional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N). A
la constante de proporcionalidad () se le denomina tasa de
crecimiento y puede considerarse algo as como la probabilidad de que
una clula se divida en un tiempo determinado.
Integrando la ecuacin anterior
durante el tiempo de cultivo, se
transforma en la siguiente
funcin exponencial:
la transformacin de esta
ecuacin en una recta (tomando

logaritmos) rinde lo siguiente:
esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta

linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad .
Comparando esta ecuacin con la similar presentada ms arriba,
podemos concluir que = ln2/T y, por consiguiente, que T = ln2/. Es
decir, que hay una correlacin inversa entre el valor de la tasa de
crecimiento () y el tiempo de generacin.
Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de

clulas, masa celular, etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si
conocemos ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento a partir de
medidas experimentales del incremento en el nmero de clulas,
biomasa, etc.
El grfico representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas,

etc.) de un cultivo (lnea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se
va consumiendo un substrato cuya concentracin (lnea azul) decrece
de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. Esta relacin de
proporcionalidad puede expresarse de la forma siguiente:
donde dS indica la variacin de la concentracin del substrato. Al

valor Ys lo denominamos rendimiento de utilizacin del substrato, ya
que mide la cantidad de biomasa que puede producirse por unidad de
substrato consumido:

El rendimiento de utilizacin de diferentes substratos puede ser

diferente (hay substratos, o alimentos, que "engordan" ms que otros),
vara entre diferentes microorganismos (en un smil antropomrfico:
hay personas que engordan ms que otras comiendo lo mismo) y vara
tambin en funcin de otras condiciones ambientales o fisiolgicas (no
engorda lo mismo uno al comer algo si est sano o enfermo o si est en
verano o en invierno). Tambin vara el rendimiento en funcin de que
el metabolismo sea oxidativo o fermentativo (estos conceptos sern
revisados ms adelante).
Podemos calcular el rendimiento de la utilizacin del substrato en

funcin de la cantidad de substrato aadido al cultivo, o en funcin de
la cantidad de carbono presente en ese substrato (por ejemplo).
Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total 8gramos de
clulas, por ejemplo) o de carbono presente en las clulas
(aproximadamente el 505 de la masa celular corresponde a carbono).
Haciendo
las
transformaciones que se
indican a la derecha sobre
la frmula que relaciona
la variacin de biomasa
con la de substrato,
llegamos a la definicin
de
un
nuevo
concepto qs denominado t
asa
especfica
de
consumo de substrato por
el organismo.
La tasa especfica de consumo de substrato la podemos considerar la

"velocidad" con la que el organismo consume el substrato.
Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor ser la
velocidad de crecimiento (). Asimismo, cuanto mayor sea el
rendimiento del substrato consumido, tambin mayor ser la tasa de
crecimiento.
Sin embargo, hay una cierta compensacin entre la tasa de consumo

del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que

tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimiento ms bajos

(o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el rendimiento
disminuye). A esta correlacin inversa se le conoce con el nombre
de efecto Pasteur.
Por ltimo, nos falta relacionar la tasa de crecimiento () con la

concentracin de substrato (S). En condiciones de substrato abundante,
la concentracin de este no afecta al valor de ; pero cuando el
substrato se hace limitante, s existe ese efecto. La expresin
matemtica que relaciona ambos parmetros se conoce con el nombre
de ecuacin de Monod y es la siguiente:
En esta ecuacin la
tasa de crecimiento ()
depende de la mxima
que puede alcanzar el
microorganismo, de la
concentracin
de
substrato y de un valor
Ks que representa la
concentracin
de
substrato a la que se
alcanza una tasa de
crecimiento igual a la
mitad de la mxima.
La ecuacin de Monod tendr mucha importancia al tratar de cultivos

continuos. Para que se cumpla esta ecuacin el rendimiento debe ser
independiente de la concentracin de substrato.
2.3.- Fases del crecimiento de un cultivo
En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de

microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito. a esto
se le denomina cultivo batch y podramos traducirlo por cultivo discontinuo por
contraposicin con el cultivo continuo que desarrollaremos ms adelante. El
desarrollo de un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la siguiente
figura:

Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: (1) la fase lagen la que el

microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria
metablica para poder crecer activamente. La duracin de esta fase es variable y en
general es mayor cuanto ms grande sea el cambio en las condiciones en las que se
encuentra el microorganismo. (2) La fase exponencial cuya cintica explicamos en la
pgina anterior. (3) La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de
microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sino que la aparicin
de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. (4) La fase de muerte en la
que el nmero de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una
constante k que depende de diferentes circunstancias.
En la fase de muerte decimos que el nmero de microorganismos

vivos disminuye exponencialmente. Pero qu es un microorganismo
vivo en trminos microbiolgicos?. Consideramos vivo al
microorganismo que puede multiplicarse (dividirse), y muerto al que ha
perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante
entender
este
concepto
porque
los
microorganismos
microbiolgicamente muertos no tienen porqu estar metablicamente
inactivos.
2.4.- Medida del crecimiento microbiano
Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes

parmetros algunos de los cuales presentar a continuacin. No
debemos olvidar que en condiciones de crecimiento equilibrado todos
los parmetros del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por
consiguiente, midiendo uno de ellos (el de medida ms fcil) podemos
medir el resto.

En este apartado revisaremos los principales mtodos de recuento de

microorganismos. Una informacin ms completa puede encontrarse en
la conexin Mtodos de recuento.
Los mtodos para el seguimiento de la evolucin de un cultivo
microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los mtodos
directos se basan en la medida de la evolucin del nmero de clulas
vivas (tcnicas de plaqueo) o del nmero de partculas (tcnicas
microscpicas y de contadores de partculas). Los mtodos indirectos se
basan en la medida de algn parmetro del cultivo que nos permite
deducir informacin sobre la evolucin del nmero de
microorganismos. La eleccin de un mtodo de seguimiento del cultivo
en concreto depende de las caractersticas del cultivo y del proceso.
Entre los mtodos principales de recuento de microorganismos
podemos destacar:
1.- Las tcnicas de recuento microscpico de clulas sin fijar usando
microscopa de contraste de fase. Para ello se cuenta el nmero de
partculas en un volumen determinado usando una clula de PetroffHauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en e que una rejilla nos
permite conocer el volumen que estamos observando). El
procedimiento es rpido y sencillo; pero no permite distinguir clulas
vivas inmviles de clulas muertas.
2.- Contaje de partculas utilizando sistemas automticos del
tipo Coulter Counter. La operacin de estos sistemas es sencilla
(mtodo de empleo) y permite rpidamente determinar el nmero de
partculas presentes en una suspensin y la distribucin de sus tamaos.
El problema es que no distingue entre clulas vivas y muertas ni entre
clulas y agregados de material insoluble presente en la suspensin del
cultivo.
3.- Tcnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de
cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las
clulas aisladas dar lugar, despus de la incubacin correspondiente, a
una colonia de forma que el nmero de estas nos permitir estimar el
nmero de clulas presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El
sistema es fcil de utilizar en el caso de clulas aisladas (no sirve en el
caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando
en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio
de cultivo slido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de
muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta ltima
opcin permite realizar el recuento de microorganismos microaerfilos
que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el

sistema de recuento en placa tenga validez estadstica, es necesario

contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la
medida.
4. Tcnicas turbidomtricas basadas en la medida de la turbidez de los
medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La
turbidez es proporcional a la masa de las partculas en suspensin
(clulas) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un
equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz
por disoluciones coloreadas (colormetro, por ejemplo). Las medidas se
hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de
550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad ptica.
La limitacin de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no
distingue clulas vivas de muerta y que normalmente no es capaz de
detectar densidades celulares menores a 10.000 clulas por mililitro.
5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtracin del cultivo
a travs de una membrana que retenga las clulas y su posterior
desecacin hasta peso constante. El sistema, obviamente, no diferencia
clulas vivas de muertas y su sensibilidad es limitada.
6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la
emisin de luz por la luciferasa de lucirnaga (Photimus pyralis) en
presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la
concentracin de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es
interesante porque la concentracin de ATP decae rpidamente en las
clulas muertas, de forma que esa medida indirecta detecta nicamente
las clulas vivas.
Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado
tcnicamente para poder ser utilizados como sistemas online. En una
operacin on line no es necesario extraer la muestra del cultivo para
realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de
fermentaciones en gran volumen porque permite realizar medidas en
tiempo real y disminuye los riesgos de contaminacin.
Antes de cerrar este apartado hay que sealar que en la naturaleza
hay muchsimos ms microorganismos de los que podemos detectar por
la mayora de los sistemas de recuento. De hecho, se estima que en el
suelo o en el agua podemos cultivar nicamente proporciones menores
al 1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas
entre las que se cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la
dependencia de otros microorganismos para el cultivo debido a
procesos de sintrofa y la oligotrofa (inhibicin por altas
concentraciones de nutrientes) que muestran algunos microorganismos.

2.5.- Factores ambientales que afectan al crecimiento de

microorganismos : Temperatura
Una vez visto cmo podemos seguir la evolucin de un cultivo,

vamos a recordar que en un proceso de crecimiento equilibrado todos
los parmetros del cultivo evolucionan manteniendo unas proporciones
constantes. Por tanto, la medida (seguimiento) de cualquiera de los
factores nos permite seguir la evolucin de los otros.
Qu factores ambientales influyen en el crecimiento microbiano?.

A continuacin vamos a revisar los que son estrictamente ambientales y
ms adelante revisaremos los relacionados con los nutrientes del
cultivo. Entre los factores ambientales destacan los siguientes:
Temperatura
Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento

adecuada. Si consideramos la variacin de la velocidad de crecimiento
() en funcin de la temperatura de cultivo, podemos observar una
temperatura mnima por debajo de la cual no hay crecimiento (dX/dt
= 0); a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la
velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se
alcanza la temperatura ptima a la que es mxima (para las
condiciones de concentracin de substrato en que se trabaja, ver la
discusin anterior al respecto). Por encima de esta temperatura ptima,
la velocidad de crecimiento decae bruscamente ( 0) y se produce la
muerte celular.
El incremento de con la temperatura se debe al incremeto

generalizado de la velocidad de las reacciones enzimticas con la
temperatura. Se denominacoeficiente de temperatura a la relacin entre
el incremento de la velocidad de reaccin y el de tempertaura. En
trminos generales, la velocidad de las reacciones bioquicas suele
aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10C la temperatura a la que
tienen lugar. La ausencia de crecimiento (=0) a temperaturas muy
bajas se debe a la reduccin de la velocidad de crecimeinto y al cambio
de estado de los lpidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos
a cristalinos (algo parecido a la precipitacin del aceite a bajas
temperaturas) impidiendo el funcionamiento de la membrana celular.
La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacin de
protenas y a las alteraciones producidas en las membranas lipdicas a
esas temperaturas.
Es importante tener en cuenta que a temperaturas muy bajas, el

metabolismo celular es muy bajo y las clulas paran de crecer; aunque
no tienen porqu comenzar a morir. Sin embargo, cuando la

temperatura es superior a la ptima, se produce la muerte celular

rpidamente (como veremos ms adelante) y las clulas no pueden
recuperar su capacidad de divisin si baja posteriormente la
temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por fro.
Hay varios tipos de microorganismos en funcin de sus temperaturas

de crecimiento mnima, mxima y ptima.
Tipode
Temp. Temp. Temp.
microorganismo mnima ptima mxima
Psicrfilo
-5 +5 12 - 15 15 - 20
Psicrtrofo
-5 +5 25 - 30 30 - 35
Mesfilo
5 15 30 - 45 35 - 47
Termfilo
40 45 55 - 75 60 - 90
Adems de los indicados existen organismos hipertermfilos que

pueden crecer a temperaturas cercanas o incluso superiores a 100C en
condiciones de alta presin. Son microorganismos muy importantes
desde el punto de vista ambiental; pero no tienen aplicaciones actuales
en agronoma o en microbiologa industrial.
Los microorganismos psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer
a temperaturas bajas. Esto es importante desde el punto de vista
aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son
capaces de crcer en condiciones de refrigeracin (4 - 8C) y de producir
infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 C).
Los microorganismos deben ser cultivados a la temperatura
adecuada para que su crecimiento sea el deseado. En cualquier caso,
hay que tener en cuenta los problemas derivados de las altas
temperaturas y controlar la de los fermentadores para evitar la
esterilizacin de los cultivos. Estas altas temperaturas, por otro lado,
tienen inters aplicado en el campo de la termodestruccin de
microorganismos y en algunos procesos de fermentacin en los que el
incremento de temperatura que se produce es capaz de eliminar los
microorganismos mesfilos patgenos presentes.
Importancia de los microorganismos de ambientes extremos
La mayor parte de los microorganismos de importancia aplicada
tanto en microbiologa industrial como alimentaria son mesfilos,
psicrfilos o psicrtrofos. En los procesos de compostaje, el papel de
los termfilos es importante, y tambin hay que considerar la presencia
de esporas termorresistentes en el estudio de los tratamientos trmicos
de termodestruccin de microorganismos en alimentos.

Sin embargo, es creciente el nmero de productos que se producen

partiendo de microorganismos termfilos porque producen protenas
termorresistentes que tienen gran utilidad en procesos aplicados. Quiz
el mejor ejemplo de esto es la ADN polimerasa Taq obtenida a partir de
la eubacteria termfila Thermus aquaticus. Esta enzima permite
sintetizar in vitro ADN a alata temperatura lo que ha sido esencial para
el desarrollo de la tecnologa de la reaccin en cadena de la
polimerasa (conocida por sus iniciales en ingls: PCR) lo cual ha
supuesto un avance en la biologa molecular, el diagnstico y la
deteccin de microorganismos en los ambientes ms variados.
Factores ambientales que afectan al crecimiento: termodestruccin
2.5.1. Aplicacin de la temperatura en la termodestruccin de

microorganismos
Un aspecto aplicado muy importante de la temperatura es su

utilizacin para la esterilizacin por calor. Es necesario esterilizar
ciertos ambientes o instrumentos, o eliminar de ellos una parte muy
importante de su carga microbiana. Esto se puede hacer con facilidad y
de forma controlada mediante tratamientos trminos. En esta seccin
veremos cmo se puede predecir cmo ser la evolucin de las
poblaciones microbianas como consecuencia de su exposicin a latas
temperaturas.
Habamos visto en su momento que durante la fase de muerte, la

desaparicin de microorganismos segua la cintica descrita en la
ecuacin siguiente:
esto es: la fase de muerte tambin sigue una cintica exponencial y

puede ser sometida a un tratamiento matemtico similar al usado para
el tratamiento matemtico del crecimiento. Si representamos la
variacin del logaritmo del nmero de clulas supervivientes a un
tratamiento trmico realizado a una temperatura dada en funcin del
tiempo de tratamiento, se obtiene una grfica como la siguiente:

el descenso del logaritmo de supervivientes es lineal con el tiempo. La

recta tiene una pendiente que permite calcular la velocidad de
termodestruccin. Se define el valor D como el tiempo necesario para
que el nmero de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo
que es lo mismo, hara que el logaritmo del nmero de supervivientes se
reduzca en una unidad). Si consideramos N 0 como el nmero de clulas al
inicio del tratamiento y Nx el nmero de clulas supervivientes despus de un
tratamiento de x minutos a una tempertatura t, el tiempo de termodestruccin se
calcula de la siguiente manera:
Las unidades del D son minutos.El tiempo de termodestruccin (D)

vara para cada temperatura (de ah el subndice t) de forma que a
mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para
distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones
fisiolgicas.
Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye
de forma logartmica tal y como se indica en la siguiente grfica:

De manera anloga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para

lograr que el nmero de supervivientes se redujera al 10% de la
poblacin inicial, el valor z indica el incremento en la temperatura
(medida en nmero de grados) necesario para que el valor D se reduzca
a la dcima parte del inicial. La frmula incluida en la grfica permite
calcular el valor z cuando conocemos el incremento de temperatura (t2t1) y los respectivos valores D.
Los valores d y z varan para cada microorganismo y para cada
condicin. Las esporas, por ejemplo, tienen valores D mucho ms altos
que las clulas vegetaticas de los mismos microorganismos. Los
microorganismos presentes en los alimentos, por otra parte, suelen tener
valores D ms altos que cuando se cultivan en condiciones de
laboratorio. Para poder determinar las condiciones en las que hacer un
tratamiento trmico para destruir microorganismos es necesario
dominar los conceptos de los valores D y z (ver problemas).
Otro valor que tiene gran importancia aplicada en el estudio de la
microbiologa de la termodestruccin es el parmetro F que
corresponde al tiempo equivalente (medido en minutos de tratamiento a
250F, o 121.1C) a todo el calor recibido considerando su capacidad de
destruir microorganismos. Al valor de la integral del calor recibido se la
denomina F0. Cuando consideramos que el calentamiento es un proceso
instantneo, se puede calcular usando la siguiente frmula:

Es muy importante saber trabajar correctamente con los conceptos

anteriores. Para ejercitarse hay una coleccin de problemas en
este enlace.
Otros tratamientos tecnolgicos para destruir microorganismos
(radiacin, por ejemplo) son susceptibles de tratamientos matemticos
similares a los descritos en esta seccin.
Factores ambientales que afectan al crecimiento: refrigeracin
2.5.2. Consideraciones sobre las bajas temperaturas

Los microorganismos se comportan a bajas temperaturas de forma
diferente segn se trate de condiciones de refrigeracin (0C-8C) o de
congelaci0on (por debajo de -20C).
En condiciones de refrigeracin los microorganismos mesfilos y
termfilos detienen su crecimiento (=0) y se mantienen durante largo
tiempo sin morir. Los psicrfilos y psicrtrofos pueden crecer en estas
condiciones y llegar a producir poblaciones importantes (esta es una
causa de deterioro de alimentos conservados en refrigeracin).
En condiciones de congelacin, la formacin de cristales en el interior
de las clulas produce unas altas mortalidades que reducen el tamao
de la poblacin. En el momento de la congelacin se produce la muerte
rpida de muchos microorganismos y, a tiempos ms largos, la tasa de
muerte se reduce aunque el nmero de viables sigue disminuyendo. En
esta segunda fase, la mortalidad es ms rpida cuando la temperatura de
congelacin es ms alta (ms prxima a valores de -20C) que cuando
es menor (valores de -80C).
La tolerancia a la congelacin de diferentes microorganismos puede
variar.
No se puede considerar la congelacin un procedimiento de
esterilizacin sino slo (en el caso de microbiologa de alimentos) un
procedimiento de conservacin.
Se pueden conservar largo tiempo cultivos de microorganismos o de clulas
eucariticas congelados en medios que contengan agentes crioprotectores
como el glicerol.

POTENCIAL DE
ALIMENTARIA
LAS
ENZIMAS
EN
LA
BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAS TRADICIONALES Y ENZIMAS ASOCIADAS

Semana 3 Fermentaciones Acido Alcoholicas

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE UCAYALI

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

TEMA: FERMENTACIONES ACIDO ALCOHOLICAS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE UCAYALI

Ing. James L. Silva Daz

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(1) alimentos (derivados lcteos y de vegetales fermentados), bebidas (vino,

(2) productos farmacuticos: antibiticos -lactmicos (penicilinas y

(3) Enzimas microbianas tales como proteasas, amilasas, etc.

(5) Productos recombinantes diseados por ingeniera gentica.

2.1.- El microorganismo: Saccharomyces cerevisiae. Los hongos

Ing. James L. Silva Daz

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quimioorgano(hetro)trofo qumica comp.orgnico orgnico

Ing. James L. Silva Daz

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Los hongos con hifas no tabicadas se denominan Ficomicetos (esta

Los hongos superiores se pueden agrupar en tres clases

o Basidiomicetos. En ellos las esporas sexuales (basidiosporas) se

Tradicionalmente se conocan como hongos

Ing. James L. Silva Daz

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reproduccin sexual. Alguno de los hongos ms importantes en

IMPACTO ACTUAL EN LA TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

2.2.- Crecimiento celular

En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de

Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos

Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo

Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar

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Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el

En un crecimiento equilibrado, todos los parmetros de crecimiento

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logaritmos) rinde lo siguiente:

esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta

Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de

El grfico representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas,

donde dS indica la variacin de la concentracin del substrato. Al

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El rendimiento de utilizacin de diferentes substratos puede ser

Podemos calcular el rendimiento de la utilizacin del substrato en

La tasa especfica de consumo de substrato la podemos considerar la

Sin embargo, hay una cierta compensacin entre la tasa de consumo

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tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimiento ms bajos

Por ltimo, nos falta relacionar la tasa de crecimiento () con la

La ecuacin de Monod tendr mucha importancia al tratar de cultivos

En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de

Ing. James L. Silva Daz

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Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: (1) la fase lagen la que el

En la fase de muerte decimos que el nmero de microorganismos

2.4.- Medida del crecimiento microbiano

Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes

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CURSO: INGENIERIA DE FERMENTACION Y ENZIMAS

En este apartado revisaremos los principales mtodos de recuento de

Ing. James L. Silva Daz

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sistema de recuento en placa tenga validez estadstica, es necesario

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